農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法
2023-07-01 06:21:51
專利名稱：農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法
技術領域：
本發明屬於生物肥料的生產技術領域，具體涉及一種農田就地培養生產叢枝菌根 真菌生物菌劑肥料的方法。
背景技術：
叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是古老而廣泛的共生體，與 陸地上80%以上的植物有共生關係。在這種共生系統中，植物經光合作用合成的糖類可以 輸送給AM真菌的內生菌絲(一般是己糖)，內生菌絲把己糖合成脂類，再輸送給外生菌絲， 以供該菌的生長繁殖。AM真菌將菌絲伸延到土壤中去，從而擴大了植物的吸收面，可以提高 對土壤營養物質的吸收，如P、N、S、Zn和水等物質，增強植物對疾病的抵抗力和抗旱能力。 但是AM真菌是共生專一性的，必須在有植物根宿主存在的條件下才能生長繁殖，從而完成 其生命循環過程，因此其菌劑的生產則較困難，在實際生產中的應用一直受到限制。AM真菌是世界上分布最廣泛的菌根類型，其寄生範圍比外生菌根要廣泛得多。當 前菌根生物技術研究方向首先是菌根接種體的大量繁殖問題，特別是AM真菌。我國已基本 具備AM真菌菌劑生產技術，然而，由於缺少基礎設施和設備的投入，再加上農田推廣應用 的運輸和使用成本高，至今沒有進行大規模工廠化生產。而發展農田就地培養AM真菌生物活性肥料技術，可以適用於綠色和有機農產品 的生產應用，大大降低使用成本，便於推廣應用。利用內生AM真菌可以有效吸收有機農家 肥(動物糞便)及其它不同種類的氮源(味精廢液和蛋白水解液)，如NO」 NH4+,胺基酸和 可溶性蛋白質，也可以提高其它肥料(磷P)的吸收。AM真菌生物活性菌劑肥料通過吸收無 機和有機氮可以提高這些普通氮肥的利用效率，具有緩釋氮肥的功效，減少湖泊河流中的 硝酸鹽含量。此外，當前的生物肥料主要集中於細菌，如根瘤菌，固氮菌，矽酸鹽細菌，解磷和解 鉀菌，還沒有共生真菌類生物肥料。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種農田就地培養生產叢 枝菌根真菌生物菌劑肥料的技術方案，該方法簡單，成本低廉，綠色環保，便於在農村推廣 利用。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於包括以 下步驟1)農田培養池及培養基質的製作在農田中，用聚乙烯塑料膜和木樁圍成培養池，然後在培養池中加入由熱火坌 5-15份，蛭石40-60份，腐殖性土 20-30份混合而成的培養基質；2)移植叢枝菌根真菌共生體及其培養將培養好的寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體，移栽至培養池中進行培養，培養期間，每一星期在培養基質中澆營養液一次，同時再在每株共生體中澆入根浸出原液，複合胺基酸營養液和腐殖酸銨溶液，所述的營養液配方為:KN033 00-500mg/L, Ca(NO3)2 520_720mg/L，MgSO4 160-360mg/L, H3BO3 3_6mg/L，MnCl2. 4H20 l_5mg/L，ZnSO4. 7H20 l_5mg/L，CuSO4. 5H20 0. 05-lmg/L, H2MoO4. H2O 0. 05-lmg/L,所述的根浸出原液為培養Ri T-DNA轉化的胡蘿蔔根組織得到的液體，所述的複合胺基酸營養液為17種標準胺基酸的混合溶液；3)生物肥料吸收轉化寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體在培養池中培養6-8周後，在離寄主植株 10-15cm處用300-500目尼龍網將培養池隔成兩室，在沒有共生體的一室培養池中，加入動 物糞便，味精廢液或蛋白水解液，以便穿過尼龍網的叢枝菌根真菌菌絲進行生物肥料的吸 收轉化；4)生物肥料的收集生物肥料的吸收轉化4-8個星期後，去除寄主植株的葉和莖，收集寄主植株的根 和叢枝菌根真菌菌絲，並和培養池中的培養基質攪拌，即得到叢枝菌根真菌生物菌劑肥料。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟1)中培養基質含有熱火坌10-15份，蛭石50-60份，腐殖性土 25-30份。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟2)中所述的寄主植株為洋蔥或百喜草，所述的叢枝菌根真菌為根內球囊黴、摩西球囊 黴、幼套球囊黴或本土叢枝菌根真菌的一種或一種以上的混合菌體。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟2)中所述的寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體為寄主根侵染率達50-90%，孢子數達 10-20個/g的共生體。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述 的步驟2)中每一星期澆15-25ml營養液一次，同時再在每株共生體中加入根浸出原液 10-25ml，複合胺基酸營養液15-25ml，濃度為的腐殖酸銨溶液2_5ml，所述的營養液含有KN033 50-450mg/L, Ca(NO3)2 550_600mg/L，MgS04200_300mg/ L, H3BO3 4-5mg/L, MnCl2. 4H20 2_4mg/L，ZnSO4. 7H20 2_4mg/L，CuSO4. 5H20 0. 1-0. 5mg/L, H2MoO4. H2O 0. 1-0. 5mg/L。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟3)中尼龍網為400目。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟3)菌絲進行生物肥料的吸收轉化的同時，通過剪去部分寄主植株的葉片或向寄主植 株葉片噴灑濃度為0. 5%的胺基酸葉面肥，並澆施矮壯素稀釋液。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於所述的 步驟4)中得到的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料中加入濃度為1.0%的葡萄糖溶液和根浸出 原液製備成農田用栽培肥料。所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在 於所述的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料、葡萄糖溶液與根浸出原液三者的重量比為100 0.5-5 0.05-0.5。本發明利用內生AM真菌菌絲吸收無機、有機氮和其它營養物質的能力，以及菌絲 儲存和輸送N給植物的機理，使用特殊的培養基質和植物宿主，培養好該菌的共生體(菌絲 和孢子)，再把該共生體由農民自己在耕作地進行大批量地培養，同時可以施加有機肥和化 學氮肥，甚至可以使用味精發酵廢液(含有高濃度(NH4)2SO4和多種胺基酸)，為菌體充分吸 收後，把N主要以精氨酸(Arg)形式儲存在菌體中，再製做成生物菌劑肥料播種於農作物的 根部，來增產增收。
該生物菌劑肥料不同於以固氮菌為主的複合微生物肥料或生物氮肥，而是以AM 真菌的繁殖體(孢子，菌絲)為菌劑，以其從培養基質吸收無機和有機氮而儲存於菌體內的 氮作為生物氮(主要是精氨酸)，再把菌體內的生物氮輸送給與其共生的植物，來完成氮的 吸收利用過程。該生物氮肥菌劑對宿主專一性不如根瘤菌強，大多數的植物都可被AM真菌 所侵染。除了具有氮肥的作用，還具有活化土壤養分、改善作物礦物質營養；提高植物抗旱 和抗病能力；促進植物生長發育，增加產量和改善品質等生物功效。上述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法與現有技術相比存 在以下有益效果1)取材容易，培養簡單，成本低廉；2)培養技術和生產技術便於在農村推 廣應用；3)生產技術綠色環保，有利於發展現代農業。且本發明得到的肥料可以降低速效化肥的用量，減少部分農藥的施用量，從而可 以以減輕對土壤、水資源和大氣的汙染，尤其適用於農作物幼苗和藥用植物的栽培。試驗表 明，使用本發明的肥料的農作物比普通培養的農作物增產達50%以上。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步說明本發明。實施例11)農田培養池及培養基質的製作在農田中，用聚乙烯塑料膜和木樁圍成培養池，木樁的間距是60CmX60Cm，培養池 四周和底部用塑料膜圍成，培養池的體積為60CmX60CmX20Cm，然後根據培養池的體積在 培養池中加入由熱火坌15份，蛭石50份，腐殖性土 25份混合而成的培養基質；熱火坌是農 田泥土經稻草焚燒後粉碎而成，蛭石從市場購買，腐殖性土由泥土和樹葉殘枝堆積腐爛後 得到；2)移植叢枝菌根共生體及其培養寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體製作培養容器，取不鏽鋼小桶，大小為 6.0X1. 1X22. 5cm3(上口直徑X下口直徑X高)，底部有孔，孔用醫用紗布堵住，小桶深且 鏤空，這樣有利於真菌菌根根系向下生長，且底部不會積水。每桶裝160g沙子，挑選地上部 分高度為4-7cm，並長有兩片嫩葉的長勢較好的寄主百喜草或洋蔥幼苗移栽至小桶內，2株 /桶，將叢枝菌根真菌大約10-30個孢子接種至寄主苗的根上，叢枝菌根真菌可以為根內球 囊黴 Glomusintraradices,摩西球囊黴 Glomus mosseae，幼套球囊黴 Glomus etunicatum 或本土叢枝菌根真菌的一種或一種以上的混合菌體。移栽後，每周加2ml/桶Hoagland營 養液，每兩天澆1次水。在培養6-8周後，寄主根侵染率達到50%以上，孢子數達到10個/g時，移栽共生體至步驟1)的培養池中進行培養，每個培養池移植5株培養好的共生體，共生體植株的間 距是20CmX20Cm。培養期間，每一星期澆20ml營養液一次，同時再在每株共生體的周圍 培養基質中澆入根浸出原液15ml，複合胺基酸營養液20ml，和濃度為3%的腐殖酸銨溶液 4ml/每株，這些營養因子有利於菌絲的繁殖和擴展。 所述的營養液配方為=KNO3400mg/L, Ca(NO3)2 620mg/L, MgS04260mg/L, H3BO3 4. 96mg/L, MnCl2. 4H20 2. 8mg/L, ZnSO4. 7H20 2. 22mg/L, CuSO4. 5H200. 18mg/L, H2MoO4. H2O 0. 19mg/L，不加磷酸鹽。所述的根浸出原液的製作方法將Ri T-DNA轉化的胡蘿蔔根培養在含有M固體培 養基的培養皿中；小心地將根移植到含有蔗糖的液體M培養基中，24°C生長4周；最後收集 得到根浸出原液，儲存在-20°C備用。所述的複合胺基酸營養液(濃度約為0. Immol)為含有17種標準的胺基酸混合 溶液。天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，穀氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸，異亮 氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，鹽酸賴氨酸，組氨酸，精氨酸和脯氨酸。3)生物肥料吸收轉化寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體在培養池中培養6周後，在離寄主植株15cm處 用400目尼龍網將培養池隔成兩室，在沒有共生體的一室培養池中，加入動物糞便，味精廢 液或蛋白水解液，叢枝菌根真菌穿過尼龍網達到另一室培養池中，進行生物肥料的吸收轉 化；4)生物氮的儲存菌絲進行生物肥料的吸收轉化的同時，通過剪去部分寄主植株的葉片或向寄主植 株葉片噴灑濃度為0. 5%的胺基酸葉面肥，用量20ml/株；並用500毫克/升的矮壯素稀釋 液按每株30-50毫升澆施；5)生物肥料的收集生物肥料的吸收轉化6個星期後，去除寄主植株的葉和莖，收集寄主植株的根和 叢枝菌根真菌菌絲，並和培養池中的培養基質攪拌，即得到叢枝菌根真菌生物菌劑肥料；用 MPN法檢測生物肥料菌劑產品，含生物氮以精氨酸計約2. 5mg/100mg (菌根繁殖體)，活性孢 子繁殖體80-100個/克幹菌劑肥料。6)生物肥料應用得到的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料按叢枝菌根真菌生物菌劑肥料、濃度為1 %的 葡萄糖溶液與根浸出原液三者的重量比100 1 0.5，製得農田用栽培肥料，用於農田中 栽培幼苗。實施例2步驟1)中採用熱火坌5份，蛭石40份，腐殖性土 20份；步驟2)中採用寄主根 侵染率達到80 %以上，孢子數達到20個/g的共生體，且培養期間，每一星期澆15ml營 養液一次，同時再在每株共生體的周圍培養基質中澆入根浸出原液10ml，複合胺基酸營 養液15ml，和濃度為2%的腐殖酸銨溶液5ml/每株，採用的營養液配方為=KNO3 500mg/ L, Ca (NO3) 2 720mg/L, MgSO4 360mg/L, H3B036mg/L, MnCl2. 4H20 5mg/L, ZnSO4. 7H20 5mg/L, CuSO4. 5H20 lmg/L, H2MoO4. H2O lmg/L，不加磷酸鹽；步驟3)中寄主植株與叢枝菌根真菌的 共生體在培養池中培養6-8周後，在離寄主植株12cm處用500目尼龍網將培養池隔成兩室；步驟4)中生物肥料吸收轉化4周；其他步驟與實施例1相同，最後得到與實施例1具有 相同效果的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料，然後按叢枝菌根真菌生物菌劑肥料、葡萄糖溶液 與根浸出原液三者的重量比為100 0.5 0.05進行配比，製成農田用栽培肥料用於農作 物栽培，最後也能取得與實施例1相同的技術效果。實施例3步驟1)中採用熱火坌10份，蛭石60份，腐殖性土 25份；步驟2)中採用寄主根 侵染率達到70%以上，孢子數達到15個/g的共生體，且培養期間，每一星期澆25ml營 養液一次，同時再在每株共生體的周圍培養基質中澆入根浸出原液25ml，複合胺基酸營 養液25ml，和濃度為3%的腐殖酸銨溶液2ml/每株，採用的營養液配方為=KNO3 300mg/ L, Ca (NO3) 2 520mg/L, MgS04160mg/L, H3BO3 3mg/L, MnCl2. 4H20 lmg/L, ZnSO4. 7H20 lmg/L, CuSO4. 5H20 0. 05mg/L, H2MoO4. H2O 0. 05mg/L，不加磷酸鹽；步驟3)中寄主植株與叢枝菌根 真菌的共生體在培養池中培養7周後，在離寄主植株15cm處用400目尼龍網將培養池隔成 兩室；步驟4)中生物肥料吸收轉化6周；其他步驟與實施例1相同，最後得到與實施例1具 有相同效果的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料，然後按叢枝菌根真菌生物菌劑肥料、葡萄糖溶 液與根浸出原液三者的重量比為100 2 0.3進行配比，製成農田用栽培肥料用於農作 物栽培，最後也能取得與實施例1相同的技術效果。
權利要求
農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵在於包括以下步驟1)農田培養池及培養基質的製作在農田中，用聚乙烯塑料膜和木樁圍成培養池，然後在培養池中加入由熱火坌5-15份，蛭石40-60份，腐殖性土20-30份混合而成的培養基質；2)移植叢枝菌根真菌共生體及其培養將培養好的寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體，移栽至培養池中進行培養，培養期間，每一星期在培養基質中澆營養液一次，同時再在每株共生體中澆入根浸出原液，複合胺基酸營養液和腐殖酸銨溶液，所述的營養液配方為KNO3 300-500mg/L，Ca(NO3)2 520-720mg/L，MgSO4 160-360mg/L，H3BO3 3-6mg/L，MnCl2.4H2O 1-5mg/L，ZnSO4.7H2O 1-5mg/L，CuSO4.5H2O 0.05-1mg/L，H2MoO4.H2O 0.05-1mg/L，所述的根浸出原液為培養Ri T-DNA轉化的胡蘿蔔根組織得到的液體，所述的複合胺基酸營養液為17種標準胺基酸的混合溶液；3)生物肥料吸收轉化寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體在培養池中培養6-8周後，在離寄主植株10-15cm處用300-500目尼龍網將培養池隔成兩室，在沒有共生體的一室培養池中，加入動物糞便，味精廢液或蛋白水解液，以便穿過尼龍網的叢枝菌根真菌菌絲進行生物肥料的吸收轉化；4)生物肥料的收集生物肥料的吸收轉化4-8個星期後，去除寄主植株的葉和莖，收集寄主植株的根和叢枝菌根真菌菌絲，並和培養池中的培養基質攪拌，即得到叢枝菌根真菌生物菌劑肥料。
2.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟1)中培養基質含有熱火坌10-15份，蛭石50-60份，腐殖性土 25-30份。
3.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟2)中所述的寄主植株為洋蔥或百喜草，所述的叢枝菌根真菌為根內球囊 黴、摩西球囊黴、幼套球囊黴或本土叢枝菌根真菌的一種或一種以上的混合菌體。
4.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其 特徵在於所述的步驟2)中所述的寄主植株與叢枝菌根真菌的共生體為寄主根侵染率達 50-90%，孢子數達10-20個/g的共生體。
5.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟2)中每一星期澆15-25ml營養液一次，同時再在每株共生體中加入根浸出 原液10-25ml，複合胺基酸營養液15-25ml，濃度為的腐殖酸銨溶液2_5ml，所述的營養液含有KN03 350-450mg/L, Ca(NO3)2 550_600mg/L，MgS04200_300mg/ L, H3BO3 4-5mg/L, MnCl2. 4H20 2_4mg/L，ZnSO4. 7H20 2_4mg/L，CuSO4. 5H20 0. 1-0. 5mg/L, H2MoO4. H2O 0. 1-0. 5mg/L。
6.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟3)中尼龍網為400目。
7.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟3)菌絲進行生物肥料的吸收轉化的同時，通過剪去部分寄主植株的葉片 或向寄主植株葉片噴灑濃度為0. 5%的胺基酸葉面肥，並澆施矮壯素稀釋液。
8.如權利要求1所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其特徵 在於所述的步驟4)中得到的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料中加入濃度為1.0%的葡萄糖溶 液和根浸出原液製備成農田用栽培肥料。
9.如權利要求8所述的農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，其 特徵在於所述的叢枝菌根真菌生物菌劑肥料、葡萄糖溶液與根浸出原液三者的重量比為 100 0.5-5 0.05-0.5。
全文摘要
農田就地培養生產叢枝菌根真菌生物菌劑肥料的方法，屬於其特徵在於包括以下步驟1)農田培養池及培養基質的製作；2)移植叢枝菌根真菌共生體及其培養；3)生物肥料吸收轉化；4)生物肥料的收集。本發明與現有技術相比存在以下有益效果1)取材容易，培養簡單，成本低廉；2)培養技術和生產技術便於在農村推廣應用；3)生產技術綠色環保，有利於發展現代農業。且本發明的肥料可以降低速效化肥的用量，減少部分農藥的施用量，從而可以以減輕對土壤、水資源和大氣的汙染，尤其適用於農作物幼苗和藥用植物的栽培。試驗表明，使用本發明的肥料的農作物比普通培養的農作物增產達50％以上。
文檔編號C05F11/08GK101805216SQ20101013459
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者田萌萌, 金海如, 馬繼芳 申請人:浙江師範大學