過敏反應引發劑片段及其應用的製作方法

2023-06-06 01:19:36 1

專利名稱：過敏反應引發劑片段及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及過敏反應引發劑片段及其應用，所述片段引發過敏反應。
背景技術：
細菌病原體及其植物宿主之間的相互作用一般分為兩類(1)相容性的(病原體-宿主)，導致在所述宿主植物中細胞間的細菌生長、症狀發展和疾病發展；和(2)不相容性的(病原體-非宿主)，導致過敏反應(發生的一種特有類型的不相容相互作用)，沒有進行性的病症。在宿主植物的相容性相互作用期間，細菌群體急劇增加，並且發生進行性症狀。在不相容性相互作用期間，細菌群體不增加，不發生進行性症狀。
過敏反應是一種快速的局部壞死，與植物對許多病原體的主動防禦有關(Kiraly，Z.，「侵入者觸發的防禦過敏性，」第201-224頁，載於Plant DiseaseAn Advanced Treatise，第5卷，J.G.Horsfall和E.B.Cowling編輯，Academic Press New York(1980)；Klement，Z.，「過敏性」第149-177頁，載於Phytopathogenic Prokaryotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy編輯，Academic Press，New York(1982))。如果高濃度(≥107細胞/ml)的宿主範圍有限的病原體(如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)或解澱粉歐文氏菌(Erwinia amylovora))浸潤到非宿主植物葉中，則容易觀察到表現為組織衰萎的由細菌引發的過敏反應(在低水平接種物下壞死僅發生在分離的植物細胞中)(Klement，Z.，「快速檢測致植物病假單胞菌的致病性」Nature 199299-300；Klement等，「在菸草葉中由致植物病細菌誘導的過敏反應」Phytopathology 54474-477(1963)；Turner等，「參與過敏反應的植物和細菌細胞之間的定量關係」Phytopathology 64885-890(1974)；Klement，Z.，「過敏性」第149-177頁，載於Phytopathogenic Prokaryotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy編輯，Academic Press，New York(1982))。看來在非宿主中引發過敏反應的能力和在宿主中具有致病性有關。正如Klement，Z.，「過敏性」第149-177頁，載於PhytopathogenicProkarvotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy編輯，Academic Press，New York所述，這些病原體在與相容宿主的相互作用中也引起儘管延長、但生理學上相似的壞死。此外，產生過敏反應或發病的能力取決於一組命名為hrp的共同的基因(Lindgren，P.B.等，「丁香假單胞菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.『phaseolicola』)的基因簇控制對菜豆植物的致病性和在非宿主植物上的過敏性」J.Bacteriol. 168512-22(1986)；Willis，D.K.等，「致植物病細菌的hrp基因，」Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991))。因此，過敏反應可能保留植物防禦本質和細菌致病性基礎的線索。
hrp基因廣泛存在於革蘭氏陰性植物病原體中，在這些植物病原體中，它們是成簇的、保守的，在某些情況下可交換(Willis，D.K.等，「致植物病細菌的hrp基因，」Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991)；Bonas，U.，「致植物病細菌的hrp基因，」第79-98頁，載於Current Topics in Microbiology and ImmunologyBacterial Pathogenesisof Plants and Animals-Molecular and Cellular Mechanisms，J.L.Dangl編輯，Springer-Verlag，Berlin(1994))。幾種hrp基因編碼與耶爾森氏菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella)和沙門氏菌屬(Salmonella)菌(spp.)所用途徑相似的蛋白分泌途徑，所述蛋白分泌途徑分泌動物疾病中必需的蛋白(Van Gijsegem等，「植物和動物致病細菌中致病性決定簇在進化上保守」Trends Microbiol.1175-180(1993))。在解澱粉歐文氏菌、丁香假單胞菌和茄假單胞菌(P.solanacearum)中，已經表明hrp基因控制富含甘氨酸的過敏反應的蛋白引發劑的產生和分泌(He，S.Y.等「丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.syringae)的HarpinPss一種通過Hrp途徑分泌且在植物中引發過敏反應的蛋白」Cell 731255-1266(1993)，Wei，Z.-H.等，「解澱粉歐文氏菌的HrpI在harpin分泌中起作用且為一個新蛋白家族的成員」J.Bacteriol.1757958-7967(1993)；Arlat，M.等，「PopA1-一種對特定矮牽牛基因型誘導過敏樣反應的蛋白，是通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌的」EMBO J.13543-553(1994))。
在引起薔薇科植物火疫病的細菌解澱粉歐文氏菌Ea321中，發現了這些蛋白中的第一種，命名為harpin(Wei，Z.-M.等，「harpin-由植物病原體解澱粉歐文氏菌產生的過敏反應的引發劑」Science 25785-88(1992))。hrpN基因中的突變揭示，解澱粉歐文氏菌在非宿主菸草葉中引發過敏反應和在高度敏感性梨果實中引起病害需要harpin。茄假單胞菌GMI1000 PopA1蛋白具有相似的物理特性，在非該菌株宿主的菸草葉中也引發過敏反應(Arlat等「PopA1-一種對特定矮牽牛基因型誘導過敏樣反應的蛋白，是通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌的」EMBO J.13543-53(1994))。然而，茄假單胞菌popA突變體在菸草中仍引發過敏反應，並在番茄中引起病害。因此，在革蘭民陰性植物病原體中，這些富含甘氨酸的過敏反應引發劑的作用差異很大。
已經分離、克隆了其它植物病原體的過敏反應引發劑，並對其進行了測序。這些病原體包括菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，「菊歐文氏菌的HarpinEch軟腐致病機理」MPMI 8(4)484-91(1995))、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，「胡蘿蔔軟腐歐文氏菌胡蘿蔔軟腐亞種(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA-突變體在菸草葉中超量表達hrpNEcc並引發過敏反應樣反應」MPMI 9(7)565-73(1966))、斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，「harpin不是斯氏歐文氏菌對玉米的致病性所必需的」8thInt』l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.7月14-19，1996和Ahmad等，「harpin不是斯氏歐文氏菌對玉米的致病性所必需的」Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.7月27-31，1996)和丁香假單胞菌丁香致病變種(CornellResearch Foundation，Inc.的WO 94/26782)。
本發明試圖鑑定引發過敏反應的過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段以及這些片段的用途。
發明概述本發明涉及歐文氏菌屬過敏反應引發劑蛋白或多肽的分離片段，其中所述片段在引發植物中引發過敏反應。也公開了分離的編碼這些片段的DNA分子。
過敏反應引發劑的片段可以用來賦予植物抗病性，以增強植物生長和/或防治蟲害。這包括在有效賦予抗病性、增強植物生長和/或防治植物或由所述植物種子生長的植物的蟲害的條件下，將非感染性形式的片段應用於植物或植物種子。
作為將所述片段應用於植物或植物種子以賦予抗病性、增強植物生長和/或防治植物蟲害的選擇方法，可以利用轉基因植物或植物種子。當利用轉基因植物時，這包括提供用DNA分子轉化的轉基因植物，所述DNA分子編碼過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段，所述片段在植物中引發過敏反應；並且在有效賦予抗病性、增強植物生長和/或防治所述植物或由所述植物種子生長的植物的蟲害的條件下，培養該植物。或者，可以提供用編碼這種片段的DNA分子轉化的轉基因植物種子，並在土壤中種植。然後，在有效賦予抗病性、增強植物生長和/或防治植物或由所述植物種子生長的植物的蟲害的條件下繁殖植物。
附圖簡述


圖1展示解澱粉歐文氏菌過敏反應引發劑(即harpin)的缺失和蛋白水解分析。A是該harpin片段的名稱。B是以胺基酸殘基計的該片段長度。C表示是否產生可檢測蛋白。D表明是否有過敏反應(即HR)引發活性。實線表示有不是harpin編碼的另外的胺基酸，而虛線表示harpin缺失的部分。框內片段上的數字表示給定片段末端存在於的胺基酸殘基；殘基#1是N端，而殘基#403是C端。
圖2是說明harpinEa、而不是harpinEaC31具體分泌的蛋白質印跡。A道，Ea273(pGP1-2)CFEP；B道，Ea273(pGP1-2)(pGPP1104)CFEP；C道，大腸桿菌DH5α(pGPP1107)CFEP harpin的大小標準；D道，BioRad低範圍分子量標記；E道，Ea273(pGP1-2)上清液；F道，Ea273(pGP12)(pGPP1104)上清液。用抗harpinEa多克隆抗體探測該印跡。
圖3是對如下浸潤的菸草葉的HR分析(1)A，harpinEa+樹莓IF；(2)B，harpinEa+蘋果IF；(3)C，harpinEa+菸草IF；(4)D，harpinEa+內切蛋白酶Glu-C；(5)E，harpinEa+胰蛋白酶；(6)F，harpinEa；(7)G，菸草IF；(8)H，內切蛋白酶Glu-C；(9)I，胰蛋白酶；和(10)J，harpinEa。IF是指細胞內液。
圖4展示用內切蛋白酶Glu-C對harpin的消化。A道是harpin；B道是harpin+內切蛋白酶Glu-C；C道是BioRad低範圍分子量標記。
圖5A展示harpin的蛋白水解。如下向考馬斯亮藍染色的聚丙烯醯胺凝膠上樣A，BioRad低範圍分子量標記；B，IF-蘋果；C，IF-樹莓；D，IF-菸草；E，harpinEa；F，harpinEa+IF-蘋果；G，harpinEa+IF-樹莓；H，harpinEa+IF-菸草。
圖5B展示如下上樣的考馬斯亮藍染色的聚丙烯醯胺凝膠A，IF-菸草；B，IF-菸草+harpinEa；C，harpinEa；D，BioRad低範圍分子量標記；E，IF-菸草+harpinEa+PMSF。在凝膠下標明樣品蛋白水解後的HR引發活性。
圖5C描述蛋白水解活性是否存在於所有測試植物的IF中。通過PAGE，在含0.1％共聚明膠的凝膠中分析從數株植物收穫的細胞內液。洗滌以除去SDS和溫育以允許明膠蛋白水解後，將凝膠染色，以顯示明膠水解活性是否存在。A，IF-蘋果；B，IF-菸草；C，IF-栒子屬植物；D，BioRad mw；E，內切蛋白酶Glu-C；和F，研磨的葉提取物-菸草。
圖6展示用菸草IF蛋白水解harpinEa後引發劑活性肽的重新分級分離。於210nm測量吸光度。峰1含有肽P91和P95；峰2含有肽P65和P69。
圖7展示harpin內幾種測試的蛋白酶的預測的蛋白水解酶切位點、以及這些酶切對活性harpin片段活性的影響。底部向上的箭頭指明根據進一步切割後活性喪失確定的對於HR引發活性潛在重要的殘基。
圖8展示歐文氏菌屬菌(Erwinia spp.)中N端附近的相似性。下劃線的殘基存在於(相同或相似)5種所檢查的蛋白中的至少4種中。前26個殘基中的9個殘基以該方式保守。
圖9A-B展示細菌HR引發蛋白的Kyte-Doolittle hydropathyplot。Ea，解澱粉歐文氏菌EA321；Est，斯氏歐文氏菌DC283；Ech，菊歐文氏菌AC4150；Ecc，胡蘿蔔軟腐歐文氏菌胡蘿蔔軟腐亞種；Rs，R，solanacearum；Pss，丁香假單胞菌丁香致病變種。
圖10展示所述過敏反應引發劑蛋白或多肽的截短蛋白。
圖11展示用於構建截短的harpin蛋白的合成寡核苷酸引物一覽表。N表示N端(5』區)，而C表示C端(3』區)。所述引物對應於本申請所示序列鑑別號N1(SEQ.ID.No.1)、N76(SEQ.ID.No.2)、N99(SEQ.ID.No.3)、N105(SEQ.ID.No.4)、N110(SEQ.ID.No.5)、N137(SEQ.ID.No.6)、N150(SEQ.ID.No.7)、N169(SEQ.ID.No.8)、N210(SEQ.ID.No.9)、N267(SEQ.ID.No.10)、N343(SEQ.ID.No.11)、C75(SEQ.ID.No.12)、C104(SEQ.ID.No.13)、C168(SEQ.ID.No.14)、C180(SEQ.ID.No.15)、C204(SEQ.ID.No.16)、C209(SEQ.ID.No.17)、C266(SEQ.ID.No.1 8)、C342(SEQ.ID.No.19)和C403(SEQ.ID.No.20)。
發明詳述本發明涉及過敏反應引發劑蛋白或多肽的分離片段，其中所述片段在植物中引發過敏反應。也公開了編碼這種片段的DNA分子以及含有這類分子的表達系統、宿主細胞和植物。公開了所述片段本身和編碼這些片段的DNA分子的用途。
按照本發明的過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段得自種類繁多的真菌和細菌病原體的過敏反應引發劑蛋白或多肽。這類多肽或蛋白能夠在用該引發劑接觸的植物組織中引發局部壞死。合適的多肽或蛋白引發劑的細菌源的實例包括歐文氏菌屬、假單胞菌屬和黃單胞菌(Xanthamonas)屬菌種(例如以下細菌解澱粉歐文氏菌、菊歐文氏菌、斯氏歐文氏菌、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、丁香假單胞菌、茄假單胞菌、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)和它們的混合物)。
過敏反應引發劑蛋白或多肽的真菌源的實例是疫黴屬(Phytophthora)。合適的疫黴屬菌種包括寄生疫黴(Phytophthoraparasitica)、隱地疫黴(Phytophthora cryptogea)、樟疫黴(Phytophthoracinnamomi)、辣椒疫黴(Phytophthora capsici)、大雄疫黴(Phytophthoramegasperma)和柑桔褐腐疫黴(Phytophthora citrophthora)。
來自菊歐文氏菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽具有對應於如下SEQ.ID.No.21的胺基酸序列Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala該過敏反應引發劑蛋白或多肽的分子量為34kDa，是熱穩定的，其甘氨酸含量高於16％，並基本上不含半胱氨酸。菊歐文氏菌過敏反應引發劑蛋白或多肽由核苷酸序列對應於如下SEQ.ID.No.22的DNA分子編碼CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141來自解澱粉歐文氏菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽具有對應於如下SEQ.ID.No.23的胺基酸序列Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala該過敏反應引發劑蛋白或多肽的分子量為39kDa，pI約為4.3，於100℃熱穩定至少10分鐘。該過敏反應引發劑蛋白或多肽基本上不含半胱氨酸。在Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer和S.V.Beer，「harpin-由植物病原體解澱粉歐文氏菌產生的過敏反應引發劑」Science 25785-88(1992)(該文獻通過引用結合到本文中)中更全面地描述了得自解澱粉歐文氏菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽。編碼該多肽或蛋白的DNA分子具有對應於如下SEQ.ID.No.24的核苷酸序列AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288得自丁香假單胞菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽具有對應於如下SEQ.ID.No.25的胺基酸序列Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340該過敏反應引發劑蛋白或多肽的分子量為34-35kDa。它富含甘氨酸(約13.5％)，且缺乏半胱氨酸和酪氨酸。在He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，「丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinPss一種通過Hrp途徑分泌且在植物中引發過敏反應的蛋白」Cell 731255-1266(1993)(該文獻通過引用結合到本文中)中發現得自丁香假單胞菌過敏反應引發劑蛋白或多肽的進一步的信息。編碼丁香假單胞菌過敏反應引發劑蛋白或多肽的DNA分子具有對應於如下SEQ.ID.No.26的核苷酸序列ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA 1026得自茄假單胞菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽具有對應於如下SEQ.ID.No.27的胺基酸序列Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340它由核苷酸序列對應於如下SEQ.ID.No.28的DNA分子編碼ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035在Arlat，M.，F.Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet和C.A.Boucher，「PopA1-一種對特定矮牽牛基因型誘導過敏樣反應的蛋白，是通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌的」EMBO J.13543-553(1994)(該文獻通過引用結合到本文中)中，提出了關於得自茄假單胞菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽的進一步信息。
來自野油菜黃單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycin)的過敏反應引發劑蛋白或多肽具有對應於如下SEQ.ID.No.29的胺基酸序列Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列是僅具有野油菜黃單胞菌大豆致病變種的過敏反應引發劑蛋白或多肽的26個殘基的氨基末端序列。它與在其它野油菜黃單胞菌致病變種中檢測到的菌毛亞基蛋白匹配。
來自野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.pelargonii)的過敏反應引發劑蛋白或多肽是熱穩定的，對蛋白酶敏感，其分子量為20kDa。它包含對應於如下SEQ.ID.No.30的胺基酸序列Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20在Cui等，「胡蘿蔔軟腐歐文氏菌胡蘿蔔軟腐亞種菌株Ecc71的RsmA-突變體在菸草葉中超量表達hrp NEcc並引發過敏反應樣反應」MPMI，9(7)565-73(1996)中，描述了胡蘿蔔軟腐歐文氏菌過敏反應引發劑蛋白或多肽的分離，該文獻通過引用結合到本文中。在Ahmad等，「harpin不是斯氏歐文氏菌對玉米的致病性所必需的」8th Int』l.Cong.Molec.Plant-Microbe Interact.7月14-19，1996和Ahmad等，「harpin不是斯氏歐文氏菌對玉米的致病性所必需的」Ann.Mtg.Am.Phytoath.Soc.7月27-31，1996中，陳述了斯氏歐文氏菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽，這些文獻通過引用結合到本文中。
在以下文獻中描述了來自寄生疫黴、隱地疫黴、樟疫黴、大雄疫黴和柑桔褐腐疫黴的過敏反應引發劑蛋白或多肽Kaman等，「來自疫黴屬的胞外蛋白引發劑大多數對細菌和真菌植物病原體具特異性並誘導對其的抗性」Molec.Plant-Microbe Interact.，6(1)15-25(1993)，Ricci等，「來自致病真菌疫黴屬在菸草中引發壞死和獲得性抗性的蛋白的結構和活性」Eur.J.Biochem.，183555-63(1989)，Ricci等，「寄生疫黴分離物在菸草中的parasiticein的差示產生和壞死和抗性的引發劑」Plant Path.41298-307(1992)，Baillreul等，「菸草中一種新的過敏反應引發劑一種真菌糖蛋白引發細胞死亡、防禦基因的表達、水楊酸的產生和系統獲得性抗性的誘導」Plant J.，8(4)551-60(1995)和Bonnet等，「在菸草和其它植物中由引發劑觸發的獲得性抗性」Eur.J.Plant Path.，102181-92(1996)，這些文獻通過引用結合到本文中。
以上引發劑是示範性的。通過在表達編碼引發劑的基因的條件下培養引發過敏反應的真菌或細菌，可以鑑定其它引發劑。通過用來自培養上清液的無細胞製備物浸潤合適的植物組織，可以測試所述製備物的引發劑活性(即局部壞死)。
本發明的方法包括上述過敏反應引發劑多肽或蛋白的片段以及來自其它病原體的全長引發劑的片段。
可以用幾種方法產生合適的片段。首先，通過常規分子遺傳操作，通過亞克隆基因片段，產生編碼已知引發劑蛋白的亞克隆。然後使所述亞克隆在體外或在細菌細胞中體內表達，以產生較小的蛋白或肽，可以按照下述步驟測試其引發劑活性。
作為另一種方法，通過用象胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌屬(Staphylococcus)蛋白酶A或胰蛋白酶消化全長的引發劑蛋白，可以產生引發劑蛋白片段。根據該引發劑蛋白的胺基酸序列，不同的蛋白水解酶可能在不同位點切割引發劑蛋白。由蛋白水解產生的一些片段可能是抗性的活性引發劑。
在另一方法中，根據對該蛋白一級結構的了解，可以採用PCR技術和選擇代表該蛋白特定部分的特定的數組引物，合成該引發劑蛋白基因的片段。然後將這些片段克隆入合適的載體中，以表達截短的肽或蛋白。
也可以用化學合成來製備合適的片段。用待產生的引發劑的已知胺基酸序列，進行這種合成。或者，使全長引發劑經水高溫和高壓將產生片段。然後，可以通過常規方法(例如層析、SDS-PAGE)分離這些片段。
歐文氏菌屬過敏反應引發劑引發過敏反應的合適片段的實例，是解澱粉歐文氏菌過敏反應引發劑的片段。合適的片段包括SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的N端片段或SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的內部片段。SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的C端片段可以跨越SEQ.ID.No.23的胺基酸105和403。SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的N端片段可以跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。SEQ.ID.No.23的胺基酸序列的內部片段可以跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。可以按照本發明鑑定其它合適的片段。
通過例如缺失或添加對該多肽的特性、二級結構和親水性質具有最小影響的胺基酸，可以製備變異體。例如，可以將一段多肽連接至該蛋白N末端的信號(或前導)序列，該信號序列在共同翻譯時或翻譯後指導該蛋白的轉移。該多肽也可以連接於一接頭或其它序列，以便容易合成、純化或鑑定該多肽。
最好用常規技術，以純化形式(純度優選至少約為60％，更優選為80％)產生本發明的片段。通常，產生本發明的片段，但不將其分泌到重組宿主細胞的生長培養基中。或者，本發明的蛋白或多肽分泌到生長培養基中。在非分泌蛋白的情況下，為了分離所述蛋白片段，繁殖攜帶重組質粒的宿主細胞(例如大腸桿菌)，通過超聲處理、加熱或化學處理裂解細胞，並將勻漿離心以去除細菌碎片。然後將上清液熱處理，通過離心分離該片段。將含有該片段的上清液部分在大小合適的葡聚糖或聚丙烯醯胺柱中經過凝膠過濾，以分離該片段。必要時，可以通過離子交換或HPLC進一步純化該蛋白部分。
可以採用常規重組DNA技術，將編碼該過敏反應引發劑多肽或蛋白片段的DNA分子引入細胞中。一般而言，這包括將該DNA分子插入該DNA分子為異源(即通常不存在)的表達系統中。將該異源DNA分子以正確的方向插入表達系統或載體的正確讀框中。該載體含有所插入的蛋白編碼序列轉錄和翻譯的必需元件。
Cohen和Boyer的美國專利第4,237,224號(該專利通過引用結合到本文中)描述了採用限制性酶切和用DNA連接酶連接，產生重組質粒形式的表達系統。然後通過轉化引入這些重組質粒，並在包括原核生物和在組織培養物中生長的真核細胞在內的單細胞培養物中繁殖。
也可以將重組基因引入諸如痘苗病毒的病毒中。可以通過將質粒轉染入受病毒感染的細胞中，產生重組病毒。
合適的載體包括但不限於以下的病毒載體，諸如λ載體系統gt11、gtWES.tB、卡隆4；和質粒載體，諸如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(參見「Stratagene克隆系統」Stratagene的產品目錄(1993)，La Jolla，Calif，該產品目錄通過引用結合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見F.W.Studier等，「使用T7 RNA聚合酶指導所克隆基因的表達」Gene Expression Technology第185卷(1990)，該文獻通過引用結合到本文中)和它們的衍生物。可以通過轉化，特別是轉導、接合、帶動轉移(mobilization)或電穿孔，將重組分子引入細胞中。採用本領域標準克隆方法，將所述DNA序列克隆入載體中，所述標準克隆方如Sambrook等，分子克隆實驗手冊，ColdSprings Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)中所述，該文獻通過引用結合到本文中。
可以利用多種宿主-載體系統表達所述蛋白編碼序列。主要的是，該載體系統必需與所用的宿主匹配。宿主-載體系統包括但不限於以下用噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌；諸如含有酵母載體的酵母的微生物；用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動物細胞；用病毒(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；和用細菌感染的植物細胞。這些載體的表達元件的強度和特異性不同。根據所用的宿主-載體系統，可以使用許多合適的轉錄和翻譯元件中的任何一種。
不同的基因信號和加工事件控制許多基因表達水平(例如DNA轉錄和信使RNA(mRNA)翻譯)。
DNA的轉錄取決於啟動子是否存在，啟動子是指導RNA聚合酶結合併藉此促進RNA合成的DNA序列。真核啟動子的DNA序列不同於原核啟動子的DNA序列。而且，真核啟動子和伴隨的遺傳信號在原核系統中可能不被識別或可能不起作用，此外，原核啟動子在真核細胞不被識別並且不起作用。
同樣，mRNA在原核細胞中的翻譯取決於不同於真核信號的適當的原核信號是否存在。mRNA在原核細胞中的有效翻譯需要該mRNA上稱為Shine-Dalgarno(「SD」)序列的核糖體結合位點。該序列是短的mRNA核苷酸序列，位於起始密碼子之前，起始密碼子通常為AUG，編碼該蛋白氨基末端的甲硫氨酸。SD序列與16S RNA(核糖體RNA)的3』端互補，並且可能通過與該rRNA形成雙鏈，促進mRNA結合於核糖體，以允許核糖體正確的定位。關於使基因表達最大化的綜述，參見Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，該文獻通過引用結合到本文中。
啟動子的「強度」(即它們促進轉錄的能力)不同。為了表達所克隆的基因，最好使用強啟動子，以獲得高水平的轉錄，並由此獲得高水平的基因表達。根據所用的宿主細胞系統，可以使用多種合適啟動子中的任一種。例如，當在大腸桿菌、其噬菌體或質粒中克隆時，可以使用以下啟動子來指導相鄰DNA區段的高水平轉錄諸如T7噬菌體啟動子、lac啟動子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、大腸桿菌噬菌體λ的PR啟動子和PL啟動子和其它啟動子，包括但不限於lacUV5、ompF、bla、lpp等。另外，雜種trp-lacUV5(tac)啟動子或用重組DNA技術或其它合成DNA技術產生的其它大腸桿菌啟動子可以用來提供所插入基因的轉錄。
可以選擇除非特異性誘導、否則抑制該啟動子作用的細菌宿主細菌菌株和表達載體。在某些操作中，加入特定的誘導物對於所插入基因的有效轉錄是必需的。例如，通過加入乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導lac操縱子。諸如trp、pro等的多種其它操縱子處於不同的控制之下。
在原核細胞中有效的基因轉錄和翻譯也需要特定的起始信號。分別通過合成的基因特異性信使RNA和蛋白的量測定，這些轉錄和翻譯起始信號的「強度」不同。含有啟動子的DNA表達載體也可以含有不同的「強」轉錄和/或翻譯起始信號的組合。例如，在大腸桿菌中的有效表達需要距起始密碼子(「ATG」)5』端7-9個鹼基的SD序列，以提供一個核糖體結合位點。因此，宿主細胞可以利用的任何SD-ATG組合均可以使用。這類組合包括但不限於來自大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因、或來自大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG組合。另外，可以使用用重組DNA技術或涉及引入合成核苷酸序列的其它技術的產生的任何SD-ATG組合。
一旦將編碼過敏反應引發劑多肽或蛋白的片段的分離DNA分子克隆入表達系統，則可以將其引入宿主細胞。這類引入可以通過不同形式的上述轉化進行，這取決於所述載體/宿主細胞系統。合適的宿主細胞包括但不限於細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲、植物等。
本發明還涉及賦予植物抗病性、增強植物生長和/或實現植物蟲害防治的方法。這些方法包括將過敏反應引發劑多肽或蛋白引發過敏反應的非感染形式的片段，在該片段有效賦予抗病性、增強生長和/或防治蟲害的條件下，以應用於植物或植物種子的全部或一部分。或者，可以將過敏反應引發劑蛋白或多肽的這些片段應用於植物，使得從這種植物本身回收的種子能夠賦予植物抗病性、增強植物生長和/或實現蟲害的防治。
作為將過敏反應引發劑多肽或蛋白應用於植物或植物種子、以便賦予植物抗病性、實現植物生長和/或防治植物或由所述種子生長的植物的蟲害的替代方法，可以利用轉基因植物或植物種子。當利用轉基因植物時，這包括提供用編碼過敏反應引發劑多肽或蛋白的片段的DNA分子轉化的轉基因植物，其中所述片段引發過敏反應；並在有效允許該DNA分子賦予植物抗病性、增強植物生長和/或防治蟲害的條件下培育該植物。或者，可以提供用編碼過敏反應引發劑多肽或蛋白的片段的DNA分子轉化的轉基因植物種子，其中所述片段引發過敏反應；並將所述植物種子種植於土壤中。然後在有效允許該DNA分子賦予植物抗病性、增強植物生長和/或防治蟲害的條件下，從該植物種子繁殖植物。
本發明將所述過敏反應引發劑多肽或蛋白應用於植物或植物種子的實施方案，以多種方式進行，包括1)應用分離的片段，或2)應用不引起病害並用編碼該片段的基因轉化的細菌。在後一實施方案中，可以通過應用含有編碼該過敏反應引發劑多肽或蛋白引發過敏反應的片段的DNA分子的細菌，將該片段應用於植物或植物種子。這類細菌必須能夠分泌或輸出該片段，使得該片段可以接觸植物細胞或植物種子細胞。在這些實施方案中，由植物或種子中的所述細菌生產該片段，或恰好在將所述細菌引入植物或植物種子之前，由細菌生產該片段。
本發明的方法可以用來處理種類繁多的植物及其種子，以賦予抗病性、增強生長和/或防治蟲害。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植物。更具體地講，有用的作物可以包括亞麻、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、捲心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風、蕪菁、花椰菜、硬花莖花椰菜、蕪菁、蘿蔔、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿蔔、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、菸草、番茄、高粱和甘蔗。合適的觀賞植物的實例是擬南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、矮牽牛、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
關於本發明過敏反應引發劑蛋白或多肽片段在賦予抗病性方面的用途，可能不賦予對感染的絕對免疫，但降低病害的嚴重程度和延遲症狀的發生。侵蝕斑數、侵蝕斑的大小和真菌病原體孢子形成的程度均降低和減小。賦予抗病性的該方法具有治療先前無法治療的病害、治療由於成本可能沒有治療的系統性病害以及避免使用傳染物或環境有害材料的潛力。
按照本發明的賦予植物的病原體抗性的方法，可用來賦予對種類繁多的病原體的抗性，所述病原體包括病毒、細菌和真菌。通過本發明的方法可以獲得特別是對以下病毒的抗性菸草花葉病毒和番茄花葉病毒。按照本發明可以賦予植物特別是對以下細菌的抗性茄假單胞菌、丁香假單胞菌菸草致病變種(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種。利用本發明方法可以使植物特別是抗以下真菌尖鐮孢(Fusarium oxysporum)和致病疫黴(Phytophthorainfestans)。
關於本發明過敏反應引發劑蛋白或多肽片段增強植物生長的用途，可以獲得各種形式的植物生長增強或促進。這可以在早至植物開始從種子生長或在植物生命較晚時發生。例如，按照本發明的植物生長包括產量更大、產生的種子量增加、萌發的種子百分率提高、植物大小增加、生物量增加、果實更多更大、果實著色更早以及果實和植物成熟更早。結果，本發明為栽培者提供顯著的經濟利益。例如萌發早和成熟早使得作物在短生長季節在其它情況下妨礙作物在該地生長的地區生長。產量更高、大小更大和生物量產量提高，使得由給定小區土地產生的歲入更多。
本發明的另一方面涉及實現任一形式的植物蟲害防治。例如，按照本發明的蟲害防治包括防止昆蟲接觸應用所述過敏反應引發劑的植物、防止昆蟲通過取食傷害植物、使昆蟲離開這類植物、殺死接近這類植物的昆蟲、幹擾昆蟲幼蟲在這類植物上取食、防止昆蟲在宿主植物上定殖、防止定殖昆蟲釋放毒植物素等。本發明也防止由昆蟲感染產生的對植物的後續病害。
本發明對種類繁多的昆蟲有效。歐洲玉米螟是玉米(馬齒種甜玉米(dent and sweet corn))的主要害蟲，但也在包括綠菜豆(green bean)、黃莢種菜豆和利馬豆以及食用大豆、胡椒、馬鈴薯和番茄以及許多雜草物種在內的超過200種植物物種上取食。損害種類繁多的蔬菜作物的其它的昆蟲幼蟲取食害蟲包括以下甜菜夜蛾、粉紋夜蛾、玉米穗蛾、秋粘蟲、小菜蛾、甘藍根花蠅(cabbage root maggot)、蔥蠅、瓜種蠅、瓜野螟(甜瓜絹野螟)、胡椒實蠅、番茄蠹蛾和蛆。總起來說，該組害蟲代表一組世界範圍內在經濟上最重要的蔬菜生產的害蟲。
當處理植物全部或一部分，包括處理葉、莖、根等時，可以通過多種方法，進行涉及應用過敏反應引發劑多肽或蛋白片段的本發明方法，其中所述片段引發過敏反應。這可以(但不必)包括使該過敏反應引發劑多肽或蛋白浸潤入該植物。合適的應用方法包括高壓或低壓噴灑、注射和接近施用引發劑時擦傷葉片。當按照本發明應用實施方案處理植物種子和繁殖體(例如插條)時，可以通過低壓和高壓噴灑、塗布、浸漬或注射，施用按照本發明的過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段。本領域技術人員可以設想其它合適的施用方法，只要它們能夠實現該片段與該植物或植物種子的細胞接觸即可。一旦用本發明的過敏反應引發劑片段處理，則可以將種子種植於天然或人工土壤中，採用常規方法栽培以產生植物。從按照本發明處理的種子繁殖出植物後，所述植物可以施用所述過敏反應引發劑蛋白或多肽片段或完整的引發劑處理一次或多次，以賦予植物抗病性、增強植物生長和/或防治該植物的蟲害。
按照本發明的過敏反應引發劑多肽或蛋白的片段可以單獨或與其它材料混合，施用於植物或植物種子上。或者，可以在不同時間分別施用該片段和其它材料。
適用於按照本發明的應用實施方案處理植物或植物種子的組合物，在載體中含有過敏反應引發劑多肽或蛋白引發過敏反應的片段。合適的載體包括水、水溶液、漿液或乾粉。在該實施方案中，該組合物含有高於500nM的該片段。
儘管不需要，但該組合物可以含有其它的添加劑，包括肥料、殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑和它們的混合物。合適的肥料包括(NH4)2NO3。合適的殺蟲劑的實例是馬拉硫磷。有用的殺真菌劑是克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩衝劑、潤溼劑、包被劑(coating agent)和摩擦劑。這些材料可以用來促進本發明方法。另外，過敏反應引發片段可以與其它常規種子製劑和處理材料(包括粘土和多糖)施用於植物種子。
在本發明涉及使用轉基因植物和轉基因種子的替代實施方案中，過敏反應引發片段不必局部施用於植物或種子。而是，按照本領域熟知的方法，產生用編碼這種片段的DNA分子轉化的轉基因植物。
可以利用微量吸管，將上述載體直接微注射入植物細胞中，以機械轉移該重組DNA。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202179-85(1985)，該文獻通過引用結合到本文中。也可以用聚乙二醇將該遺傳物質轉移到植物細胞中。Krens等，Nature，29672-74(1982)，該文獻通過引用結合到本文中。
用賦予對病原體抗性的基因轉化植物細胞的另一種方法是粒子轟擊(也稱為生物彈道轉化)宿主細胞。這可以以幾種方式之一完成。第一種方法涉及將惰性或生物活性粒子發射到細胞。該技術在Sanford等的美國專利第4,945,050、5,036,006和5,100,792號中有描述，這些專利通過引用結合到本文中。一般而言，該方法包括在有效刺入細胞外表面並被引入細胞內部的條件下，將惰性或生物活性粒子發射到所述細胞。當利用惰性粒子時，可以通過用含該異源DNA的載體包被所述粒子，將該載體引入細胞。或者，可以用該載體包圍靶細胞，使得該載體跟隨所述粒子而被攜帶入細胞。也可以將生物活性粒子(例如含有該載體和異源DNA的乾燥的細菌細胞)發射入植物細胞。
再一引入方法是原生質體與其它實體融合，所述其它實體或者為小細胞、細胞、溶酶體，或者為其它可融合的脂質表面的物體。Fraley等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.791859-63(1982)，該文獻通過引用結合到本文中。
也可以將該DNA分子通過電穿孔引入植物細胞中。Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824(1985)，該文獻通過引用結合到本文中。在該技術中，在含所述表達盒的質粒存在下，將植物原生質體電穿孔。高場強的電脈衝使生物膜可逆地通透，允許引入所述質粒。電穿孔的植物原生質體重新形成細胞壁，分裂並再生。
將該DNA分子引入植物細胞的另一種方法是用預先用該基因轉化的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農桿菌(A.rhizogenes)感染植物細胞。在本領域已知的合適條件下，培養轉化的植物細胞，以形成苗或根，並進一步發育為植物。一般而言，該方法涉及用細菌懸浮液接種植物組織，並在無抗生素的再生培養基上，於25-28℃培養該組織48-72小時。
農桿菌是革蘭氏陰性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的一個代表屬。該屬的物種引起根瘤病(根癌農桿菌)和毛根病(毛根農桿菌)。根瘤和毛根中的植物細胞被誘導產生稱為冠癭鹼的胺基酸衍生物，它們僅被細菌分解代謝。負責表達冠癭鹼的細菌基因是嵌合表達盒控制元件的便利的來源。另外，對冠癭鹼存在的分析，可以用來鑑定轉化的組織。
可以利用根癌農桿菌的Ti質粒或毛根農桿菌的Ri質粒，將異源基因序列引入合適的植物細胞中。農桿菌感染時，將Ti質粒或Ri質粒轉送植物細胞，並且穩定地整合入植物基因組中。J.Schell，Science.2371176-83(1987)，該文獻通過引用結合到本文中。
轉化後，必須再生轉化的植物細胞。
在Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures.第1卷(MacMillanPubilishing Co.，New York，1983)；和Vasil I.R.(編輯)，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，Acad.Press，Orlando，第I卷，1984和第III卷(1986)中描述了由培養的原生質體再生植株，所述文獻通過引用結合到本文中。
已知實際上可以由培養的細胞或組織再生所有的植物，包括但不限於甘蔗、糖甜菜、棉花、果樹和豆科植物的所有主要物種。
再生方法隨植物物種而變，但一般首先提供轉化的原生質體的懸浮液或含轉化的外植體的培養皿。形成愈傷組織，並可以由愈傷組織誘導苗，隨後生根。或者，可以在愈傷組織中誘導胚形成。這些胚作物天然的胚開始發育形成植株。培養基一般含有各種胺基酸和激素，諸如生長素和細胞分裂素。也最好將穀氨酸和脯氨酸加入培養基中，尤其對於玉米和亞麻的這類物種。有效的再生將取決於培養基、基因型、培養的歷史。如果控制這三種變量，則再生一般可重現和可重複。
在表達盒穩定引入轉基因植物後，可以通過有性雜交將其轉移至其它植物。許多標準育種技術的任一種均可以使用，這取決於待雜交的物種。
一旦產生了該類型的轉基因植物，則按照常規方法培育所述植物本身，編碼該過敏反應引發片段的基因的存在導致抗病性、增強植物生長和/或防治植物蟲害。或者從轉基因植物回收轉基因種子或繁殖體(例如插條)。然後可以將種子種植於土壤中，並用常規方法栽培，以產生轉基因植物。在有效賦予植物抗病性、增強植物生長和/或防治蟲害的條件下，由種植的轉基因種子繁殖轉基因植物。儘管不希望被理論束縛，但這種抗病性、生長的增強和/或蟲害的防治可能是RNA介導的，或可能由於表達所述多肽或蛋白片段而產生。
當按照本發明使用轉基因植物和植物種子時，它們還可以用處理施用過敏反應引發片段的植物和種子所用的相同材料進行處理。這些其它材料包括過敏反應引發片段，可以通過上述方法施用於轉基因植物和植物種子，所述方法包括高壓或低壓噴灑、注射、塗布和浸漬。同樣，在由轉基因植物種子繁殖植物後，所述植物可以用過敏反應引發片段處理一次或多次，以賦予抗病性、增強生長和/或防治蟲害。這類植物也可以用常規植物處理劑(例如殺蟲劑、肥料等)處
<
實施例2-分子生物學技術採用幾種方法獲得兩種解澱粉歐文氏菌harpin的截短的或者改變的形式。這些技術包括(i)用標準技術(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，編輯Cold Spring Harbor，Labotatory Cold Spring，Harbor，NY(1989)，該文獻通過引用結合到本文中)，將含有編碼解澱粉歐文氏菌過敏反應引發劑蛋白或多肽的基因(即hrpN)的部分的限制性片段，亞克隆入表達載體中；(ii)將Ω片段(Fellay，R.等，「土壤細菌和水生細菌的插入子(interposon)誘變，設計用於革蘭氏陰性細菌體外插入誘變的一個DNA片段家族」Gene 52147-154(1987)，該文獻通過引用結合到本文中)插入hrpN中；(iii)定點誘變方法(Innis等，PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press San Diego，CA(1990)；Kunkel等，「不用選擇表型的快速有效的定點誘變」Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82488-492(1985)，該文獻通過引用結合到本文中)；和(iv)產生嵌套缺失(Erase-a-BaseTM試劑盒；Promega，Madison，WI)。因為在pCPP1084中對限制性酶切位點進行了定位，所以可以不進行pCPP1084中的解澱粉歐文氏菌的過敏反應引發劑蛋白或多肽(即harpinEa)的C端缺失分析。對於N端缺失，用Qiagen小量製備柱(Qiagen，Chatsworth，CA)製備pCPP1084 DNA，並用sstI消化，然後用EcoRI消化。隨後，將消化的DNA經過外切核酸酶III消化，連接並轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。通過瓊脂糖凝膠電泳估計缺失的大小。參考缺失的harpin的部分，將harpin片段命名(例如harpinEaC82缺失全長harpinEa的C端82個胺基酸殘基)。實施例3-蛋白表達為了由T7啟動子進行表達，施用依賴於T7 RNA聚合酶的系統。這些系統不是利用菌株大腸桿菌BL21(DE3)(Studier等，「用噬菌體T7 RNA聚合酶指導所克隆基因的選擇性高水平的表達」J.Mol.Biol.，189113-130(1986)，該文獻通過引用結合到本文中)，就是利用大腸桿菌DH5α中的質粒pGP1-2(Tabor，S.等，「用於受控的僅表達特定基因的噬菌體T7 DNA聚合酶/啟動子系統」Proc.Natl.Acad.Sci.，USA821074-1078(1985)，該文獻通過引用結合到本文中)。通過加入終濃度為0.4mM的IPTG，誘導由T7啟動子表達hrpN。對於在解澱粉歐文氏菌Ea321(即harpinEa)或Ea273中的表達，通過42℃熱休克10分鐘轉化，或通過電穿孔(Biorad Gene PulserTM)，引入pGP1-2。在菸草Xanthi栽培品種葉片中，通過植物內裂解(He等，「丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinPss一種通過Hrp途徑分泌且在植物中引發過敏反應的蛋白」Cell 731255-1266(1993)該文獻通過引用結合到本文中)，或通過製備煮沸或未煮沸的「CFEP」(Wei等，「harpin-由植物病原體解澱粉歐文氏菌產生的過敏反應的引發劑」Science 25785-88(1992)該文獻通過引用結合到本文中)，篩選過敏反應(即HR)引發活性。實施例4-harpin的體外蛋白水解按照建議(Scopes等，Protein PurificationPrinciples and Practice，第二版，Springer-Verlag.New York(1987)，該文獻通過引用結合到本文中)，於20-37°下，用葡萄球菌屬V8蛋白酶(也稱為內切蛋白酶Glu-C)、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶在體外將harpinEa蛋白水解16小時。或者在50mM碳酸氫銨pH7.8(其中僅在穀氨酸後發生切割)中，或者在50mM磷酸鉀pH7.8(其中在穀氨酸和天冬氨酸後發生切割)中，進行內切蛋白酶Glu-C的消化。實施例5-植物來源的蛋白酶如所描述的(Hammond-Kosack等，「細胞間液的製備和分析」第15-21頁，載於S.J.Gurr，M.J.McPherson和D.J.Bowles(編輯)，Molecular Plant Pathology A Practical Approach，第二版，The PracticalApproach Series，IRL Publishers，Oxford(1992)，該文獻通過引用結合到本文中)，通過用高純度水真空浸潤胞間隙，由菸草、番茄、蘋果、樹莓和栒子屬植物獲得細胞間液。於20-37℃、pH，通過將等體積IF與harpinEa混合，進行PAGE純化的harpinEa的蛋白水解消化。通過用研缽和研棒在5mM磷酸鉀中研磨菸草葉片(leaf panel)，獲得總葉片提取物。將該提取物離心並過濾，如使用IF一樣，使用澄清的研磨葉片提取物。如下使用蛋白酶抑制劑胃酶抑制劑A(終濃度為1μM)、E-64(1μM)、抑酶肽(2μg/ml)、鄰二氮雜菲(1mM)和對苯甲酸汞(PCMB)(Sigma，St.Louis，MO)。實施例6-肽的純化通過在Vydac C18柱上進行反相HPLC，採用0.1％三氟乙酸中的2-60％乙腈梯度，分級分離用菸草IF消化後獲得的harpin的肽片段。將分級部分凍幹，重新懸浮於5mM磷酸鉀中，並浸潤入菸草葉片中。如上所述，用35-70％的乙腈梯度，重新分級分離具有最大HR引發活性的分級部分，並通過氣相層析-質譜(GC-MS)和通過在ComellBiotechnology Program Core Facility上對N端蛋白測定，分析每個分級部分的純度。實施例7-蛋白酶活性染色的凝膠在活性染色的與0.1％明膠共聚的聚丙烯醯胺凝膠(Laemmli，「在噬菌體T4頭部裝配期間結構蛋白的切割，」Nature 227680-685(1970)，該文獻通過引用結合到本文中)中分析IF的蛋白酶活性(Heussen等，「在含有十二烷基硫酸鈉和共聚基質的聚丙烯醯胺凝膠中電泳分析血纖溶酶原激活物，」Anal.Biochem.102196-202(1980)，該文獻通過引用結合到本文中)。電泳後，徹底衝洗每個凝膠，以除去SDS，並允許蛋白酶在凝膠中重新摺疊。在另外的溫育以允許發生蛋白水解後，用30％甲醇成/10％乙酸中的0.1％氨基黑將凝膠染色。每個凝膠均染成黑色(由於存在共聚明膠)，蛋白酶已經消化明膠的情況除外，導致代表蛋白酶活性位點的無色條帶。實施例8-截短的harpin保留HR引發活性
圖1顯示由各種DNA構成物編碼的蛋白的穩定性和HR引發活性。編碼harpinEa或harpinEar的部分的許多DNA構成物，在T7啟動子-聚合酶系統(Tabor等，「用於受控的僅表達特定基因的噬菌體T7DNA聚合酶/啟動子系統」Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 821074-1078(1985)，該文獻通過引用結合到本文中)中誘導表達並通過PAGE分析細胞提取物後，可能由於所編碼蛋白的不穩定性，不產生可檢測的蛋白產物。DNA構成物(例如通過Erase-a BaseTM方案獲得的那些構成物)不產生可檢測的顯示相對於全長蛋白為N端缺失的蛋白產物。沒有鑑定出穩定而無活性的蛋白。編碼於C端截短的蛋白、且通常包括另外的載體編碼的胺基酸的幾種構成物產生可檢測的產物(例如harpinEaC82)。相反，編碼harpinEa的相同321個N端胺基酸殘基、但由於存在Ω片段而產生截短的蛋白(harpinEaC82Ω)的構成物是不穩定的(即沒有檢測到產物)。編碼具有大的內部缺失的harpinEa片段(harpinEaI175)的構成物也成功地用於表達蛋白。測試這些不同的截短的蛋白的HR引發活性。98個殘基的N端harpinEa片段(harpinEaC305)是表現出HR引發活性的最小的細菌產生的肽。實施例9-具有改變的C端的harpinEa的分泌檢查harpin C端的改變對其分泌的影響。harpin C31含有harpinN端的372個胺基酸，但缺失C端的31個殘基，這些殘基被該載體編碼的47個殘基取代，產生略大於野生型harpinEa的蛋白。C31蛋白保留HR引發活性，且是穩定的，並且容易表達和通過蛋白質分析或PAGE檢測出，但它不再如野生型蛋白一樣，分泌到培養上清液中(圖2)。harpinEaC31的存在不幹擾野生型harpin的分泌，在CFEP和培養上清液中均發現野生型harpin。然而，harpinEaC31僅在CFEP中發現。實施例10-蛋白水解對harpinEa的HR引發活性的影響為了產生另外的harpinEa片段，用包括內切蛋白酶Glu-C、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶在內的幾種蛋白酶，在體外蛋白水解純化的全長蛋白(例如圖3和圖4)。用胰蛋白酶或用木瓜蛋白酶消化的harpin溶液損失了所有活性。相反，在用內切蛋白酶Glu-C消化後，保留了HR引發活性。用胰蛋白酶消化後通過PAGE檢測，沒有明顯的大於6kD的肽。內切蛋白酶Glu-C消化，產生一種約20kD的片段，大於如果切割所有酶切位點所預期的大小，表明消化不完全(圖4)。實施例11-質外體液(apoplastic fluid)(IF)含有harpin降解蛋白水解活性來自菸草和其它植物的質外體液(細胞間液；IF)也用來蛋白水解harpin。在含共聚明膠的聚丙烯醯胺凝膠中存在多個活性染色條帶(圖5A至5C)，以及在用IF過夜消化純化的harpinEa後，可檢測harpinEa消失(Schagger等，「用於分離1-100kDa蛋白的Tricine-十二烷基硫酸鈉凝膠電泳，「Anal.Biochem.166368-379(1987)，該文獻通過引用結合到本文中)，表明每種測試的IF均具有蛋白酶活性。蛋白酶活性於30℃下基本上高於20℃下的活性，該活性於pH8.5下高於pH7下的活性。使用幾種抑制劑，以限定IF的蛋白水解活性。使用的單一的蛋白酶沒有防止harpinEa的降解。然而，分別針對酸性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的抑制劑胃酶抑制劑A(1μM)、E-64(1μM)、抑酶肽(2μg/ml)和鄰二氮雜菲(1mM)的混合物，部分抑制蛋白水解。
由於植物質外體中存在的蛋白水解活性而降解的harpinEa保留HR引發活性(圖3)。相反，通過用研缽和研棒研磨菸草葉產生的澄清提取物蛋白水解的harpinEa，損失HR引發活性。為了研究harpin的質外體降解是否是其HR引發活性的必要條件，比較將或者完整的harpin或者用菸草IF預降解的harpin浸潤入菸草葉片所需的時間長度。兩種製備物均在相似的時間範圍(12-18小時，取決於實驗)內引發HR。實施例12-HR引發肽片段的特徵鑑定通過反相HPLC(Vydac C18柱)將用質外體植物蛋白酶消化產生的肽分級分離，並測試其活性。用菸草IF處理完整的harpinEa後，三個分離部分含有對菸草的一些HR引發活性。三種中的兩種的活性弱，幾乎不存在蛋白。沒有將它們進一步特徵鑑定。含有最強活性以及最多蛋白的分級部分19，用更窄的洗脫梯度重新分級分離(圖6)。重新分級分離、N端蛋白測序和通過質譜分析分子量，表明存在四種大範圍重疊的肽。峰19-1含有肽P91和P95，對應於harpinEa殘基110-200和110-204；峰19-2含有肽P64和P68，對應於harpinEa殘基137-200和137-204。19-1和19-2每種均具有HR引發活性。由此證實保留活性的最小的肽由殘基137-204組成。每個峰中的兩種肽在所用的條件下無法有分離。這些活性片段不同於最小的活性N端片段(harpinEaC305)，表明在植物中harpinEa的一個以上的部分表現出活性。用胰蛋白酶進一步消化，去除了19-2的HR引發活性。該蛋白酶切割圖7所示的P64和P68。在碳酸氫銨緩衝液中用內切蛋白酶Glu-C進一步消化，消除了19-1的HR引發活性。預測內切蛋白酶Glu-C切割圖7所示的P91和P95。在用內切蛋白酶Glu-C或胰蛋白酶進一步消化這些肽後，喪失了引發劑活性。實施例13-解澱粉歐文氏菌的harpin與其它蛋白的相似性將來自幾種其它細菌性植物病原體的蛋白性HR引發劑和已知或被認為通過III型分泌途徑分泌的其它蛋白的預測蛋白質序列，與harpinEa的蛋白序列進行比較。當將harpinEa與解澱粉歐文氏菌Ea246(即harpinEar)、菊歐文氏菌EC16(harpinEch)(Bauer等，「菊歐文氏菌的harpinEch一種引起軟腐病發病的過敏反應的引發劑，」Mol.Plant-Microbe Interact 8484-491(1995)，該文獻通過引用結合到本文中)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌胡蘿蔔軟腐亞種(harpinEcc)(Mukherjee等，於第8屆國際分子植物-微生物相互作用大會上提出，Knoxville，TN(1996)，該文獻通過引用結合到本文中)、斯氏歐文氏菌(harpinEs)(Frederick等，「斯氏歐文氏菌的wts吸溼(Water-Soaking)基因與hrp基因相關」於第7屆國際分子植物-微生物相互作用研討會上提出，Edinburgh，Scotland(1994)，該文獻通過引用結合到本文中)、Ralstonia solanacearum(茄假單胞菌)(PopA)(「PopA1-一種對特定矮牽牛基因型誘導過敏樣反應的蛋白，是通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌的」EMBO J.13543-553(1994)，該文獻通過引用結合到本文中)、丁香假單胞菌61(harpinPss)(He等，「丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinPss一種通過Hrp途徑分泌且在植物中引發過敏反應的蛋白」Cell 731255-1266(1993)該文獻通過引用結合到本文中)、丁香假單胞菌番茄致病變種(harpinPst)(Preston等，「丁香假單胞菌丁香、大豆和番茄致病變種的hrpZ蛋白是由含耶爾森氏菌數ysc同系物的操縱子編碼，並在番茄而不是大豆中引發過敏反應，」Mol.Plant-Microbe Interact 8717-732(1995)，該文獻通過引用結合到本文中)的引發劑比較時，得自歐文氏菌屬的harpin在C端含有許多相似性區。另外，所有引發劑均富含甘氨酸，為分泌的和熱穩定的。先前已經報導了harpinPss和harpinEa之間有限的相似性(He等，「丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinPss一種通過Hrp途徑分泌且在植物中引發過敏反應的蛋白」Cell 731255-1266(1993)該文獻通過引用結合到本文中)、(Laby等，於第7屆國際分子植物-微生物相互作用研討會上提出，Edinburgh，Scotland(1994)，該文獻通過引用結合到本文中)。harpinEa和來自歐文氏菌屬菌種(Erwinia spp.)的其它harpin之間在每種蛋白的極N端明顯有一個有限的相似性區，其中在前26個殘基中的9個是保守的(圖8)。圖9描述了由不同歐文氏菌屬菌種產生的每種harpin的Kyte-Doolittle親水性圖。所檢查的每種歐文氏菌屬harpin均顯示出通常相似的沿全長該蛋白的疏水性分布圖。該分布圖不同於用PopA1和harpinPss證明的分布圖，不具有在那兩種蛋白的分布圖中明顯的對稱性。每種歐文氏菌屬harpin的親和性分布圖一般相互相似，但不同於報導的harpinPss的分布圖(Alfano等，「用功能性非極性harZ缺失突變、截短的hrpZ片段和hrmA突變，分析丁香假單胞菌HrpZ harpin在引發菸草過敏反應中的作用」Mol.Microbiol.19715-728(1996)，該文獻通過引用結合到本文中)。harpinEcc在殘基54-143周圍具有顯著的疏水區(Mukherjee等，於第8屆國際分子植物-微生物相互作用大會上提出，Knoxville，TN(1996)，該文獻通過引用結合到本文中)。該蛋白的該部分也是harpinEa和harpinEs最具疏水性的區域。每種蛋白的其餘部分主要是親水的。
全長蛋白蛋白水解消化後獲得的harpin的截短蛋白和片段顯示出harpinEaHR引發活性的幾個意料之外的方面。這些harpin片段證明，HR引發活性殘基位於該蛋白的不同區內，並且該蛋白的小至68個殘基和可能更小的相對小的片段對於該活性是足夠的。得自其它植物病原體的引發劑蛋白片段也保留生物活性，包括Caldosporium fulvum的Avr9(Van den Ackervecken等，「用內源植物蛋白酶加工Caldosporiumfulvum的AVR9品種特異性引發劑」Pl.Physiol.10391-96(1993)，該文獻通過引用結合到本文中)、大雄疫黴的Pep-13(Nurnburger等，「真菌寡肽引發劑與歐芹質膜的高親和性結合觸發多種防禦反應」Cell，78449-460(1990)，該文獻通過引用結合到本文中)和丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinPss(Alfano等，「用功能性非極性harZ缺失突變、截短的HrpZ片段和hrmA突變，分析丁香假單胞菌HrpZ harpin在引發菸草過敏反應中的作用」Mol.Microbiol.19715-728(1996)，該文獻通過引用結合到本文中)。
截短的harpin片段的表達和全長harpin的蛋白水解，表明這兩種不同的片段保留HR引發活性。每種活性片段的一級結構顯示出相互沒有可辨別的相似性，或與其它引發劑活性肽沒有可辨別的相似性。然而，胰蛋白酶和內切蛋白酶Glu-C的酶切位點提示活性需要每種片段的部分。可能感興趣的是特異性地改變酶切位點或其附近的胺基酸殘基，以確定HR引發活性是改變還是喪失。另外，harpinEaP64和P68在反相HPLC期間表現出不同的疏水性(圖6)，它們對應於Kyte-Doolittle圖中的一個疏水峰(圖9)。可以通過誘變或通過合成改變的肽，測試該推定的疏水域的作用。然而，多種片段獨立地具有HR引發活性的事實，使全長蛋白的分析變複雜。
該蛋白的片段保留HR引發活性的這一發現，也使得確定了(至少)兩種質外體蛋白酶活性，這些蛋白酶不同於胞間的植物蛋白酶。已經在一些細節上研究了兩種質外體植物蛋白酶(來自大豆)。一種對EDTA敏感的金屬蛋白酶SMEP(Huangpu等，「來自大豆嫩葉的胞外蛋白酶的純化和發育分析」Plant Physiol 108969-974(1995)；McGeeham等，「大豆葉金屬蛋白酶的測序和特徵鑑定」Plant Phvsiol.991179-1183(1992)，這些文獻通過引用結合到本文中)，被認為於G/L和G/I進行切割。有趣的是，儘管在完整的harpinEa中有19個潛在的SMEP酶切位點，但其中僅有一個位於片段P91和P95中，在片段P64和P68內中沒有一個酶切位點(圖7)。因此，P91和P95可以代表菸草質外體中的SMEP樣蛋白酶的部分消化產物。其他人研究了大豆質外體蛋白酶SLAP，這是一種對對氯苯甲酸汞(pCMB)敏感的巰基蛋白酶(Huangpu等，「來自大豆嫩葉的胞外蛋白酶的純化和發育分析」Plant Physiol108969-974(1995)，該文獻通過引用結合到本文中)。幾方面的證據提示，在所述IF中的多種蛋白水解活性降解harpinEa。一種絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF減少harpinEa的降解，但不完全阻斷harpinEa的降解(圖5C)；所測試的單個蛋白酶均不阻斷harpin的降解，殘基109、136、200和204後的酶切位點是不同的。內切蛋白酶Glu-C不消除全長harpin的活性，但確實消除P91和P95的活性(推定消除P64和P68的活性)；胰蛋白酶消除P64和P68的活性(推定消除P91和P95的活性)。這些最終的消化物提示每種不同的HR引發肽推定對其活性必需的具體部分，如前所述。
與研磨的葉提取物中存在的消除活性的胞內蛋白水解活性相反，質外體活性降解harpin，但不破壞其HR引發活性。這產生許多吸引人的問題，例如植物使用harpin片段作為引發劑信號嗎？當將用全長harpin和菸草細胞間液預消化的harpin浸潤入菸草葉時，檢查HR的定時。由每種製備物引發的HR在浸潤後12-18小時發生。將蛋白酶抑制劑與harpin共同浸潤入菸草葉片中，對harpin的HR引發活性也沒有作用，儘管在這種情況下不能消除有限的蛋白水解降解，特別是因為看來至少兩種，可能多種質外體蛋白酶存在於菸草中。因為預消化的harpin引發的HR不比未消化的蛋白快，所以蛋白水解降解看來不可能是發生HR所需的限速步驟。這些能夠部分水解harpin、而不能消除harpin對菸草的HR引發活性的質外體蛋白酶的作用尚不清楚。Salzer等，「雲杉屬植物細胞對從外生菌根真菌(Hebelomacrustuliniforme)釋放的引發劑快速反應以及雲杉屬植物細胞的胞外酶使這些引發劑失活」Planta 198118-126(1996)(該文獻通過引用結合到本文中)已經注意到雲杉(Picea abies(L.)Karst.)通過使質外體中的這些由外生菌根真菌Hebeloma crustuliniforme釋放的真菌細胞壁引發劑失活，而調節所述引發劑的水平。他們提出，作為雲杉屬(Picea)與真菌共生相互作用的一部分，雲杉屬控制該引發劑的水平。同樣，已經表明菜豆(Phaseolus vulgaris)的PGIP在調節菜豆中植物-寄生物相互作用期間存在的具引發劑活性的寡聚半乳糖醛酸酐(galacturonide)的水平(Desiderio等，「細胞-細胞通信中的聚半乳糖醛酸酶PGIP和寡聚半乳糖醛酸酐」Biochem.Sci.Trans.22394-397(1994)，該文獻通過引用結合到本文中)。也許harpin片段保留HR引發活性是植物識別病原體存在能力的主要原因。在該方面，可能感興趣的是探索與非工程改造的植物相比，為質外體表達harpin活性降解蛋白酶而工程改造的轉基因宿主和非宿主植物是否可以表現出對解澱粉歐文氏菌表達出降低或提高的敏感性。
儘管進行了許多嘗試，但從hrpN僅成功地表達了harpinEa和harpinEa的少數截短的衍生物。關於蛋白穩定性的問題是明顯的，因為幾種截短的harpin不穩定，並且難以純化。另外，截短的harpin的表達可以對細菌有害。然而，截短的harpinEaC31是穩定的且容易純化，但不分泌，暗示C端序列參與harpin的分泌。不幸的是，在該蛋白中存在載體編碼的胺基酸使該結論複雜化。克隆β-半乳糖苷酶-harpin融合蛋白的所有嘗試均未成功，在諸如pBluescript的幾種常用的質粒中克隆和表達lacZ啟動子下遊的hrpN也未成功。這類構成物的表達顯然對細菌菌株有害。
Wei等，「harpin-由植物病原體解澱粉歐文氏菌產生的過敏反應的引發劑」Science 25785-88(1992)(該文獻通過引用結合到本文中)先前報導了，BLAST檢索標明，harpinEa與包括角蛋白在內的幾種其它富含甘氨酸的蛋白以及富含甘氨酸的細胞壁蛋白具有略微相似性。然而，這被認為是由於harpinEa的高甘氨酸含量引起的，就這一點而論，沒有提示harpinEa的作用。對來自幾種致植物病細菌產生的HR引發蛋白的N端的檢查(圖8)產生了以下潛在的相似性。然而，所述區域相當短。推導的一級序列相似性的區域限於N端前26個殘基，其作用尚不清楚。令人驚奇的是，胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的harpinEcc看來與來自解澱粉歐文氏菌和斯氏歐文氏菌的harpin比與來自菊歐文氏菌的harpin更相似，在其分類位置以及其發病機制(即軟腐病)方面與菊歐文氏菌更相關。另外，儘管一級序列的相似性僅在每種蛋白C端三分之一中是最強的，但歐文氏菌屬的harpin沿其整個長度具有廣泛的相似的疏水性分布圖(圖9)。根據其疏水性分布圖，Alfano等，「用功能性非極性harZ缺失突變、截短的hrpZ片段和hrmA突變，分析丁香假單胞菌HrpZ harpin在引發菸草過敏反應中的影響」Mol.Microbiol.19715-728(1996)(該文獻通過引用結合到本文中)推測，harpinPss可能具有兩性性質。然而，歐文氏菌屬的harpin的分布圖不匹配harpinPss的分布圖。
最近，已經描述了來自其它植物致病細菌和真菌的許多其它分泌的富含甘氨酸的致病性相關蛋白、HR或其它植物防禦反應的引發劑(Boller，「植物細胞中的微生物信號的化學感覺(chemoperception)」Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.46189-214(1996)，該文獻通過引用結合到本文中)，所述其它植物致病細菌和真菌包括大雄疫黴(Ballieul等，「菸草中的一種新的過敏反應引發劑一種真菌糖蛋白引發細胞死亡、表達防禦基因，產生水楊酸並誘導系統獲得性抗性」Plant Journal 8551-560(1995)；Nurnburger等，「真菌寡肽引發劑與歐芹質膜的高親和性結合觸發多種防禦反應」Cell.78449-460(1994)，所述文獻通過引用結合到本文中)和Magnaporthe grisea(Sweigard等，「在稻瘟病真菌中宿主菌種特異性的基因-PWL2的鑑定、克隆和特徵鑑定，」Platn Cell 71221-1223(1995)，該文獻通過引用結合到本文中)。已經描述了來自Phynchosporium secalis的蛋白性HR引發劑(Rohe等，「來自大麥病原體Phynchosporium secalis的品種特異性引發劑NIP1決定對Rrs1抗性基因型宿主植物的無毒性，」EMBO Journal144168-4177(1995)，該文獻通過引用結合到本文中)，而致病疫黴(Pieterse等，「致病疫黴的ipiB和ipiO基因簇的結果和基因組組織，」Gene，13867-77(1994)，該文獻通過引用結合到本文中)產生功能未知的富含甘氨酸的致病性相關蛋白家族。因為每種引發劑蛋白或肽片段的一級胺基酸序列相互之間沒有表現出明顯的相似性，所以不清楚它們是否與植物細胞、質膜或靶細胞上或其中的相同靶相互作用。在該方面，可能感興趣的是測試這些分子中的任一種是否抑制其它分子的作用。諸如Pep13、Avr9、P68和harpinEaC305的具有植物防禦反應引發活性(HR和其它)的肽的增加的可得性，使得可以精確地探測它們在植物細胞上或植物細胞中的靶，以及可以確定它們的活性機制是否相似、不同或重疊。實施例14-細菌菌株和質粒用於以下實施例的大腸桿菌菌株包括分別購自Gibco BRL和Stratagen的DH5α和BL21(DE3)。pET28(b)載體購自Novagen。EcoDH5α/2139含有完整的hrpN基因。2139構成物由Cornell University的D.Bauer產生。通過用HindIII限制性酶消化，從2139質粒上切下hrpN基因，然後從瓊脂糖凝膠中純化，以用作PCR合成截短的hrpN克隆的DNA模板。這些克隆隨後插入含有用於選擇轉化子的Kanr基因的(His)6載體pET28(b)中。實施例15-DNA操作限制性酶得自Boehringer Mannheim或Gibco BRL。T4 DNA連接酶、牛小腸鹼性磷酸酶(CIAP)和PCR SupermixTM得自Gibco BRL。QIAprep Spin Miniprep試劑盒、Quagen Plasmid Mini試劑盒和QIAquick PCR純化試劑盒購自Qiagen。由Lofstrand Labs Limited(Gaithersbutg，MD)合成PCR引物。由Bio-Synthesis，Inc.(Lewisville，TX)合成寡肽。所有的DNA操作，諸如質粒分離、限制性酶消化、DNA連接和PCR，均按照標準技術(分子克隆)或生產商提供的方案進行。實施例16-hrpN基因的片段化通過PCR產生一系列N端和C端截短的hrpN基因片段和內部片段(
圖10)。全長的hrpN基因用作DNA模板，設計用於每個截短的克隆的3』和5』引物(
圖11)。3』引物包含於含有起始密碼子ATG(甲硫氨酸)的NdeI酶切位點中，而5』引物含有終止密碼子TAA和用於連接入pET28(b)載體中的一個HindIII酶切位點。在GeneAmpTM9600或9700中，在0.5ml試管中進行PCR。將45μl SupermixTM與每對DNA引物各20pmole、10ng全長harpin DNA和diH2O混合，終體積為50μl。將混合物於95℃加熱2分鐘後，進行30個循環的PCR，每個循環於94℃1分鐘、58℃1分鐘和於72℃1.5分鐘。在6％TBE凝膠(Novex)上證實PCR產物。用QIAquick PCR純化試劑盒純化擴增的DNA，用Nde I和Hind II於37℃消化5小時，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶25∶1)抽提一次，並用乙醇沉澱。5μg pET28(b)載體DNA用15單位的Nde I和20單位的Hind III於37℃消化3小時，然後用CIAP處理，以降低由不完全單一酶消化產生的背景。消化的載體DNA用QIAquick PCR純化試劑盒純化，直接用於連接。在含約200ng消化的pET28(b)、30ng靶PCR片段和1單位T4 DNA連接酶的15μl混合物中，於14-16℃下進行連接5-12小時。將5-7.5μl連接溶液加入15ml facon試管中的100μl DH5α感受態細胞中，並冰上溫育30分鐘。於42℃熱休克45秒後，將0.9ml SOC溶液或0.45ml LB培養基加入每個試管中，並於37℃溫育1小時。將20、100和200μl轉化細胞置於具有30μg/ml卡那黴素的LB瓊脂上，並於37℃溫育過夜。將單個菌落轉移至3ml LB培養基，並於37℃溫育過夜。用QIAprepMiniprep試劑盒由2ml培養物製備質粒DNA。通過限制性酶消化或部分測序，分析來自轉化細胞的DNA，以證實轉化的成功。用上述標準化學轉化法，將有所需DNA序列的質粒轉染入BL21中。產生在pet28(b)載體中包含全長harpin蛋白的克隆作為陽性對照，產生僅具有pET28(b)載體的克隆作為陰性對照。實施例17-harpin截短蛋白的表達使含hrpN克隆的大腸桿菌BL21(DE3)菌株於37℃在含30μg/ml卡那黴素的Luriar肉湯培養基(g/l Difco酵母提取物、10g/L Difco胰蛋白腖、5g/L NaCl和1mM NaOH)中生長過夜。然後將細菌接種到100倍體積的相同培養基中，並於37℃生長至OD620為0.6-0.8。然後將細菌接種到250倍體積的相同培養基中，於37℃生長至OD620為約0.3或0.6-0.8。加入1mM IPTG，並將培養物於19℃生長過夜(約18小時)。用該策略，不是所有的克隆均成功地表達。其中幾個克隆必須在Terrfic肉湯(12g/L Bacto胰蛋白腖、24g/L Bacto酵母、0.4％甘油、0.17M K2PO4和0.72 K2HPO4)中生長，和/或在IPTG誘導後於37℃生長，和/或生長不足過夜時間時(earlier than overnight)收穫(表2)。
表2harpin截短蛋白的表達
0.01M Tris--pH8.0)，於室溫下溫育10分鐘，再以14,000rpm離心10分鐘，保留上清液。將50μl等份的50％平衡的(His)6-結合鎳瓊脂糖樹脂的漿液加入上清液中，並於4℃混合1小時。然後用尿素洗滌緩衝液(8M尿素、0.1M Na2HPO4和0.01M Tris--pH6.3)洗滌鎳瓊脂糖3次，在洗滌之間以5,000rpm離心5分鐘。從該樹脂上用50μl尿素洗脫緩衝液(8M尿素、0.1M Na2HPO4、0.01M Tris和0.1MEDTA--pH6.3)洗脫該蛋白。根據所述截短蛋白的大小，流出液在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸預製凝膠上電泳，以證實表達。實施例19-在菸草中誘導HR將來自50ml培養用於小規模純化所述截短蛋白的培養物的1.5ml等份，以14,000rpm離心4分鐘，並重新懸浮於等體積的5mM磷酸鉀緩衝液pH6.8中。將細胞上清液超聲處理約30秒，然後用磷酸緩衝液以1∶2和1∶10稀釋。通過在單板葉片中製造一個洞，並用無針頭的注射器將細菌裂解液浸潤到葉胞間隙(intercellular leaf space)，將兩種稀釋液加純細胞裂解液浸潤到10-15片葉菸草植株的第4-9片葉中。記錄浸潤後24-48小時記錄HR反應。菸草(Nicotiana tabacum v.Xanthi)幼苗在環境室中於20-25℃下生長，光周期為12h光照/12h黑暗，RH約為40％。細胞裂解液用於原始HR分析(以便根據HR活性篩選所述截短的蛋白)，因為小規模尿素純化由於純化方法將蛋白變性，產生非常少的蛋白。實施例20-大規模天然純化harpin截短蛋白用於綜合生物活性分析將6個500ml hrpN克隆的培養物如前所述培養，以誘導所述截短蛋白的表達。收穫培養物時，將細胞以7,000rpm離心5分鐘，重新懸浮於咪唑裂解緩衝液(5mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Tris)加0.05％Triton X-100和0.1mg/ml溶菌酶中，於30℃溫育15分鐘，超聲處理2分鐘，然後再以15,000rpm離心20分鐘，並保留上清液。將4ml等份的50％平衡的(His)6-結合鎳瓊脂糖樹脂的漿液加入上清液中，並於4℃混合約4小時。然後用咪唑洗滌緩衝液(20mM咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)洗滌鎳瓊脂糖3次，在洗滌之間以5,000rpm離心5分鐘，然後置於一次性層析柱中。將該柱以1100prm離心1分鐘，以除去任何殘留的洗滌緩衝液，然後通過將該柱與4ml咪唑洗脫緩衝液(1M咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)於室溫下溫育10分鐘，然後將該柱以1100rpm離心1分鐘，將該蛋白從該樹脂上洗脫下來。根據截短的蛋白，流出液在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸預製凝膠上電泳，以證實表達。通過將該蛋白帶與Mark 12分子量標記中的標準蛋白進行比較，確定該蛋白的濃度。實施例21-大規模尿素純化harpin截短蛋白用於綜合生物活性分析該方法與大規模天然純化相同，只是使用尿素裂解緩衝液、洗滌緩衝液和洗脫緩衝液，並且不將細胞如天然純化中進行超聲處理。純化後，通過對濃度逐步降低的尿素透析8小時，然後對10mM Tris/20mM NaCl透析過夜，將蛋白復性。復性過程引起所述N端蛋白沉澱。通過加入100mM Tris-HCl pH10.4，然後將該蛋白於30℃加熱約1小時，將沉澱的1-168蛋白溶解。通過將該蛋白帶與Mark 12分子量標記中的標準蛋白進行比較，確定該蛋白的濃度。用該策略，1-75和-104蛋白片段沒有成功地溶解，因此將它們在100mM Tris-HCl pH10.4中超聲處理以儘可能溶解該蛋白，並暴露該蛋白的活性位點以用於生物活性分析。實施例22-harpin截短蛋白的表達進行所述片段蛋白的小規模表達和純化，以根據表達和HR活性進行篩選(表3)。
表3<
>所有克隆的片段蛋白均在一定程度上表達，三種小片段(胺基酸169-209、150-209、150-209和150-180)除外。所述片段以不同水平表達。片段210-403和267-403表達非常好，由小規模純化產生高濃度的蛋白，在SDS凝膠電泳上產生顯著的蛋白帶。其它片段(諸如胺基酸1-168和1-104)產生少得多的蛋白，電泳時產生弱蛋白帶。難以確定最小的C端蛋白片段343-403是否表達，因為除懷疑的343-403蛋白外，在凝膠上還出現幾種背景蛋白。也測試分別由全長harpin蛋白和僅背景蛋白組成的陽性對照蛋白和陰性對照蛋白的表達和HR活性。
進行所述片段蛋白的大規模表達和純化，以測定表達水平和HR活性的效價(表4)。
表4harpin截短蛋白的表達水平和HR效價(大規模純化)
由於時間限制，不是所有的所述蛋白均以大規模表達。選擇在harpin特徵鑑定中被認為是最重要的截短的蛋白。陽性對照(全長harpin)表達的水平相對高，為3.7mg/ml。所有的C端蛋白均以相對高水平表達，為2-5mg/ml，如前討論的片段343-403除外。N端片段也表達非常好，然而在純化過程期間，所述蛋白沉澱，很少重新溶解。表3中的濃度僅反映出溶解的蛋白。內部片段表達範圍為2-3.6mg/ml。極難測定片段105-168的濃度(推測該濃度比所顯示的高得多)，因為SDS凝較上的蛋白帶大，但染色差。陰性對照含有預期的幾種背景蛋白，但不含有顯著誘導的主蛋白。實施例23-菸草中HR的誘導低至僅5-7μg/ml的全長陽性對照蛋白誘發HR。陰性對照(pET28)咪唑純化「蛋白」僅含有背景蛋白，低至1∶2稀釋度的該蛋白誘導HR反應，這將降低了該測定的靈敏度，因為不能使用1∶1和1∶2稀釋度。這種假HR可能是由於用於純化過程中的咪唑結合一種或幾種背景蛋白的親和性，由此咪唑沒有完全透析出。約60mM濃度的咪唑不引發假HR反應。
一個確定的結構域包含該蛋白從胺基酸137-180(SEQ.ID.No.23)的一個小內部區，僅有44個胺基酸，被鑑定為最小的HR域。另一潛在的HR域被認為位於該蛋白的N端，從胺基酸1-104(可能是1-75)(SEQ.ID.No.23)。由於在純化這些片段蛋白中遇到的困難，難以證實或縮小N端HR域。所述N端片段蛋白必須用尿素純化，因為當使用天然純化方法時，沒有回收到蛋白。這樣，這些蛋白在復性期間沉澱，並難以或幾乎不可能恢復為溶液，由此使得難以使所述蛋白通過HR測定，因為僅可溶性蛋白能夠引發HR。縮小N端HR域的困難僅由以下事實構成陰性對照在低稀釋度水平下引發假HR，由此降低該測定的靈敏度。
如陽性對照一樣，內部域蛋白在5-10μg/ml蛋白下引發HR反應，而N端域蛋白在1-3μg/ml下引發HR反應，濃度低於陽性對照。
令人驚奇的是，當在胺基酸168和169之間切割所述內部HR域時(片段76-168和105-168)(SEQ.ID.No.23)，所述片段損失其HR活性。這提示片段1-168(SEQ.ID.No.23)的HR活性不應歸因於內部HR域，但應歸因於某些其它域，導致這樣一種假設在該蛋白的N端區中可能發現一個第二HR域。然而，如前所討論的，難以證實這種假設。
harpin C端(胺基酸210-403(SEQ.ID.No.23))不含有HR域。用目前HR測定，它不誘發可檢測水平的HR。甚至胺基酸169-403(SEQ.ID.No.23)的大C端片段也不誘發HR，即使它含有部分內部HR域。如上所述，該蛋白胺基酸168和169之間(SEQ.ID.No.23)引起HR活性的喪失。
因為具有61個胺基酸或更少胺基酸的某些小的克隆蛋白不表達，所以合成具有30個胺基酸的幾種寡肽，以縮小內部HR域的功能區。合成胺基酸121-179(SEQ.ID.No.23)範圍內的所述寡肽。然而，這些寡聚物不誘發HR反應。預期沒有由寡聚物137-166、121-150和137-156(SEQ.ID.No.23)產生HR反應，因為這些片段不含有必不可少的胺基酸168和169(SEQ.ID.No.23)。預期寡聚物150-179(SEQ.ID.No.23)誘發HR反應。可能30個胺基酸對於該蛋白太小，因為缺乏摺疊，並因此缺乏結合，而不能誘發任何活性，或可能在該肽合成期間重要的胺基酸丟失(或者在加工中，或僅由於選擇合成哪30個胺基酸)，因此，所述片段不能誘發HR。也可能(儘管不可能)這些小蛋白在大腸桿菌中已經經歷了合成時它們不含有的某種形式的翻譯後修飾，因此不能引發HR反應。實施例24-HR誘導片段的生物活性跨越SEQ.ID.No.24的核苷酸1-104和核苷酸1-168的兩種N端harpin片段，有效地誘導菸草對TMV的抗性，其方式類似於全長的harpin蛋白。跨越SEQ.ID.No.24的核苷酸76-209和核苷酸105-209的內部片段，也有效地誘導TMV抗性。另外，這些相同的四種片段在番茄中賦予植物生長的增強(「PGE」)，株高比
用於該目的，本領域技術人員可以在其中進行變化，而不偏離以下權利要求書限定的本發明的精神和範圍。
序列表(1)一般資料(i)申請人Cornell Research Foundation，Inc.and EDEN Bioscience Corporation(ii)發明名稱誘發過敏反應的過敏反應引發劑片段及其應用(iii)序列數30(iv)通信地址(A)收信人Nixon，Hargrave，Devans和Doyle LLP(B)街道Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市Rochester(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵政編碼14603(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，版本1.30(vi)當前申請數據(A)申請號(B)提交日期(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號US 60/048,109(B)申請日1997年5月30日(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)註冊號30,727(C)參考/檔案號19603/1302(ix)電訊資料(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)263-1600(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGAATTCAT ATGAGTCTGA ATACAAGTGG G 31(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GGGAATTCAT ATGGGCGGTG GCTTAGGCGG T 31(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GGCATATGTC GAACGCGCTG AACGATATG 29(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGGAATTCAT ATGTTAGGCG GTTCGCTGAA C 31(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCATATGCT GAACACGCTG GGCTCGAAA 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GGCATATGTC AACGTCCCAA AACGACGAT 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCATATGTC CACCTCAGAC TCCAGCG27(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵
(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GGGAATTCAT ATGCAAAGCC TGTTTGGTGA TGGG34(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GGGAATTCAT ATGGGTAATG GTCTGAGCAA G 31(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GGAATTCAT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC G31(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GGGAATTCAT ATGACACCAG CCAGTATGGA GCAG34(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GCAAGCTTAA CAGCCCACCA CCGCCCATCA T 31(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GCAAGCTTAA ATCGTTCAGC GCGTTCGACA G 31(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GCAAGCTTAA TATCTCGCTG AACATCTTCA GCAG34(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15GCAAGCTTAA GGTGCCATCT TGCCCATCAC 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GCAAGCTTAA ATCAGTGACT CCTTTTTTAT AGGC34(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17GCAAGCTTAA CAGGCCCGAC AGCGCATCAG T 31(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GCAAGCTTAA ACCGATACCG GTACCCACGG C 31(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19GCAAGCTTAA TCCGTCGTCA TCTGGCTTGC TCAG34(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20GCAAGCTTAA GCCGCGCCCA GCTTG 25(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度338個胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO21Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45
Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala(2)SEQ ID NO22的信息
(i)序列特徵(A)長度2141個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO22CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度403個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO23Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400GlyAla Ala(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度1288個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO24AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT1288(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵(A)長度341個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO25Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度1026個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO26ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA 1026(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特徵(A)長度344個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO27Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特徵(A)長度1035個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO28ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA1035(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特徵(A)長度26個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO29Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO30Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20
權利要求
1.歐文氏菌屬過敏反應引發劑蛋白或多肽的分離片段，其中所述片段在植物中引發過敏反應。
2.按照權利要求1的分離片段，其中所述過敏反應引發劑蛋白或多肽得自解澱粉歐文氏菌、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、菊歐文氏菌或斯氏歐文氏菌。
3.按照權利要求2的分離片段，其中所述過敏反應引發劑蛋白或多肽得自解澱粉歐文氏菌。
4.按照權利要求3的分離片段，其中所述片段選自SEQ.ID.No.23胺基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23胺基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23胺基酸序列的內部片段。
5.按照權利要求4的分離片段，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的胺基酸105和403的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的C端片段。
6.按照權利要求4的分離片段，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的N端片段1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。
7.按照權利要求4的分離片段，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的內部片段76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。
8.編碼按照權利要求1的分離的DNA分子。
9.按照權利要求8的分離的DNA分子，其中所述過敏反應引發劑蛋白或多肽得自解澱粉歐文氏菌、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、菊歐文氏菌或斯氏歐文氏菌。
10.按照權利要求9的分離的DNA分子，其中所述過敏反應引發劑蛋白或多肽得自解澱粉歐文氏菌。
11.按照權利要求10的分離的DNA分子，其中所述片段選自SEQ.ID.No.23胺基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23胺基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23胺基酸序列的內部片段。
12.按照權利要求10的分離的DNA分子，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的胺基酸105和403的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的C端片段。
13.按照權利要求10的分離的DNA分子，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的N端片段1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。
14.按照權利要求10的分離的DNA分子，其中所述片段為跨越SEQ.ID.No.23的以下胺基酸的SEQ.ID.No.23胺基酸序列的內部片段76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。
15.用按照權利要求8的DNA分子轉化的表達系統。
16.按照權利要求15的表達系統，其中所述分子處於正確意義的取向和正確的讀框中。
17.用按照權利要求8的DNA分子轉化的宿主細胞。
18.按照權利要求17的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自植物和細菌細胞。
19.按照權利要求17的宿主細胞，其中所述DNA分子用表達系統轉化。
20.用按照權利要求8的DNA分子轉化的轉基因植物。
21.按照權利要求20的轉基因植物，其中所述植物選自亞麻、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、捲心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風、蕪菁、花椰菜、硬花莖花椰菜、蕪菁、蘿蔔、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿蔔、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、菸草、番茄、高粱和甘蔗。
22.按照權利要求20的轉基因植物，其中所述植物選自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、矮牽牛、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
23.用按照權利要求8的DNA分子轉化的轉基因植物種子。
24.按照權利要求23的轉基因植物種子，其中所述植物選自亞麻、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、捲心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風、蕪菁、花椰菜、硬花莖花椰菜、蕪菁、蘿蔔、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿蔔、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、菸草、番茄、高粱和甘蔗。
25.按照權利要求23的轉基因植物種子，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
26.賦予植物抗病性的方法，包括在賦予抗病性的條件下，將非感染形式的過敏反應引發劑蛋白或多肽引發過敏反應的片段施用於植物或植物種子。
27.按照權利要求26的方法，其中在所述施用期間處理植物。
28.按照權利要求26的方法，其中在所述施用期間處理植物種子，所述方法還包括在天然或人工土壤中種植用所述過敏反應引發劑片段處理的種子，和在所述土壤中由所述種子繁殖植物。
29.增強植物生長的方法，包括在有效增強植物生長的條件下，將非感染形式的過敏反應引發劑蛋白或多肽引發過敏反應的片段施用於植物或植物種子。
30.按照權利要求29的方法，其中在所述施用期間處理植物。
31.按照權利要求29的方法，其中在所述施用期間處理植物種子，所述方法還包括在天然或人工土壤中種植用所述過敏反應引發劑片段處理的種子，和在所述土壤中由所述種子繁殖植物。
32.防治植物蟲害的方法，包括在有效防治蟲害的條件下，將非感染形式的過敏反應引發劑蛋白或多肽引發過敏反應的片段施用於植物或植物種子。
33.按照權利要求32的方法，其中在所述施用期間處理植物。
34.按照權利要求32的方法，其中在所述施用期間處理植物種子，所述方法還包括在天然或人工土壤中種植用所述過敏反應引發劑片段處理的種子，和在所述土壤中由所述種子繁殖植物。
35.賦予植物抗病性的方法，包括提供用一種DNA分子轉化的轉基因植物或植物種子，所述DNA分子編碼過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段，所述片段引發過敏反應，和在有效賦予抗病性的條件下，種植所述轉基因植物或由所述轉基因植物種子產生的轉基因植物。
36.按照權利要求35的方法，其中提供轉基因植物。
37.按照權利要求35的方法，其中提供轉基因植物種子。
38.增強植物生長的方法，包括提供用一種DNA分子轉化的轉基因植物或植物種子，所述DNA分子編碼過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段，所述片段引發過敏反應，和在有效增強植物生長的條件下，種植所述轉基因植物或由所述轉基因植物種子產生的轉基因植物。
39.按照權利要求38的方法，其中提供轉基因植物。
40.按照權利要求38的方法，其中提供轉基因植物種子。
41.防治植物蟲害的方法，包括提供用一種DNA分子轉化的轉基因植物或植物種子，所述DNA分子編碼過敏反應引發劑蛋白或多肽的片段，所述片段引發過敏反應，和在有效防治蟲害的條件下，種植所述轉基因植物或由所述轉基因植物種子產生的種轉基因植物。
42.按照權利要求41的方法，其中提供轉基因植物。
43.按照權利要求41的方法，其中提供轉基因植物種子。
全文摘要
本發明涉及歐文氏菌屬過敏反應引發劑蛋白或多肽在植物中引發過敏反應的分離的片段。也公開了編碼歐文氏菌屬過敏反應引發片段的分離的DNA分子。過敏反應引發劑蛋白或多肽引發過敏反應的分離片段和編碼它們的分離DNA片段,可以用來賦予植物的抗病性、增強植物生長和/或防治植物蟲害。通過在有效賦予抗病性、增強植物生長和/或防治植物或由植物種子培育的植物的蟲害的條件下,將非感染形式的過敏反應引發劑蛋白或多肽引發過敏反應的片段施用於所述植物或植物種子上,可以達到這一點。或者,提供用編碼過敏反應引發片段的DNA分子轉化的轉基因植物或植物種子,並在有效賦予抗病性、增強植物生長和/或防治植物或由所述植物種子培育的植物的蟲害的條件下,種植轉基因植物或由所述轉基因植物種子產生的植物。
文檔編號A01H5/00GK1265145SQ98807613
公開日2000年8月30日 申請日期1998年5月28日 優先權日1997年5月30日
發明者R·J·拉拜, 韋忠民, S·V·貝爾 申請人:康乃爾研究基金會有限公司, 伊登生物科學有限公司