雜交輕鏈小鼠的製作方法

2023-05-26 08:21:36 3

雜交輕鏈小鼠的製作方法
【專利摘要】提供了表達人λ可變(hVλ)序列的遺傳修飾的小鼠，包括從內源小鼠λ輕鏈基因座表達hVλ序列的小鼠，從內源小鼠κ輕鏈基因座表達hVλ序列的小鼠，以及從其中hVλ序列連接至小鼠恆定序列的轉基因或附加體表達hVλ序列的小鼠。提供了其為用於產生抗原結合蛋白的體細胞突變的人λ可變序列的來源的小鼠。提供了用於產生包含人λ可變序列的抗原結合蛋白包括人抗體的組合物和方法。
【專利說明】雜交輕鏈小鼠
[0001] 本申請是申請號為201180038411. 4、申請日為2011年6月22日、發明名稱為"雜 交輕鏈小鼠"的中國發明專利申請的分案申請，原申請為國際申請號為PCT/US2011/041370 的國家階段申請，該國際申請要求申請日分別為2010年6月22日和2010年6月22日，申 請號分別為61/357, 314和61/357, 317的美國申請的優先權。
[0002] 領域
[0003] 包含與小鼠或人輕鏈恆定區（λ或kappa(K ))有效連接的小鼠或人λ可變 (νλ)輕鏈序列的遺傳修飾的小鼠。表達包含含有來源於人λ可變（hVA)基因區段的可 變結構域、人λ JQ1JA )基因區段和小鼠輕鏈恆定（Q)結構域的免疫球蛋白輕鏈的表位結 合蛋白的遺傳修飾的小鼠。遺傳修飾的小鼠，其在內源小鼠輕鏈基因座上包含未重排的免 疫球蛋白IambdaU)輕鏈可變核酸序列。能夠重排並且從內源輕鏈基因座表達嵌合人λ/ 小鼠 Q輕鏈的小鼠，所述內源輕鏈基因座包括，利用一個或多個hVA基因區段以及一個或 多個hJA基因區段對所有內源小鼠輕鏈可變區基因區段的替換。包含hVA結構域和小鼠 Q結構域的體細胞突變的抗體。
[0004] 背景
[0005] 表達為完全人或者部分人及部分小鼠的抗體的小鼠在本領域是已知的。例如，已 報導了，從包含人輕鏈和重鏈免疫球蛋白可變區基因的轉基因表達完全人抗體的轉基因小 鼠。包括利用人HCVR和LCVR基因區段對內源小鼠重鏈可變區（HCVR)基因區段和κ輕鏈 可變區（LCVR)基因區段的替換並且產生具有嵌合人/小鼠 κ鏈的嵌合抗體的遺傳修飾的 小鼠也是已知的。
[0006] 抗體輕鏈由兩個分離的基因座：kappa( κ )和lambda( λ )之一編碼。小鼠抗體輕 鏈主要為κ型。人中的κ對λ輕鏈使用的比率為約60:40,然而在小鼠中，該比率為約 95:5。小鼠中κ輕鏈的偏愛性使用據報導在能夠表達完全或部分人抗體的遺傳修飾的小 鼠中被保留。因此，表達完全或部分人抗體的小鼠顯示在λ可變使用上受到限制。
[0007] 本領域需要產生用於製備表位結合蛋白的λ可變區（無論是小鼠的還是人的）。 本領域需要表達完全或部分人抗體的小鼠，其中所述小鼠顯示增加的λ可變（νλ)使用。
[0008] 本領域需要表達完全或部分人抗體的小鼠，其中所述小鼠顯示增加的λ可變 (V入）使用。
[0009] 概述
[0010] 提供了遺傳修飾的小鼠、胚胎、細胞、組織以及用於修飾小鼠的核酸構建體，和用 於產生和使用它們的方法及組合物。提供了在kappa( K )輕鏈的背景下產生IambdaU) 可變區（人或非人）的小鼠和細胞。還提供了在κ或λ輕鏈的背景下，例如從內源小鼠 輕鏈基因座，產生人λ可變區的小鼠和細胞。還提供了，用於產生包含λ可變區的抗體的 方法。還提供了，用於選擇與關聯（cognate) λ可變區一起表達的重鏈的方法。
[0011] 提供了包括體細胞突變的可變區的嵌合和人抗原結合蛋白（例如，抗體）以及編 碼其的核酸，包括具有包含融合至小鼠輕鏈恆定結構域的、來源於人νλ和人JA基因區段 的可變結構域的輕鏈的抗體。
[0012] 在一個方面，提供了在包含小鼠恆定區的輕鏈上表達人λ可變區序列的小鼠。在 一個方面，提供了在包含K恆定區的輕鏈上表達人λ可變區序列的小鼠。在一個方面，提 供了從內源小鼠輕鏈基因座表達包含人λ可變區序列的輕鏈的小鼠。在一個方面，提供了 包含重排的輕鏈基因的小鼠，所述輕鏈基因包含連接至小鼠恆定區序列的人λ可變序列； 在一個實施方案中，小鼠恆定區序列為λ恆定序列；在一個實施方案中，小鼠恆定區序列 為κ恆定序列。
[0013] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠包含未重排的人λ輕鏈可變 基因區段Οινλ)和人λ連接基因區段〇αλ)。在一個實施方案中，未重排的hVA和hJA 在小鼠輕鏈基因座上。在一個實施方案中，未重排的hV λ和未重排的hj λ在轉基因上並 且有效地連接至人或小鼠恆定區序列。在一個實施方案中，未重排的hV λ和未重排的hj λ 在附加體（印isome)上。在一個實施方案中，小鼠能夠產生免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包 含從未重排的hV λ序列和hj λ序列以及小鼠輕鏈恆定區（Q)核酸序列衍生的輕鏈。還提 供了用於產生和使用遺傳修飾的小鼠的方法和組合物。提供了抗體，所述抗體包含（a)融 合至小鼠重鏈恆定區的人重鏈可變結構域（hV H)，和（b)融合至小鼠 Q結構域的人νλ ;包 括其中，例如在本發明的小鼠的抗體或免疫細胞的選擇過程中，對一個或多個可變結構域 進行體細胞突變。在一個實施方案中，未重排的hV λ和未重排的hj λ與人或小鼠 κ恆定 區（Ck)有效地連接。在一個實施方案中，未重排的hV λ和未重排的hj λ與人或小鼠 λ 恆定區（CA)有效地連接。
[0014] 在一個方面，提供了在其種系中在內源小鼠輕鏈基因座上包含人λ輕鏈可變區 序列的小鼠，其中人λ可變區序列在包含小鼠免疫球蛋白恆定區基因序列的輕鏈中表達。
[0015] 在一個實施方案中，內源小鼠輕鏈基因座為λ基因座。在一個實施方案中，內源 小鼠輕鏈基因座為κ基因座.
[0016] 在一個實施方案中，小鼠在內源小鼠輕鏈基因座上不存在內源輕鏈可變序列。
[0017] 在一個實施方案中，所有或基本上所有的內源小鼠輕鏈可變區基因區段被一個或 多個人λ可變區基因區段替換。
[0018] 在一個實施方案中，人λ輕鏈可變區序列包含人序列。在一個實施方案中， 人JX序列選自JX 1、JX 2、JX 3、JX 7及其組合。
[0019] 在一個實施方案中，人λ輕鏈可變區序列包含人輕鏈基因座的A簇的片段。在具 體的實施方案中，人λ輕鏈基因座的A簇的片段從hV λ 3-27延伸至hV λ 3-1。
[0020] 在一個實施方案中，人λ輕鏈可變區序列包含人輕鏈基因座的B簇的片段。在具 體的實施方案中，人λ輕鏈基因座的B簇的片段從hV λ 5-52延伸至hV λ 1-40。
[0021] 在一個實施方案中，人λ輕鏈可變區序列包含A簇的基因組片段和B簇的基因組 片段。在一個實施方案中，人λ輕鏈可變區序列包含A簇的至少一個基因區段和B簇的至 少一個基因區段。
[0022] 在一個實施方案中，超過10%的小鼠輕鏈天然庫（na'ive repertoire)來源於選 自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少兩個1^入基因區段。在一個實施方案中，超過20% 的小鼠輕鏈天然庫來源於選自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少三個hV λ基因區段。在 一個實施方案中，超過30%的小鼠輕鏈天然庫來源於選自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的 至少四個hV λ基因區段。
[0023] 在一個方面，提供了表達免疫球蛋白輕鏈的小鼠，所述免疫球蛋白輕鏈包含與小 鼠恆定區融合的人λ可變序列，其中所述小鼠顯示約1:1的 K使用對λ使用的比率。
[0024] 在一個實施方案中，從內源小鼠輕鏈基因座表達免疫球蛋白輕鏈。
[0025] 在一個方面，提供了包含與小鼠 κ輕鏈恆定區序列連續的λ輕鏈可變區序列 (V入）和至少一個J序列（J)的小鼠。
[0026] 在一個實施方案中，小鼠缺乏功能性小鼠 Vk和/或小鼠 Jk基因區段。
[0027] 在一個實施方案中，V λ為人V λ (hV λ )，並且J為人J λ (hj λ )。在一個實施方 案中，hV λ和hj λ為未重排的基因區段。
[0028] 在一個實施方案中，小鼠包含多個未重排的hVA基因區段和至少一個hJA基因 區段。在具體的實施方案中，多個未重排的hVA基因區段為至少12個基因區段、至少28 個基因區段或至少40個基因區段。
[0029] 在一個實施方案中，至少一個hJX基因區段選自JX 1、JX 2、JX 3、JX 7及其組 合。
[0030] 在一個實施方案中，內源小鼠 λ輕鏈基因座被完整或部分缺失。
[0031] 在一個實施方案中，小鼠 κ輕鏈恆定區序列在內源小鼠 Κ輕鏈基因座上。
[0032] 在一個實施方案中，約10%至約45%的小鼠 B細胞表達抗體，所述抗體包括包含 人λ輕鏈可變（V λ)結構域和小鼠 κ輕鏈恆定（Ck)結構域的輕鏈。
[0033] 在一個實施方案中，人λ可變結構域來源於重排的hVX/hJX序列，所述hVA/ hJA 序列選自 3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、 3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、卜40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、 5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7 和 1-51/1。
[0034] 在一個實施方案中，小鼠還包括來自人κ輕鏈基因座的人Vk-Jk基因間區域， 其中人Vk-Jk基因間區域與νλ序列和J序列連續。在具體的實施方案中，人Vk-Jk 基因間區域置於νλ序列與J序列之間。
[0035] 在一個方面，提供了小鼠，所述小鼠（a)在內源小鼠輕鏈基因座上包含至少12至 至少40個未重排的人λ輕鏈可變區基因區段和至少一個人JA基因區段；(b)包含位於 至少12至至少40個輕鏈可變區基因區段與至少一個人J λ序列之間的人V κ-J κ基因間 序列；其中所述小鼠表達包含含有人νλ結構域和小鼠 Ck結構域的輕鏈的抗體。
[0036] 在一個方面，提供了表達包含含有λ可變序列和Κ恆定序列的輕鏈的抗體的小 鼠。
[0037] 在一個實施方案中，小鼠顯示了約1:1的κ使用對λ使用的比率。
[0038] 在一個實施方案中，獲自小鼠骨髓的未成熟B細胞群體顯示約1:1的κ使用對λ 使用的比率。
[0039] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠包含與包含小鼠 Q基因的小 鼠輕鏈基因座有效連接的未重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區段。
[0040] 在一個實施方案中，νλ和/或JA基因區段為人基因區段。在一個實施方案中， νλ和/或JA基因區段為小鼠基因區段，並且Q為小鼠 CK。
[0041] 在一個實施方案中，內源小鼠輕鏈基因座為κ輕鏈基因座。在一個實施方案中， 內源小鼠輕鏈基因座為λ輕鏈基因座。
[0042] 在一個實施方案中，未重排的VX和JX基因區段在內源小鼠輕鏈基因座上。
[0043] 在一個實施方案中，未重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區段在轉基因上。
[0044] 在一個實施方案中，小鼠還在內源小鼠重鏈免疫球蛋白基因座上包括，一個或多 個人V、D和/或J基因區段對一個或多個重鏈V、D和/或J基因區段的替換。
[0045] 在一個實施方案中，小鼠在包含小鼠 C κ基因的內源小鼠 κ輕鏈基因座上包含未 重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區段。
[0046] 在一個實施方案中，小鼠在包含小鼠 C λ基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上包含未 重排的人免疫球蛋白λ輕鏈可變基因區段（νλ)和λ連接基因區段（JA)。
[0047] 在一個實施方案中，輕鏈可變基因基因座（"'基因座"）包含至少一個人 V λ (hv λ)基因區段。在一個實施方案中，'基因座包含至少一個人JA (hj λ)基因區段。 在另一個實施方案中，'基因座包含多至4個hj λ基因區段。在一個實施方案中，'基因 座包含含有人λ和人κ基因組序列的連續序列。
[0048] 在一個實施方案中，κ輕鏈可變基因基因座（"Κ基因座"）包含至少一個人 V λ (hv λ)基因區段。在一個實施方案中，K基因座包含至少一個人(hj λ)基因區段。 在一個實施方案中，κ基因座包含多至4個hj λ基因區段。在一個實施方案中，κ基因座 包含至少一個hVA和至少一個hJA，並且不存在或基本上不存在功能性Vk區基因區段以 及不存在或基本上不存在功能性Jk區基因區段。在一個實施方案中，小鼠不包含功能性 Vk區基因區段。在一個實施方案中，小鼠不包含功能性Jk區基因區段。
[0049] 在一個實施方案中，λ輕鏈可變基因基因座（" λ基因座"）包含至少一個hVA 基因區段。在一個實施方案中，λ基因座包含至少一個人JA (hJA)基因區段。在另一個 實施方案中，λ基因座包含多至4個hJA基因區段。
[0050] 在一個實施方案中，'基因座包含多個hV λ。在一個實施方案中，選擇多個hV λ， 以導致反映人中觀察到的V λ使用的約10 %、約20 %、約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、 約70%、約80%或約90%或更多的λ輕鏈可變區庫的表達。在一個實施方案中，八基因 座包含基因區段hVA 1-40、1-44、2-8、2-14、3-21及其組合。
[0051] 在一個實施方案中，hVX包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具體的實 施方案中，'基因座包括橫跨νλ 3-12至νλ 3-1的人λ輕鏈基因座的連續序列。在一個 實施方案中，\基因座包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個hVX。在具體的實施方 案中，hVA包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具體的實施方案中，八基因座包 含橫跨VA 3-12至VA 3-1的人λ基因座的連續序列。在一個實施方案中，'基因座在內 源κ基因座上。在具體的實施方案中，'基因座在內源κ基因座上並且內源λ輕鏈基因 座被部分或完全缺失。在一個實施方案中，'基因座在內源λ基因座上。在具體的實施方 案中，'基因座在內源λ基因座上並且內源κ基因座被部分或完全缺失。
[0052] 在一個實施方案中，'基因座包括13至28個或更多的hV λ。在具體的實施方案 中，hVA 包括2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25和3-27。在具體的實施方案中， κ基因座包含橫跨νλ 3-27至νλ 3-1的人λ基因座的連續序列。在一個實施方案中，' 基因座在內源κ基因座上。在具體的實施方案中，'基因座在內源κ基因座上並且內源 入輕鏈基因座被部分或完全缺失。在另一個實施方案中，'基因座在內源λ基因座上。在 具體的實施方案中，'基因座在內源λ基因座上並且內源κ基因座被部分或完全缺失。
[0053] 在一個實施方案中，'基因座包含29至40個hVX。在具體的實施方案中，κ基因 座包含橫跨VA 3-29至VA 3-1的人λ基因座的連續序列，橫跨νλ 5-52至VA 1-40的人λ 基因座的連續序列。在具體的實施方案中，遺傳修飾的小鼠中的hV λ 1-40與hV λ 3-29之間 的所有或基本上所有序列基本上由下述組成：天然發現的（例如，在人群中）在hV λ 1-40 基因區段下遊（3'非翻譯部分的下遊）的約959 bp的人λ序列、限制性酶位點（例如， PI-SceI)、緊接著天然發現的hVλ3-29基因區段的上遊的約3,431bp的人λ序列。在一 個實施方案中，\基因座在內源小鼠 κ基因座上。在具體的實施方案中，'基因座在內源 小鼠 κ基因座上並且內源小鼠 λ輕鏈基因座被部分或完全缺失。在另一個實施方案中， \基因座在內源小鼠 λ基因座上。在具體的實施方案中，'基因座在內源小鼠 λ基因座 上並且內源小鼠 κ基因座被部分或完全缺失。
[0054] 在一個實施方案中，'基因座包含至少一個hj λ。在一個實施方案中，'基因座 包含多個hJA。在一個實施方案中，'基因座包含至少2、3、4、5、6或7個hJA。在具體 的實施方案中，'基因座包含4個hj λ。在具體的實施方案中，4個hj λ為hj λ UhJA 2、 hJA 3和hJA 7。在一個實施方案中，\基因座為κ基因座。在具體的實施方案中，'基 因座在內源κ基因座上並且內源λ輕鏈基因座被部分或完全缺失。在一個實施方案中， \基因座包含一個hj λ。在具體的實施方案中，一個hj λ為hj λ 1。在一個實施方案中， '基因座在內源κ基因座上。在具體的實施方案中，'基因座在內源κ基因座上並且內 源λ輕鏈基因座被部分或完全缺失。在另一個實施方案中，'基因座在內源λ基因座上。 在具體的實施方案中，'基因座在內源λ基因座上並且內源 Κ基因座被部分或完全缺失。
[0055] 在一個實施方案中，八基因座包含至少一個hV λ、至少一個hj λ和小鼠 C κ基因。 在一個實施方案中，'基因座包含至少一個hV λ、至少一個hj λ和小鼠 C λ基因。在具體 的實施方案中，小鼠 CA基因為CA 2。在具體的實施方案中，小鼠 CA基因與小鼠 CA 2具 有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %或至少99 %的同 一性。
[0056] 在一個實施方案中，小鼠在內源小鼠 κ基因座上包括，利用一個或多個hV λ基因 區段對內源小鼠 Vk基因區段的替換，其中hVA基因區段有效地連接至內源小鼠 Ck區基 因，以便小鼠重排人νλ基因區段並且表達包含人νλ結構域和小鼠 Ck的反向嵌合免疫 球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，90-100%的未重排的小鼠 Vk基因區段被至少一個未重 排的hVA基因區段替換。在具體的實施方案中，所有或基本上所有內源小鼠 Vk基因區段 被至少一個未重排的hVA基因區段替換。在一個實施方案中，利用至少12、至少28或至 少40個未重排的hVA基因區段進行替換。在一個實施方案中，利用至少7個功能性未重 排的hV λ基因區段、至少16個功能性未重排的hV λ基因區段或至少27個功能性未重排 的hVA基因區段進行替換。在一個實施方案中，小鼠包括利用至少一個未重排的hJA基 因區段對所有小鼠 Jk基因區段的替換。在一個實施方案中，至少一個未重排的hJA基 因區段選自JA 1、JA 2、JA 3、JA 4、JA 5、JA 6、JA 7及其組合。在具體的實施方案中，一 個或多個 hVX 基因區段選自 3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、 3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、卜47、5-48、9-49、1-50、卜51、 5-52 hVA基因區段及其組合。在具體的實施方案中，至少一個未重排的hJA基因區段選 自 JX 1、JX 2、JX 3、JX 7 及其組合。
[0057] 在一個實施方案中，小鼠在內源小鼠 λ基因座上包括，利用一個或多個人νλ基 因區段對內源小鼠 νλ基因區段的替換，其中hVA基因區段有效地連接至小鼠 CA區基 因，以便小鼠重排hVA基因區段並且表達包含hVA結構域和小鼠 CA的反向嵌合免疫球 蛋白輕鏈。在具體的實施方案中，小鼠 C λ基因為C λ 2。在具體的實施方案中，小鼠 C λ基因 與小鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同一 性。在一個實施方案中，90-100%的未重排的小鼠 VA基因區段被至少一個未重排的hVA 基因區段替換。在具體的實施方案中，所有或基本上所有內源小鼠 νλ基因區段被至少一 個未重排的hVA基因區段替換。在一個實施方案中，利用至少12、至少28或至少40個未 重排的hVA基因區段進行替換。在一個實施方案中，利用至少7個功能性未重排的hVA基 因區段、至少16個功能性未重排的hVA基因區段或至少27個功能性未重排的hVA基因區 段進行替換。在一個實施方案中，小鼠包括利用至少一個未重排的hJA基因區段對所有小 鼠 JA基因區段的替換。在一個實施方案中，至少一個未重排的hJA基因區段選自JA 1、 2、JA 3、JA 4、JA 5、JA 6、JA 7及其組合。在具體的實施方案中，一個或多個hVA基 因區段選自 3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、 3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52 hVA 基因區段 及其組合。在具體的實施方案中，至少一個未重排的hJA基因區段選自JA1、JA 2、JA 3、 JA 7及其組合。
[0058] 在一個方面，提供了包含位於內源小鼠 κ輕鏈基因座上的人Vk-Jk基因間區域 序列的遺傳修飾的小鼠。
[0059] 在一個實施方案中，人Vk-Jk基因間區域序列在小鼠的內源κ輕鏈基因座上， 所述基因座包含hV λ和hj λ基因區段，並且人V κ-J κ基因間區域序列位於hV λ與hj λ 基因區段之間。在具體的實施方案中，hVA和hJA基因區段能夠在小鼠中重組以形成功 能性人λ輕鏈可變結構域。
[0060] 在一個實施方案中，提供了包含多個hv λ和一個或多個hj λ的小鼠，並且人 Vk-Jk基因間區域序列在轉錄方向上被置於鄰近的或最3'端的hV λ序列的下遊和第一 個hj λ序列的上遊或5'端。
[0061] 在一個實施方案中，人Vk-Jk基因間區域為這樣的區域，其位於人Vk 4-1基因 區段的下遊或3'端約130 bp，人Vk 4-1基因區段的3'非翻譯區下遊約130 bp，並且橫跨 至人JK 1基因區段的上遊或5'端約600 bp。在具體的實施方案中，人Vk-Jk基因間區 域在大小上為約22.8 kb。在一個實施方案中，Vk-Jk基因間區域與從人Vk4_1基因區 段的3'非翻譯區的末端延伸至人JkI基因區段的上遊約600bp的人Vk-Jk基因間區域 具有約90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多或約95%或更多的 同一性。在一個實施方案中，V κ-Jk基因間區域包含SEQ ID NO: 100。在具體的實施方案 中，V κ-J κ基因間區域包含SEQ ID NO: 100的功能性片段。在具體的實施方案中，V κ-J κ 基因間區域為SEQ ID NO: 100。
[0062] 在一個方面，提供了包含所述的人Vk -Jk基因間區域序列的小鼠、小鼠細胞（例 如，小鼠胚胎幹細胞）、小鼠胚胎和小鼠組織，其中基因間區域序列是異位的。在具體的實施 方案中，異位序列置於人源化內源小鼠免疫球蛋白基因座上。
[0063] 在一個方面，提供了包含所述的人Vk-Jk基因間區域序列的分離的核酸構建 體。在一個實施方案中，核酸構建體包含將人Vk-Jk基因間區域序列靶向小鼠輕鏈基因 座的靶向臂。在具體的實施方案中，小鼠輕鏈基因座為κ基因座。在具體的實施方案中， 靶向臂將人Vk-Jk基因間區域靶向修飾的內源小鼠 K基因座，其中靶向是至hVA序列 與hj λ序列之間的位置。
[0064] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中小鼠包含不超過2個的輕鏈等位基因， 其中輕鏈等位基因（a)在包含小鼠基因的內源小鼠輕鏈基因座上包含未重排的免疫球 蛋白人νλ和JA基因區段；以及，（b)在包含小鼠 Q基因的內源小鼠輕鏈基因座上包含 未重排的免疫球蛋白 '和叉基因區段。
[0065] 在一個實施方案中，內源小鼠輕鏈基因座為κ基因座。在另一個實施方案中，內 源小鼠輕鏈基因座為λ基因座。
[0066] 在一個實施方案中，不超過2個的輕鏈等位基因選自κ等位基因和λ等位基因、 2個κ等位基因和2個λ等位基因。在具體的實施方案中，2個輕鏈等位基因之一為包含 CA 2基因的λ等位基因。
[0067] 在一個實施方案中，小鼠包含一個功能性免疫球蛋白輕鏈基因座和一個非功能性 輕鏈基因座，其中所述功能性輕鏈基因座在包含小鼠 Cκ基因的內源小鼠 κ輕鏈基因座上 包含未重排的免疫球蛋白人νλ和JA基因區段。
[0068] 在一個實施方案中，小鼠包含一個功能性免疫球蛋白輕鏈基因座和一個非功能性 輕鏈基因座，其中所述功能性輕鏈基因座在包含小鼠 Cλ基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上 包含未重排的免疫球蛋白人νλ和JA基因區段。在一個實施方案中，CA基因為CA 2。 在具體的實施方案中，小鼠 C λ基因與小鼠 C λ 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%、至少95 %或至少98%的同一性。
[0069] 在一個實施方案中，小鼠還包含至少一個免疫球蛋白重鏈等位基因。在一個實施 方案中，至少一個免疫球蛋白重鏈等位基因在表達人/小鼠重鏈的包含人重鏈基因的內源 小鼠重鏈基因座上包含人Vh基因區段、人D h基因區段和人Jh基因區段。在具體的實施方 案中，小鼠包含2個免疫球蛋白重鏈等位基因，並且小鼠表達人/小鼠重鏈。
[0070] 在一個實施方案中，小鼠包含第一輕鏈等位基因，所述第一輕鏈等位基因在包含 內源C κ基因的內源小鼠 κ基因座上包含未重排的hV κ和未重排的hj κ ;和第二輕鏈等 位基因，所述第二輕鏈等位基因在包含內源Ck基因的內源小鼠K基因座上包含未重排的 hV λ和未重排的hj λ。在具體的實施方案中，第一和第二輕鏈等位基因為遺傳修飾的小鼠 的僅有的功能性輕鏈等位基因。在具體的實施方案中，小鼠包含非功能性λ基因座。在一 個實施方案中，遺傳修飾的小鼠不表達包含λ恆定區的輕鏈。
[0071] 在一個實施方案中，小鼠包含第一輕鏈等位基因，所述第一輕鏈等位基因在包含 內源C K基因的內源小鼠 κ基因座上包含未重排的hV K和未重排的hj K ;和第二輕鏈等 位基因，所述第二輕鏈等位基因在包含內源CA基因的內源小鼠 λ基因座上包含未重排的 hVA和未重排的hJA。在具體的實施方案中，第一和第二輕鏈等位基因是遺傳修飾的小鼠 的僅有的功能性輕鏈等位基因。在一個實施方案中，內源CA基因為CA 2。在具體的實施 方案中，小鼠 CA基因與小鼠 CA 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95 %或至少98%的同一性。
[0072] 在一個實施方案中，小鼠包含6個免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包 含小鼠 Ck基因的內源小鼠 K輕鏈基因座包含未重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區段， 第二等位基因在包含小鼠 Ck基因的內源小鼠Κ輕鏈基因座上包含未重排的免疫球蛋白 Vk和Jk基因區段，第三等位基因在包含小鼠 CA基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上包含 未重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區段，第四和第五等位基因各自獨立地在包含小鼠重 鏈基因的內源小鼠重鏈基因座上包含未重排的V h和Dh以及Jh基因區段，並且第六等位基 因（a)在包含小鼠 CA基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上包含未重排的免疫球蛋白νλ和 JA基因區段，（b)包含無功能的λ基因座，或（c)完全或部分缺失λ基因座。
[0073] 在一個實施方案中，第一等位基因包含未重排的hV λ和hj λ。在一個實施方案 中，第二等位基因包含未重排的hVK和hjK。在一個實施方案中，第三等位基因包含未重 排的hVA和hJA。在一個實施方案中，第四和第五等位基因各自獨立地包含未重排的hV H 和hDH以及hJH。在一個實施方案中，第六等位基因包含被完全或部分缺失的內源小鼠 λ基 因座。
[0074] 在一個實施方案中，小鼠包含6個免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包 含小鼠 CA基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上包含未重排的免疫球蛋白νλ和JA基因區 段，第二等位基因在包含小鼠 CA基因的內源小鼠 λ輕鏈基因座上包含未重排的免疫球蛋 白νλ和JA基因區段，第三等位基因在包含小鼠 Ck基因的內源小鼠Κ輕鏈基因座上包 含未重排的免疫球蛋白Vk和Jk基因區段，第四和第五等位基因各自獨立地在包含小鼠 重鏈基因的內源小鼠重鏈基因座上包含未重排的V i^PDh以及義基因區段，並且第六等位基 因（a)在包含小鼠 Ck基因的內源小鼠 Κ輕鏈基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vk和 Jk基因區段，（b)包含無功能的κ基因座，或（c)缺失Κ基因座的一個或多個元件。
[0075] 在一個實施方案中，第一等位基因包含未重排的hVA和hJA基因區段。在一個 實施方案中，第二等位基因包含未重排的hVA和hJA基因區段。在一個實施方案中，第三 等位基因包含未重排的hVK和hjK基因區段。在一個實施方案中，第四和第五等位基因 各自獨立地包含未重排的hV H和hDH以及hJH基因區段。在一個實施方案中，第六等位基因 包含在功能上被沉默的內源小鼠 κ基因座。
[0076] 在一個實施方案中，遺傳修飾的小鼠包括包含重排的抗體基因的B細胞，所述抗 體基因包含有效地連接至小鼠 Q結構域的重排的hVA結構域。在一個實施方案中，小鼠 匕結構域選自小鼠 Cκ和小鼠 Cλ結構域。在具體的實施方案中，小鼠 C λ結構域來源於 CA2基因。在具體的實施方案中，小鼠 CA結構域來源於與小鼠 CA2具有至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA結構域。
[0077] 在一個方面，提供了在為Ck的Q上表達VA區的遺傳修飾的小鼠。在一個方面， 提供了在選自人Ck、人CX或小鼠 Ck的Q上表達hVX區的遺傳修飾的小鼠。在一個方 面，提供了在小鼠 Ck上表達hVA區的遺傳修飾的小鼠。
[0078] 在一個實施方案中，約10-50%的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其約 9-28%表達包含融合至小鼠 Ck結構域的hVA結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0079] 在具體的實施方案中，約23-34%的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其 約9-11%表達包含融合至小鼠 Ck結構域的hVA結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0080] 在具體的實施方案中，約19-31 %的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其 約9-17%表達包含融合至小鼠 C κ結構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0081] 在具體的實施方案中，約21-38%的小鼠脾細胞為B細胞（S卩，⑶19-陽性），或其 約24-27%表達包含融合至小鼠 C κ結構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0082] 在具體的實施方案中，約10-14%的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其 約9-13%表達包含融合至小鼠 C κ結構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0083] 在具體的實施方案中，約31-48%的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其 約15-21%表達包含融合至小鼠 Ck結構域的hVA結構域的免疫球蛋白輕鏈。在具體的實 施方案中，約30-38%的小鼠脾細胞為B細胞（即，⑶19-陽性），或其約33-48%表達包含 融合至小鼠 Ck結構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0084] 在一個實施方案中，約52-70%的小鼠骨髓為B細胞（即，⑶19-陽性），或其約 31-47 % 的未成熟 B 細胞（即，CD19-陽性/Β220-中間陽性（intermediate positive)/ IgM-陽性）表達包含融合至小鼠 C κ結構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0085] 在一個實施方案中，約60%的小鼠骨髓為B細胞（S卩，⑶19-陽性），或其約38. 3% 的未成熟B細胞（即，CD19-陽性/Β220中間陽性/IgM-陽性）表達包含融合至小鼠 Ck結 構域的hV λ結構域的免疫球蛋白輕鏈。
[0086] 在一個實施方案中，小鼠表達包含輕鏈的抗體，所述輕鏈包含來源於人V和人J基 因區段的可變結構域，以及來源於小鼠恆定區基因的恆定結構域。在一個實施方案中，小鼠 恆定區基因為Ck基因。在另一個實施方案中，小鼠恆定區基因為CA基因。在具體的實 施方案中，CX區為CX 2。在具體的實施方案中，小鼠 CX基因來源於與小鼠 CX 2具有至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。在 具體的實施方案中，抗體還包括包含來源於人V、人D和人J基因區段的可變結構域以及來 源於小鼠重鏈恆定區基因的重鏈恆定結構域的重鏈。在一個實施方案中，小鼠重鏈恆定區 基因包含重鏈恆定結構域的鉸鏈-CH 2-CH3序列。在另一個實施方案中，小鼠重鏈恆定區基 因包含重鏈恆定結構域的CH1-鉸鏈-CH 2-CH3序列。在另一個實施方案中，小鼠重鏈恆定區 基因包含重鏈恆定結構域的CH1-CH 2-CH3-CH4序列。在另一個實施方案中，小鼠重鏈恆定區 基因包含重鏈恆定結構域的CH 2-CH3-CH4序列。
[0087] 在一個實施方案中，小鼠表達包含含有重排的人V λ-J λ序列和小鼠 C κ序列的 輕鏈的抗體。在一個實施方案中，重排的人νλ-JA序列來源於選自3-1、4-3、2-8、3-9、 3-10、2-14、3-19、2-23、3-25、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、9-49 和 1-51 基因區段的 hVA基因區段的重排。在一個實施方案中，重排的人νλ -JX序列來源於選自JX 1、JA 2、 JA 3和JA 7基因區段的hJX基因區段的重排。
[0088] 在一個實施方案中，小鼠表達包含含有重排的免疫球蛋白λ輕鏈可變區的輕 鏈的抗體，所述重排的免疫球蛋白λ輕鏈可變區包含選自3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、 2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、 1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、 7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7和1-51/1的人￥入/7入序列。在具體的實施方案中，8細 胞表達抗體，所述抗體包含與小鼠重鏈恆定結構域融合的人免疫球蛋白重鏈可變結構域， 以及與小鼠 κ輕鏈恆定結構域融合的人免疫球蛋白λ輕鏈可變結構域。
[0089] 在一個方面，提供了表達抗體的小鼠，所述抗體包含，（a)含有來源於未重排的人 重鏈可變區基因區段的重鏈可變結構域的重鏈，其中重鏈可變結構域融合至小鼠重鏈恆定 (Ch)區；和（b)含有來源於未重排的hV λ和hj λ的輕鏈可變結構域的輕鏈，其中輕鏈可變 結構域融合至小鼠 Q區。
[0090] 在一個實施方案中，小鼠包含，（i)重鏈基因座，其包括用所有或基本上所有功能 性人V、D和J基因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 V、D和J基因區段的替換，小 鼠 Ch基因，（ii)第一 κ輕鏈基因座，其包括用所有、基本上所有或多個功能性hV λ和hj λ 基因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 Vk和Jk基因區段的替換，以及小鼠 Ck 基因，（iii)第二κ輕鏈基因座，其包括用所有、基本上所有或多個功能性hV κ和hj κ基 因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 Vk和Jk基因區段的替換，以及小鼠 Ck基 因。在一個實施方案中，小鼠不表達包含C λ區的抗體。在一個實施方案中，小鼠包括C λ 基因和/或νλ和/或JA基因區段的缺失。在一個實施方案中，小鼠包括非功能性λ輕 鏈基因座。在具體的實施方案中，λ輕鏈基因座被全部或部分缺失。
[0091] 在一個實施方案中，小鼠包含（i)重鏈基因座，其包括用所有或基本上所有功能 性人V、D和J基因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 V、D和J基因區段的替換、小 鼠 Ch基因，（ii)第一 λ輕鏈基因座，其包括用所有、基本上所有或多個功能性hV λ和hj λ 基因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 νλ和JA基因區段的替換，以及小鼠 CA 基因，（iii)第二λ輕鏈基因座，其包括用所有、基本上所有或多個功能性hV λ和hj λ基 因區段對所有或基本上所有功能性內源小鼠 νλ和JA基因區段的替換，以及小鼠 CA基 因。在具體的實施方案中，小鼠 C λ基因為CA 2。在具體的實施方案中，小鼠 C λ基因來源 於與小鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同 一性的C λ基因。
[0092] 在一個實施方案中，小鼠包括Ck基因和/或Vk和/或Jk基因區段的缺失。在 一個實施方案中，小鼠包括非功能性κ輕鏈基因座。
[0093] 在一個方面，提供了表達抗體的遺傳修飾的小鼠，其中超過10%、超過15%、超過 20%、超過25%、超過30%、超過35%、超過40%、超過60%、超過70%、超過80%或超過 90%的由小鼠產生的總IgG抗體包含λ-來源的可變結構域，並且其中小鼠表達包含與小 鼠 Ck區融合的κ來源的可變結構域的抗體。在具體實施方案中，約15-40%、20_40%、 25-40%、30-40%或35-40%的由小鼠產生的總抗體包含λ來源的可變結構域。
[0094] 在一個實施方案中，λ來源的可變結構域來源於hV λ和hj λ。在一個實施方案 中，λ來源的可變結構域存在於包含小鼠 Ck區的輕鏈中。在具體的實施方案中，λ來源 的可變區存在於包含小鼠 CA區的輕鏈中。在另一個具體的實施方案中，CA區為CA2區。 在一個實施方案中，κ來源的可變結構域來源於hV κ和hj κ，並且在具體的實施方案中存 在於包含小鼠 Ck區的輕鏈中。
[0095] 在一個方面，提供了包含上遊同源臂和下遊同源臂的分離的DNA構建體，其中上 遊和下遊同源臂將所述構建體靶向小鼠 κ基因座，並且構建體包含功能性未重排的hVA 區段和功能性未重排的hj λ區段，以及選擇或標記序列。
[0096] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含用於靶 向小鼠 VA 2上遊的小鼠 λ序列的靶向臂、5'和3'側翼連接有重組酶識別位點的選擇盒， 以及用於靶向小鼠 JX2的3'端的小鼠 λ序列的靶向臂。在一個實施方案中，選擇盒為 Frt'ed Hyg-TK盒。在一個實施方案中，3'靶向臂包含小鼠 CA 2、J λ 4、C λ 4和小鼠增強子 2· 4。
[0097] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含：用於 靶向VAl的5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、5'和3'側翼連接有重組酶識別位點的選擇 盒以及用於靶向小鼠 CAl的3'端的小鼠 λ序列的3'靶向臂。在一個實施方案中，選擇 盒為Ioxed新黴素盒。在一個實施方案中，3'靶向臂包含小鼠 λ3'增強子和小鼠 λ3'增 強子3.1。
[0098] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含用於 革巴向νλ 2的5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、5'和3'偵懷連接有重組酶識別位點的選擇 盒以及用於靶向小鼠 JA 2的3'端與小鼠 CA 2的5'端的小鼠 λ序列的3'靶向臂。在 一個實施方案中，選擇盒為Frt'ed潮黴素-TK盒。在一個實施方案中，3'靶向臂包含小鼠 C λ 2-J λ 4-C λ 4基因區段和小鼠 λ增強子2. 4。
[0099] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含用於靶 向νλ 2的5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、5'和3'側翼連接有重組酶識別位點的選擇盒、 包含從hV λ 3-12下遊至hj λ 1的末端的人λ輕鏈基因座的連續區域的人基因組片段，以 及用於靶向小鼠 JA 2的3'端的小鼠 λ序列的3'靶向臂。在一個實施方案中，選擇盒為 Frt'ed新黴素盒。在一個實施方案中，3'靶向臂包含小鼠 CA 2-J λ 4-C λ 4基因區段和小 鼠 λ增強子2. 4。
[0100] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其包含從hV λ 3-12下遊至hj λ 1的末端 的人λ輕鏈基因座的連續區域。
[0101] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含用於靶 向νλ 2的5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、5'和3'側翼連接有重組酶識別位點的選擇盒， 以及包含從hV λ 3-27下遊至hV λ 2-8的末端的人λ輕鏈基因座的連續區域的人基因組片 段。在一個實施方案中，選擇盒為Frt'ed潮黴素盒。在一個實施方案中，人基因組片段包 含3'靶向臂。在具體的實施方案中，3'靶向臂包含約53 kb的從hVA 3-12下遊至hVA 2-8 的末端的人λ輕鏈基因座。
[0102] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其包含從hV λ 3-27下遊至hV λ 3-12的末 端的人λ輕鏈基因座的連續區域。
[0103] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含：用於 靶向VA 2的5'端的小鼠 λ基因座的靶向臂、5'和3'側翼連接有重組酶識別位點的選擇 盒、包含從hV λ 5-52下遊至hV λ 1-40的末端的人λ輕鏈基因座的連續區域的第一人基因 組片段、限制性酶位點以及包含從hV λ 3-29下遊至hV λ 82Κ的末端的人λ輕鏈基因座的 連續區域的第二人基因組片段。在一個實施方案中，選擇盒為Frt'ed新黴素盒。在一個實 施方案中，限制性酶位點為歸巢內切核酸酶的位點。在具體的實施方案中，歸巢內切核酸酶 為Pl-Scel。在一個實施方案中，第二人基因組片段為3'靶向臂。在具體的實施方案中，3' 靶向臂包含約27 kb的從hV λ 3-29下遊至hV λ 82K的末端的人λ輕鏈基因座。
[0104] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其包含從hV λ 5-52下遊至hV λ 1-40的末 端的人λ輕鏈基因座的連續區域。
[0105] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含：用於 靶向內源Vk基因區段的5'端的小鼠 κ基因座的靶向臂、兩個並置的重組酶識別位點、並 置的重組酶識別位點的3'端的選擇盒以及用於靶向κ輕鏈可變基因區段的5'端的小鼠 κ序列的3'靶向臂。在一個實施方案中，並置的重組酶識別位點彼此以相反的方向放置。 在具體的實施方案中，重組酶識別位點是不同的。在另一個具體的實施方案中，重組酶識別 位點為IoxP位點和1〇χ511位點。在一個實施方案中，選擇盒為新黴素盒。
[0106] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含：用 於靶向小鼠 Jk基因區段的5'端的小鼠 κ基因座的靶向臂、選擇盒、選擇盒3'端的重 組酶識別位點以及用於靶向小鼠 Jk基因區段的3'端與小鼠 κ內含增強子（intronic enhancer)的5'端的小鼠 κ序列的3'靶向臂。在一個實施方案中，選擇盒為潮黴素 -TK 盒。在一個實施方案中，重組酶識別位點在轉錄上處於與選擇盒相同的方向。在具體的實 施方案中，重組酶識別位點為IoxP位點。
[0107] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體，其在轉錄的方向上從5'至3'包含：包含 內源小鼠 Vk基因區段的5'端的序列的第一小鼠基因組片段、第一重組酶識別位點、第二 重組酶識別位點以及包含內源小鼠 Jk基因區段的3'端與小鼠 κ內含增強子的5'端之 間的序列的第二小鼠基因組片段。
[0108] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中遺傳修飾包括使用上述或本文中描述 的一個或多個DNA構建體進行的修飾。
[0109] 在一個方面，提供了分離的DNA構建體用於製備本文中描述的小鼠的用途。在一 個方面，提供了本文中描述的分離的DNA構建體用於產生抗原結合蛋白的方法的用途。 [0110] 在一個方面，提供了非人幹細胞，其包括包含上述和本文中描述的DNA構建體的 靶向載體。在一個方面，提供了非人幹細胞，其中非人幹細胞來源於本文中描述的小鼠。
[0111] 在一個實施方案中，非人幹細胞為胚胎幹（ES)細胞。在具體的實施方案中，ES細 胞為小鼠 ES細胞。
[0112] 在一個方面，提供了本文中描述的非人幹細胞用於產生本文中描述的小鼠的用 途。在一個方面，提供了本文中描述的非人幹細胞用於產生抗原結合蛋白的用途。
[0113] 在一個方面，提供了小鼠胚胎，其中小鼠胚胎包含本文中提供的遺傳修飾。在一個 實施方案中，提供了包含供體ES細胞的宿主小鼠胚胎，其中供體ES細胞包含本文中描述的 遺傳修飾。在一個實施方案中，小鼠胚胎為前桑椹胚期（pre-morula stage)胚胎。在具體 的實施方案中，前桑椹胚期胚胎為4細胞期胚胎或8細胞期胚胎。在另一個具體實施方案 中，小鼠胚胎為胚泡。
[0114] 在一個方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用於產生本文中描述的小鼠的用途。 在一個方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用於產生抗原結合蛋白的用途。
[0115] 在一個方面，提供了非人細胞，其中非人細胞包含來源於本文中描述的遺傳修飾 的小鼠的重排的免疫球蛋白輕鏈基因序列。在一個實施方案中，細胞為B細胞。在一個實 施方案中，細胞為雜交瘤。在一個實施方案中，所述細胞編碼體細胞突變的免疫球蛋白輕鏈 可變結構域和/或免疫球蛋白重鏈可變結構域。
[0116] 在一個方面，提供了非人細胞，其中非人細胞包含來源於本文中描述的遺傳修飾 的小鼠的重排的免疫球蛋白輕鏈基因序列。在一個實施方案中，細胞為B細胞。在一個實 施方案中，細胞為雜交瘤。在一個實施方案中，所述細胞編碼體細胞突變的免疫球蛋白輕鏈 可變結構域和/或免疫球蛋白重鏈可變結構域。
[0117] 在一個方面，提供了本文中描述的非人細胞用於產生本文中描述的小鼠的用途。 在一個方面，提供了本文中描述的非人細胞用於產生抗原結合蛋白的用途。
[0118] 在一個方面，提供了表達免疫球蛋白輕鏈的小鼠 B細胞，所述免疫球蛋白輕鏈包 含（a)來源於hVA基因區段和hJA基因區段的可變區；和（b)小鼠 Q基因。在一個實施 方案中，小鼠 Q基因選自Ck和CA基因。在具體的實施方案中，CA基因為CA 2。在具 體的實施方案中，小鼠 C λ基因來源於與小鼠 C λ 2具有至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。在一個實施方案中，小鼠 B細胞還表 達關聯重鏈，所述重鏈包含（c)來源於hVH，hDH，和（d)hJ H區段的可變區。在一個實施方案 中，B細胞不包含重排的λ基因。在另一個實施方案中，B細胞不包含重排的κ基因。
[0119] 在一個方面，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生抗體的方法，包括：(a)將遺傳 修飾的小鼠暴露於抗原，其中小鼠具有在內源輕鏈基因座上包含至少一個hVA和至少一 個hj λ的基因組，其中內源輕鏈基因座包含小鼠匕基因；(b)允許遺傳修飾的小鼠產生對 抗原的免疫應答；和（c)從（b)的小鼠分離特異性識別抗原的抗體，或從（b)的小鼠分離包 含特異性識別抗原的免疫球蛋白結構域的細胞，其中抗體包含來源於hVA、hJA和小鼠 Q 基因的輕鏈。在具體的實施方案中，小鼠 Q基因為小鼠 C κ基因。
[0120] 在一個實施方案中，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生抗體的方法，包括：(a) 將遺傳修飾的小鼠暴露於抗原，其中小鼠具有在內源κ基因座上包含至少一個hVA和在 κ基因座上包含至少一個hj λ的基因組，其中κ基因座包含小鼠 Ck基因；(b)允許遺傳 修飾的小鼠產生對抗原的免疫應答；和（C)從（b)的小鼠分離特異性識別抗原的抗體，或 從（b)的小鼠分離包含特異性識別抗原的免疫球蛋白結構域的細胞，其中抗體包含來源於 hVX、hJX和小鼠 Ck基因的輕鏈。
[0121] 在一個實施方案中，κ輕鏈恆定基因選自人C κ基因和小鼠 Ck基因。
[0122] 在一個實施方案中，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生抗體的方法，包括：(a) 將遺傳修飾的小鼠暴露於抗原，其中小鼠具有在λ輕鏈基因座上包含至少一個hVA和 在λ輕鏈基因座上包含至少一個的基因組，其中λ輕鏈基因座包含小鼠 CA基因； (b)允許遺傳修飾的小鼠產生對抗原的免疫應答；和（c)從（b)的小鼠分離特異性識別抗 原的抗體，或從（b)的小鼠分離包含特異性識別抗原的免疫球蛋白結構域的細胞，或在B的 小鼠中鑑定編碼結合抗原的重鏈和/或輕鏈可變結構域的核酸序列，其中抗體包含來源於 hVA、hJX和小鼠 CA基因的輕鏈。
[0123] 在一個實施方案中，λ輕鏈恆定基因選自人CA基因和小鼠 CA基因。在一個實 施方案中，λ輕鏈恆定基因為人CA基因。在具體的實施方案中，人CA基因選自CA 1、 CU 2、CA 3和CA 7。在一個實施方案中，λ輕鏈恆定基因為小鼠 CA基因。在具體的實 施方案中，小鼠 CX基因選自CX 1、CX 2和CX 3。在具體的實施方案中，小鼠 CX基因為 CA 2。在另一個具體的實施方案中，小鼠 CX基因來源於與小鼠 CA 2具有至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。
[0124] 在一個方面，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生重排的抗體基因的方法，包括： (a)將遺傳修飾的小鼠暴露於抗原，其中所述遺傳修飾在內源輕鏈基因座上包含hV λ和 hJA，其中內源輕鏈基因座包含小鼠 Q基因或其功能性片段；和，（b)在所述小鼠中鑑定重 排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包含λ輕鏈可變區基因區段和Q 基因或其功能性片段。
[0125] 在一個實施方案中，該方法還包括從小鼠克隆編碼重鏈和/或輕鏈可變區的核酸 序列，其中重鏈和/或輕鏈可變區來自包含人νλ和小鼠 Q的抗體。
[0126] 在一個實施方案中，小鼠 Q基因或其功能性片段選自人Q基因和小鼠 Q基因，或 其功能性片段。
[0127] 在一個實施方案中，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生重排的抗體基因的方 法，包括：(a)將遺傳修飾的小鼠暴露於抗原，其中所述遺傳修飾包括在κ輕鏈基因座上包 含hV λ和hj λ，其中κ輕鏈基因座包含小鼠 C κ基因或其功能性片段；和（b)在所述小 鼠中鑑定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含λ輕鏈可變區基因區 段和Ck基因或其功能性片段。
[0128] 在一個實施方案中，κ輕鏈恆定基因或其功能性片段選自人C κ基因和小鼠 Ck 基因或其功能性片段。
[0129] 在一個實施方案中，該方法還包括從小鼠克隆編碼重鏈和/或輕鏈可變區的核酸 序列，其中重鏈和/或輕鏈可變區來自包含人Vλ和小鼠 cK的抗體。
[0130] 在一個實施方案中，提供了用於在遺傳修飾的小鼠中產生重排的抗體基因的方 法，包括：(a)將遺傳修飾的小鼠暴露於抗原，其中所述遺傳修飾在小鼠 λ輕鏈基因座上包 含hVA和hJA，其中λ輕鏈基因座包含小鼠 CA基因或其功能性片段；和，（b)在所述小 鼠中鑑定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含λ輕鏈可變區基因區 段和CA基因或其功能性片段。
[0131] 在一個實施方案中，λ輕鏈恆定基因或其功能性片段選自人C λ基因和小鼠 CA 基因或其功能性片段。在具體的實施方案中，λ輕鏈恆定基因為小鼠 CA基因或其功能性 片段。
[0132] 在一個實施方案中，該方法還包括從小鼠克隆編碼重鏈和/或輕鏈可變區的核酸 序列，其中重鏈和/或輕鏈可變區來自包含人νλ和小鼠 CA的抗體。
[0133] 在一個方面，提供了用於產生抗體的方法，包括：將本文中描述的小鼠暴露於抗 原，讓小鼠產生包括產生特異性結合抗原的抗體的免疫應答，鑑定小鼠中的編碼重鏈的重 排的核酸序列和小鼠中的編碼抗體的關聯輕鏈可變結構域序列的重排的核酸序列，其中所 述抗體特異性結合抗原，和利用融合至人恆定結構域的重鏈和輕鏈可變結構域的核酸序列 來產生期望的抗體，其中期望的抗體包括包含融合至Q結構域的V λ結構域的輕鏈。在一 個實施方案中，V λ結構域為人的並且Q結構域為人或小鼠 C λ結構域。在一個實施方案 中，V λ結構域為小鼠的並且Q結構域為人或小鼠 CK結構域。
[0134] 在一個實施方案中，提供了用於產生抗體的方法，包括：將本文中描述的小鼠暴露 於抗原，讓小鼠產生包括產生特異性結合抗原的抗體的免疫應答，鑑定小鼠中的編碼重鏈 的重排的核酸序列和小鼠中的編碼抗體的關聯輕鏈可變結構域序列的重排的核酸序列，其 中所述抗體特異性結合抗原，和利用融合至人恆定結構域的核酸序列的重鏈和輕鏈可變結 構域的核酸序列來產生期望的抗體，其中期望的抗體包括包含融合至Ck結構域的νλ結 構域的輕鏈。
[0135] 在一個實施方案中，提供了用於產生抗體的方法，包括：將本文中描述的小鼠暴露 於抗原，讓小鼠產生包括產生特異性結合抗原的抗體的免疫應答，鑑定小鼠中的編碼重鏈 可變結構域的重排的核酸序列和編碼抗體的關聯輕鏈可變結構域序列的重排的核酸序列， 其中所述抗體特異性結合抗原，和利用融合至編碼人重鏈恆定結構域和人輕鏈恆定結構域 的核酸序列的所述核酸序列來產生來源於人序列的抗體，其中特異性結合抗原的抗體包括 包含融合至小鼠 CA結構域的人V λ結構域的輕鏈。
[0136] 在一個實施方案中，小鼠 CX區選自CX 1、CX 2和CX 3。在具體的實施方案中， 小鼠 CA區為CA 2。
[0137] 在一個方面，提供了用於產生重排的抗體輕鏈可變區基因序列的方法，包括（a) 將本文中描述的小鼠暴露於抗原；(b)讓小鼠產生免疫應答；（c)鑑定小鼠中的包含編碼與 小鼠 Q結構域融合的重排的人V λ結構域序列的核酸序列的細胞，其中細胞還編碼包含人 Vh結構域和小鼠 Ch結構域的關聯重鏈，並且其中細胞表達結合抗原的抗體；（d)從細胞克隆 編碼人V λ結構域的核酸序列和編碼關聯人Vh結構域的核酸序列；和，（e)使用編碼人V λ 結構域的克隆的核酸序列和編碼關聯人Vh結構域的克隆的核酸序列來產生完全人的抗體。
[0138] 在一個實施方案中，提供了用於產生重排的抗體輕鏈可變區基因序列的方法，包 括（a)將本文中描述的小鼠暴露於抗原；(b)使小鼠產生免疫應答；（c)鑑定小鼠中的包含 核酸序列的細胞，所述核酸序列編碼在相同核酸分子上與編碼小鼠 Ck結構域的核酸序列 連續的重排的人V λ結構域序列，其中細胞還編碼包含人Vh結構域和小鼠 Ch結構域的關 聯重鏈，並且其中細胞表達結合抗原的抗體；（d)從細胞克隆隆編碼人V λ結構域的核酸序 列和編碼關聯人Vh結構域的核酸序列；和（e)使用編碼人V λ結構域的克隆的核酸序列和 編碼關聯人Vh結構域的克隆的核酸序列來產生完全人的抗體。
[0139] 在一個實施方案中，提供了用於產生重排的抗體輕鏈可變區基因序列的方法，包 括（a)將本文中描述的小鼠暴露於抗原；(b)讓小鼠產生針對抗原的免疫應答；（c)鑑定小 鼠中的包含編碼與小鼠 CA結構域融合的重排的人V λ結構域序列的DNA的細胞，其中所 述細胞還編碼包含人Vh結構域和小鼠 Ch結構域的關聯重鏈，並且其中細胞表達結合抗原的 抗體；（d)從細胞克隆編碼重排的人V λ結構域的核酸序列和編碼關聯人Vh結構域的核酸 序列；和，（e)使用編碼人V λ結構域的克隆的核酸序列和編碼關聯人Vh結構域的克隆的 核酸序列了產生完全人的抗體。在一個實施方案中，小鼠 CA結構域為小鼠 CA 2。在具體 的實施方案中，小鼠 C λ結構域來源於與小鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至 少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。
[0140] 在一個方面，提供了表達融合至內源輕鏈恆定區（CJ的人λ來源的輕鏈的遺傳 修飾的小鼠，其中小鼠在用抗原免疫後，產生包含融合至小鼠 Q結構域的人νλ結構域的 抗體。在一個實施方案中，小鼠 Cli結構域選自Ck結構域和CA結構域。在一個實施方案 中，小鼠 Q結構域為C κ結構域。在一個實施方案中，小鼠 Q結構域為C λ結構域。在具 體的實施方案中，CA結構域為CA2。在具體的實施方案中，小鼠 CA結構域來源於與小 鼠 C λ 2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同一性的 CA基因。
[0141] 在一個方面，提供了包含本文中描述的修飾的內源κ或λ輕鏈基因座的遺傳修 飾的小鼠，其表達與多個免疫球蛋白重鏈相關的多個免疫球蛋白λ輕鏈。在一個實施方案 中，重鏈包括人序列。在多個實施方案中，人序列選自可變序列、C H1、鉸鏈、CH2、CH3及其組 合。在一個實施方案中，多個免疫球蛋白λ輕鏈包括人序列。在多個實施方案中，人序列 選自可變序列、恆定序列及其組合。在一個實施方案中，小鼠包括失能的內源免疫球蛋白基 因座，並且從轉基因或染色體外附加體表達重鏈和/或λ輕鏈。在一個實施方案中，小鼠 在內源小鼠基因座上包括，利用一個或多個人免疫球蛋白序列對一些或所有內源小鼠重鏈 基因區段（S卩，V、D、J)和/或一些或所有內源小鼠重鏈恆定序列（例如，C H1、鉸鏈、Ch2、Ch3 或其組合）和/或一些或所有內源小鼠輕鏈序列（例如，V、J、恆定區或其組合）的替換。
[0142] 在一個方面，提供了適用於產生具有人λ來源的輕鏈的抗體的小鼠，其中在小鼠 中產生的所有或基本上所有抗體經表達具有人λ來源的輕鏈。在一個實施方案中，從內源 輕鏈基因座表達人λ來源的輕鏈。在一個實施方案中，內源輕鏈基因座為κ輕鏈基因座。 在具體的實施方案中，K輕鏈基因座為小鼠 K輕鏈基因座。
[0143] 在一個方面，提供了用於產生人抗體的λ來源的輕鏈的方法，包括從本文中描述 的小鼠獲得輕鏈序列和重鏈序列，以及使用輕鏈序列和重鏈序列來產生人抗體。
[0144] 在一個方面，提供了用於產生抗原結合蛋白的方法，包括將本文中描述的小鼠暴 露於抗原；讓小鼠產生免疫應答；和從小鼠獲得結合抗原的抗原結合蛋白，或從小鼠獲得 用於產生結合抗原的抗原結合蛋白的序列。
[0145] 在一個方面，提供了來源於本文中描述的小鼠的細胞。在一個實施方案中，細胞選 自胚胎幹細胞、多能細胞、誘導的多能細胞、B細胞和雜交瘤。
[0146] 在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的細胞。在一個實施方案中，細胞 為小鼠細胞。在一個實施方案中，細胞選自雜交瘤和四源雜交瘤（quadroma)。在一個實施 方案中，細胞表達包含與小鼠恆定序列融合的人λ可變序列的免疫球蛋白輕鏈。在具體的 實施方案中，小鼠恆定序列為小鼠 κ恆定序列。
[0147] 在一個方面，提供了來源於本文中描述的小鼠的組織。
[0148] 在一個方面，提供了本文中描述的小鼠或細胞的用於產生抗原結合蛋白的用途。 在一個實施方案中，抗原結合蛋白為人蛋白質。在一個實施方案中，人蛋白質為人抗體。
[0149] 在一個方面，提供了由本文中描述的小鼠、細胞、組織或方法產生的抗原結合蛋 白。在一個實施方案中，抗原結合蛋白為人蛋白質。在一個實施方案中，人蛋白質為人抗體。
[0150] 除非另外明確地指出或從上下文中很明顯的看出，否則可將本文中描述的任何實 施方案和方面彼此結合使用。通過參考隨後的描述，其它實施方案對於本領域技術人員將 變得很顯然。
[0151] 附圖概述
[0152] 圖1顯示了包括V λ基因區段的簇（A、B和C)以及J λ和C λ區對（J-C對）的 人λ輕鏈基因座的不按比例的詳細說明。
[0153] 圖2顯示了用於使內源小鼠 λ輕鏈基因座失活的靶向策略的不按比例的總體說 明。
[0154] 圖3顯示了用於使內源小鼠 κ輕鏈基因座失活的靶向策略的不按比例的總體說 明。
[0155] 圖4Α顯示用於靶向內源小鼠 λ輕鏈基因座的具有人λ輕鏈序列（包括12個 hV λ基因區段和hj λ 1基因區段）的初始靶向載體（12/1-λ靶向載體）的不按比例的總 體說明。
[0156] 圖4Β顯示4個用於靶向內源小鼠 κ輕鏈基因座的具有人λ輕鏈序列的初始靶 向載體的不按比例的總體說明，所述載體分別包括12個hVA基因區段以及hJA 1基因區 段（12/1-κ靶向載體）、12個hVA基因區段以及hJAl、2、3和7基因區段（12/4-κ靶向 載體）、12個1^入基因區段、人^ 1^基因組序列以及}^入1基因區段（12(1〇1-1^靶 向載體）和12個hV λ基因區段、人V κ-J κ基因組序列以及hj λ 1、2、3和7個基因區段 (12(κ)4_κ革巴向載體）。
[0157] 圖5Α顯示了用於將40個hV λ基因區段和單個hj λ基因區段逐步插入小鼠 λ 輕鏈基因座內的靶向策略的不按比例的總體說明。
[0158] 圖5Β顯示了用於將40個hV λ基因區段和單個hj λ基因區段逐步插入小鼠 κ 基因座內的靶向策略的不按比例的總體說明。
[0159] 圖6顯示了用於產生獨特人λ-Κ雜交靶向載體的靶向和分子工程步驟的不按比 例的總體說明，所述雜交靶向載體用於構建包含人κ基因間序列、多個hJA基因區段或這 兩者的雜交輕鏈基因座。
[0160] 圖7A顯示包含有效地連接至內源CA 2基因的40個hVA基因區段和單個hJA 基因區段的修飾的小鼠 λ輕鏈基因座的基因座結構的不按比例的總體說明。
[0161] 圖7Β顯示4個獨立的修飾的小鼠 κ輕鏈基因座的基因座結構的不按比例的總體 說明，所述基因座包含有效地連接至內源Ck基因的40個hVA基因區段和1或4個hJA 基因區段，並且具有或不具有連續的人Vk-Jk基因組序列。
[0162] 圖8A顯示來自野生型小鼠（WT)、對於包括人V κ-J κ基因組序列的12個hV λ和 4個hJX基因區段是純合的小鼠（12hVA-VK JK-4hJA)以及對於40個hVX和1個hJA 基因區段是純合的小鼠（40hVX-IhJX)的針對⑶19+門控的IgA +和IgK+脾細胞的等值 線圖。
[0163] 圖8B顯示從野生型（WT)、對於包括人Vk-Jk基因組序列的12個hVA和4個 hJA基因區段是純合的小鼠（12hVA-VK JK-4hJA)以及對於40個hVX和1個hJA基 因區段是純合的小鼠（40hV λ-IhJ λ)收穫的脾中的⑶19+B細胞的總數。
[0164] 圖9Α，在上圖框中，顯示了來自野生型小鼠（WT)和對於包括人Vk-Jk基因組序 列的40個hV λ和4個J λ基因區段是純合的小鼠（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )的針對單線態 (singlet)門控和針對B和T細胞（分別地CD19+和CD3+)染色的脾細胞的等值線圖。下圖 框顯示了來自野生型小鼠（WT)和對於包括人Vk-Jk基因組序列的40個hVA和4個JA 基因區段是純合的小鼠（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )的針對⑶19+門控和針對Ig λ +和Ig κ +的 表達染色的脾細胞的等值線圖。
[0165] 圖9Β顯示從野生型小鼠（WT)和對於包括人V κ -J κ基因組序列的40個hV λ和 4個JX基因區段是純合的小鼠（40hVA-VK JK-4hJA)收穫的脾中的CD19+、CD19+IgK + 和CD19+IgX+B細胞的總數。
[0166] 圖9C顯示來自野生型小鼠（WT)和對於包括人Vk-Jk基因組序列的40個 hVA和4個JX基因區段是純合的小鼠（40hVA-VK JK-4hJA)的針對CD19+門控和針 對免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾細胞的等值線圖。在各個等值線圖 上標明了成熟（對於WT，72 ;對於40hVA-VK JK-4hJA，51)和過渡（對於WT，13 ;對於 40hV λ -V κ J κ -4hJ λ，22) B 細胞。
[0167] 圖9D顯示從野生型小鼠（WT)和對於包括人V κ -J κ基因組序列的40個hV λ和 4個JX基因區段是純合的小鼠（40hVX-VKjK-4hJX)收穫的脾中的⑶19+B細胞、過渡 B 細胞（CDig+IgMhiIgDltO 和成熟 B 細胞（CDig+IgM1t5IgDhi)的總數。
[0168] 圖10A，在上圖框中，顯示了來自野生型小鼠（WT)和對於包括人V K-J κ基因組 序列的40個hV λ和4個J λ基因區段是純合的小鼠（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )的針對B 和T細胞（分別地，CD19+和CD3+)染色的骨髓的等值線圖。下圖框顯示了來自野生型小鼠 (WT)和對於包括人Vk-Jk基因組序列的40個hVX和4個JX基因區段是純合的小鼠 (40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )的針對CD19+門控和針對ckit+和CD43+染色的骨髓的等值線圖。 祖B細胞（Pro B cell)和前B細胞標示於下圖框的等值線圖上。
[0169] 圖IOB顯示從野生型小鼠（WT)和對於包括人V κ-J κ基因組序列的40個hV λ 和4個J λ基因區段是純合的小鼠（40hV λ -V κ J κ -4hJ λ )的股骨收穫的骨髓中的祖B細 胞（CD19+CD43+ckit+)和前 B 細胞（CD19+CD43-cki〇 的數目。
[0170] 圖IOC顯示來自野生型小鼠（WT)和對於包括人V K -Jk基因組序列的40個hV λ 和4個JA基因區段是純合的小鼠（40hVA-VKjK-4hJA)的針對單線態門控的、針對免 疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓的等值線圖。未成熟的、成熟的和祖/前B細胞標示 於各個等值線圖上。
[0171] 圖IOD顯示從野生型小鼠（WT)和對於包括人V κ-J κ基因組序列的40個hV λ 和4個JA基因區段是純合的小鼠（40hVA-Vk Jk _4hJA)的股骨分離的骨髓中的未成熟 (B220intIgM+)和成熟（B220 hiIgM+)B 細胞的總數。
[0172] 圖IOE顯示從野生型小鼠（WT)和對於包括人Vk -Jk基因組序列的40個hV λ 和4個JA基因區段是純合的小鼠（40hVA-VKjK-4hJA)的股骨分離的、針對未成熟 (B220intIgM +)和成熟（B220hiIgM+)B細胞門控的、針對IgX和IgK表達染色的骨髓的等值 線圖。
[0173] 圖11顯示從在內源小鼠 κ輕鏈基因座上具有人λ輕鏈基因序列的小鼠的脾 細胞RNA擴增的18個獨立的RT-PCR克隆的V λ -J λ -C κ連接的核苷酸序列比對。Α6 = SEQ ID NO:57 ；B6 = SEQ ID NO:58 ；F6 = SEQ ID NO:59 ；B7 = SEQ ID NO:60 ；E7 = SEQ ID NO:61 ;F7 = SEQ ID NO:62 ;C8 = SEQ ID NO:63 ;E12 = SEQ ID NO:64 ; 1-4 = SEQ ID NO:65 ； 1-20 = SEQ ID NO:66 ；3B43 = SEQ ID NO:67 ；5-8 = SEQ ID NO:68 ；5-19 = SEQ ID N0:69 ；1010 = SEQ ID N0:70 ；11A1 = SEQ ID N0:71 ；7A8 = SEQ ID N0:72 ；3A3 = SEQ ID N0:73;2-7 = SEQ ID N0:74。小寫鹼基表示因重組過程中的突變和/或N添加而產生的非 種系鹼基。由hj λ 1和小鼠 Ck的核苷酸序列編碼的構架4區域（FWR4)內的共有胺基酸 示於序列比對的底部。
[0174] 圖12顯示從在內源小鼠 κ輕鏈基因座上具有包括連續的人Vk-Jk基因組序列 的人λ輕鏈基因序列的小鼠的脾細胞RNA擴增的12個獨立的RT-PCR克隆的VA-JA-Ck 連接的核苷酸序列比對。5-2 = SEQ ID NO:87;2-5 = SEQ ID NO:88; 1-3 = SEQ ID NO:89; 4B-1 = SEQ ID N0:90 ；3B-5 = SEQ ID NO:91 ；7A-1 = SEQ ID NO:92 ；5-l = SEQ ID N0:93 ； 4A-1 = SEQ ID NO:94 ；IIA-I = SEQ ID NO:95 ；5-7 = SEQ ID NO:96 ；5-4 = SEQ ID N0:97 ； 2-3 = SEQ ID N0:98。小寫鹼基表示因重組過程中的突變和/或N添加而產生的非種系鹼 基。由各個人JA和小鼠 Ck的核苷酸序列編碼的構架4區域（FWR4)內的共有胺基酸示 於序列比對的底部。
[0175] 圖13顯示從在內源小鼠 λ輕鏈基因座上具有人λ輕鏈基因序列的小鼠的脾細 胞RNA擴增的3個獨立RT-PCR克隆的V λ -J λ -C λ連接的核苷酸序列比對。2D1 = SEQ ID NO: 101 ;2D9 = SEQ ID NO: 102 ;3E15 = SEQ ID NO: 103。小寫鹼基表示因重組過程中的突 變和/或N添加而產生的非種系鹼基。由hJA 1和小鼠 CA 2的核苷酸序列編碼的構架4 區域（FWR4)內的共有胺基酸示於序列比對的底部。
[0176] 發明詳述
[0177] 雖然詳細地論述了不同實施方案的具體特徵，但具體方面、實施方案和實施例的 描述不限制權利要求的主題；權利要求描述了本發明的範圍。本文中使用的所有術語和短 語包括本領域中通常賦予它們的含義。
[0178] 術語"連續的"是指，在相同核酸分子上的存在，例如，如果兩個核酸序列存在於相 同核酸分子上但被另一個核酸序列中斷，則它們是"連續的"。例如，重排的V(D) J序列與恆 定區基因序列是"連續的"，雖然V (D) J序列的最後一個密碼子之後並未緊接恆定區序列的 第一個密碼子。在另一個實例中，如果兩個V基因區段序列存在於相同的基因組片段上，則 它們是"連續的"，儘管它們可被不編碼V區域的密碼子的序列隔開，例如它們可被調控序 列例如啟動子或其它非編碼序列隔開。在一個實施方案中，連續序列包括包含如在野生型 基因組中發現的排列的基因組序列的基因組片段。
[0179] 短語"來源於"，當在"來源於"引述的基因或基因區段的可變區方面使用時，包括 使序列追溯至特定未重排的基因區段的能力，所述未重排的基因區段經重排以形成表達可 變結構域的基因（在適用的情況下，解釋剪接差異和體細胞突變）。
[0180] 短語"功能性"，當在可變區基因區段或連接基因區段方面使用時，是指在表達的 抗體庫中的使用；例如，在人Υλ基因區段中3-1、4-3、2-8等是功能性的，而νλ基因區段 3-2、3-4、2-5等是非功能性的。
[0181] "重鏈基因座"包括染色體例如小鼠染色體上的位置，其中在野生型小鼠中發現重 鏈可變區（V h)、重鏈多樣性區（Dh)、重鏈連接區（Jh)和重鏈恆定區（Ch)DNA序列。
[0182] " κ基因座"包括染色體例如小鼠染色體上的位置，其中在野生型小鼠中發現κ 可變區（Vk)、κ連接區（Jk)和κ恆定區（Ck) DNA序列。
[0183] " λ基因座"包括染色體例如小鼠染色體上的位置，其中在野生型小鼠中發現λ 可變區（νλ)、λ連接區（JX)和λ恆定區（CX)DNA序列。
[0184] 術語"未重排的"包括免疫球蛋白基因座的這樣的狀態，其中V基因區段和J基因 區段（對於重鏈，還有D基因區段）分開地存在，但能夠被連接以形成包含V(D)J庫的單個 V、（D)、J的重排的V⑶J基因。
[0185] 表達人λ可變結構域的小鼠
[0186] 先前已報導了表達完全人或部分人且部分小鼠的抗體的小鼠。 VELOC IMMUNE?基因工程小鼠包括，利用人V⑶J基因區段對內源小鼠基因座上的未重 排的V(D)J基因區段的替換。VELOGIMMUNE?小鼠表達具有人可變結構域和小鼠恆定 結構域的嵌合抗體（參見，例如，美國專利7, 605, 237)。大部分其它報導涉及，在具有失能 的內源免疫球蛋白基因座的小鼠中從完全人轉基因表達完全人抗體的小鼠。
[0187] 抗體輕鏈由兩個分開的基因座：kappa( κ )和lambda( λ )之一編碼。小鼠抗體輕 鏈主要為κ型。產生小鼠抗體的小鼠和產生完全人或嵌合人-小鼠抗體的修飾的小鼠在 輕鏈使用上顯示偏愛性。人也顯示輕鏈偏愛性，但不像小鼠這樣明顯；小鼠的K輕鏈對λ 輕鏈的比率為約95:5,然而在人中，該比率為約60:40。小鼠中的更明顯的偏愛性據認為不 會嚴重地影響抗體多樣性，因為在小鼠中，λ可變基因座並不是如此多樣的。在人中情況 則不同。人λ輕鏈基因座是豐富多樣的。
[0188] 人λ輕鏈基因座延伸超過1，〇〇〇 kb並且包含超過80個編碼可變（V)或連接（J) 區段的基因（圖1)。在人λ輕鏈基因座內，超過一半的所有觀察到的νλ結構域由基因區 段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21編碼。總體上，約30個左右的人V λ基因區段據認為是功能 性的。存在7個JA基因區段，其中僅4個被認為是通常具有功能的JA基因區段--JAl、 JA 2、JA 3 和 JA 7。
[0189] 人中的λ輕鏈基因座在結構上與小鼠和人中的K基因座相似，因為人λ輕鏈基 因座具有幾個能夠重組以形成功能性輕鏈蛋白質的可變區基因區段。人λ輕鏈基因座包 含約70個V基因區段和7個JA-CX基因區段對。此類-CX基因區段對中僅有4個 顯示是功能性的。在一些等位基因中，第五JA-CA基因區段對據報導為假基因 （CA 6)。 70 νλ基因區段顯示包含38個功能性基因區段。70個νλ序列排列在3個簇中，其全都 包含不同V基因家族組的不同成員（Α、Β和C簇；圖1)。這是用於在非人動物中產生具有 人V區域的抗體的相對未利用的多樣性的潛在豐富資源。
[0190] 形成鮮明對比地，小鼠 λ輕鏈基因座僅包含2個或3個（取決於品系）小鼠 νλ 區基因區段（圖2)。至少因為該原因，小鼠中的嚴重的κ偏愛性據認為對總的抗體多樣性 不是特別有害。
[0191] 根據小鼠 λ輕鏈基因座的已公布的圖譜，該基因座基本上由在約200 kb的跨度 內的兩個基因區段簇組成（圖2)。這兩個簇包含兩組能夠獨立地重排的V、J和C基因： V λ 2-J λ 2-C λ 2-J λ 4-C λ 4 和 V λ I-J λ 3-C λ 3-J λ I-C λ 1 〇 雖然已發現 V λ 2 與所有 J λ 基因區段重組，但V λ 1顯示只與C λ 1重組。C λ 4據認為是具有缺陷性剪接位點的假基因。
[0192] 小鼠 κ輕鏈基因座明顯不同。來自小鼠Κ基因座的參與導致功能性輕鏈蛋白的 重組事件的基因區段的結構和數目要複雜得多（圖3)。因此，小鼠 λ輕鏈未對一般小鼠中 的抗體群體的多樣性作出巨大貢獻。
[0193] 在小鼠中利用人λ輕鏈基因座的豐富多樣性，特別地，將很可能產生用於輕鏈V 結構域的更完全的人庫的來源。先前利用該多樣性的嘗試使用包含大量隨機整合入小鼠基 因組的人λ輕鏈基因座的人轉基因（參見，例如，US 6, 998, 514和US 7, 435, 871)。包含此 類隨機整合的轉基因的小鼠據報導表達完全人λ輕鏈，然而，在一些情況下，一個或兩個 內源輕鏈基因座保持完整。該情形是不想要的，因為人λ輕鏈序列與小鼠輕鏈（ Κ或λ) 在小鼠的表達的抗體庫中相對抗。
[0194] 相比之下，本發明人描述了遺傳修飾的小鼠，其能夠從小鼠輕鏈基因座直接表達 一個或多個λ輕鏈核酸序列，包括通過內源小鼠輕鏈基因座上的替換。能夠從內源基因座 表達人λ輕鏈序列的遺傳修飾的小鼠可被進一步培育成包含人重鏈基因座，從而可用於 表達包含完全人的V區（重鏈和輕鏈）的抗體的小鼠。在多種實施方案中，V區與小鼠恆 定區一起表達。在多種實施方案中，內源小鼠免疫球蛋白基因區段不存在並且V區與人恆 定區一起表達。此類抗體被證明在許多應用（診斷以及治療）中是有用的。
[0195] 對於在小鼠中表達來源於人νλ和JA基因區段的結合蛋白的各種實施方案，可 實現許多有利方面。可通過將人λ序列置於內源輕鏈基因座例如小鼠 κ或λ基因座上 來實現有利方面。從此類小鼠產生的抗體可具有包含融合至小鼠 Q區（特別地小鼠 Ck或 CU區）的人VA結構域的輕鏈。小鼠還將表達人νλ結構域，所述人νλ結構域適於與人 Q區（特別地Ck和/或CA區）一起用於鑑定和克隆。因為此類小鼠中的B細胞發育在 其它方面是正常的，所以能夠在CA或Ck區的背景中產生相容的νλ結構域（包括體細 胞突變的V λ結構域）。
[0196] 描述了在免疫球蛋白κ或λ輕鏈基因座上包含未重排的V λ基因區段的遺傳修 飾的小鼠。描述了表達包含具有融合至Ck和/或CA區的人νλ結構域的輕鏈的抗體的 小鼠。
[0197] 免疫球蛋白κ輕鏈基因座的不表達轉錄物（Sterile Transcript)
[0198] 在小鼠中表達人免疫球蛋白λ序列的主題的變化反映在能夠進行此類表達的遺 傳修飾的小鼠的不同實施方案上。因此，在一些實施方案中，遺傳修飾的小鼠包含來自人基 因座的某些非編碼序列。在一個實施方案中，遺傳修飾的小鼠在內源κ輕鏈基因座上包含 人νλ和JA基因區段，並且還包含人 Κ輕鏈基因組片段。在具體的實施方案中，人Κ輕 鏈基因組片段為在人Vk基因區段與人Jk基因區段之間天然發現的非編碼序列。
[0199] 人和小鼠 κ輕鏈基因座包含編碼不表達轉錄物的序列，所述轉錄物不存在起始 密碼子或開放閱讀框架，並且被當作是調控κ輕鏈基因座的轉錄的元件。此類不表達轉錄 物產生自位於最接近的V κ基因區段的下遊或3'端與處於κ輕鏈恆定區基因（Ck)的上 遊的κ輕鏈內含增強子（EKi)的上遊或5'端之間的基因間序列。不表達轉錄物產生自 基因間序列的重排（以形成融合至Ck的Vk JkI區段）。
[0200] 處於Ck基因的上遊的Κ輕鏈基因座的替換可除去編碼不表達轉錄物的基因間 區域。因此，在多種實施方案中，利用人λ輕鏈基因區段對小鼠 Ck基因上遊的小鼠Κ輕 鏈序列的替換將導致人源化小鼠 κ輕鏈基因座，所述基因座包含人νλ和基因區段但 不包含編碼不表達轉錄物的κ輕鏈基因間區域。
[0201] 如本文中所描述的，利用人λ輕鏈基因區段對內源小鼠Κ輕鏈基因座的人源化 (其中人源化除去基因間區域）導致，與λ輕鏈使用的顯著增加偶聯的κ輕鏈基因座的使 用的顯著下降。因此，雖然不存在基因間區域的人源化小鼠是有用的（因為其可產生具有 人輕鏈可變結構域（例如，人λ或κ結構域）的抗體），但是來自基因座的使用減少。
[0202] 還描述了，利用人νλ和基因區段對內源小鼠 Κ輕鏈基因座的人源化，該人 源化偶聯人κ基因間區域的插入以產生νλ基因座，所述基因座在轉錄上在最後一個人 νλ基因區段與第一個人JA基因區段之間包含Κ基因間區域；所述基因座與不存在Κ基 因間區域的基因座相比，在B細胞群體中顯示了更高的表達。該觀察結果與這樣的假說相 符：基因間區域一通過不表達轉錄物直接地，或間接地一抑制內源λ輕鏈基因座的使用。 在這樣的假說下，包括所述基因間區域將導致內源λ輕鏈基因座的使用減少，從而使得小 鼠限制性選擇，但利用修飾的（λ至κ)基因座來產生抗體。
[0203] 在不同的實施方案中，利用人λ輕鏈序列對小鼠 Ck基因上遊的小鼠Κ輕鏈序 列的替換還在轉錄方向上包括，置於最3'端的νλ基因區段的3'非翻譯區與第一個人JA 基因區段的5'端之間的人κ輕鏈基因間區域。或者，這樣的基因間區域可通過在內源λ 輕鏈基因座中產生缺失而從替換的內源κ輕鏈基因座（在小鼠 Cκ基因的上遊）省略。同 樣地，在該實施方案下，小鼠從包含人λ輕鏈序列的內源κ輕鏈基因座產生抗體。
[0204] 工程化小鼠以表達人V λ結構域的方法
[0205] 描述了產生遺傳修飾的小鼠的各種方法，所述遺傳修飾的小鼠產生包含具有融合 至內源CJ例如Ck或CA)區的人Υλ結構域的輕鏈的抗體。描述了遺傳修飾，在不同的 實施方案中，所述遺傳修飾包括一個或兩個內源輕鏈基因座的缺失。例如，為了從內源抗體 庫消除小鼠 λ輕鏈，可進行第一 VA-JA-CA基因簇的缺失和利用人Υλ-JA基因區段完 全或部分地替換第二基因簇的νλ-JA基因區段。還提供了遺傳修飾的小鼠的胚胎、細胞， 以及用於產生所述小鼠、小鼠胚胎和細胞的靶向構建體。
[0206] -個內源VX-JX-CX基因簇的缺失和另一個內源VX-JX-CX基因簇的 VA-JA基因區段的替換，在不同的實施方案中，對動物的天然抗體恆定區的締合和功能具 有相對最小的破壞，因為內源CA基因保持完整並從而保持正常的功能性和與內源重鏈恆 定區締合的能力。因此，在此類實施方案中，取決於用於裝配包含2條重鏈和2條輕鏈的功 能性抗體分子的功能性輕鏈恆定區，修飾不影響其它內源重鏈恆定區。此外，在不同實施方 案中，修飾不影響包括內源重鏈和輕鏈（例如連接至小鼠 CA區的hVA結構域）的功能性 膜結合的抗體分子的裝配。因為至少一個功能性CA基因保留在內源基因座上，所以包括 利用人V λ-J λ基因區段對內源V λ-J λ-C λ基因簇的V λ-J λ基因區段的替換的動物應 當能夠產生正常λ輕鏈，所述輕鏈能夠在免疫應答中通過存在於動物的表達的抗體庫中 的人V λ-J λ基因區段結合抗原。
[0207] 在圖2中提供了缺失的內源小鼠 V λ -J λ -C λ基因簇的示意性說明（未按比例）。 如所說明的，小鼠 λ輕鏈基因座被組織成2個基因簇，所述兩個基因簇都包含能夠重組以 形成功能性小鼠 λ輕鏈的功能性基因區段。內源小鼠 V λ I-J λ 3-C λ 3-J λ I-C λ 1基因簇 被具有側翼連接重組位點的新黴素盒的靶向構建體（靶向載體1)缺失。另一個內源基因 簇（V λ 2-V λ 3-J λ 2-C λ 2-J λ 4-C λ 4)被具有側翼連接有重組位點的潮黴素-胸苷激酶盒 的靶向構建體（靶向載體2)部分缺失。在該第二靶向事件中，CA 2-JA4-CA 4內源基因 區段得到保留。使用與第一靶向構建體（靶向載體1)不同的重組位點構建第二靶向構建 體（靶向載體2)，從而允許在已實現成功靶向後選擇性缺失選擇盒。所得的雙靶向基因座 在功能上被沉默，因為不能產生內源λ輕鏈。該修飾的基因座可用於插入人Υλ和JA基 因區段以產生包含人νλ和JA基因區段的內源小鼠 λ基因座，由此在修飾的基因座上重 組後，動物產生包含連接至內源小鼠 CA基因區段的重排的人νλ和JA基因區段的λ輕 鏈。
[0208] 在不同的實施方案中，遺傳修飾小鼠以使得內源λ基因區段不具有功能，這導致 在其抗體庫中只顯示κ輕鏈的小鼠，從而產生可用於評估λ輕鏈在免疫應答中的作用以 及可用於產生包含Vk結構域但不包含νλ結構域的抗體庫的小鼠。
[0209] 表達已在內源小鼠 λ輕鏈基因座上重組的連接至小鼠 CA基因的hVA的遺傳修 飾的小鼠可由本領域已知的任何方法產生。圖4A中提供了，利用人νλ和JA基因區段對 內源小鼠 νλ2-νλ3-】λ2基因區段的替換的示意性說明（未按比例）。如所說明的，內源 小鼠 λ輕鏈基因座（已使其無功能）被包括側翼連接有重組位點的新黴素盒的靶向構建 體（12/1-λ靶向載體）替換。V λ 2-V λ 3-J λ 2基因區段被包含含有12個hV λ基因區段 和單個hj λ基因區段的人λ序列的基因組片段置換。
[0210] 因此，該第一方法在內源λ輕鏈基因座上放置了與單個hJA基因區段連續的一 個或多個hVA基因區段（圖4A)。
[0211] 可通過使用類似的技術來實現對修飾的內源λ輕鏈基因座的進一步修飾（以插 入更多的hV λ基因區段）。例如，在圖5Α中提供了，用於逐步插入額外的人hV λ基因區段 的兩個另外的靶向構建體（+16-λ和+12-λ靶向載體）的示意性說明。如所說明的，使用 由先前插入的人λ輕鏈序列提供的同源性，在連續的步驟中將包含特定人hV λ基因區段 的另外的基因組片段插入修飾的內源λ輕鏈基因座。通過依次與每一個說明的靶向構建 體重組，將28個另外的hVA基因區段插入修飾的內源λ輕鏈基因座。這產生了嵌合基因 座，所述基因座產生包含連接至小鼠 CA基因的人νλ-JA基因區段的λ輕鏈蛋白質。
[0212] 在小鼠 λ基因座上插入人λ輕鏈基因區段的上述方法保持位於CA 2-JA4-CA 4 基因區段下遊的增強子（命名為Enh 2. 4、Enh和Enh3. 1，圖4A和圖5A)。該方法在內源小 鼠 λ輕鏈基因座上導致單個修飾的等位基因（圖7A)。
[0213] 提供了用於產生表達包含有效地連接至小鼠 CA基因區段的hVA和JA基因區 段的輕鏈的小鼠的組合物和方法，包括用於產生從內源小鼠 λ輕鏈基因座表達此類基因 的小鼠的組合物和方法。所述方法包括，選擇性地使一個內源小鼠 VA-JA-CA基因簇喪 失功能（例如，通過靶向缺失），並在內源小鼠 λ輕鏈基因座上使用hVA和JA基因區段， 以在小鼠中表達hV λ結構域。
[0214] 或者，在第二方法中，可將人λ輕鏈基因區段置於內源Κ輕鏈基因座上。在不同 的實施方案中，遺傳修飾包括內源κ輕鏈基因座的缺失。例如，為了從內源抗體庫消除小 鼠 κ輕鏈，可進行小鼠 Vk和】!^基因區段的缺失。還提供了遺傳修飾的小鼠胚胎、細胞， 以及用於產生所述小鼠、小鼠胚胎和細胞的靶向構建體。
[0215] 由於上述原因，小鼠 V κ和J κ基因區段的缺失使用相對最小的破壞。在圖3中 提供了，缺失的小鼠 Vk和Jk基因區段的示意性說明（未按比例）。通過位於兩個精確定 位的靶向載體（各自使用位點特異性重組位點）之間的小鼠序列的重組酶介導的缺失，來 缺失內源小鼠 Vk和Jk基因區段。將第一靶向載體（JK靶向載體）用於第一靶向事件 以缺失小鼠 Jk基因區段。將第二靶向載體（Vk靶向載體）用於第二隨後的靶向事件，以 缺失位於最遠端的小鼠 Vk基因區段的5'端的序列。兩個靶向載體都包含位點特異性重 組位點，從而允許在實現成功靶向後選擇性缺失兩個選擇盒和所有其間的小鼠 κ輕鏈序 列。所得的經缺失的基因座在功能上被沉默，因為不能產生內源κ輕鏈。該修飾的基因座 可用於插入hVX和JX基因區段以產生包含hVX和JX基因區段的內源小鼠 K基因座， 從而在修飾的基因座上重組後，動物產生包含有效地連接至內源小鼠 Ck基因區段的重排 的hVA和JA基因區段的λ輕鏈。可將不同的包含人λ輕鏈序列的靶向載體與該缺失 的小鼠 κ基因座結合使用，以產生包含與小鼠 Ck區有效連接的人λ基因區段的雜交輕 鏈基因座。
[0216] 因此，第二方法將一個或多個人νλ基因區段置於小鼠 Κ輕鏈基因座上，與單個 人JA基因區段連續（12/1-κ靶向載體，圖4Β)。
[0217] 在不同的實施方案中，可改進該方法以添加基因區段和/或調控序列，從而優化 小鼠抗體庫內來自小鼠 κ基因座的人λ輕鏈序列的使用。
[0218] 在第三方法中，將一個或多個hVA基因區段置於小鼠 Κ輕鏈基因座上，與4個 hj λ基因序列連續（12/4-κ靶向載體，圖4B)。
[0219] 在第三方法中，將一個或多個hVA基因區段置於小鼠 Κ輕鏈基因座上，與人κ 基因間序列和單個hj λ基因序列連續（12 (κ) I-κ靶向載體，圖4Β)。
[0220] 在第四方法中，將一個或多個hVA基因區段置於小鼠 Κ輕鏈基因座上，與人κ 基因間序列和4個hj λ基因序列連續（12 (04-κ靶向載體，圖4Β)。
[0221] 在小鼠 κ基因座上插入人λ輕鏈基因區段的所有上述方法維持在Ck基因上遊 的κ內含增強子元件（命名為Ek i，圖4Β和圖5Β)和在C κ基因下遊的3' κ增強子（命 名為Εκ3'，圖4B和圖5B)。所述方法在內源小鼠 κ輕鏈基因座上導致4個分開的修飾的 等位基因（圖7B)。
[0222] 在不同的實施方案中，遺傳修飾的小鼠包括內源小鼠 λ輕鏈基因座的敲除。在一 個實施方案中，通過缺失橫跨V λ 2至J λ 2的區域和橫跨V λ 1至C λ 1的區域的策略來敲 除λ輕鏈基因座（圖2)。減小或消除內源λ輕鏈基因座表達內源λ結構域的能力的任 何策略適合於與本公開內容中的實施方案一起使用。
[0223] 來自遺傳修飾的小鼠的λ結構域抗體
[0224] 在小鼠 κ或λ輕鏈基因座上包含人λ序列的小鼠將表達包含融合至小鼠 CJC κ 或(U)區的hVA區的輕鏈。將此類小鼠有利地培育成這樣的小鼠，所述小鼠（a)包含在 功能上被沉默的輕鏈基因座（例如，內源小鼠 κ或λ輕鏈基因座的敲除）；(b)包含含有 有效地連接至內源小鼠 CA基因的hV和hj基因區段的內源小鼠 λ輕鏈基因座；（c)包含 含有有效地連接至內源小鼠 Ck基因的hVK和hjK基因區段的內源小鼠 Κ輕鏈基因座； 和，（d)這樣的小鼠，其中一個κ等位基因包含hV κ和hj κ ;另一個κ等位基因包含hV λ 和hj λ ;-個λ等位基因包含hV λ和hj λ並且一個λ等位基因被沉默或敲除，或兩個 λ等位基因都包含hVX和hJX ;和，兩個重鏈等位基因各自包含hVH、hDdPhJH。
[0225] 通過將編碼hV λ結構域的核酸克隆入具有編碼人C λ的基因的表達構建體，來將 包含在Ck或CA的背景中表達的hVA結構域的抗體用於產生完全人抗體。將所得的表 達構建體轉染入適當的宿主細胞，以表達顯示融合至hCX的完全hV λ結構域的抗體。 實施例
[0226] 下列實施例被提供用以描述如何產生和使用本發明的方法和組合物，並且無意限 制本發明人所認定的本發明的範圍。除非另外指出，否則溫度以攝氏度表示，並且壓力為大 氣壓或接近大氣壓。
[0227] 實施例I
[0228] 小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座的缺失
[0229] 使用VELOGI GENE?技術（參見，例如，美國專利6, 586, 251和Valenzuela 等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6) :652-659)產生各種革巴向 構建體來修飾小鼠基因組細菌人工染色體（BAC)文庫，以使小鼠 κ和λ輕鏈基因座失活。
[0230] 小鼠 λ輕鏈基因座的缺失。通過同源重組修飾來自小鼠 BAC克隆 1^23-1351^15(11^壯(^11)的0嫩，以通過￥入-^-(：入基因簇的靶向缺失來使內源小鼠入 輕鏈基因座失活（圖2)。
[0231] 簡而言之，使用靶向載體在單個靶向事件中缺失包含V λ I-JA 3-C λ 3-J λ I-CA I 基因區段的整個近端簇，所述靶向載體包含側翼連接有IoxP位點的新黴素盒，具有包含 VAl基因區段5'端的序列的5'小鼠同源臂和包含CXl基因區段3'端的序列的3'小鼠 同源臂（圖2,靶向載體1)。
[0232] 製備第二靶向構建體以精確地缺失包含VX 2-JX 2-CX 2-JX 4-CX 4的遠端內源 小鼠 λ基因簇，除了靶向構建體包含含有νλ2基因區段5'端的序列的5'小鼠同源臂和含 有內源CA2基因區段5'端的序列的3'小鼠同源臂外（圖2,靶向載體2)。因此，第二靶向 構建體精確地缺失V λ 2-J λ 2,同時在內源小鼠 λ基因座上留下完整的CA 2-J λ 4-C λ 4。 通過本領域已知的核型分析和篩選方法（例如，Taqman馨）確認包含滅活的內源λ基因 座（如上文中描述的）的ES細胞。隨後從修飾的ES細胞分離DNA，將其經歷利用CRE重組 酶的處理，從而介導包含新黴素標記基因的近端靶向盒的缺失，僅在缺失點留下單個IoxP 位點（圖2,下圖）。
[0233] 小鼠 κ輕鏈基因座的缺失。使用類似的上述方法產生幾個靶向構建體，以通過同 源重組修飾來自小鼠 BAC克隆RP23-302gl2和RP23-254m04 (Invitrogen)的DNA，從而在兩 步法中使小鼠 κ輕鏈基因座失活（圖3)。
[0234] 簡而言之，使用靶向載體在單個靶向事件中缺失內源小鼠 κ輕鏈基因座的Jk基 因區段（1-5)，所述靶向載體包含潮黴素-胸苷激酶（hyg-TK)盒，且在hyg-TK盒的3'端含 有單個IoxP位點（圖3, Jk靶向載體）。用於產生該靶向載體的同源臂包含在內源小鼠 Jk基因區段的5'和3'端的小鼠基因組序列。在第二靶向事件中，製備第二靶向載體以 缺失最遠端的內源小鼠 Vk基因區段的上遊（5'）的小鼠基因組序列的部分（圖3，Vk靶 向載體）。該靶向載體包含反向l〇x511位點、IoxP位點和新黴素盒。用於產生該靶向載體 的同源臂包含在最遠端的小鼠 Vk基因區段上遊的小鼠基因組序列。依次（即，Jk然後 Vk)將靶向載體用於靶向ES細胞中的DNA。通過本領域已知的核型分析和篩選方法（例 如，Taqman?)確認具有雙革巴向的染色體（即，被兩個革巴向載體革巴向的單個內源小鼠 κ基因 座）的ES。隨後從修飾的ES細胞分離DNA，將其經歷利用Cre重組酶的處理，從而介導內 源小鼠 Vk基因區段和兩個選擇盒的缺失，同時以彼此相反的方向留下兩個並置的Iox位 點（圖 3,下圖；SEQ ID NO: 1)。
[0235] 因此，產生了兩個包含完整增強子和恆定區的修飾的內源輕鏈基因座（κ和入）， 用於以精確地方式使用下述靶向載體逐步插入未重排的人λ種系基因區段。
[0236] 實施例II
[0237] 用人λ輕鏈微小-基因座（Mini-Locus)對小鼠輕鏈基因座的替換
[0238] 工程化多個靶向載體以將人λ基因區段逐步插入內源小鼠K和λ輕鏈基因座 (使用類似的上述方法）。對內源輕鏈基因座進行多個獨立的初始修飾，每一個修飾產生包 含有效地連接至小鼠輕鏈恆定基因和增強子的hVA和JA基因區段的嵌合輕鏈基因座。
[0239] 包含12個人VX和1個人JX基因區段的人λ微小-基因座。使用稱為 RPl l-729g4的BAC克隆（Invitrogen)，對一系列初始靶向載體進行工程化以包含來自A簇 的前12個連續的人V λ基因區段和hj λ 1基因區段或4個hj λ基因區段。圖4A和4B分 別顯示了被構建用於產生人λ輕鏈基因區段在小鼠 λ和κ輕鏈基因座上的初始插入的 靶向載體。
[0240] 對於第一組初始靶向載體，工程化來自729g4 BAC克隆的包含12個hV λ基因區 段和hj λ 1基因區段的124, 125 bp DNA片段，以在hj λ 1基因區段的996 bp下遊（3'）包 含PI-SceI位點，用於連接3'小鼠同源臂。不同的兩組同源臂用於連接至該人片段；一組 同源臂包含來自135kl5 BAC克隆的內源小鼠 λ序列（圖4A)，另一組包含分別來自小鼠 BAC克隆RP23-302gl2和RP23-254m04的小鼠 Vk和Jk基因區段的5'和3'端的內源κ 序列（圖4B)。
[0241] 對於12/1-λ靶向載體（圖4A)，在實施例1中描述的修飾的小鼠 λ基因座的包 含小鼠 C λ 2-J λ 4-C λ 4和增強子2. 4的27, 847 bp DNA片段的5'末端上進行PI-SceI位 點的工程化。通過將約28 kb小鼠片段連接至約124 kb人λ片段而將其用作3'同源臂， 這產生了從5'至3'包含hj λ 1基因區段、在hj λ 1基因區段3'端的996 bp的人λ序列、 在小鼠 CX 2基因5'端的1229 bp的小鼠 λ序列、小鼠 CX 2基因和約28 kb小鼠片段的 剩餘部分的3'連接。人νλ3-12基因區段的上遊（5'）是在5'小鼠同源臂的起點之前的 另外1456 bp的人λ序列，所述5'小鼠同源臂包含相應於內源小鼠 λ基因座5'端的序 列的23, 792bp的小鼠基因組DNA。在5'同源臂與人λ序列的起點之間的是側翼連接有 Frt位點的新黴素盒。
[0242] 因此，12/1-λ靶向載體從5'至3'包括，5'同源臂（包含內源λ基因座5'端的 約24 kb的小鼠 λ基因組序列）、5' Frt位點、新黴素盒、3' Frt位點、約123 kb的人基因組 入序列（包含前12個連續的hVA基因區段和hJAl基因區段）、PI-SceI位點和3'同源 臂（包含約28 kb的小鼠基因組序列，包括內源C λ 2-J λ 4-C λ 4基因區段、小鼠增強子2. 4 序列和增強子2. 4下遊（3'）的另外的小鼠基因組序列）（圖4Α)。
[0243] 以類似的方式，12/1-κ靶向載體（圖4Β)使用相同的約124人λ片段，除了使用 包含小鼠 κ序列的小鼠同源臂，以便可通過同源重組實現對內源κ基因座的靶向外。因 此，12/1-κ靶向載體從5'至3'包括，5'同源臂（包含內源κ基因座5'端的約23 kb的 小鼠基因組序列）、I-CeuI位點、5' Frt位點、新黴素盒、3' Frt位點、約124 kb的人基因組 入序列（包含前12個連續的hVA基因區段和hJAl基因區段）、PI-SceI位點和3'同源 臂（包含約28 kb的小鼠基因組序列，包括內源小鼠 Ck基因、EKi和Εκ3'以及Εκ3'下 遊（3'）的另外的小鼠基因組序列）（圖4Β，12/1-κ靶向載體）。
[0244] 與這兩個初始靶向載體之一的同源重組產生了修飾的小鼠輕鏈基因座（κ或 入），其包含有效地連接至內源小鼠輕鏈恆定基因和增強子（C κ或C λ 2以及E κ i/E κ 3' 或Enh 2. 4/Enh 3. 1)基因的12個hV λ基因區段和hj λ 1基因區段，所述基因座在重組後 導致嵌合λ輕鏈的形成。
[0245] 具有12個人νλ和4個人JA基因區段的人λ微小基因座。在將多樣性添加至 嵌合λ輕鏈基因座的另一個方法中，將第三初始靶向載體工程化，以將來自A簇的前12個 連續的人VA基因區段和hJA 1、2、3和7基因區段插入小鼠 κ輕鏈基因座（圖4Β，12/4-κ 革巴向載體）。通過從頭DNA合成（Integrated DNA Technologies)產生包含hj λ 1、J λ 2、 JA 3和JA 7基因區段的DNA區段，其包含每一個JA基因區段和來自每一個JA基因區 段的緊鄰5'和3'區域的約100 bp的人基因組序列。將PI-SceI位點工程化至該約I kb DNA片段的3'末端，並且連接至氯黴素盒。從相對於人BAC克隆729g4的hj λ 1基因區段 在5'和3'位置上的人λ序列PCR擴增同源臂。在修飾的729g4 BAC克隆上進行利用該 中間靶向載體的同源重組，所述修飾的729g4 BAC克隆先前已利用側翼連接有Frt位點的 新黴素盒靶向人V λ 3-12基因區段的上遊（5'），其還在5' Frt位點的5'端包含I-CeuI位 點。雙靶向的729g4 BAC克隆從5'至3'包含I-CeuI位點、5'Frt位點、新黴素盒、3'Frt 位點、約123 kb的片段（包含前12個hVX基因區段）、約I kb的片段（包含人JX1、2、3 和7基因區段）、PI-SceI位點和氯黴素盒。用I-CeuI和PI-SceI -起降解該中間靶向載 體，隨後將其連接入修飾的小鼠 BAC克隆（上文中描述的）以產生第三靶向載體。
[0246] 該連接導致用於將人λ序列插入內源K輕鏈基因座的第三靶向載體，所述第三 靶向載體從5'至3'包括，5'小鼠同源臂（包含內源小鼠 κ基因座5'端的約23 kb的基 因組序列）、I-CeuI位點、5' Frt位點、新黴素盒、3' Frt位點、約123 kb片段（包含前12個 hVA基因區段）、約I kb的片段（包含hJXl、2、3和7基因區段）、PI_SceI位點和3'同 源臂（包含約28 kb的小鼠基因組序列，包括內源小鼠 Ck基因、EKi和Εκ3'以及Εκ3' 下遊（3'）的另外的小鼠基因組序列（圖4Β，12/4-κ靶向載體）。利用該第三靶向載體的 同源重組產生包含有效地連接至內源小鼠 Ck基因的12個hVA基因區段和4個hJA基 因區段的修飾的小鼠 κ輕鏈基因座，所述基因座在重組後導致嵌合人λ/小鼠K輕鏈的 形成。
[0247] 具有整合的人κ輕鏈序列的人λ微小基因座。以類似的方式將兩個另外的靶向 載體（與經工程化用於產生人λ基因區段至內源 Κ輕鏈基因座中的初始插入的那些靶向 載體（圖4Β，12/1-κ和12/4-κ靶向載體）相似）工程化，以通過使用獨特地構建的靶向 載體（包含連續的人λ和 Κ基因組序列）逐步地插入人λ輕鏈基因區段。此類靶向載 體被構建來包括天然地位於人Vk 4-1與Jk 1基因區段之間的約23 kb人κ基因組序列。 將該人κ基因組序列特別地置於這兩個另外的靶向載體中的人Vλ與人Jλ基因區段之 間（圖 4Β，12(κ)1-κ 和 12(κ)4_κ 靶向載體）。
[0248] 使用上述修飾的RPll_729g4 BAC克隆產生包含人κ基因組序列的兩個靶向載體 (圖6)。利用側翼連接有NotI和AsiSI限制位點的壯觀黴素選擇盒靶向該修飾的BAC克 隆（圖6,左上）。利用壯觀黴素盒的同源重組導致雙靶向的729g4 BAC克隆，所述克隆從 5'至3'包括，I-CeuI位點、5' Frt位點、新黴素盒、3' Frt位點、約123 kb片段（包含前12 個hV λ基因區段）、位於hV λ 3-1基因區段的九聚物序列下遊（3'）約200 bp的NotI位 點、壯觀黴素盒和AsiSI位點。將包含人κ序列的單獨的人BAC克隆（CTD-2366jl2)以獨 立的兩次靶向在hV κ 4-1與hj κ 1基因區段之間的位置上的工程化限制位點，以允許隨後 克隆約23 kb的片段，用於與雙靶向的修飾的729g4 BAC克隆中包含的hV λ基因區段連接 (圖6,上右）。
[0249] 簡而言之，2366jl2 BAC克隆在大小上為約132 kb並且包含hV κ基因區段1-6、 1-5、2-4、7-3、5-2、4-1、在￥1^基因區段下遊的人1^基因組序列、}^1^基因區段1-5、11(^ 和約20 kb的人κ基因座的另外的基因組序列。首先用靶向載體靶向該克隆，所述靶向 載體包含側翼連接有Frt位點的潮黴素盒和在3'Frt位點下遊（3'）的NotI位點。用於 該靶向載體的同源臂包含BAC克隆內的Vk基因區段的5'和3'端的人基因組序列，從而 在用該靶向載體進行同源重組後，Vk基因區段被缺失並且NotI位點被工程化在hV κ 4-1 基因區段下遊約133 bp (圖6,上右）。利用兩個靶向載體在3'末端獨立地靶向該修飾的 2366jl2 BAC克隆以用氯黴素盒使hjK基因區段缺失，所述靶向載體還包含hJAl基因 區段、PI-SceI位點和AsiSI位點或包含4個hj λ基因區段的人λ基因組片段（同上）、 PI-SceI位點和AsiSI位點（圖6,右上）。這兩個相似的靶向載體的同源臂包含hjK基 因區段的5'和3'端的序列。利用此類第二靶向載體和修飾的2366jl2 BAC克隆的同源重 組產生雙靶向的2366jl2克隆，其從5'至3'包括5' Frt位點、潮黴素盒、3' Frt位點、NotI 位點、人κ基因座的22, 800 bp基因組片段（包含Vk 4-1與Jk 1基因區段之間的基因間 區域）、hj λ 1基因區段或含有hj λ 1、J λ 2、J λ 3和J λ 7的人λ基因組片段、PI-SceI位 點和氯黴素盒（圖6,右上）。使用雙靶向的729g4和2366 j 12克隆通過兩個連接步驟獲得 用於產生兩個另外的修飾的兩個最終的靶向載體。
[0250] 利用NotI和AsiSI降解雙靶向的729g4和2366jl2克隆，從而分別產生包含新 黴素盒和hVA基因區段的一個片段，和包含人 κ基因座的約23 kb基因組片段（包含在 Vk 4-1與Jk 1基因區段之間的基因間區域）、hJA 1基因區段或包含hJA 1、JA 2、JA 3和 JA 7基因區段的基因組片段、PI-SceI位點和氯黴素盒的另一個片段。這些片段的連接產 生兩個獨特的BAC克隆，其從5'至3'分別包含hVA基因區段、Vk 4-1與JkI基因區段 之間的人1^基因組序列、}1^1基因區段或包含}1^1、02、^3和^7基因區段的基 因組片段、PI-SceI位和氯黴素盒（圖6,下方）。隨後用I-CeuI和PI-SceI降解這些新的 BAC克隆以釋放獨特的片段（包含上遊新黴素盒和連續的人λ及κ序列），將其連接入修 飾的小鼠 BAC克隆302gl2,所述克隆從5'至3'包含內源κ基因座5'端的小鼠基因組序 列、I-CeuI位點、5' Frt位點、新黴素盒、3' Frt位點、hV λ基因區段（3-12至3-1)、V λ 3-1 下遊約200 bp的NotI位點、在人V κ 4-1與J κ 1基因區段之間天然發現的約23 kb的人 κ序列、hJXl基因區段或包含hJXl、JX 2、JA 3和JA 7基因區段的基因組片段、小鼠 已匕1、小鼠(^基因和已1^3'（圖4，121^入一￥1^了1^-^入1和121^入一￥1^了1^-4^入革巴向載 體）。利用這兩個靶向載體的同源重組產生了兩個單獨的修飾的小鼠 κ輕鏈基因座，所述 基因座包含與內源小鼠 Ck基因有效連接的12個hVA基因區段、人K基因組序列以及1 個或4個hJA基因區段，所述基因座在重組後導致嵌合人λ/小鼠 Κ輕鏈的形成。
[0251] 實施例III
[0252] 將另外的人V λ基因區段工程化至人λ輕鏈微小基因座中
[0253] 使用類似的靶向載體和方法將另外的hV λ基因區段獨立地添加至實施例2中描 述的每一個初始修飾中（圖5Α, +16-λ祀向載體和圖5Β, +16-κ祀向載體）。
[0254] 16個額外的人VX基因區段的引入。用於構建靶向載體（用於將16個另外的 hV λ基因區段添加至實施例2中描述的修飾的輕鏈基因座）的上遊（5'）同源臂包含內源 κ或λ輕鏈基因座的5'端的小鼠基因組序列。3'同源臂與所有靶向載體一樣，包含與實 施例2中描述的修飾的人λ序列的5'末端重疊的人基因組序列。
[0255] 簡而言之，工程化兩個靶向載體（圖5Α和5Β，+16-λ或+16-κ靶向載體）以用 於將16個額外的hVA基因區段引入實施例2中描述的修飾的小鼠輕鏈基因座。工程化包 含來自A簇的21個連續hV λ基因區段的來自人BAC克隆RP11-761113 (Invitrogen)的約 172 kb DNA片段，以具有包含內源κ或λ輕鏈基因座的5'端的小鼠基因組序列的5'同 源臂和包含人基因組λ序列的3'同源臂。此類靶向構建體中使用的5'小鼠 κ或λ同 源臂與實施例2中描述的5'同源臂相同（圖5Α和5Β)。3'同源臂包括相應於實施例2中 描述的人基因組λ序列的約123 kb片段的5'末端的等同物的人基因組λ序列的53, 057 bp重疊。這兩個靶向載體從5'至3'包括，5'小鼠同源臂（包含內源小鼠 κ輕鏈基因座 的5'端的約23 kb的基因組序列或內源λ輕鏈基因座的5'端的約24kb的小鼠基因組序 列）、5' Frt位點、潮黴素盒、3' Frt位點和包含21個連續hV λ基因區段的171，457 bp的人 基因組λ序列，該人基因組λ序列的約53 kb與實施例3中描述的人λ序列的5'末端 重疊，且用作該祀向構建體的3'同源臂（圖5Α和5Β,+16-λ或+16-κ祀向載體）。利用 此類靶向載體的同源重組獨立地產生修飾的小鼠 κ和λ輕鏈基因座，其各自包含有效地 連接至內源小鼠恆定基因（Ck或CA 2)的28個hVA基因區段和hJAl基因區段，所述基 因座在重組後導致嵌合輕鏈的形成。
[0256] 還以類似的方式將+16-κ靶向載體用於將16個另外的hV λ基因區段引入實施 例2中描述的其它初始修飾，所述修飾整合了多個hj λ基因區段，且具有和不具有整合的 人Κ序列（圖4Β)。利用該靶向載體在包含其它初始修飾的內源小鼠 κ基因座上進行的 同源重組產生包含與內源小鼠 C κ基因有效連接的28個hV λ基因區段和hj λ 1、2、3和7 基因區段（具有和不具有人Vk-Jk基因組序列）的小鼠 Κ輕鏈基因座，所述基因座在重 組後導致嵌合λ-κ輕鏈的形成。
[0257] 12個另外的人V λ基因區段的引入。使用相似的靶向載體和方法將另外的hV λ 基因區段獨立地添加至上文描述的每一個修飾中。與包含另外的hVA基因區段的靶向載 體的同源重組所產生的最終的基因座結構示於圖7A和7B中。
[0258] 簡而言之，工程化靶向載體（圖5A和5B，+12-λ或12-κ靶向載體）以將12個 另外的hVA基因區段引入上述修飾的小鼠 Κ和λ輕鏈基因座。工程化來自人BAC克隆 RPl 1-22118 (Invitrogen)的包含12個連續的來自B簇的hV λ基因區段的93, 674 bp DNA 片段，以具有5'同源臂（包含內源小鼠 κ或λ輕鏈基因座的5'端的小鼠基因組序列）和 3'同源臂（包含人基因組λ序列）。用於該靶向構建體的5'同源臂與上述用於添加16個 hV λ基因區段的5'同源臂相同（圖5Α和5Β)。通過將PI-SceI位點工程化至來自BAC克 隆RPll-761I13的人λ序列的 27,468 bp基因組片段中包含的人Vλ3-29P基因區段的5' 端約3431bp來產生3'同源臂。該PI-SceI位點用作連接點，以使用+16-λ或+16-κ靶 向載體（圖5Α和5Β)將另外的約94 kb人λ序列的片段連接至約27 kb人λ序列片段 (其與先前的修飾中的人λ序列的5'末端重疊）。這兩個靶向載體從5'至3'包括，5'同 源臂（包含內源κ輕鏈基因座的5'端的約23 kb的小鼠基因組序列或內源λ輕鏈基因 座的5'端的約24kb的小鼠基因組序列）、5' Frt位點，新黴素盒、3' Frt位點和121，188bp 的包含16個hVA基因區段和PI-SceI位點的人基因組λ序列，所述人基因組λ序列的 約27 kb與獲自16個另外的hV λ基因區段的插入的人λ序列的5'末端重疊，且用作該 靶向構建體的3'同源臂（圖5Α和5Β，+12-λ或12-κ靶向載體）。利用此類靶向載體的 同源重組獨立地產生修飾的小鼠 κ和λ輕鏈基因座（其包含有效地連接至內源小鼠恆定 基因（Ck或CA 2)的40個hVA基因區段和人JA 1)，所述基因座在重組後導致嵌合輕鏈 的形成（圖5A和5B的下方）。
[0259] 還以類似的方式將+12-κ靶向載體用於將12個另外的hV λ基因區段引入其它 初始修飾，所述初始修飾整合了多個hJA基因區段，且具有和不具有整合的人Κ序列（圖 4Β)。利用該靶向載體在包含其它修飾的內源小鼠 κ基因座上的進行同源重組產生小鼠 κ輕鏈基因座，所述基因座包含有效地連接至內源小鼠 Ck基因的40個hVA基因區段和 hJA 1、2、3和7基因區段（具有和不具有人Vk-Jk基因組序列），所述基因座在重組後， 導致嵌合λ-K輕鏈的形成。
[0260] 實施例IV
[0261] 具有人λ輕鏈基因區段的靶向的ES細胞的鑑定
[0262] 按照上述實施例製備的靶向的BAC DNA被用於對小鼠 ES細胞進行電穿孔，以 產生修飾的ES細胞，所述細胞用於產生表達人λ輕鏈基因區段的嵌合小鼠。通過定量 Taqman?測定來鑑定包含未重排的人λ輕鏈基因區段的插入的ES細胞。針對人λ序 列和相關選擇盒的插入（等位基因的獲得，goa)、內源小鼠序列和任何選擇盒的丟失（等位 基因的丟失，L0A)以及側翼小鼠序列的保留（等位基因保留，AR)，設計特異性引物組和探 針。對於人λ序列的每一次額外插入，使用另外的引物組和探針來確認另外的人λ序列 的存在，且使用先前的引物組和探針來確認先前靶向的人序列的保留。表1顯示了用於定 量PCR測定的引物和相關探針。表2顯示了用於確認人λ輕鏈基因區段的每一個部分在 ES細胞克隆中的插入的組合。
[0263] 任選地用表達FLP的構建體轉染具有人λ輕鏈基因區段的ES細胞，以除去通過 插入包含人V λ 5-52-V λ 1-40基因區段的靶向構建體而引入的Frt' ed新黴素盒（圖5A和 5B)。新黴素盒可任選地通過與表達FLP重組酶的小鼠交配來除去（例如，US 6, 774, 279)。 任選地，新黴素盒被保留在小鼠中。
[0264] 表 1
【權利要求】
1. 一種輕鏈等位基因，所述輕鏈等位基因包含與小鼠 Ck基因區段可操作地連接的、 未重排的人A免疫球蛋白輕鏈可變基因區段（hV A )和人A連接基因區段（hj入）。
2. 如權利要求1所述的輕鏈等位基因，其中，所述等位基因包含多個未重排的hV A基 因區段。
3. 如權利要求2所述的輕鏈等位基因，其中，所述輕鏈等位基因包含： (a) 至少12個hVX基因區段；或 (b) 13至28個hVX基因區段； (c) 28個或更多個hV A基因區段。
4. 如權利要求3所述的輕鏈等位基因，其中，所述hVA基因區段包含：hVX3-l、 hV 入 4-3、hVA 2-8、hVA 3-9、hVA 3-10、hVA 2-11 和 hVA 3-12。
5. 如權利要求3所述的輕鏈等位基因，其中，所述hVA基因區段包含：hVX2-14、 hV 入 3-16、hVA 2-18、hVA 3-19、hVA 3-21、hVA 3-22、hVA 2-23、hVA 3-25 和 hVA 3-27。
6. 如權利要求1所述的輕鏈等位基因，其中，所述人基因區段是hj入1。
7. 如權利要求1所述的輕鏈等位基因，其中，所述輕鏈等位基因包含四個未重排的 hJX基因區段。
8. 如權利要求7所述的輕鏈等位基因，其中，所述四個未重排的hj A基因區段是 J入1、J入2、J入3和J入7。
9. 如權利要求1所述的輕鏈等位基因，其中，所述輕鏈等位基因包含： (a) 橫跨hV X 3-12至hV A 3-1的人X輕鏈基因座的連續序列； (b) 橫跨hV入3-27至hV入3-1的人入輕鏈基因座的連續序列；或 (c) 橫跨hV入3-29至hV入3-1的人入輕鏈基因座的連續序列，以及橫跨hV入5-52至 hVA 1-40的人X輕鏈基因座的連續序列。
10. -種用於產生小鼠的方法，所述方法包括遺傳修飾所述小鼠以使所述小鼠在其種 系中包含如權利要求1-9中任一項所述的輕鏈等位基因。
11. 如權利要求10所述的方法，其中，所述輕鏈等位基因位於所述小鼠種系的內源k 基因座上。
12. -種抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白是在如權利要求10或11所述方法產生的經 遺傳修飾的小鼠中生成的。
13. -種細胞，所述細胞包含如權利要求1-9中任一項所述的小鼠輕鏈等位基因。
14. 一種生成分離的小鼠胚胎幹細胞（ES)的方法，所述方法包含遺傳修飾所述ES細胞 以使其包含如權利要求1-9中任一項所述的輕鏈等位基因。
15. -種體細胞突變的抗體，所述抗體是在如權利要求10或11所述方法產生的經遺傳 修飾的小鼠中生成的。
16. -種編碼重排的人A輕鏈可變區的核酸，所述核酸是從如權利要求10或11所述 方法產生的經遺傳修飾的小鼠中分離。
17. -種分離的細胞，所述細胞來自如權利要求10或11所述方法產生的經遺傳修飾的 小鼠或者可從所述小鼠中獲得。
18. 如權利要求17所述的細胞，其中，所述細胞是B細胞。
19. 一種編碼重排的人A輕鏈可變區的核酸，所述核酸是從權利要求18所述的細胞中 分離。
20. -種雜交瘤，所述雜交瘤來自如權利要求10或11所述方法產生的經遺傳修飾的小 鼠或者可從所述小鼠中獲得。
21. -種編碼重排的人A輕鏈可變區的核酸，所述核酸是從權利要求20所述的雜交瘤 中分離。
22. 使用如權利要求12所述的抗原結合蛋白在生產用作治療劑的藥物中的用途。
23. -種產生體細胞突變的抗體的方法，所述抗體與目標抗原結合，所述方法包括： (a) 將如權利要求10或11所述方法產生的經遺傳修飾的小鼠暴露於目標抗原； (b) 從（a)的小鼠中獲得一種或多種B淋巴細胞，其中，所述一種或多種B淋巴細胞產 生與目標抗原結合的抗體；和 (c) 鑑定編碼（b)的抗體的免疫球蛋白輕鏈的核酸序列，其中，所述免疫球蛋白輕鏈包 含人免疫球蛋白A輕鏈可變結構域和小鼠免疫球蛋白恆定結構域；和 (d) 使用具有人免疫球蛋白恆定區核酸序列的（c)的核酸序列來產生與目標抗原結合 的人抗體。
24. -種如權利要求23所述的方法產生的體細胞突變的抗體。
25. 使用如權利要求24所述的體細胞突變的抗體在生產用作治療劑的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N15/85GK104404050SQ201410535091
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2011年6月22日 優先權日:2010年6月22日
【發明者】L·麥克唐納, S·史蒂文斯, C·古雷爾, A·J·莫菲, K·A·霍希亞瓦 申請人:瑞澤恩製藥公司