一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物與應用的製作方法

2023-05-26 18:24:01 4

專利名稱：一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因工程領域，涉及一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物，以及該基因與其表達產物在改良植物品質等方面的應用。
背景技術：
微生物蛋白農藥是對多種農作物具有很強生物活性的一類蛋白質藥物。按作用機理不同又可分為傳統微生物蛋白農藥和新型微生物蛋白農藥。傳統微生物蛋白農藥主要是來自蘇雲金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲晶體蛋白(ICP)，新型微生物蛋白農藥主要是蛋白激發子類物質，它與傳統微生物蛋白農藥最大的區別在於其不直接殺滅害蟲和病原物，而是激發植物自身的抗病防蟲基因的表達，並促進植物生長發育。目前研究報導的具有代表性的新型微生物蛋白農藥主要有過敏蛋白(Harpin)、隱地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受關注、最有應用前景的是Harpin類蛋白激發子。
Harpin蛋白主要是由歐文氏桿菌屬(Erwinia)細菌產生的一類能激發植物過敏反應的蛋白質(30-40kda)，可誘導植物體內一系列基因的表達，激活植物自身的生長系統和防衛系統，從而使植物能抵禦多種病害的侵染和逆境的脅迫，並獲得促進生長發育和提高增產的效果。1992年，美國康乃爾大學的韋忠民等首先從梨火疫歐文氏桿菌(E.amylovora)中克隆出這類過敏蛋白基因，並首次提出Harpin蛋白誘導植物的過敏反應可能與其抗病性作用有關，由此推動了新型微生物蛋白農藥研究的興起。經過約10年的努力，以此為背景的美國Eden生物科技公司成功開發和研製出具有廣譜抗病防蟲功能的新型微生物蛋白農藥Messenger，該產品以其對大田作物和經濟作物抗病增產方面良好的效果以及對綠色無公害農業卓越的貢獻，曾兩度獲美國環境保護委員會頒發的總統綠色化學挑戰獎。
現代分子植物病理學揭示，植物病原細菌既有其致病性，也有誘導植物產生抗病性和促進生長的能力，而決定這種能力的基因是植物病原細菌的hrp(hypersensitive response andpathogenicity)基因簇。hrp基因決定著植物病原細菌在非寄主植物上激發過敏反應(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on hostplants)。HR是植物一種局部的、快速的細胞編程死亡形式，是植物主動抗性的結果，其抗性作用不僅表現在對病原細菌侵染擴展的限制，而且能進一步誘導植物體內產生類似免疫機制的系統獲得性抗性反應。
繼韋忠民等(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)成功克隆和表達hrpNEa基因之後，近10多年來人們又相繼從E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到編碼Harpin類蛋白的基因，並成功表達了這些蛋白，如HarpinEcc，36kda(Mukherjee A.，Mol.Plant-Microbe Interact.1997，10462-471.)；HarpinEch，36kda(Bauer D.W.，Mol.Plant Microbe Interact，1995，8484491)；HarpinPss，34.7kda；HarpinPsg，35.3kda；HarpinPst，36.5kda(Preston G.，Mol Plant-Microbe Interact.，1995，8717)；HarpinXoo，15.3kda，HarpinXooc，15.6kda(聞偉剛，植物病理學，2001，31(4)295-300)等。
迄今為止，所有這些Harpin類蛋白差不多都具有以下分子特徵(1)親水性；(2)對熱穩定，100℃處理10分鐘不會失活；(3)對蛋白酶K和紫外線敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)無四級結構。
最近的研究表明，Harpin類蛋白可能在植物的信號通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發現擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等。現在通常認為，植物細胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過與這些受體蛋白HrBP結合激活植物中的多條信號通路。這些信號通路大致可以分為以下三類(1)與植物抗病和驅蟲相關的信號通路的激活，包括過敏反應與細胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶介導的途徑以及其它一些抗性基因介導的途徑；(2)與促進植物生長相關的信號通路的激活，包括一般的生長調節因子、胚軸延伸轉錄因子、生長轉錄因子、乙烯反應元件結合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)與植物抗逆相關的信號通路的激活，包括熱休克蛋白、COR基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴於NPR1介導的植物對細菌抗性的信號通路。
Harpin蛋白雖然來源於病原菌，但作為一類非特異性的激發蛋白因子，卻能引起非寄主植物發生過敏反應，並誘導其抗病性、驅蟲性和抗逆性的增加，以及促進生長發育、提高產量等。更有趣的是，在轉hrpNEa基因的梨上，HarpinEa對產生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表現出非常強的抗性。

發明內容
本發明的目的是提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物，以及hrpN基因和其表達產物的應用。
本發明所提供的一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因，名稱為hrpNEccsl，其基因編碼區共計有1071個核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因來自胡蘿蔔軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS008菌株，該基因以hrpN基因簇形式存在於CSDS008菌株的染色體DNA上。該基因可在調節植物生長發育、防治植物病蟲害(包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性)、增強植物的抗逆性(植物對乾旱、嚴寒、鹽鹼等不良環境的耐受性)、延長作物產品的儲存時間及對盆花、苗木的塑型作用有關的農業生物技術育種、轉基因植物以及與其它有益基因重組構建具有商業價值的遺傳重組體等方面廣泛應用前景。含有該基因的遺傳重組體，亦可應用於調節植物生長發育和防治病蟲害有關的農業生物技術育種、轉基因植物等方面。
一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的基因hrpNEccsl所編碼的蛋白質HarpinEccsl，其胺基酸序列如序列表中SEQ ID No.2，共有356個胺基酸殘基，分子量35.55kda，等電點pI5.5，富含甘氨酸(Gly)而缺乏半胱氨酸(Cys)，是水溶性酸性蛋白，無四級結構，並且具有Harpin類蛋白的基本分子屬性和生物學活性。
HarpinEccsl蛋白質在促進植物生長發育、增強植物的廣譜抗病性(包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性)、增強植物的驅蟲性、增強植物的抗逆性(植物對乾旱、嚴寒、鹽鹼等不良環境的耐受性)、延長作物產品的儲存時間、對盆花和苗木的塑型作用方面有廣泛應用前景。因此，該蛋白質可以配製成生物製品，應用到以上方面。
本發明關於一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的基因hrpNEccsl及其表達產物HarpinEccsl蛋白質，將按以下內容進行具體表述1、hrpNEccsl基因的來源hrpNEccsl基因來自胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwiniacarotovora subsp carotovora)白菜(Chinese cabbage)軟腐菌(soft-rotting bacteria)變種CSDS008菌株，菌株採自四川什邡國家無公害蔬菜生產基地，胡蘿蔔、白菜、芹菜是其寄主植物。該基因以hrpN基因簇形式存在於CSDS008菌株的染色體DNA上。
2、hrpNEccsl基因的克隆和測序(1)菌株首先在LB平板上篩選，並進行胞外蛋白酶活性和HR檢測。(2)將選取的單克隆菌落，於28℃下在LB液體培養基中振蕩培養12小時，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細菌染色體DNA。(3)細菌染色體DNA經Sau3A部分消化，用質粒載體pLARF5構建胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS008菌株的基因組文庫。(4)用胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)Ecc71菌株的hrpNEcc基因(Cui Y,et al.Molecular Plant-MicrobeInteractions，1996，9(7)565-573)作分子探針，通過克隆雜交從CSDS008基因組文庫中篩選鑑別hrpN+質粒，獲得包括hrpN基因整個編碼區在內的1.7kb DNAs片段，並進一步將此片段亞克隆進pBluescript載體中。(5)用通用T7引物進行核苷酸序列測定，其中有一個1071bp的閱讀框(reading frame)即為hrpNEccsl基因的編碼區，序列如SEQ ID No.1。
3、hrpNEccsl基因的PCR擴增與純化根據hrpNEccsl基因的核苷酸序列，設計一對PCR擴增引物，即P15』-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG -3』和P25』-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3』。其中G/GATCC為引入的限制酶BamH I的酶切位點，A/AGCTT為引入的限制酶HindIII的酶切位點。用純化的白菜軟腐菌CSDS008菌株的染色體DNA作模板，按如下擴增參數進行PCR反應先95℃預變性5min，然後94℃/2min 1個循環；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24個循環；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min 1個循環。擴增產物用PCR產物純化試劑盒進行純化。
4、hrpNEccsl基因工程菌株的構建hrpNEccsl基因的PCR擴增產物經限制酶BamH I和HindIII消化後，克隆進高表達載體pET28a(+)的BamH I-HindIII位點。用pET28a(+)-hrpNEccsl質粒轉化受體菌E.coli JM109(DE3)，通過選擇壓篩選出含有pET28a(+)-hrpNEccsl質粒的陽性表達工程菌株。
5、hrpNEccsl基因的表達產物及其檢測hrpNEccsl基因的表達產物為HarpinEccsl蛋白質。將含有hrpNEccsl基因超表達質粒pET28a(+)-hrpNEccsl的大腸桿菌工程菌株E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液體培養基中37℃培養生長，待OD600達到0.7(即細菌進入對數生長期)後，再加入誘導劑IPTG至終濃度1mM，繼續培養6個小時後，離心收集細菌細胞。細菌細胞經超聲波破碎、離心、12％SDS-PAGE凝膠電泳，在電泳膠板的細菌樣品泳道上，會呈現一條顯著寬而濃的35.55kda條帶，它就是hrpNEccsl基因的表達產物HarpinEccsl蛋白質，約佔細菌蛋白總量的50％左右。將HarpinEccsl蛋白質進一步分離純化，並對HarpinEccsl蛋白質進行Western blot分析和HR檢測。
根據hrpNEccsl基因的核苷酸序列推測，HarpinEccsl蛋白質的胺基酸序列如SEQID.No2。該蛋白質具有以下屬性(1)由356個胺基酸殘基組成；(2)分子量35.55kda；(3)等電點pI5.5；(4)富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)；(5)對溫度特穩定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(6)沒有四級結構。
6、HarpinEccs蛋白質的生物學活性及其應用目前公認的Harpin類蛋白的生物活性檢測方法主要有(1)過敏反應(hypersensitive response，HR)，通常以菸草作被試植物，這也是Harpin類蛋白生物活性檢測最快速、簡便的方法；(2)血清學反應，即用標準的Harpin蛋白純品製成血清抗體，然後用這種抗血清對未知樣品進行Western blot分析，通過抗體-抗原識別反應，可以準確檢測出未知樣品中的Harpin類蛋白。
HarpinEccsl蛋白質具有以下主要生物學功能(1)促進植物生長發育、提高產量；(2)增強植物的廣譜抗病性，包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對某些有害昆蟲的驅蟲性；(4)增強植物的抗逆性；(5)延長植物產品的儲存時間；(6)對盆花、苗木還有良好的塑型作用。
HarpinCSSY002蛋白質在增強植物抗病、驅蟲、抗逆以及促進生長和提高產量方面的良好效果。HarpinCSSY002蛋白質不會引起病原物的抗藥性，也不會誘發植物遺傳結構(基因組DNA)的改變，且該蛋白質屬天然有機蛋白質，在自然界能很快被光分解或被微生物降解、沒有殘留公害，對人畜鳥魚無毒性，在使用過程中無須特殊防護措施，是未來替代高毒、高殘留化學農藥和化學調節劑的理想的環保型生物產品。
目前正在就其對各種作物、蔬菜、水果、花卉以及各種經濟植物包括菸草、茶葉等數十種植物的抗病驅蟲和促長增產效果進行廣泛的試驗和品比。已有試驗結果顯示，HarpinCSSY002蛋白對黃瓜、西紅柿、土豆、辣椒、菸草、玉米、草莓等的抗病驅蟲和促長增產效果明顯，同時對提高某些植物如菸草、茶葉的品質亦有很好的效果，而且在同類Harpin產品中對比效果也很顯著。HarpinCSSY002蛋白可直接應用於植物的生長發育調節和病蟲害防治，包括糧食作物、經濟植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場的養護等；使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面噴施、花果噴塗等；使用劑量因使用方法和品種而異，一般5μg/ml-80μg/ml均為有效濃度；施用後2-12小時內即發生作用，藥效可持續20天左右，一個生長季節可用藥2-3次。
本發明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpNEccsl基因的高效表達載體pET28a(+)質粒在國內外分子生物學研究及醫藥工業中已廣泛應用，對環境安全可靠。
本發明中使用的縮略語LB(細菌培養基，酵母粉5g/L+蛋白腖10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那黴素)；IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺醯氟)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)。
具體實施例方式
實施例一 hrpNEccsl基因的克隆和測序(1)hrpNEccsl基因來自胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)白菜(Chinese cabbage)軟腐菌(soft-rotting bacteria)變種CSDS008菌株，該基因以hrpN基因簇形式存在於CSDS008菌株的染色體DNA上。把胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)白菜(Chinese cabbage)軟腐菌(soft-rotting bacteria)變種CSDS008菌株首先在LB平板上篩選，並進行胞外蛋白酶活性和HR檢測。(2)將選取的單克隆菌落，於28℃下在LB液體培養基中振蕩培養12小時，離心收集菌體，用基因組DNA分離試劑盒分離、純化細菌染色體DNA。(3)細菌染色體DNA經Sau3A部分消化，用質粒載體pLARF5構建胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS008菌株的基因組文庫。(4)用胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)Ecc71菌株的hrpNEcc基因(Cui Y,et al.Molecular Plant-MicrobeInteractions，1996，9(7)565-573)作分子探針，通過克隆雜交從CSDS008基因組文庫中篩選鑑別hrpN+質粒，獲得包括hrpN基因整個編碼區在內的1.7kb DNAs片段，並進一步將此片段亞克隆進pBluescript載體中。(5)用通用T7引物進行核苷酸序列測定，其中有一個1071bp的閱讀框(reading frame)即為hrpNEccsl基因的編碼區，序列如SEQ ID No.1。
實施例二 hrpNEccsl基因的相關應用
(1)用基因重組技術將hrpNEccsl基因克隆進抗卡那黴素的Ti質粒載體中，形成hrpNEccsl-Ti質粒；(2)用hrpNEccsl-Ti質粒轉化農桿菌細胞，篩選含hrpNEccsl-Ti質粒的陽性表達農桿菌；(3)將處於再生壁時期的胡蘿蔔原生質體與含hrpNEccsl-Ti質粒的農桿菌一起共培養36-48小時，離心洗滌去菌後在含卡那黴素的選擇培養基上篩選轉化的胡蘿蔔細胞克隆；(4)將轉化的胡蘿蔔細胞克隆在分化培養基上培養成再生植株，即獲得胡蘿蔔hrpNEccsl基因轉基因植株，該轉基因植株與未轉hrpNEccsl基因的胡蘿蔔再生植株相比，具有明顯的生長優勢和抗軟腐病特性。
實施例三 含有hrpNEccsl基因的遺傳重組體的應用(1)用基因重組技術將hrpNEccsl基因與hrpNEa基因融合，形成hrpNEccsl-hrpNEa融合基因；(2)將hrpNEccsl-hrpNEa融合基因克隆進抗卡那黴素的高效表達質粒載體pETa(+)中，形成hrpNEccsl-hrp NEa-pETa(+)質粒；(3)用hrpNEccsl-hrp NEa-pETa(+)質粒轉化工程菌JM 109(DE3)，在加卡那黴素選擇壓下篩選含hrpNEccsl-hrpNEa-pETa(+)質粒的陽性表達菌株；(4)用發酵法生產該融合基因表達的融合蛋白HarpinEccsl-HarpinEa，並通過SDS PAGE檢測融合蛋白的表達情況，從而獲得生物學活性更強和作用範圍更廣的Harpin類融合蛋白激發子。
實施例四 HarpinEccsl蛋白質的製備和純化1 菌種製備及大規模發酵(1)製備原種將帶有hrpNEccsl基因高效表達質粒pET28a(+)的工程菌E.coliJM109(DE3)菌株於甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上劃線，37℃培養過夜。
(2)製備母種將原種斜面上生長良好的單克隆菌落接種於加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml搖瓶中，於37℃110rpm振蕩培養12h。
(3)製備生產種將母種菌液按1％體積比接種於加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L發酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通氣量條件下培養12h。
(4)大規模發酵將50L以上的發酵罐加入70％體積的甘油-LB及終濃度40μg/ml的Km後，原位滅菌30min(120℃，1.1MPa)；然後按1％體積比接入生產種子菌，37℃200rpm和1L/min通氣量條件下發酵培養；待細菌進入對數生長期(OD600＝0.7)後，調節轉速和通氣量，以保證發酵環境有充足的供氧(DO＞30％)，並按特定程序進行對數分期補料；在細菌對數生長期結束前1-2小時，通過微孔濾膜加入誘導劑IPTG至終濃度1mM；繼續誘導發酵4-6小時，即可下罐。此法可實現工程菌的高密度或高效培養。
2 HarpinEccsl蛋白質的分離和純化HarpinEccsl蛋白質在大腸桿菌細胞中主要以包涵體(inclusion body)形式存在。離心(5,000rpm，10min)收集經IPTG誘導4-6小時的大腸桿菌細胞，以20mMTris緩衝液(pH9.0)充分懸浮後，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超聲波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混勻後再超聲波破碎10min，10,000rpm離心10min，取上清液於100℃水浴10min，冷卻後12,000rpm離心10min，收集上清液。此上清液中即含有較高純度的HarpinEccsl蛋白質，濃度達3600μg/ml。
實施例五 HarpinEccsl蛋白質的使用方法HarpmEccsl蛋白質在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處理時間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下介紹的方法使用(1)浸種首先用水將HarpinEccsl蛋白質配成30-60μg/ml的濃度，然後將種子浸於其中8-12小時。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結束後，將種子從HarpinEccsl蛋白質浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗一周後，苗高比對照增長10％以上，生長量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明顯增強。
(2)拌種將種子稍加溼潤，加入種子量0.1％的HarpinEccsl蛋白質製劑，充分拌勻後播種。出苗後苗齊苗壯，增強苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根適於移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先將HarpinEccsl蛋白質製劑配成30μg/ml的水溶液，然後將被移栽作物幼苗的根浸在該溶液中1-2小時。移栽後，植株恢復生長快，緩苗時間縮短，植株長勢強勁。
(4)葉面噴霧作物的整個生長季節均可進行噴施。將HarpinEccsl蛋白質製劑配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分櫱期、初花期、初果期或灌漿期進行噴霧使用。作物生長季節一般可噴霧2-3次。噴霧後，可提高作物營養體生長量15-30％，提高產量10-20％，而且整個生長季節可省掉80％以上的化學農藥。某些作物如黃瓜可抗住60％的灰黴病、菸草可抗住60-80％的花葉病毒病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐鹽鹼等)和驅蟲效果。
實施例六 HarpinEccsl蛋白質的應用舉例目前已對數十種作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinEccsl蛋白質的施用效果試驗，雖然在不同作物品種上表現程度有所不同，但HarpinEccsl蛋白質的促長增產、抗病驅蟲、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型、延長果蔬儲存時間等方面的作用是顯著的。下面舉幾例加以說明(1)玉米選取兩塊5分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對照和處理樣塊。處理塊分別在4葉期和6葉期用15-20μg/ml的HarpinEccsl蛋白質溶液作了葉面噴霧，此外不使用任何農藥，其它方面的管理與對照塊一樣。在試驗過程中發現，用藥後一周，處理塊平均株高比對照塊高出10-15cm，玉米大小斑病發病率也比對照塊低20-30％；同時處理塊開花比對照塊提前5-10天，灌漿期雙苞率明顯高於對照。收穫後比較產量，處理塊比對照塊增產12％以上。
(2)黃瓜選取二塊5分地大小的3葉期黃瓜苗田，分別用作對照、HarpinCSSY002蛋白質處理的樣塊。HarpinCSSY002蛋白質處理液的濃度為20μg/ml。處理塊分別在3葉期、5葉期和7葉期進行過葉面噴霧，其它管理同對照。試驗結果表明HarpinCSSY002蛋白質處理，開花比對照提前8天；花葉病比對照減少65％；灰黴柄比對照減少30％；產量比對照增加23％以上。
(3)草莓選取約2分地大小的兩廂3葉期草莓苗棚，分別作對照和HarpinCSSY002蛋白質處理。處理苗棚的HarpinCSSY002蛋白質使用濃度為20μg/ml。3葉期開始葉面噴霧，以後每間隔15天噴施一次，共計5次。結果顯示，處理棚比對照棚提早10左右開花；單株花、果率平均比對照增加2-3個；灰黴病發生率明顯少於對照；鮮果呈色好、果型優、畸形果率低，產量比對照增產25％以上。另外，通過對等量鮮果進行烘乾稱重，發現處理棚的乾物質積累也比對照增加1-2％。
(4)仙客來仙客來是深受大眾喜歡的盆花品種，但是由細菌性軟腐病引起的死亡率很高，高溫時休眠，而且因病毒病造成的畸形葉、花嚴重影響了其觀賞價值和商業價值。我們選取了400盆3-4月齡仙客來作供試材料，隨機分成兩組，分別作對照和HarpinCSSY002蛋白質處理。HarpinCSSY002蛋白質的使用濃度為20μg/ml。處理方法為葉面噴霧，每間隔10-15天噴施一次。結果表明，用藥一周以後，處理組的葉色變深、有光澤，株型也明顯變得挺拔、緊湊、活脫，並能打破高溫休眠；用藥一個月以後，以前因病毒病而畸形捲曲的幼葉開始逐漸伸展成正常形態，而對照組的幼葉則變得越來越畸形，連開出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，HarpinCSSY002蛋白質對仙客來葉片上的白粉蝨也有一定的驅趕作用。
(5)菸草菸草為蚜蟲易感植物。用25μg/ml濃度的HarpinCSSY002蛋白製劑在25℃條件下對菸草種子浸種24-48小時，並以pH6.5的5mM磷酸鉀緩衝液作對照浸種處理，然後分別播於三個培養盤中萌發，待出苗以後分組移栽於同一塊大田中，隨後每天觀察記錄感染蚜蟲的數目。結果發現，對照處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲的平均數分別為0、3、3、6、7、9、13、17；Harpin蛋白處理組第1、2、3、6、7、8、9、10天單株感染蚜蟲的平均數分別為0、0、0、1、0、0、2、2。
(6)非洲鳳仙花非洲鳳仙花是一種常見觀賞草花。取10盆生長勢基本一致的非洲鳳仙花，分作處理和對照2組，每組5盆，處理組和對照組分別用25μg/ml濃度的HarpinCSSY002蛋白製劑和水進行葉面噴霧，共噴2次，每次間隔7天，其它管理條件一致。待15天以後，將2組材料停止水肥管理(即停止澆水和施肥)，結果發現，15天以後，對照組植株開始出現枯黃凋零，花葉病毒病爆發，而處理組植株長勢健康，未發生花葉病毒病。
(7)草莓果實保鮮取剛採集的新鮮草莓100粒，按50粒1組分成處理和對照2組，處理組用30μg/ml HarpinCSSY002蛋白溶液浸10分鐘，對照組用純淨水浸10分鐘，然後分別裝在2個透氣小籃中，上面覆以紗布，室溫下放置1周，結果表明，對照組草莓90％以上已軟化，顏色暗褐，其中10％已嚴重黴爛，而處理組草莓90％以上顏色鮮亮，果粒脆嫩，只有少數幾粒顏色變深，果粒變軟。
序列表110成都派潤生物科技有限公司120一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物與應用1602170PatentIn Version 2.121012111071212DNA213胡蘿蔔軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)2211-107140011 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaggcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg
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Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly130 135 140Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ser Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala165 170 175Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu180 185 190Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe195 200 205Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Lys Ala Gly210 215 220Leu Gln Glu Leu ASn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg225 230 235240Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln245 250 255Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys260 265 270Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala275 280 285Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys290 295 300Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr305 310 315 320Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly325 330 335Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys340 345 350Lys Leu Ser Ser*35權利要求
1.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因，其特徵在於該基因的核甘酸序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.根據權利要求1所述的hrpN基因，其特徵在於該基因自胡蘿蔔軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種菌株中獲得。
3.根據權利要求1或2所述的hrpN基因在調節植物生長發育和防治病蟲害有關的農業生物技術育種、轉基因植物方面的應用。
4.根據權利要求1或2所述的hrpN基因，在以下任一方面的應用(1)促進植物生長發育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對乾旱、嚴寒、鹽鹼等不良環境的耐受性)；(5)延長作物產品的儲存時間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
5.含有權利要求1或2所述的hrpN基因的遺傳重組體。
6.根據權利要求5所述的遺傳重組體在調節植物生長發育和防治病蟲害有關的農業生物技術育種、轉基因植物方面的應用。
7.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因編碼的Harpin蛋白質，其特徵在於該蛋白質具有序列表中SEQ ID No.2的胺基酸序列；該蛋白質具有以下屬性(1)共有356個胺基酸殘基；(2)分子量35.55kda；(3)等電點pI5.5；(4)富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)；(5)對溫度穩定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(6)沒有四級結構。
8.含有權利要求7所述的Harpin蛋白質的生物製品。
9.根據權利要求7所述的Harpin蛋白質，在以下任一方面的應用(1)促進植物生長發育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對乾旱、嚴寒、鹽鹼等不良環境的耐受性)；(5)延長作物產品的儲存時間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
10.根據權利要求8所述的Harpin蛋白質的生物製品，在以下任一方面的應用(1)促進植物生長發育；(2)植物的廣譜抗病性，包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驅蟲性；(4)植物的抗逆性(植物對乾旱、嚴寒、鹽鹼等不良環境的耐受性)；(5)延長作物產品的儲存時間；(6)對盆花、苗木的塑型作用。
全文摘要
本發明公開了一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細胞信號因子的hrpN基因及其表達產物與應用。本發明所提供的hrpN基因源自胡蘿蔔軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，該基因在調節植物生長發育和防治病蟲害有關的農業生物技術育種、轉基因植物方面有廣泛應用前景。該基因的編碼蛋白質的胺基酸序列如SEQID No.2，該蛋白質具有多種功能活性，能廣泛誘導植物產生廣譜抗病性、驅蟲性和抗逆性，並促進植物生長發育和提高產量，因而其相關製品可作為生物農藥直接用於植物的生長發育調節和病蟲害防治。
文檔編號A01N65/00GK1858208SQ20051002081
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者吳伯驥, 湯承, 曹茂林, 張珏, 崔亞亞 申請人:成都派潤生物科技有限公司