利用藥物松胞素b檢測淋巴細胞轉化的方法

2023-05-11 10:03:41 1

專利名稱：利用藥物松胞素b檢測淋巴細胞轉化的方法
利用藥物松胞素B檢測淋巴細胞轉化的方法技術領域
本發明屬於醫學檢測技術領域，具體涉及一種檢測淋巴細胞轉化的方法。
技術背景
淋巴細胞轉化試驗是檢測細胞免疫功能的體外試驗方法之一，是各醫學專業學生，特別是檢驗專業學生必做的實驗項目，臨床上主要用於腫瘤、遲發性變態反應、細胞免疫缺陷、器官移植及某些可能有細胞免疫參與的疾病診斷。
已知淋巴細胞的活化或致敏作用是指當抗原與致敏淋巴細胞反應時通常發生在體內的某一過程的體外關聯作用。淋巴細胞轉化是由Nowell於1960年首次使用的術語， Hirschorn後來用其來描述小型靜止淋巴細胞經暴露於促細胞分裂劑植物凝集素(PHA)下轉化為淋巴母細胞的形態過程。淋巴細胞活化作用是一種通常用來評估人體的細胞免疫性的體外技術，實驗結果可以反映機體的免疫力情況，所以檢測對象主要是免疫缺陷性的，患有傳染性和自身免疫性疾病或腫瘤。在與促細胞分裂劑一起孵育後，會發生許多複雜的生化反應，這些反應包括與膜相關聯的早期現象，例如磷脂合成的增加、二價陽離子通透性增加、腺嘌呤環化酶的活化作用和胞內cAMP的同時增加；緊隨之後的是蛋白質、RNA及DNA合成的增加，最終導致淋巴細胞形態學發生特徵性改變和增值分裂。這些先於細胞分裂的生化反應，是淋巴細胞活化作用的多數試驗的基本原理。便利性和習慣性使得臨床免疫學家使用DNA合成而沒用使用諸如cAMP或磷脂代謝的增加等作為淋巴細胞活化作用的標誌物。
淋巴細胞轉化作用最早是通過對培養物中存在的淋巴母細胞百分比來評估的。轉化淋巴細胞即淋巴母細胞的形態特徵是(1)轉化淋巴母細胞體積增大，約大於原淋巴細胞3倍；(2)細胞核的核膜清晰，核內染色質疏鬆呈網狀結構，可見1 3個核仁，有的核呈分裂相；C3)胞漿豐富，呈嗜鹼性染色，核周圍的胞漿有一染色較淺的透明區，為偽足狀突起，胞漿內有小空泡出現。該方法的主要優點是從形態學判斷轉化淋巴細胞，但因其極端變異性和結果的主觀性而得不到廣泛利用。
目前DNA合成最準確的檢測方法是使用氚標記的胸苷(3H_dT)，在DNA合成過程中3H-dT其摻入量可由液相閃爍儀來檢測，通過該摻入量來計算DNA合成能力並間接反映機體的細胞免疫功能。由於使用了放射性物質，此方法對實驗室要求很高，並且可能會對環境和工作場所造成放射性汙染。同時，此方法是通過放射性計數來反映細胞免疫功能的，實驗組和對照組的細胞數必須保證絕對相同，否則實驗結果就不具有可信性。這兩方面的缺點限制了此法的廣泛應用。
由於上述常規方法本身的缺陷，實際應用中會碰到一系列的問題；另外，由於其複雜性和精確性，這些常規方法絕對不適用於臨床，只能限於實驗室研究。發明內容
本發明的目的在於提供一種簡便、經濟、用途廣，且適合於臨床使用的檢測淋巴細胞轉化的方法。
依據原理靜止淋巴細胞暴露於促細胞分裂劑植物凝集素(PHA)可以轉化為淋巴母細胞並可進一步分裂增殖，淋巴細胞的這種活化作用可用來評估人體細胞免疫性，且淋巴細胞的增殖活躍程度與機體的細胞免疫能力正相關；而松胞素B可以阻滯細胞的分裂而不阻滯細胞核的分裂。具有不同免疫能力的淋巴細胞經過PHA和松胞素B的雙重作用後的雙核細胞率會不同，免疫力越強的淋巴細胞的雙核細胞率越高。因此，可通過淋巴細胞的雙核率直觀地反映機體的細胞免疫功能。
本發明提供的檢測淋巴細胞轉化的方法，具體步驟如下1、取若干份健康人外周血，每份血分成照射組(免疫抑制組)和非照射組；2、血樣用含PHA營養液培養無菌操作將0.2-0. 6ml血樣加入含有PHA營養液小瓶內， PHA終濃度為30-70 μ g/ml，混勻後，置37°C溫箱培養1_2天；3、加入松胞素B繼續培養在含PHA營養液中培養結束後，向培養液內加入松胞素B， 終濃度為2-6 μ g/ml，37°C溫箱繼續培養；4、溶解紅細胞培養結束後，吸棄上清液，加入37°C預溫的0.87% NH4Cl溶液3_5ml，置 37°C溫箱孵育 10-15min ；5、低滲處理離心棄上清後每管細胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室溫低滲 10-20min ；6、固定液固定採用兩步固定法，低滲後加入固定液固定液(固定液低滲液=15-8), 滴管混勻後立即離心，棄上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液為甲醇和冰醋酸的混和液，兩者質量比為甲醇冰醋酸=7-9 1 ；7、檢測照射與非照射淋巴細胞的雙核率的差異，雙核率=雙核細胞數/N，N為觀察淋巴細胞個數，N 一般取500—1000。
依據本發明採用松胞素B進行致敏性淋巴細胞轉化試驗的新方法，可以克服傳統方法遇到的問題。該方法的主要優點有1、轉化的淋巴細胞可形成雙核細胞，這與單核細胞相比，更加直觀且客觀(見附圖)；2、檢測指標為形態學觀察，所以屬於金標準(見附圖)；3、實驗成本很低；4、操作簡單，設備要求低，所有實驗室都可以開展；5、不使用放射性物質，不會對環境和工作場所造成汙染；6、全血培養物，結果不受細胞數影響；7、結果準確，重複性好。
本發明是一種淋巴細胞轉化試驗的新方法，是檢測細胞免疫功能的體外試驗方法之一，可應用於腫瘤、遲發性變態反應、細胞免疫缺陷、器官移植、以及某些細胞免疫性疾病的診斷；另外，該技術也可用於藥物或毒物的免疫毒理學研究，如檢測藥物或毒物對淋巴細胞的影響、估算藥物或毒物劑量的大小等。


圖1為不同處理情況下淋巴細胞的形態學特點(*400倍)。其中(1)顯示血樣在沒有植物凝集素(PHA)和松胞素B (CB)處理的情況下，血液淋巴細胞的形態學特點；(2)顯示血樣在有PHA而沒有CB處理的情況下，血液淋巴細胞的形態學特點，體積增大、胞漿豐富的細胞為轉化的淋巴細胞；(3)顯示血樣在PHA和CB共同處理的情況下，血液淋巴細胞的形態學特點，形成明顯雙核的細胞為轉化的淋巴細胞；(4)顯示以2Gy γ射線照射(免疫抑制)血樣後，在PHA和CB共同處理的情況下，血液淋巴細胞的形態學特點，形成明顯雙核的細胞為轉化的淋巴細胞。
具體實施方式
(一)材料。
1植物血凝素(sigma公司)，松胞素B (Sigma公司)。
2培養液為RPMI1640 (PAA)，含10%小牛血清(四季青)，1%雙抗(基諾)。
3肝素抗凝管。
4 生理鹽水、087% NH4Cl 溶液、Giemsa 染液。
(二)操作方法。
1.無菌採血，每份0. 5ml，分成2Gy照射組(免疫抑制組)和非照射組，將其分別注入4. 5ml含有PHA的RPMI1640培養液內，PHA終濃度為50 μ g/ml，混勻後，置37°C溫箱培養2天。
2.第3天向培養液內加入松胞素B，終濃度為3 μ g/ml，細胞繼續培養Mh。
3.溶解紅細胞第4天吸棄上清液，加入37°C預溫的0.87% NH4Cl溶液:3ml，置 37 °C溫箱孵育15min，然後加生理鹽水7ml。
4. 300g離心lOmin，棄去上清液，每管細胞加入7ml 0. 075M KCl混勻，室溫低滲 15min。
5.加入Iml固定液(質量比為甲醇冰醋酸9:1)預固定細胞。
6. 300g離心lOmin，除去低滲液，每管加入5ml固定液固定30min。
7. 300g離心lOmin，保留約0. 5ml固定液，滴片，乾燥。
8.用Giemsa染液染色30min，40倍顯微鏡觀察500個淋巴細胞，雙核率=雙核細胞數/500。
結果取10份健康人外周血，每份血分成2Gy照射組(免疫抑制組)和非照射組，檢測照射與非照射淋巴細胞的雙核率的差異。結果顯示，轉化後的淋巴細胞形成了明顯的雙核細胞，非照射組的雙核率為51. 7%士4. 3%，照射組的雙核率為29. 4%士5. 6%，照射後淋巴細胞的雙核率下降了 22. 3%(P<0. 001)，表明照射後T淋巴細胞的免疫功能明顯受到抑制， 表明淋巴細胞的雙核率可以很好的反映機體的細胞免疫功能。見圖1所示。
該新方法檢測指標直觀、操作簡單、快速、經濟、結果準確。
權利要求
1. 一種利用藥物松胞素B檢測淋巴細胞轉化的方法，其特徵在於具體步驟為(1)取若干份健康人外周血，每份血分成照射組(免疫抑制組)和非照射組；(2)血樣用含PHA營養液培養無菌操作將0.2-0. 6ml血樣加入含有PHA營養液小瓶內，PHA終濃度為30-70 μ g/ml，混勻後，置37°C溫箱培養1_2天；(3)加入松胞素B繼續培養在含PHA營養液中培養結束後，向培養液內加入松胞素B， 終濃度為2-6 μ g/ml，37°C溫箱繼續培養；(4)溶解紅細胞培養結束後，吸棄上清液，加入37°C預溫的0.87% NH4Cl溶液3_5ml， 置37°C溫箱孵育10-15min ；(5)低滲處理離心棄上清後每管細胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室溫低滲 10-20min ；(6)固定液固定採用兩步固定法，低滲後加入固定液(固定液低滲液=1:5-8)，滴管混勻後立即離心；棄上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液為甲醇和冰醋酸的混和液，按質量比，甲醇冰醋酸=7-9 1 ；(7)檢測照射與非照射淋巴細胞的雙核率的差異，雙核率=雙核細胞數/N，N為觀察淋巴細胞個數，N取500—1000。
全文摘要
本發明屬於醫學檢測技術領域，具體為一種利用藥物松胞素B檢測淋巴細胞轉化的方法。本發明根據外周血淋巴細胞在體外經過植物血凝素的刺激後可以轉化為可以分裂的淋巴母細胞，以及藥物松胞素B可以阻滯細胞的分裂而不阻滯細胞核的分裂這兩個原理，以2Gyg射線照射人外周血進行免疫抑制，並以PHA刺激後再加入松胞素B處理，檢測照射與非照射淋巴細胞的雙核率的差異。結果表明，轉化後的淋巴細胞會形成雙核細胞，而受照射淋巴細胞的雙核率顯著下降，表明照射後T淋巴細胞的免疫功能明顯受到抑制，雙核率可以很好地反映淋巴細胞的免疫功能。該方法檢測指標直觀、操作簡單、快速、經濟、結果準確。
文檔編號C12Q1/06GK102505039SQ20111033355
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者葉爽, 張江虹, 潘燕, 白楊, 袁德曉, 邵春林 申請人:復旦大學