耐表面活性劑的纖維素酶及其修飾方法

2023-10-06 10:38:14 1

專利名稱：耐表面活性劑的纖維素酶及其修飾方法
技術領域：
本發明涉及一種修飾 具有內切葡聚糖酶活性的蛋白(特別是屬於家族45並具有內切葡聚糖酶活性的纖維素酶)的N-末端為焦穀氨酸，從而使其成為在表面活性劑時內切葡聚糖酶活性降低很小的纖維素酶的方法，並涉及該纖維素酶。
背景技術：
纖維素是自然資源中最豐富的資源，因此可有效分解纖維素的纖維素酶系統在各個領域具有廣泛用途。在本發明過程中，純化和測定了多種纖維素酶，進一步，克隆了多種纖維素酶的基因，並通過序列同源性分析而進行家族分類(參見非專利參考文獻I)。另一方面，根據其性質，可將纖維素酶應用於多個工業領域，特別是紡織品加工領域。例如，纖維素酶處理可改善含纖維素的織物的手感和/或外觀，或通過「酵素洗滌」，賦予含纖維素的有色織物「石磨」外觀，從而使織物的色彩局部性變化。另外，在萊塞爾加工過程中，可用纖維素酶除去加工過程中在織物表面產生的絨毛。在本文中，萊塞爾是一種來源於木漿的再生纖維素織物，最近由於其本身特性，例如高強度或吸水性，並且其生產過程造成的環境汙染小而倍受關注。目前認為纖維素酶是通過多個酶的共同作用，例如協同作用來分解纖維素的。在由多個酶組成的纖維素酶組中含有可降低織物韌性的酶等不適於紡織品加工領域的酶。因此，需要通過蛋白分離技術和/或基因工程技術從纖維素酶組中分離適於紡織品加工的酶組分，並生產這些酶組分。特別地，對來源於絲狀真菌例如木黴屬(Trichoderma)或腐質黴屬(Humicola)的微生物的纖維素酶已進行了深入研究。例如，已分離到腐質黴屬中的纖維素酶組分CBH 1、EG V(參見專利文獻I)、NCE2、NCE4和NCE5，及木黴屬中的CBH 1、CBH
I1、EG II和EG III等，因此，可通過基因工程技術製備過表達的酶或單一組分的酶等，從而來生產含一種或多種特定的纖維素酶組分為主要組分，適於不同目的的纖維素酶製品。另外，已表明屬於家族45的纖維素酶，例如NCE4 (參見專利文獻2)、NCE5 (參見專利文獻3)、RCEl (參見專利文獻4)或STCEl (參見國際專利申請PCT/JP2004/15733)在上述領域是非常有用的。另一方面，當纖維素酶用於衣物洗滌劑時，則不僅要改善纖維素酶組分的量，而且要改善其性質。更具體地，衣物洗滌劑含多種表面活性劑，而且將其溶解於水所獲得的溶液是鹼性的(pH10-pH 11)。因此，包含在衣物洗滌劑中的纖維素酶要在鹼性條件下可耐受多種表面活性劑的作用。Otzen, D.E.等人已報導向來源於Humicola insolens的Cel45的內部胺基酸序列中引入一個突變，可使其在PH7，存在線性烷基苯磺酸鹽(LAS)的條件下表現出約3.3倍於野生型Cel45的活性(參見非專利文獻2)。但由該突變提供的在存在表面活性劑時抑制活性降低的作用僅限於Cel45或其同源蛋白，並不適於與Cel45同源性較低的，屬於家族45的內切葡聚糖酶。(專利文獻I)國際專利W091/17243(專利文獻2)國際 專利W098/03667(專利文獻3)國際專利W001/90375(專利文獻4)國際專利W000/24879非專利文獻 1:Henrissat B., Bairoch A.Updating the sequence-bas edclassification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316:695-696 (1996)非專利文獻2:Daniel E.0tzen, Lars Christiansen, Martin Schulein.Acomparative study of the unfolding of the endoglucanase Cel45 from Humicolainsolens in denaturant and surfactant.Protein Sc1.8:1878-1887 (1999)發明描述本發明要解決的問題本發明的一個目標是提供將具有內切葡聚糖酶活性的蛋白(特別是屬於家族45，並具有內切葡聚糖酶活性的蛋白)轉變為具有內切葡聚糖酶活性，而且其活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白的方法；該方法中使用的載體；具有內切葡聚糖酶活性，而且其活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白；及其編碼多核苷酸。本發明的另一個目標是用上述微生物提供一種可有效地生產用於洗滌衣物的酶蛋白的微生物。解決問題的方法本發明人進行了廣泛研究，發現將焦穀氨酸(以下有時以PQ表示)或含PQ的肽加到屬於家族45，並具有內切葡聚糖酶活性的蛋白的N末端的蛋白，例如N末端添加型纖維素酶，與野生型纖維素酶相比較，其內切葡聚糖酶活性在表面活性劑存在時沒有顯著降低。在存在陰離子表面活性劑時保持高內切葡聚糖酶活性的性質對用於衣物洗滌的酶來說是非常有用的，但沒有發現這樣的纖維素酶。另外，也沒有關於通過添加焦穀氨酸或含焦穀氨酸的肽而在存在表面活性劑時保持酶活性的作用的報導。本發明的另一個方面是關於所有N末端未被保護而在存在表面活性劑時保持酶活性的纖維素酶，可通過向纖維素酶中加入焦穀氨酸或含焦穀氨酸的肽來抑制在表面活性劑存在時活性降低。可添加焦穀氨酸或含焦穀氨酸的肽的纖維素酶無特別的限定，但優選屬於家族45的纖維素酶。因此，本發明包括以下方面:1) 一種抑制在存在表面活性劑時內切葡聚糖酶活性降低的方法，其特徵在於修飾具有內切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦穀氨酸的蛋白的N末端，使其成為N末端具有焦穀氨酸的蛋白；(2) (I)中的方法，其中通過向具有內切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦穀氨酸的蛋白的N末端加入焦穀氨酸或可轉變為焦穀氨酸的胺基酸，或N末端含有焦穀氨酸或可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的肽來進行修飾；(3)(1)中的方法，其中通過用焦穀氨酸或可轉變為焦穀氨酸的胺基酸，或N末端含有焦穀氨酸或可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的肽替換具有內切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦穀氨酸的蛋白的N末端胺基酸或包含N末端的區域來進行修飾；(4) (1)到(3)任一項中的方法，其中具有內切葡聚糖酶活性、而N末端不是焦穀氨酸的蛋白是屬於家族45的纖維素酶；(5) 一種具有內切葡聚糖酶活性的修飾蛋白，其N末端胺基酸通過胺基酸修飾轉變為焦穀氨酸；(6) (5)中的修飾蛋白，其是通過⑴到⑷任一項中的方法獲得的；(7) 一種從以下組中選擇的蛋白:(a)包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白；(b)包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或添加一個或多個胺基酸所得的胺基酸序列，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的修飾蛋白 '及(C)同源蛋白，其胺基酸序列與包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白的同源性至少為85%，並且，其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小；(8)編碼(5)到(7)任一項中的蛋白的多核苷酸；(9)從以下組中選擇的多核苷酸:(a)包含SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列的多核苷酸；(b)包含在SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列中缺失、替換、插入或添加一個或多個鹼基所得的鹼基序列，而且其所編碼蛋白的內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的多核苷酸；及(c)與SEQ ID NO:1、3、37或39所示的核酸序列在嚴緊條件下雜交，而且編碼內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白的多核苷酸；(10)含⑶或(9)所述的多核苷酸的表達載體；(11)用(10)所述的表達載體轉化的宿主細胞；(12) (11)所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母或絲狀真菌；(13) (12)所述的宿主細胞,其中，所述絲狀真菌是屬於腐質黴屬(Humicola)或木黴屬的微生物；(14) (13)中的宿主細胞,其中，所述絲狀真菌是Humicola insolens或綠色木黴(Trichoderma viride)；(15) 一種生產(5)到(7)中任何一種蛋白的方法，包括:培養(11)到(14)任一項中的宿主細胞，從培養的宿主細胞或培養物中回收蛋白；及(16) 一種由(15)所述的方法產生的蛋白。發明效果根據本發明可有效產生用於衣物洗滌，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的新型纖維素酶。發明的優選實施方案屬於家族45並具有內切葡聚糖酶活性的蛋白(此後有時指「屬於家族45的纖維素酶」)家族45此處所用術語「家族45」是指根據Henrissat B.等人.關於碳水化合物活性酶的疏水簇分析而劃分為家族45的蛋白[Henrissat B., Bairoch A.Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316:695-696(1996)]。具有內切葡聚糖酶活性的蛋白此處所用術語「具有內切葡聚糖酶活性的蛋白」是指具有內切葡聚糖酶活性的酶，例如內切-1，4-β-葡聚糖酶伍03.2.1.4)，它可水解β-1，4-葡聚糖中的β_1，4_吡喃型葡萄糖基鍵。表面活性劑此處所用術語「表面 活性劑」是一種含在衣物洗滌劑中的洗滌劑成分，可廣泛地分為陰離子、陽離子和非離子表面活性劑。通常使用的是陰離子表面活性劑。本發明中所用的優選陰離子表面活性劑可以是，例如線性烷基苯磺酸鹽(以下有時以LAS表示)。內切葡聚糖酶活性此處所用術語「內切葡聚糖酶(以下以「EGU」表示)活性」定義為通過以下流程測定的羧甲基纖維素溶液粘度的降低而得到的酶活性。更具體地，作為底物溶液，將羧甲基纖維素(Hercules)溶解在0.lmol/L的Tris-HCl緩衝液(ρΗΙΟ.0)中，使終濃度為3.5%.預先將底物溶液(5mL)在40°C加熱10分鐘，然後加入0.15mL酶溶液，將整個溶液混勻，在40°C反應30分鐘。通過R型粘度計(RE 100 ；T0KI SANGYO C0.，LTD.)在40°C測定混合液的粘度。「I單位」酶活性定義為在每個反應條件下，將最初粘度降低到1/2所用的酶量。使用的陰離子表面活性劑是線性烷基苯磺酸鹽(Wako Pure Chemical Industries, C0., Ltd.),將其加到羧甲基纖維素溶液中，至終濃度為800ppm。存在表面活性劑時內切葡聚糖酶活性降低的抑制此處所用術語「存在表面活性劑時其內切葡聚糖酶活性降低較小「是指將其N末端根據本發明進行修飾的蛋白(N末端修飾型蛋白)與修飾前的原始蛋白(以下簡稱為原始蛋白)在存在表面活性劑時，對其內切葡聚糖酶活性進行比較，N末端修飾型蛋白的內切葡聚糖酶活性比原始蛋白高。原始蛋白本發明方法中所用的原始蛋白並無特別限定，只要N末端是除焦穀氨酸外的胺基酸，並具有內切葡聚糖酶活性的蛋白即可。原始蛋白優選地可以包括，例如纖維素酶(例如，內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或葡萄糖苷酶)，及屬於家族45的纖維素酶。在本文中，只要原始蛋白至少具有內切葡聚糖酶活性即可，因此可以是只具有內切葡聚糖酶活性的蛋白，或具有除內切葡聚糖酶活性外其它一種或多種酶活性的蛋白。另外，原始蛋白可以是天然蛋白或經遺傳修飾的蛋白。屬於家族45的纖維素酶的來源 屬於家族45的纖維素酶可通過基因工程技術，例如重組DNA技術或多肽合成技術產生，或從分離的野生型菌株獲得。另外，纖維素酶包括屬於家族45的野生型纖維素酶的突變體。屬於家族45的纖維素酶可從微生物，例如絲狀真菌或接合菌獲得。絲狀真菌包括，例如屬於腐質黴屬(例如Humicola insolens)、木黴屬(例如綠色木黴)、圓孢黴屬(例如 Staphylotrichum coccosporum)或 Myriococcum(例如 Myriococcum thermophilum)的微生物。更具體地，來源於腐質黴屬的纖維素酶包括，例如CBH 1、EG V、NCE2、NCE4或NCE5等；來源於木黴屬的纖維素酶包括，例如CBH 1、CBH I1、EG II和EG III等；來源於Staphylotrichum屬的纖維素酶包括,例如STCEl和STCE3等；及來源於Myriococcum屬的纖維素酶包括，例如MTEl等。接合菌包括,例如屬於根黴屬(Rhizopus)(例如米麴黴(Rhizopus oryzae))、毛黴屬(Mucor)(例如卷枝毛黴(Mucor circinelloides))或須黴屬(Phycomyces)(例如閃光須黴(Phycomyces nitens))的微生物。更具體地，包括來源於米麴黴的RCE 1、RCE II或RCE III ;來源於卷枝毛黴的MCEI或MCE II ;或來源於閃光須黴的 PCE I(W000/24879)。焦穀氨酸或含焦穀氨酸的肽此處所用術語「焦穀氨酸「是指通過成熟蛋白N末端穀氨醯胺或穀氨酸的環化而產生的焦穀氨酸。焦穀氨酸具有N末端氨基不暴露在外的性質。可在體內或體外進行焦穀氨酸的環化。體內，通過將編碼經基因工程設計而使成熟蛋白的N末端為穀氨醯胺或穀氨酸的修飾蛋白的多核苷酸在宿主中進行表達，從而得到焦穀氨酸環化的蛋白。體外，將N末端具有穀氨醯胺或穀氨酸的蛋白用酸性溶液，例如甲酸進行處理，從而得到焦穀氨酸環化的蛋白。此處所用術語「肽」是 指含一個或多個胺基酸，而且胺基酸通過肽鍵聚合的化合物。因此，此處所用術語「含焦穀氨酸的肽」是指其N末端為焦穀氨酸的肽。含焦穀氨酸的肽包括兩個或多個交聯的胺基酸，例如2到40個胺基酸，優選地為2到30個胺基酸，更優選地為2到20個胺基酸，更優選地為2到10個胺基酸，更優選地為2到5個胺基酸，最優選地為2到4個胺基酸交聯。胺基酸並無特別限定，只要他們可被本領域技術人員用於所述目的即可。在本發明的方法中，對將原始蛋白修飾為N末端具有焦穀氨酸的蛋白的方法不進行限定，只要可進行蛋白修飾即可。這些方法包括，例如基因工程技術或化學技術。根據基因工程技術，原始蛋白可通過，例如基因工程水平上的添加和/或替代合適的胺基酸或胺基酸序列而進行修飾。在一個通過基因工程添加的實施例中，通過向原始蛋白(例如，具有內切葡聚糖酶活性，且N末端不是焦穀氨酸的蛋白)的N末端加入焦穀氨酸或N末端含焦穀氨酸的肽而進行蛋白修飾。例如，更具體地，通過基因工程技術進行添加的實施例可包括以下步驟:(1)向編碼原始蛋白的多核苷酸的5』末端添加編碼可轉變為焦穀氨酸的胺基酸(穀氨醯胺或穀氨酸)的多核苷酸，或編碼N末端具有可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的多肽的多核苷酸 '及(2)在可使N末端胺基酸進行焦穀氨酸環化的宿主中表達(I)中所得的多核苷酸。在通過基因工程替代的實施例中，通過將原始蛋白的N末端胺基酸或N末端區替代為焦穀氨酸或N末端含焦穀氨酸的肽而進行蛋白修飾。例如，更具體地，通過基因工程替代的實施例可包括以下步驟:(1)將編碼原始蛋白的5』末端或含5』末端區的多核苷酸用編碼可轉變為焦穀氨酸的胺基酸(穀氨醯胺或穀氨酸)的多核苷酸，或編碼N末端具有可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的肽的多核苷酸替代；及
(2)在可使N末端胺基酸進行焦穀氨酸環化的宿主中表達(I)中所得的多核苷酸。使用化學技術的實施例可包括，例如，(a)將焦穀氨酸(或N末端含焦穀氨酸的肽)直接加到原始蛋白的N末端的實施例；(b)將可轉變為焦穀氨酸的胺基酸(或N末端具有可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的肽)通過化學方法加到原始蛋白N末端，並通過化學方法進行N末端胺基酸焦穀氨酸化的實施例；或(c)將N末端具有可轉變為焦穀氨酸的胺基酸的原始蛋白的N末端胺基酸通過化學方法焦穀氨酸化的實施例。在屬於家族45的纖維素酶的N末端加入焦穀氨酸或合焦穀氨酸的肽的方法修飾方法可通過用屬於家族45的纖維素酶在實施例中進行進一步闡述。在屬於家族45的纖維素酶的N末端加入焦穀氨酸或含焦穀氨酸的肽的方法可通過基因工程技術進行。在通常所用的纖維素酶的生產中，編碼所需纖維素酶的多核苷酸的編碼區可連接到在絲狀真菌等宿主中有功能的啟動子和終止子之間，然後將得到的表達盒轉入宿主中。另夕卜，編碼在宿主細胞中具有分泌功能的信號肽序列的多核苷酸也可以加到表達盒中。當將表達盒引入到宿主細胞中時，所需的纖維素酶可分泌到培養基中，從而可很容易地收集所需的纖維素酶。在這種情況下，可通過向緊鄰分泌信號肽序列的下遊加入編碼胺基酸的多核苷酸而將所需胺基酸加到纖維素酶的N末端。另外，也可通過用宿主中的分泌信號序列進行N末端胺基酸的氨基基團的修飾。例如，在來源於綠色木黴的cbhl或cbh2，或來源於Humicola insolens的NCE2或NCE5中，N末端是焦谷酸化的,這種修飾可通過用來源於這種微生物的分泌信號序列並在綠色木黴或Humicola insolens中表達來製備。根據優選實施例，如上所述製備的屬於家族45的修飾纖維素酶具有在存在表面活性劑時其內切葡聚糖酶活性降低很小的優勢性質。根據另一個實施例，整個序列可根據本領域技術人員常用的技術進行化學合成。在這種情況下，可用部分天然蛋白進行合成。
_3] 本發明中的蛋白本發明中的蛋白通過將具有內切葡聚糖酶活性的原始蛋白的N末端修飾為焦穀氨酸而進行製備(例如，通過獲得屬於家族45的纖維素酶，並向該成熟蛋白的N末端胺基酸中鏈加入焦穀氨酸(PQ)或含焦穀氨酸的肽而製備)，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小。另外，本發明包括通過上述方法製備的，其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白。更具體地，本發明中的蛋白包括從由以下蛋白組成的組中選擇的蛋白:(a)包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白；(b)含有在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或添加一個或多個胺基酸所得的胺基酸序列，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的修飾蛋白 '及(C)同源蛋白，其胺基酸序列與SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白的同源性至少為85%， 而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小。SEQ ID NO:2的胺基酸序列是N末端添加型NCE4的胺基酸序列(參見實施例A2)，其中含有5個胺基酸(N末端為焦穀氨酸)的肽加到來源於Humicola insolens麗200-1的內切葡聚糖酶NCE4的N末端。SEQ ID NO:4的胺基酸序列是N末端替代型STCEl的胺基酸序列(參見實施例B2),其中含有4個胺基酸(N末端為焦穀氨酸)的肽替代來源於Staphylotrichumcoccosporum IFO 31817的內切葡聚糖酶STCEl的N末端胺基酸(Ala)。SEQ ID NO:38的胺基酸序列是pQ添加型STCEl的胺基酸序列(參見實施例B3)，其中焦穀氨酸加到來源於Staphylotrichum coccosporum IFO 31817的內切葡聚糖酶STCEl的N末端。SEQ ID NO:40的胺基酸序列是N末端添加型STCEl的胺基酸序列(參見實施例B4),其中含有4個胺基酸(N末端為焦穀氨酸)的肽加到來源於Staphylotrichumcoccosporum IFO 31817的內切葡聚糖酶STCEl的N末端。此處所用術語「修飾 蛋白」是指包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中缺失、替代、插入或添加一個或多個胺基酸(例如，一個或幾個胺基酸)所得的胺基酸序列，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白。修飾例如「缺失、替代、插入或添加」的胺基酸的數目優選地是I到30，更優選地是I到10，最優選地是I到6。另外，修飾蛋白是指包含在SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中保守替代一個或多個胺基酸，而且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白。此處所用術語「保守替代」是指蛋白中一個或多個胺基酸殘基可被具有相同化學性質的不同胺基酸替代，從而使其蛋白活性不發生實質性改變。保守替代可包括，例如將疏水殘基替代為另一個疏水殘基，或將極性殘基替代為另一個具有相同電荷的極性殘基。具有相同化學性質並可互相保守替代的胺基酸是本領域技術人員已知的。更具體地，非極性(疏水)胺基酸包括，例如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸。極性(中性)胺基酸包括，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺或半胱氨酸。帶正電荷的鹼性胺基酸包括，例如精氨酸、組氨酸或賴氨酸。帶負電荷的酸性胺基酸包括，例如天冬氨酸或穀氨酸。此處所用術語「同源蛋白」是指其與包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的同源性(序列相似性)至少為85% (優選地是90%或以上，最優選地是95%或以上)，且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的蛋白。此處所用同源性以用已知的同源性分析軟體FASTA3，根據預設參數計算出的值(相似性)表示[Science，227，1438-1441 (1985) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，85，2444-2448(1988) ；http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mai1/homology-j.html]。如上所述，在本發明的「由胺基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白」中，除了加到N末端的由5個胺基酸組成的肽外，其它部分來源於內切葡聚糖酶NCE4。另外，在本發明的「胺基酸序列SEQ ID NO:4、38或40所示的蛋白」中，除了 N末端胺基酸或肽外，其它部分來源於內切葡聚糖酶STCE1。內切葡聚糖酶NCE4和STCEl屬於家族45。已知屬於家族45的內切葡聚糖酶包括，例如來源於腐質黴屬的NCE5 (W001/90375)。在

圖1和2中，所示的是內切葡聚糖酶STCEl的胺基酸序列[信號肽(SEQ ID NO:43)，成熟蛋白(SEQ ID NO:44)]、內切葡聚糖酶NCE4的胺基酸序列[信號肽(SEQ ID NO:45)，成熟蛋白(SEQ ID NO:46)]和內切葡聚糖酶NCE5的胺基酸序列[信號肽(SEQ ID NO:47)，成熟蛋白(SEQ ID NO:48)]的比對結果。圖1所示的是前半部分(即N末端部分)的比對結果，圖2所示的是後半部分(即C末端部分)的比對結果。圖1和2中的符號表示與STCEl —致的胺基酸。如圖1和2所示，屬於家族45的內切葡聚糖酶包括作為共有結構域的催化結構域(I到207位)，有些含有接頭(208到258位)和/或纖維素結合結構域(CBD) (259到295位)。在本文中，以上結構域之後的括號中的數字表示內切葡聚糖酶STCEl的胺基酸序列(SEQ ID NO:44)中的胺基酸編號。在內切葡聚糖酶的催化結構域和纖維素結合結構域均存在保守胺基酸，但在接頭沒有明顯的保守區存在。含多個保守胺基酸或在該區域所含的共有胺基酸的區域(例如，催化結構域或纖維素結合結構域，特別是催化結構域)是對內切葡聚糖酶(例如STCEl或NCE4)酶活性重要的區域或胺基酸。因此，在除了這種重要區域或胺基酸的其它區域或胺基酸處進行胺基酸修飾(例如缺失、替代、插入和/或添加，特別是保守替代)，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。。另外，即使在內切葡聚糖酶含多個保守胺基酸的區域中，用不同的胺基酸對非共有胺基酸進行修飾(優選地是相同的胺基酸進行保守替代)也可以保持酶活性。因此，通過這種修飾，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。即使是含有大量保守胺基酸的區域內的共有胺基酸，改變為其它胺基酸時，有時也可維持其酶活性，尤其是改變為可保守取代類似胺基酸的時候，其可能性增高。本發明的修飾蛋白質或同源蛋白質，只有是具有內切葡聚糖酶活性，可以是任意區域，例如催化區域、接頭或纖維素結合區域所含的胺基酸改變的蛋白質。編碼本發明中蛋白的多核苷酸根據本發明，提供編碼包含SEQ ID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白，或其修飾或同源蛋白(以下統稱為本發明中的蛋白)的多核苷酸。當給定一個蛋白的胺基酸序列時，則可容易地選擇編碼該胺基酸序列的核苷酸序列，因此可選擇多種編碼本發明中蛋白的核苷酸序列。此處所用術語「多核苷酸」包括DNA和RNA，DNA是優選的。本發明中的多核苷酸包括從由以下多核苷酸組成的組中選擇的多核苷酸:(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39的多核苷酸；(b)包含在核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39中缺失、替代、插入或添加一個或多個鹼基所得的鹼基序列，而且其所編碼蛋白的內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的多核苷酸；及(C)在嚴緊條件下與核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、37或39所示的多核苷酸雜交，而且其所編碼蛋白的內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的多核苷酸。在上述(b)中的核苷酸序列中，被缺失、替代、插入或添加的核苷酸的數目可以是例如I到90，優選地是I到30，更優選地是I到18，最優選地是I到9。此處所用術語「在嚴緊條件下」是指以下條件。根據ECL直接DNA/RNA標記和檢測系統(Amersham)的說明書所述，在42°C預雜交1小時後，加入核苷酸序列SEQ ID N0:l、3、37或39所示的多核苷酸，並在42°C雜交14到16小時。雜交後，用含0.4% SDS和6mol/L尿素的0.5XSSC(1XSSC ;15mmol/L檸檬酸鈉，150mmol/L氯化鈉)在42°C洗滌20分鐘，並重複2次，然後用5 X SSC在室溫下洗滌5分鐘，並重複2次。
本發明中的多核苷酸包括天然多核苷酸。也可以是全合成的多核苷酸。而且可用部分天然多核苷酸進行合成。典型地，本發明中的多核苷酸可從來源於微生物的基因組文庫，通過基因工程的普通方法，例如用根據部分胺基酸序列信息設計的合適的DNA探針，進行篩選而獲得。本發明中的蛋白的產生本發明中的蛋白可 通過用含編碼本發明蛋白的多核苷酸片段的多核苷酸分子(優選以表達載體形式)轉化宿主細胞，從而使多核苷酸分子在宿主細胞中複製，並進行基因表達而在宿主細胞中產生。根據本發明，提供了含編碼本發明中的蛋白的多核苷酸片段，從而使多核苷酸片段可在宿主微生物中複製並表達蛋白的表達載體。本發明中的表達載體可基於存在於染色體外並能獨立於染色體複製而進行複製的自主複製載體(例如質粒)進行構建。選擇性地，本發明中的表達載體可以是用載體轉化宿主時將其整合到宿主微生物基因組中，與染色體一起複製的載體。本發明中載體的構建可通過基因工程中通用流程或方法進行。為了用本發明中的表達載體轉化宿主微生物而表達具有所需活性的蛋白。優選地是表達載體除了本發明中的多核苷酸片段外還包括，例如可調控表達的多核苷酸，或篩選轉化子的基因標記。在本發明中可使用多種調控轉錄或翻譯的信號作為可調控表達的多核苷酸，例如啟動子、終止子或編碼分泌信號肽的多核苷酸。可通過普通方法將調控的多核苷酸與其插入片段進行連接。本發明中所用的啟動子並無特別限定，只要其在宿主微生物中具有轉錄活性即可。啟動子可以是調控來源於相同或不同宿主微生物的編碼蛋白的基因表達的多核苷酸。例如，可在大腸桿菌中使用乳糖操縱子或色氨酸操縱子的啟動子；在酵母中使用乙醇脫氫酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖利用基因或甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子；在真菌例如絲狀真菌中使用α-澱粉酶基因、葡糖澱粉酶基因、纖維二糖水解酶基因或甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子。信號肽並無特別限定，只要其可在宿主微生物中提供蛋白分泌作用即可。信號肽多核苷酸可從與編碼蛋白的基因相同或不同來源的宿主微生物中獲得。基因標記可根據篩選轉化子的方法進行合適的選擇。例如，在本發明中可使用抗藥基因或與營養缺陷型突變互補的基因作為基因標記。例如，當宿主是細菌時，可使用氨苄青黴素抗性基因、卡那黴素抗性基因或四環素抗性基因。當宿主是酵母時，可使用色氨酸合成基因(trpl，trpC)、尿嘧啶合成基因(ura3)、亮氨酸合成基因(leu2)或組氨酸合成基因(his3)。當宿主是真菌例如絲狀真菌時，可使用越黴素抗性基因、硝酸鹽利用基因(niaD)、精氨酸合成基因(argB)、尿嘧啶合成基因(pyr4)、潮黴素抗性基因、除草劑抗性基因、博來黴素抗性基因或aureobasidin抗性基因。根據本發明，提供用表達載體轉化的微生物。本發明中所用的宿主-載體系統並無特別限定。例如，可使用大腸桿菌、放線菌、酵母或絲狀真菌系統，或利用這種微生物進行融合蛋白表達的系統。當用酵母作為宿主時，包括，例如，使用釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物，優選地是釀酒酵母。當使用絲狀真菌作為宿主時，可以使用任何絲狀真菌，優選地是屬於腐質黴屬、木黴屬、麴黴屬(Aspergillus)、Acremonium或鐮刀菌屬(Fusarium)的微生物,更優選地是屬於腐質黴或木黴屬的微生物。更優選地是Humicola insolens、Humicola thermoidea、綠色木黴、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、長梗木黴(Trichoderma 1ngibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑麴黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、尖抱鍵抱(Fusarium oxysporum)或 Acremonium cellulolyticus,優選地是Humicola insolens 或綠色木黴。可通過普通方法，例如 鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、土壤桿菌法或基因槍法用表達載體轉化微生物，根據待轉化宿主選擇合適的方法。在本發明中，將本發明中的轉化子進行培養，得到的培養物用來獲得本發明的目的蛋白。本發明中的轉化子可通過普通方法選擇合適的培養基或培養條件進行培養。可向培養基中補充例如可被本發明中的轉化子代謝或利用的碳源或氮源、無機鹽、各種維生素、各種胺基酸例如穀氨酸或天冬醯胺、微量營養物質例如核苷酸、或選擇試劑例如抗生素。另外，可適當添加利於本發明中的轉化子生長或促進本發明中的蛋白產生的有機和/或無機物質。另外，如果需要，可使用含其它營養物質的天然或合成培養基。可在培養基中使用任何碳源和氮源，只要它可被本發明中的轉化子利用即可。可利用碳源可使用例如蔗糖、澱粉、甘油、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、纖維素、纖維二糖、糊精、動物油或植物油或其水解物。一般來說，其濃度在培養基中優選地是0.1 %到5%。可利用氮源可使用例如動植物組分或其提取物、例如蛋白腖、肉提取物、玉米浸出液或脫脂豆粉、有機酸銨鹽例如琥珀酸銨鹽或酒石酸銨鹽、尿素或其它多種含氮化合物例如無機酸或有機酸。無機鹽可使用例如那些可產生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、磷酸、硫酸或其它離子的無機鹽。可適當使用任何含其它組分，例如細胞、分泌液或微生物例如酵母提取物、或細小植物粉的培養基，只要這種培養基不幹預本發明中的轉化子生長和本發明中的蛋白的產生和積累即可。當培養具有營養需求的突變株時，通常向培養基中加入滿足其營養需求的物質。在本文中，如果培養基中含天然底物，則不需加入這種營養物質。根據所用的轉化子和外部條件，對培養條件例如培養基成分、培養基流動性、培養溫度、攪拌速率或通氣速率進行合適的選擇和控制，從而得到優選的結果。如果在液體培養基中產生泡沫，則可使用消泡劑例如矽樹脂油、植物油、礦物油或表面活性劑。在獲得的培養物中積累的本發明中的蛋白包含於本發明中的轉化子和培養物濾液中。因此，可通過離心分離培養物組分而從培養物濾液和轉化子細胞中獲得本發明中的蛋白。本發明中的蛋白可通過普通方法從培養物濾液中回收。從培養物中回收本發明中的蛋白的流程可按單獨或按任意順序組合，或重複進行。例如，可使用萃取過濾、離心、透析、濃縮、乾燥、冷凍、吸附、解吸附、基於在各種溶劑中溶解度不同的分離方法(例如沉澱、鹽析、結晶、重結晶、反向溶解或層析)。另外，本發明中的蛋白可從本發明中的轉化子的培養物中獲得。例如，通過普通方法從培養物中提取(例如，研磨處理或壓力破碎)、回收(例如，過濾或離心)、或純化(例如，鹽析或溶劑沉澱)。可根據普通方法對得到的粗物質進行純化，例如用載體物質例如葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、合成多聚物或矽膠進行柱層析。本發明中的目的蛋白的純品可從本發明中的轉化子培養物中通過上述方法單獨或以合適組合而獲得。如上所述，根據本發明的另一個實施例，提供本發明中的新型蛋白的生產過程。可以與製備轉化子的原始宿主實質上相同的方式進行轉化子的培養(包括培養條件)。轉化子培養後的目的蛋白的回收方法可通過常用的方法進行。保藏菌株用本發明的表達載體pE⑶01轉化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/pE⑶01)(FERM BP-5973)在1996年7月12日國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心[(以前名稱)通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，並於1997年6月13日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERM BP-5973[FERMP-15729]。用本發明的表達載體pMKDOl轉化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/pMKDOl)(FERM BP-5974)在1996年7月12日在國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心[(以前名稱)通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，並於1997年6月13日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERM BP-5974[FERMP-15730]。用本發明的表達載體pCBl_M2XR轉化的大腸桿菌JM109 (Escherichia coli/PCB1-M2XR) (FERM BP-6045)在1996年9月9日在國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心[(以前名稱)通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，並於1997年8月11日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERMBP-6045[FERM P-15840]。在本文中，本發明中的質粒pCBl-M2不僅可通過實施例中描述的方法獲得，而且也可以通過預先用限制性酶XbaI消化的質粒pCBl-M2XR的自連而獲得。作為本發明中的表達載體的宿主的Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977)在1996年7月15日在國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心[(以前名稱)通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，並於1997年6月13日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERMBP-5977[FERM P-15736]。作為本發明中的表達載體的宿主的綠色木黴MC300-1 (Trichoderma virideMC300-1) (FERM BP-6047)在1996年9月9日在國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心[(以前名稱)通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)]，並於1997年8月11日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERMBP-6047[FERM P-15842]。用本發明的表達載體pUC118_STCEex轉化的大腸桿菌JM109(E.coli DH5 α /pUC118-STCEex) (FERM BP-10127)在2003年12月I日在國內保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(地址:〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)，並於2004年9月15日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號後的括號[]中的數字是國內保藏號)是FERM BP-10127[FERM P-19602]。在本文中，質粒pUC118_STCEex是通過將STCE基因插入到質粒pUC118的BamHI位點而得到的質粒。包含在BamHI片段中的內切葡聚糖酶STCEl基因包括一個內含子，其序列為SEQ ID NO:5。
實施例本發明將通 過以下實施例進行進一步描述，但不作為對本發明的限制。實施侈Il Al:在Humicola insolens中表汰N末端添力口型纖維素酶矛口裡予牛.型纖維素酶的表達載體的構建(I)用於表達N末端添加型纖維素酶的表達載體pMKDOl的構建用BamHI消化質粒pUC118 (Takara Bio)。得到的片段用DNA平端化試劑盒(TakaraBio)進行平端化，然後用DNA連接試劑盒(Takara Bio)進行自連，從而得到pUC118BN。將所得的PUC118BN用SphI消化，平末端化後自連得到pUC118BSN。然後，根據特開平N0.8-126492 中所述的方法從 Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977)獲得含纖維素酶NCE2基因全長的3.4kb Pst1-XbaI片段。將該片段連接到預先用相同的限制性酶消化的 pUC118BSN 中，得到 pUC118BSN_PX。用 Sculptor 體外突變系統(Amersham Bioscience)在pUC118BSN-PX引入定點突變，得到質粒pM21。用於突變的寡核苷酸使用的是寡核苷酸MNC-02 和 MNC-03。MNC-02:5』 -GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAAT G_3』 (SEQ ID NO:6)MNC-03:5，-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3』 (SEQ ID NO:7)用BamHI消化質粒pM21,並與來源於Humicola insolens MN200-1的纖維二糖水解酶基因(NCE3)的BamHI消化的PCR片段連接，得到質粒pKM04。用來源於Humicolainsolens MN200-1 (FERM BP-5977)的基因組 DNA (W098/03640)為模板，以下列引物 MKA-05和MKA-06擴增NCE3的PCR片段。MKA-05:5，-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAG G_3』 (SEQ ID NO:8)MKA-06:5』 -TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCA C_3』 (SEQ ID NO:9)然後，用來源於構巢麴黴(Aspergillus nidulans)的trpC基因的啟動子和終止子(Mullaney, E.J.，et.al.，Mol.Gem.Genet.，199,37-45,1985)製備可在 Humicolainsolens中表達特開昭59-175889號公報記載的越黴素抗性基因的基因。將得到的基因連接到用XbaI消化的質粒pKM04中，得到表達N末端添加型纖維素酶的表達載體pKMDOl (FERM BP-5974)。在pKMDOl中，在距NCE2基因的成熟蛋白N末端下遊IObp和其終止密碼子下遊3bp處引入BamHI識別位點，從而在屬於家族45的纖維素酶的N末端加入5個胺基酸殘基。表I
權利要求
1.選自下述的、N末端為焦穀氨酸的蛋白質: (a)由在SEQID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或添加I 30個胺基酸所得的胺基酸序列組成、所述胺基酸序列的N末端被轉變為焦穀氨酸、且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的修飾蛋白質； (b)由在SEQID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列中保守替換I 30個胺基酸所得的胺基酸序列組成、所述胺基酸序列的N末端被轉變為焦穀氨酸、且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小的修飾蛋白質；及 (c)同源蛋白質，其由與包含SEQID NO:2、4、38或40所示的胺基酸序列的蛋白質的同源性至少為85%的胺基酸序列組成、所述胺基酸序列的N末端被轉變為焦穀氨酸、且其內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小。
2.選自下述的、編碼N末端為焦穀氨酸的蛋白質的多核苷酸: (a)多核苷酸，其由在SEQID NO:1、3、37或39所示的鹼基序列中缺失、替換、插入或添加I 90個鹼基所得的鹼基序列組成、所述鹼基序列的N末端密碼子編碼穀氨酸或穀氨醯胺、且所述多核苷酸編碼蛋白質的內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小；及 (b)多核苷酸，其在嚴緊條件下與SEQID NO:1、3、37或39的鹼基序列組成的多核苷酸序列雜交、所述鹼基序列的N末端密碼子編碼穀氨酸或穀氨醯胺、且所述多核苷酸編碼蛋白質的內切葡聚糖酶活性在存在表面活性劑時降低很小。
3.包含權利要求2的多核苷酸的表達載體。
4.用權利要求3的表達載體轉化的宿主細胞。
5.權利要求4的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母或絲狀真菌。`
6.權利要求5的宿主細胞,其中，所述絲狀真菌是屬於腐質黴(Humicola)或木黴屬(Trichoderma)的微生物。
7.權利要求6中的宿主細胞,其中，所述絲狀真菌是Humicolainsolens或綠色木黴(Trichoderma viride)。
8.生產前述蛋白質的方法，包括:培養權利要求5 7任一項中的宿主細胞的步驟，以及從培養獲得的宿主細胞或其培養物中回收權利要求1的蛋白質的步驟。
9.根據權利要求8的方法生產的蛋白質。
全文摘要
公開了一種抑制在存在表面活性劑時內切糖苷酶活性降低的方法，其特徵在於通過修飾具有內切糖苷酶活性，N末端胺基酸不是焦穀氨酸的蛋白，使其轉變為N末端具有焦穀氨酸的蛋白。另外，公開了一種具有內切糖苷酶活性，其N末端通過胺基酸修飾轉變為焦穀氨酸的修飾蛋白，編碼該蛋白的多核苷酸，包含該多核苷酸的表達載體，用該表達載體轉化的宿主細胞和通過培養宿主細胞而生產蛋白的方法。
文檔編號C12N15/56GK103103171SQ20121035089
公開日2013年5月15日 申請日期2004年12月7日 優先權日2003年12月8日
發明者渡邊學, 矢內耕二, 露木由美子 申請人:明治制果藥業株式會社