黃牛tas1r2基因的單核苷酸多態性及其檢測方法
2023-04-30 16:49:56
專利名稱：黃牛tas1r2基因的單核苷酸多態性及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及以黃牛的功能基因的單核苷酸多態性(SNP)作 為分子遺傳標記，特別涉及一種黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性及其檢測方法。
背景技術：
近幾年來，我國肉牛生產發展很快，但生產水平較低，平均產肉率不高，其中一個 重要原因是迄今我國還沒有一個自己培育的專門化肉牛品種。要大力發展我國的肉牛生 產，除了利用國外優秀的肉牛品種雜交改良我國地方黃牛外，還必須培育自己的肉牛品種。作為世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，我國黃牛品種資源十分豐富，適應性 強，肉質良好。然而，由於歷史上以役用為主，我國黃牛作為規模化肉用生產的牛種，缺點也 是明顯的。這主要表現在後驅不發達，產肉少，育肥增重速度趕不上國外的專門化品種，加 上沒有經過系統的肉用性能選育，肉的品質規格往往差異較大，優質高檔肉塊產量少，造成 發展肉牛生產的規模效益比不上專門化的國外肉牛品種。但另一方面，我國各黃牛品種內 個體間存在極大的差異，一些個體的生長肥育性能較好。在一些群體中，部分個體具有很好 的肉用特徵。如果通過品種內高強度的選擇和培育，完全有可能在較短時間內培育成為中 國特有的優良肉牛品種。肉用性狀是典型的、具有重要經濟價值的數量性狀，受環境因素影響較大，用常規 育種方法進行育種進展緩慢。20世紀80年代後期以來，國際上的動物遺傳育種已經進入分 子水平，即分子育種，使育種朝著快速改變動物基因型的方向發展。近幾年來，由於分子生 物學和各種分子生物技術的發展，使人們又可能直接從遺傳物質本身的基礎上揭示生物的 性狀特徵，它與基因產物的研究相比克服了年齡、性別、組織及各種內外環境因素的影響， 而且所提供的遺傳差異，即遺傳標記的種類又非常多，如微衛星、PCR-SSCP, PCR-RFLP等遺 傳標記的種類也越來越多，因此，分子育種越來越受到人們的重視。在20世紀90年代中期 以後，我國逐漸開展了黃牛肉用性能的分子遺傳學研究。採用基因標記等現代分子育種新 技術結合常規育種，以便能夠加快中國肉牛品種的培育和選育。SSCP(single strand comformation polymorphism)即單鏈構象多態性。 PCR-SSCP技術是PCR技術和SSCP技術的結合，其原理是變性後的產物在電泳時，空間構象 不同的單鏈DNA會因其遷移率不同而得到分離，從而檢測相應的遺傳變異。這項技術具有 簡便、快速、敏感和經濟等特點，適用於大樣本基因變異情況的篩查。TAS1R2 (taste receptor, type Lmember 2)是味覺受體第一家族的成員。目前已 確定的哺乳動物味覺受體基因家族有兩個，即味覺受體第一家族(taste receptor family 1 members,TlRs)禾口味覺受體第二家方矣(taste receptor family 2 members,T2Rs)。研究 表明，甜味與鮮味(胺基酸味)主要由味覺細胞上G蛋白偶聯受體第一家族(TlRs)識別。味覺是動物最基本、最原始的生理感覺之一，人和動物利用味覺來識別食物的性 質、調節食慾、控制攝食量。鮮和甜被人們認為為相對「好」的味覺，它能促進對營養食物較 多進食；而苦和酸相對而言的是「壞」的味覺，使得機體對有毒的和低PH值食物更加警惕，
3促使它們拒絕或是減少對含有有害物質的攝取。所以味覺恰如其分的調整了生物體的採食 行為。TlRs家族由3個基因組成，TlRU T1R2和T1R3，它們以異源二聚體的形式發揮作 用，T1R2和T1R3結合形成甜味受體，TlRl和T1R3 —起作為鮮味受體。甜味覺一直是人類 和其他動物的喜好的味覺，所以甜味覺可以提高食慾，增加攝食量。為此，TAS1R2基因遺傳 變異或SNP位點在動物生產實踐中對肉用性狀、生長發育性狀具有重要的作用。關於TAS1R2基因的研究國內外多見於人和小鼠，還未見有關TAS1R2基因遺傳變 異或SNP研究的報導。由於目前中國黃牛TAS1R2基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因 位點的功能研究及該基因遺傳變異與經濟性狀(如產肉、生長發育等性狀)關聯的研究成 為空白。
發明內容
本發明解決的問題在於提供黃牛TAS1R2基因單核苷酸多態性檢測方法及其應 用，尋找與黃牛經濟性狀相關的SNP作為分子標記，加快黃牛良種繁育速度。本發明通過以下技術方案來實現一種黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性，其基因單核苷酸多態性包括黃牛TAS1R2基因第288位為A或G的單核苷酸多態性。上述黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性的檢測方法為以包含TAS1R2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴 增黃牛TAS1R2基因；對擴增產物進行變性之後，再進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；根據電泳結 果鑑定黃牛TAS1R2基因第288位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為上遊引物P1:F5' -CACCTCTGAGACCTCCATT-3 『下遊引物P2:R5' -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3 『。所述的PCR擴增反應程序為95°C 預變性 5min ；94°C 變性 30s，64°C退火 30s，72°C 延伸 30s，35 個循環；72°C 延 伸 IOmin0所述的聚丙烯醯胺凝膠電泳為質量濃度為10%的聚丙烯醯胺凝膠電泳。所述的根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果TAS1R2基因第288位的鹼基多態性為AA 型表現；AG型表現；GG型表現。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明公開了與黃牛產肉性狀相關的功能基因TAS1R2的核苷酸多態性，該核苷 酸多態性能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確 估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。針對上述TAS1R2基因的SNP多態性，本發明還公開了其檢測方法，通過設計特定 的PCR引物擴增片段，運用SSCP方法並結合DNA測序方法，簡單、快速、低成本、精確的檢測 其單核苷酸的多態性。本發明對TAS1R2基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與郟縣紅牛、 秦川牛和魯西牛性狀之間進行了性狀關聯分析；結果顯示TAS1R2基因的核苷酸多態位點
4能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。由於TAS1R2基因功能主要涉及產肉這個經濟性狀，本發明提供的檢測方法為 TAS1R2基因的SNP與體尺性狀關係的建立奠定了基礎，以便用於中國黃牛肉用經濟性狀的 標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
圖1為黃牛血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為黃牛TAS1R2基因第1外顯子215bp PCR擴增產物電泳圖；圖3為黃牛TAS1R2基因第1外顯子215bp PCR產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測 TAS1R2基因多態性的電泳結果圖；泳道2、4為AA基因型個體；泳道1、3、5為AG基因型個 體；泳道6為GG基因型個體。圖4為黃牛TAS1R2基因SNP的不同基因型測序峰圖。
具體實施例方式本發明以TAS1R2基因保守序列設計引物擴增TAS1R2基因第1外顯子215bp片段， 分別以3種黃牛品種的基因組為模板，進行PCR擴增，並對PCR產物純化，經SSCP分析和測 序後尋找該擴增片段的單核苷酸多態；針對發現的單核苷酸多態進行性狀關聯性分析，並 提供其檢測方法，使得TAS1R2基因的核苷酸多態性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺 傳標記，為加快建立具有優質經濟性狀的黃牛種群提供依據。a、黃牛TAS1R2基因部分DNA序列的擴增及其多態性的檢測1、黃牛血樣的採集及處理取黃牛血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次後放入冰 盒，-80°C保存備用。本發明採用了 3個黃牛品種，具體如表1所示。表1黃牛樣品來源表
權利要求
一種黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性，其特徵在於，其基因單核苷酸多態性包括黃牛TAS1R2基因第288位為A或G的單核苷酸多態性。
2.一種黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟 以包含TAS1R2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛TAS1R2基因；對擴增產物進行變性處理之後，再進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；根據電泳結 果鑑定黃牛TAS1R2基因第288位的單核苷酸多態性； 所述的引物對P為上遊引物 Pl :F5 『 -CACCTCTGAGACCTCCATT-3 『 下遊引物 P2 R5 『 -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3 『。
3.如權利要求2所述的黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵在於， 所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ；94°C變性30s，64°C退火30s，72 °C延伸30s，35個循環；72°C延伸 IOmin0
4.如權利要求2所述的黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵在於， 所述的聚丙烯醯胺凝膠的質量濃度為10%。
5.如權利要求2所述的黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵在於， 所述的根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果TAS1R2基因第288位為AA型表現；AG型表現和GG 型表現。
全文摘要
本發明公開了一種黃牛TAS1R2基因的單核苷酸多態性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態性包括以包含TAS1R2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛TAS1R2基因；對產物進行變性後，再對變性後的擴增片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；根據電泳結果鑑定黃牛TAS1R2基因第288bp的鹼基多態性。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛產肉性狀密切相關的分子遺傳標記，以用於黃牛的輔助選擇和分子育種，加快黃牛良種繁育速度。
文檔編號C12Q1/68GK101962683SQ201010531550
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月4日 優先權日2010年11月4日
發明者單俐敏, 張春雷, 房興堂, 汪琴, 袁靜, 錢麗娜, 陳宏 申請人:徐州師範大學