三七不定根的培養方法
2023-05-25 12:37:41 1
專利名稱：三七不定根的培養方法
發明屬生物醫藥領域，具體涉及一種三七不定根的培養方法。
背景技術：
三七是我國特有的中藥材之一，名列我國「參、茸、桂、七」傳統四大名貴中藥之列。 三七具有散瘀止血、消腫定痛等功效，既可作為滋補品直接食用，又是許多保健品和藥品的重要 原料，如血塞痛、雲南白藥、複方丹參滴丸和複方三七通絡片等。三七藥材中含有約15%總皂苷，約3%黃酮，2%多糖，7%胺基酸及其他成分，包括多個單體成分，且各單體成分的藥理和藥效作用並不盡然相同。三七總皂苷分為人參二醇皂苷和人參三醇皂苷兩大組分，還有一些獨立於醇類皂苷之外的單體皂苷。其中，人參二醇皂苷中的Rgl具有鎮靜神經的作用，其功能與人參中的主要皂苷成分相同，此外還有一些單體皂苷起消炎、定痛作用。人參三醇皂苷中，Rbl起活血化瘀作用，而其中某些單體皂苷則起去腐生新作用。三七胺基酸中含有至少9個以上單體胺基酸，其中佔三七塊根總量僅 2% -3%的單體物質L-二氨基丙酸，是三七止血作用的全部活性成分。其他單體胺基酸，如胱氨酸、穀氨酸等，則起其他補益作用，三七黃酮和多糖及其衍生物，有調節機體免疫能力、 抑制癌細胞生長等作用。以三七總皂苷為處方原料的系列產品，已在臨床廣泛應用，年總產值將近30億元。三七具有不可替代的藥用功能和價值，在醫藥行業中佔有重要地位。但三七的生長受地理條件的限制以及載培土地不能重複利用的影響，栽培面積十分有限，導致藥材供應不穩定。三七的適種區域狹小，長不到300公裡，寬不足50公裡，資源不可擴張。藥用植物資源是中藥產業得以存在、發展的根本，只有合理科學地保護性開發利用，才能保證中藥產業的可持續發展。產業化規模的非土地植物組織培養可以解決該問題。通過組織培養方法可獲得有效成分含量高、生產周期短的三七組織培養物，從而代替土地栽培的三七，解決土地問題和三七藥材供應問題，具有重要的經濟意義和社會意義。不定根培養是80年代發展起來的一項新技術，不定根是分化的植物器官，是由植物的愈傷組織誘導出來的根，和藥用植物的懸浮細胞相比，其有效成分含量穩定，和大田栽培的植物相比，不僅有效成分含量高而穩定、 生長速度快，而且節省土地資源，因此不定根培養尤其適合於根類藥材的組織培養，以組織培養物或其有效成分替代名貴稀有緊缺的三七原料。組織培養具有以下優點(1)使用植物材料資源少，僅利用植物的一小部分營養器官作為外植體進行誘導；(2)生產周期短，繁殖係數大，在短期內可生產出大量組織，生產速度超過大田栽培；(3)不受環境、季節限制， 可在有限空間內進行操作；利於工廠化生產。(4)可獲得脫毒的無菌組織，提高藥用植物的品質。生物反應器是實現植物組織大規模工業化生產的關鍵因素之一，其具有工作體積大、單位體積生產能力高，物質和化學條件控制方便，不受時間和地點限制，隨時隨地規模化生產等許多優點，為植物組織培養生產天然產物的商業化開闢了廣闊前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種三七不定根的培養方法。與傳統大田栽培方法比較，本發明培養方法簡單、效率高，次生代謝產物含量高、主要皂苷成分均得以表達且其比例與藥材相近；不定根生長迅速、無內生真菌汙染，本培養工藝操作簡單、重複性好、規模生產迅速方便。本發明三七不定根的培養方法包括以下步驟(7)三七愈傷組織的誘導將三七根消毒，切成小片，接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周可見愈傷組織形成；(8)三七愈傷組織的擴增與繼代培養將誘導出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的2，4-D、IAA和激動素中的任一種植物生長調節劑，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周；(9)三七不定根的誘導將擴增出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周，可見不定根的形成；(10)三七不定根的擴繁與繼代培養將已形成的不定根接種於MS固體培養基上， 加入濃度為lmg/L的IBA、NAA和激動素中的任一種植物生長調節劑，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周； (11)三七不定根不同根系的篩選和活性成分的測定及擴繁對培養出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養，待株系穩定後，進行活性成分的測定，並建立相應成分的指紋圖譜，然後根據檢測結果篩選出最優不定根系， 並接種於內裝含3%蔗糖的MS液體培養基的不同體積三角瓶中，並加入濃度為lmg/L的 IBA植物生長調節劑，在IOOrpm速度的搖床上、25度避光條件下進行擴繁，培養周期為3_4 周。(12)三七不定根的反應器培養將不定根接種於內部裝有含3-5%蔗糖的MS液體培養基的氣升式反應器中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在供氣速度為 0. lvvmU8-25度及避光或光照條件下進行培養，培養周期為6_12周，即得三七不定根。本培養方法簡單、效率高，次生代謝產物含量高、主要皂苷成分均得以表達且其比例與藥材相近；不定根生長迅速、無內生真菌汙染，本培養工藝操作簡單、重複性好、規模生產迅速方便。
具體實施例方式實施例1 將三七根消毒，切成小片，接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3周可見愈傷組織形成；將誘導出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的激動素，在無菌、室溫及避光條件下培養3周；將擴增出的愈傷組織接種於 MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3周，可見不定根的形成；將已形成的不定根接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的IBA、，在無菌、室溫及避光條件下培養3 周；對培養出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養，待株系穩定後，進行活性成分的測定，並建立相應成分的指紋圖譜，然後根據檢測結果篩選出最優不定根系，並接種於內裝含3%蔗糖的MS液體培養基的不同體積三角瓶中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進行擴繁，培養周期為3周。將不定根接種於內部裝有含3%蔗糖的MS液體培養基的氣升式反應器中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在供氣速度為0. lvvm, 18_25°C及避光或光照條件下進行培養，培養周期為6-8周，即得三七不定根。實施例2 將三七根消毒，切成小片，接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養5周可見愈傷組織形成；將誘導出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的IAA，在無菌、室溫及避光條件下培養4周；將擴增出的愈傷組織接種於MS 固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3周，可見不定根的形成；將已形成的不定根接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的NAA、，在無菌、室溫及避光條件下培養5 周；對培養出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養，待株系穩定後，進行活性成分的測定，並建立相應成分的指紋圖譜，然後根據檢測結果篩選出最優不定根系，並接種於內裝含3%蔗糖的MS液體培養基的不同體積三角瓶中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進行擴繁，培養周期為5周。將不定根接種於內部裝有含3%蔗糖的MS液體培養基的氣升式反應器中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在供氣速度為0. lvvm、18_25°C及避光或光照條件下進行培養，培養周期為8-10周，即得三七不定根。實施例3 將三七根消毒，切成小片，接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養5周可見愈傷組織形成；將誘導出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的IAA，在無菌、室溫及避光條件下培養4周；將擴增出的愈傷組織接種於MS 固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3周，可見不定根的形成；將已形成的不定根接種於MS固體培養基上，加入濃度為lmg/L的IBA、，在無 菌、室溫及避光條件下培養5 周；對培養出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養，待株系穩定後，進行活性成分的測定，並建立相應成分的指紋圖譜，然後根據檢測結果篩選出最優不定根系，並接種於內裝含3%蔗糖的MS液體培養基的不同體積三角瓶中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進行擴繁，培養周期為5周。將不定根接種於內部裝有含3%蔗糖的MS液體培養基的氣升式反應器中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在供氣速度為0. lvvm、18_25°C及避光或光照條件下進行培養，培養周期為10-12周，即得三七不定根。
權利要求
1.一種三七不定根的培養方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)三七愈傷組織的誘導將三七根消毒，切成小片，接種於MS固體培養基上，在無菌、 室溫及避光條件下培養3-5周可見愈傷組織形成；(2)三七愈傷組織的擴增與繼代培養將誘導出的愈傷組織接種於MS固體培養基上， 加入植物生長調節劑，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周；(3)三七不定根的誘導將擴增出的愈傷組織接種於MS固體培養基上，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周，可見不定根的形成；(4)三七不定根的擴繁與繼代培養將已形成的不定根接種於MS固體培養基上，加入植物生長調節劑，在無菌、室溫及避光條件下培養3-5周；(5)三七不定根不同根系的篩選和活性成分的測定及擴繁對培養出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養，待株系穩定後，進行活性成分的測定，並建立相應成分的指紋圖譜，然後根據檢測結果篩選出最優不定根系，並接種於內裝含3%蔗糖的MS液體培養基的不同體積三角瓶中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進行擴繁，培養周期為3_4周。(6)三七不定根的反應器培養將不定根接種於內部裝有含3-5%蔗糖的MS液體培養基的氣升式反應器中，並加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調節劑，在供氣速度為0. Ivvm, 18-25°C及避光或光照條件下進行培養，培養周期為6-12周，即得三七不定根。
2.如權利要求1所述的三七不步根的培養方法，其特徵在於，如步驟(2)所述的植物生長調節劑，選自濃度為lmg/L的2，4-D、IAA和激動素。
3.如權利要求1所述的三七不步根的培養方法，其特徵在於，如步驟(4)所述的植物生長調節劑，選自濃度為lmg/L的IBA、NAA和激動素。
全文摘要
本發明提供一種三七不定根的培養方法，包括三七愈傷組織的誘導、三七愈傷組織的擴增與繼代培養、三七不定根的誘導、三七不定根的擴繁與繼代培養、三七不定根不同根系的篩選和擴繁及三七不定根的反應器培養本培養方法簡單、效率高，次生代謝產物含量高、主要皂苷成分均得以表達且其比例與藥材相近；不定根生長迅速、無內生真菌汙染，本培養工藝操作簡單、重複性好、規模生產迅速方便。
文檔編號A01H4/00GK102210265SQ20101013928
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月2日 優先權日2010年4月2日
發明者宋波 申請人:上海天龍藥業有限公司