雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因及其克隆和鑑別方法
2023-11-11 04:30:52 1
專利名稱：雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因及其克隆和鑑別方法
技術領域：
本發明屬於動物生物工程領域，具體為動物重要功能性基因的克隆。
背景技術：
脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)屬於脂類結合蛋白超家族的成員，存在於動物體的細胞內，是一類分子量為14-15KD的蛋白。FABP對長鏈脂肪酸具有很強的結合能力，其主要功能是運輸細胞內的長鏈脂肪酸、調節細胞的生長及分化、細胞的信號傳導、基因轉錄和保護游離脂肪酸的酶解。在哺乳動物中至少有9種FABP已經被分離出來，它們分別是肝臟(L-)FABP、小腸(I-)FABP、心臟(H-)FABP、脂肪(A-)FABP、表皮(E-)FABP、迴腸(IL-)FABP、腦(B-)FABP、髓磷脂(M-)FABP和睪丸(T-)FABP。在禽類有至少5種FABP被分離出來，它們分別是肝臟(L-)FABP、小腸(I-)FABP、脂肪(A-)FABP、肌肉(M-)FABP和視網膜(R-)FABP。這些蛋白由126-134個胺基酸組成，並且由第一個被分離的組織而命名。編碼這些蛋白的基因具有相同的結構，都是由4個外顯子和3個內含子構成，並且外顯子的長度基本相同或相近，但內含子的長度變異很大。
哺乳動物脂肪型脂肪酸結合蛋白(A-FABP)基因在人、小鼠和豬等物種中已經被克隆並且分別被定位到不同的染色體上。人的A-FABP被定位在8q21上；小鼠的A-FABP被定位在3號染色體上；豬的A-FABP被定位在4號染色體上。Gerbens(1998)等研究發現A-FABP基因的多態性與杜洛克豬的肌肉內脂肪含量顯著相關。截止到本發明完成並申請時，雞A-FABP基因的序列未見報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因，本發明的目的還在於提供這種雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的克隆方法以及鑑別方法，為進一步研究該基因序列的變異與雞重要經濟性狀間的關聯奠定基礎。
本發明的雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因由4個外顯子、3個內含子構成。
其基因序列為1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTG3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC本發明的雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的克隆方法是取雞腹部脂肪組織，利用TRIZOL試劑盒提取總RNA。用反轉錄試劑盒將脂肪組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄反應體系為反應體系中包含1μl脂肪組織總RNA、1×反轉錄反應緩衝液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制劑、5U禽源反轉錄酶，加水至總體積為20ul。反應條件為42℃時溫育60分鐘，99℃時5分鐘。根據哺乳動物A-FABP基因序列的保守區設計一對引物MF和MR，對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反應緩衝液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃50秒、55℃1分鐘、72℃1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，有一條大約160bp的特異性片段，將特異性片段回收並連接到PMD18-T載體上，之後轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，篩選出陽性克隆，測序後得到一條163bp的核苷酸序列，將其編號為MFMR；利用3』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列3』方向序列。根據MFMR核苷酸序列再設計一條上遊引物AFF2，利用反轉錄引物oligo dT-adaptor上的M4序列作為下遊引物，用這對引物對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增，反應體系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反應緩衝液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃30秒、50℃30秒、72℃1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，有一條大約500bp的特異性片段，將該片段回收並測序，得到一條541bp的核苷酸序列，編號為AFF2M4。
利用5』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列5』方向序列，根據MFMR和AFF2M4核苷酸序列再設計三條引物，分別為AF5』F、AF5』R和AFR3，利用這三條引物將MFMR序列的5』端擴增出來。第1步，將AFR3引物5』端磷酸化，其方法為向20ul反應液中加入2ul 10×T4多聚核酸激酶緩衝液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul。將上述的反應液置於37℃中溫育30分鐘後用無水乙醇沉澱，溶於5ul去離子水中備用；第2步，用5』端磷酸化AFR3引物代替oligo dT-adaptor反轉錄引物將雞脂肪組織RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄之後向反應液加入1μl RNase H在37℃溫育60分鐘，然後用無水乙醇沉澱備用；第3步，環化cDNA第一條鏈，在已沉澱的cDNA第一條鏈的管中加入5μl 10×連接緩衝液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4連接酶，加水至50μl，將混合液置於16℃溫育24小時，然後取出備用或-20℃保存；第4步，用AF5』F、AF5』R引物對環化的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含環化的cDNA混合液2μl，1×PCR反應緩衝液，引物AF5』F和AF5』R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃30秒、52℃30秒、72℃1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，有一條大約350bp的特異性片段。將該片段利用上述的方法回收並測序，得到一條342bp的核苷酸序列，編號為AF5』FAF5』R將上述3個片段的核苷酸序列拼接起來，得到一條完整的mRNA序列。
本發明的雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因可以通過檢測其是否在雞的基因組中存在、組織特異性表達及在不同品種和周齡間的表達差異來鑑別。
雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因是否在雞的基因組中存在採用如下方法來鑑別為了驗證上述序列確實存在於雞的基因組中，本發明利用MFMR序列與雞基因組DNA的Southern雜交來加以證實。將雞的基因組30ug平均分成3管，分別用限制性內切酶Bgl II單酶切，EcoR I單酶切，BamH I和Hind III雙酶切，酶切體系均為100ul，其中包含限制性內切酶10ul、10×酶切緩衝液10ul和去離子水，酶切反應條件為37℃12小時，反應結束後用無水乙醇沉澱，之後溶於30ul去離子水中備用，將酶切之後的DNA在0.8％瓊脂糖凝膠電泳後轉移到尼龍膜上，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。用DIG標記與檢測試劑盒將MFMR序列標記成探針，並與含有雞基因組的尼龍膜進行雜交，然後檢測雜交信號，具體操作參考DIG標記與檢測試劑盒的說明書。Southern Blot結果如圖4所示，在BamH I和Hind III雙酶切的泳道上雜出一條大約2.7kb的信號帶，在EcoR I單酶切的泳道上雜出一條大於10kb的信號帶，在Bgl II單酶切的泳道上有兩條大約2.2kb和4.5kb的信號帶，原因是探針序列中有一個Bgl II酶切位點，而沒有BamH I、Hind III和EcoR I酶切位點，結果表明雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因序列存在於雞的基因組中。
雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的組織特異性表達採用如下方法來家別1.RT-PCR方法取8周齡肉雞的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、小腸、腦、胸肌、腹脂10種組織，分別提取總RNA，具體方法參照TRIZOL試劑盒說明書。用反轉錄試劑盒將分別將上述10種組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄引物為oligo dT-adaptor。然後用AFF0和AFR3引物對上述10種組織的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，擴增片斷長度358bp，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘，根據雞的GAPDH基因序列設計併合成引物GF和GR，同時對上述10種組織的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，擴增片段長度為491bp左右，作為PCR擴增時的陽性對照，PCR反應體系及反應條件與上同，PCR結束後進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，並將同一組織的兩種PCR產物置於同一膠孔中同時電泳，結果如圖5所示，雞GAPDH基因在10種組織中都有擴增產物，而雞A-FABP基因只在腹脂中有擴增產物，表明雞A-FABP基因只在脂肪組織中表達。
2.Northern Blot方法為了證實雞A-FABP基因確實只在脂肪組織中表達，再通過NorthernBlot進行驗證。取8周齡肉雞的腦、胸肌、肝臟、腹脂、腎臟、心臟和肺7種組織，分別提取總RNA，在1％甲醛凝膠上電泳(圖6)，之後轉到尼龍膜上，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。用32P-dCTP將MFMR片段標記成探針，具體操作參考隨機引物標記探針試劑盒說明書，之後與尼龍膜雜交、洗膜、壓片、顯影和定影，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。NorthernBlot結果如圖7所示，結果顯示只在腹脂上有雜交信號，證明該基因只在脂肪組織中表達。
雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因在不同品種和周齡間的表達差異採用如下方法來鑑別為了進一步了解雞A-FABP基因的表達規律，本發明通過半定量RT-PCR法檢測該基因在6、8周齡蛋雞和肉雞脂肪組織中的表達。分別取6周齡、8周齡的蛋雞和肉雞各兩隻，提取脂肪組織總RNA，反轉錄之後作為PCR的模板(反轉錄引物為oligo dT-adaptor)。用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物分別在同等條件下進行擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板2μl(相當於100ng總RNA)，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1 U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分鐘共26個循環，最後72℃延伸7分鐘，取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖8所示。將凝膠上的條帶根據亮度和面積進行量化分析，結果如圖9所示，該結果未見到雞A-FABP基因在不同品種和周齡間有明顯的差異和規律，將cDNA模板10倍稀釋之後繼續用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物進行擴增，PCR反應體系及反應條件同上。取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖10所示，將凝膠上的條帶根據亮度和面積進行量化分析，結果如圖11所示。結果顯示該基因在8周齡肉雞脂肪組織中的表達量顯著高於同周齡時的蛋雞和6周齡時肉雞的表達量。
本發明在於提供一種雞脂肪型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP)基因全序列，其中包括部分5』側翼區、4個外顯子、3個內含子和部分3』側翼區。基因序列如列在後面的序列表(序列標識號2)所示。本項發明的關鍵在於提取高質量的組織總RNA，並且有效的實施了3』RACE和5』RACE的方法獲得雞A-FABP基因全長cds，進而獲得雞A-FABP的基因組序列。
本發明還涉及到A-FABP基因在不同品種、周齡雞間的表達特點和規律，該基因只在雞的脂肪組織中表達，並且該基因在8周齡肉雞的表達量高於同周齡的蛋雞和6周齡肉雞的表達量。獲得本項發明的關鍵在於選擇合適的基因作為參照，本項發明選用雞GAPDH基因作為對照基因，該基因在不同品種和不同時期雞的各種組織中基本恆定表達。另外有效的控制PCR體系和擴增條件也是取得本項發明的關鍵之處，通過控制PCR的循環次數可以將PCR產物控制在指數增長期，這樣就保證了PCR產物能有效地反映模板中目的基因的含量。
本發明克隆了雞A-FABP基因，並研究了該基因在不同組織中的表達特點和在不同品種、周齡間的表達規律，為進一步研究該基因序列的變異與雞重要經濟性狀間的關聯奠定了基礎，同時對研究該基因的體外表達、蛋白結構及功能具有重要意義。
圖1是實施例1中所述的PCR產物1％瓊脂糖電泳分析結果。
第1泳道為回收的PCR產物；第2-4泳道為PCR擴增產物；第5泳道為陰性對照；第6泳道為分子量標準(pBR322/HaeIII).
圖2是實施例1中所述3』RACE的PCR產物1％瓊脂糖電泳分析結果。
第1泳道為DL2000marker；第2泳道為空白對照；第3-7泳道為PCR產物。
圖3是實施例1中所述5』RACE的PCR產物1％瓊脂糖電泳分析結果。
第1泳道為DL2000 marker；第2泳道為空白對照；第3-7泳道為PCR產物。
圖4是雞A-FABP基因與雞基因組的Southern雜交結果。
第1泳道為BamH I和HindIII雙酶切的結果；第2泳道為EcoR I酶切基因組的雜交結果；第3泳道為Bgl II酶切基因組的雜交結果.
圖5是雞A-FABP基因在10種組織中的RT-PCR結果。
第1泳道為DL2000marker.第2-11泳道依次為心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、胸肌、腹脂。
圖6是雞7種組織總RNA的甲醛變性凝膠電泳結果。
1腦；2胸肌；3肝臟；4腹脂；5腎臟；6心臟；7肺圖7是雞A-FABP基因與7種組織總RNA的Northern雜交結果。
1腦；2胸肌；3肝臟；4腹脂；5腎臟；6心臟；7肺圖8是雞A-FABP基因在不同品種、周齡雞脂肪組織中的RT-PCR檢測結果。模板濃度為100ng/25ul時的結果。1.DL2000marker；2.陰性對照；3. 6周齡肉雞；4. 6周齡蛋雞；5.8周齡肉雞；6. 8周齡蛋雞圖9模板濃度為100ng/25ul時的量化分析結果。
圖10是雞A-FABP基因在不同品種、周齡雞脂肪組織中的RT-PCR檢測結果。模板濃變為10ng/25ul時的結果。1.DL2000marker；2.陰性對照；3. 6周齡肉雞；4. 6周齡蛋雞；5.8周齡肉雞；6. 8周齡蛋雞圖11模板濃度為10ng/25ul時的量化分析結果。
(五)具體實施方案下面舉例對本發明作更詳細的描述以下為實施例1、2中所用的實驗材料菌種、質粒和工具酶DH5α其基因型為supE44 ΔLac169(Ф80 LacZ ΔM15)hsdR17 RecA endA1 gyrA98 thi-1 recA1PMD18-T載體試劑盒內含PMD18-T質粒、Solution I和Control DNA。購自大連寶生物有限公司。DNA聚合酶及dNTP購自Promega Corporation，USA。蛋白酶K購自美國BRL公司。反轉錄試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit Ver.2.1)及限制性內切酶購自大連寶生物有限公司。T4多聚核酸激酶及單鏈RNA連接酶購自Promega Corporation，USA。化學試劑三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、Tris飽和酚、瓊脂糖(Agrose)、十二烷基磺酸鈉(SDS)購自北京鼎國生物技術發展中心。三氯甲烷、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、硼酸北京化工廠生產。酵母浸出物、胰蛋白腖英國Oxoid公司產品。IPTG、X-gal、Ampr購自華美生物工程公司。DNA Marker(DL2000，pBR322/HaeIII)購自大連寶生物有限公司。膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自上海華舜生物公司。鮭魚精子DNA、隨機引物標記探針試劑盒、TRIZOL試劑盒購自GIBICOL公司。地高鋅標記與檢測試劑盒、ExpressHsyb雜交液、探針純化試劑盒和核酸雜交尼龍膜AmershamPharmcia公司產品。32P同位素，北京亞輝公司。雞血樣、組織樣和寡核苷酸引物以AA肉雞、海蘭蛋雞各2隻為實驗材料，分別於6周齡和8周齡時採腦、胸肌、肝臟、腹脂、腎臟、心臟、肺、脾、小腸和肌胃10種組織，-70℃保存；同時翅靜脈採血，EDTA鈉抗凝，提取基因組DNA之後，TE溶解，-20℃保存。以下引物由上海博亞生物公司合成MF5』-CTGGTGTGGGTTTTGCTACC-3』；MR5』-TCATCTGCTGTTGTCTCATC-3』AFF25』-TGGGTGTGGGGTTTGCTACC-3』M45′-TCATCTGCTGTTGTCTCATC-3′AF5』F5』-ACTGAAGCAGGTGCAGAA-3』AF5』R5』-TGCTGTGGTCTCATCAAACT-3』AFR35』-CCATCCACCACTTTCCTCTT-3』AFF05』-AGACTGCTACCTGGCCTGACA-3』AFF3 5』-GGTCCA AAGCACCCTGATGA-3』AFR4(5』-TTGTTCGCCTTCGGATCAG-3』GF5』-TGACGTGCAGCAGGAACAC-3』，GR5』-CAGTTGGTGGTGCACGATG-3』實施例1雞A-FABP基因的克隆取雞腹部脂肪組織，利用TRIZOL試劑盒提取總RNA，具體方法參照TRIZOL試劑盒說明書。用反轉錄試劑盒將脂肪組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈。反轉錄反應體系為反應體系中包含1μl脂肪組織總RNA、1×反轉錄反應緩衝液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制劑、5 U禽源反轉錄酶，加水至總體積為20ul。反應條件為42℃時溫育60分鐘；99℃時5分鐘以滅活反轉錄酶。根據哺乳動物A-FABP基因序列的保守區設計一對引物MF和MR，對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增。PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反應緩衝液，引物MF和MR各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，50秒；55℃，1分鐘；72℃，1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖1所示，有一條大約160bp的特異性片段。將特異性片段回收並連接到PMD18-T載體上，之後轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，篩選出陽性克隆，由上海聯合基因有限公司測序，得到一條163bp的核苷酸序列，將其編號為MFMR。該序列與豬的心臟脂肪酸結合蛋白基因有68％的同源性，與豬的脂肪型脂肪酸結合蛋白基因有75％的同源性。
利用3』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列3』方向序列。根據上述獲得的MFMR核苷酸序列再設計一條上遊引物AFF2，利用反轉錄引物oligo dT-adaptor上的M4序列作為下遊引物。用這對引物對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增。PCR反應體系同上，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖2所示，有一條大約500bp的特異性片段。將該片段利用上述的方法回收並測序，得到一條541bp的核苷酸序列，編號為AFF2M4。分析這段核苷酸序列得知，該序列與MFMR序列為同一基因序列，並且是MFMR序列在3』方向的繼續延伸。
利用5』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列5』方向序列。根據上述獲得的MFMR和AFF2M4核苷酸序列再設計三條引物，分別為AF5』F、AF5』R和AFR3，利用這三條引物將MFMR序列的5』端擴增出來。第1步，將AFR3引物5』端磷酸化，其方法為向20ul反應液中加入2ul 10×T4多聚核酸激酶緩衝液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul，將上述的反應液置於37℃中溫育30分鐘後用無水乙醇沉澱，溶於5ul去離子水中備用。第2步，用5』端磷酸化AFR3作為反轉錄引物將雞脂肪組織RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反應體系與反應條件除用AFR3代替oligo dT-adaptor外，其它均同上.反轉錄之後向反應液加入1μlRNase H在37℃溫育60分鐘，然後用無水乙醇沉澱備用。第3步，環化cDNA第一條鏈，在已沉澱的cDNA第一條鏈的管中加入5μl 10×連接緩衝液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4連接酶，加水至50μl，將混合液置於16℃溫育24小時，然後取出備用或-20℃保存。第4步，用AF5』F、AF5』R引物對環化的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含環化的cDNA混合液2μl，1×PCR反應緩衝液，引物AF5』F和AF5』R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；52℃，30秒；72℃，1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖3所示，有一條大約350bp的特異性片段。將該片段利用上述的方法回收並測序，得到一條342bp的核苷酸序列，編號為AF5』FAF5』R。分析這段核苷酸序列得知，該序列與MFMR序列為同一基因序列，並且是MFMR序列在5』方向的繼續延伸。
將上述3個片段的核苷酸序列拼接起來，得到一條完整的mRNA序列，如序列表中序列標識號1所示，該序列中包含一個399bp的基因開放閱讀框，分析該開放閱讀框，與豬和人的脂肪型脂肪酸結合蛋白的編碼區序列同源性分別為73.68％和73.43％，因此將該序列命名為雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因。
為了驗證上述序列確實存在於雞的基因組中，本發明利用MFMR序列與雞基因組DNA的Southern雜交來加以證實。將雞的基因組30ug平均分成3管，分別用限制性內切酶Bgl II單酶切，EcoR I單酶切，BamH I和HindIII雙酶切.酶切體系均為100ul，其中包含限制性內切酶10ul、10×酶切緩衝液10ul和去離子水。酶切反應條件為37℃12小時。反應結束後用無水乙醇沉澱，之後溶於30ul去離子水中備用。將酶切之後的DNA在0.8％瓊脂糖凝膠電泳後轉移到尼龍膜上，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。用DIG標記與檢測試劑盒將MFMR序列標記成探針，並與含有雞基因組的尼龍膜進行雜交，然後檢測雜交信號，具體操作參考DIG標記與檢測試劑盒的說明書。Southern Blot結果如圖4所示，在BamH I和HindIII雙酶切的泳道上雜出一條大約2.7kb的信號帶，在EcoR I單酶切的泳道上雜出一條大於10kb的信號帶，在Bgl II單酶切的泳道上有兩條大約2.2kb和4.5kb的信號帶，原因是探針序列中有一個Bgl II酶切位點，而沒有BamH I、Hind III和EcoR I酶切位點。該結果表明上述基因序列存在於雞的基因組中。
為了獲得雞A-FABP基因的內含子序列，本發明根據雞A-FABP基因mRNA序列又設計了AFF0、AFF3和AFR4引物。AFF0與AF5』R配對使用擴增第1內含子，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含雞基因組DNA(50ng/ul)1μl，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mMdNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；56℃，40秒；72℃，2分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘。AFF2與AFR3配對使用擴增第2內含子，PCR反應體系及反應條件除引物和退火溫度為60℃外，其它與擴增第1內含子相同。AFF3和AFR4配對使用擴增第3內含子，PCR反應體系及反應條件除引物和退火溫度為54℃外，其它與擴增第1內含子相同。將上述3個PCR產物回收並測序，方法與上同。將這3個核苷酸序列與雞A-FABP的mRNA序列拼接起來構成雞A-FABP基因組基因序列，如序列表中序列標識號2所示。
實施例2雞A-FABP基因的表達規律及特點取8周齡肉雞的10種組織(心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、小腸、腦、胸肌、腹脂)，分別提取總RNA，具體方法參照TRIZOL試劑盒說明書。用反轉錄試劑盒將分別將上述10種組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄引物為oligo dT-adaptor，方法與實施例1中同。然後用AFF0和AFR3引物對上述10種組織的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，擴增片斷長度358bp，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘。根據雞的GAPDH基因序列設計併合成引物GF和GR，同時對上述10種組織的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，擴增片段長度為491bp左右，作為PCR擴增時的陽性對照，PCR反應體系及反應條件與上同。PCR結束後進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，並將同一組織的兩種PCR產物置於同一膠孔中同時電泳，結果如圖5所示，雞GAPDH基因在10種組織中都有擴增產物，而雞A-FABP基因只在腹脂中有擴增產物，該結果表明雞A-FABP基因只在脂肪組織中表達。
為了證實雞A-FABP基因確實只在脂肪組織中表達，再通過Northern Blot進行驗證。取8周齡肉雞的7種組織(腦、胸肌、肝臟、腹脂、腎臟、心臟和肺)，分別提取總RNA，方法同上，在1％甲醛凝膠上電泳(圖6)，之後轉到尼龍膜上，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。用32P-dCTP將MFMR片段標記成探針，具體操作參考隨機引物標記探針試劑盒說明書，之後與尼龍膜雜交、洗膜、壓片、顯影和定影，具體操作參考《分子克隆第二版》的說明。Northern Blot結果如圖7所示，結果顯示只在腹脂上有雜交信號，因此證明該基因只在脂肪組織中表達。
為了進一步了解雞A-FABP基因的表達規律，本發明通過半定量RT-PCR法檢測該基因在6、8周齡蛋雞和肉雞脂肪組織中的表達。分別取6周齡、8周齡的蛋雞和肉雞各兩隻，提取脂肪組織總RNA，反轉錄之後作為PCR的模板。RNA提取及反轉錄反應與上同(反轉錄引物為oligodT-adaptor)。用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物分別在同等條件下進行擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板2μl(相當於100ng總RNA)，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1U Taqpolymerase，加水至總體積為25ul。PCR反應條件為94℃預變性5分鐘；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分鐘共26個循環，最後72℃延伸7分鐘。取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖8所示。將凝膠上的條帶根據亮度和面積進行量化分析，結果如圖9所示，該結果未見到雞A-FABP基因在不同品種和周齡間有明顯的差異和規律。將cDNA模板10倍稀釋之後繼續用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物進行擴增，PCR反應體系及反應條件同上。取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖10所示，將凝膠上的條帶根據亮度和面積進行量化分析，結果如圖11所示。結果顯示該基因在8周齡肉雞脂肪組織中的表達量顯著高於同周齡時的蛋雞和6周齡時肉雞的表達量。
序列表序列標識號1序列類型核苷酸序列長度654bp鏈數單鏈分 子 型mRNA-cDNA特徵從1bp至60bp為5』UTR，從61bp至459bp為編碼區，從460bp至639bp為3』UTR，從639p以後為polyA。來源雞脂肪組織性質雞A-FABP基因mRNA序列1GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT TGAGGACTAT121 ATGAAAGAGC TGGGTGTGGG GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT181 TTAACTATCA GCATCAATGG TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT241 ACAGAGATCT CTTTCAAGCT GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA301 ACAAAGAATG TCATAACCCT AGACAGTGGC ACACTGAAGC AGGTGCAGAA GTGGGATGGC361 AAAGAGACTG TTATCAAGAG AAAAGTGGTG GATGGGAACC TGCTGGTGGA ATGCACCATG421 AATAATGTTA CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA481 CTGATGCTGA AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT541 TTTGAACAGA ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA601 ATTTGTTGTG GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTACA AAAAAAAAAA AAAA序列標識號2序列類型核苷酸序列長度3389bp鏈數單鏈分 子 型基因組DNA特徵從1bp至60bp為5』側翼區，從61bp至133bp為外顯子1，從134bp至1373bp為內含子1，從1374bp至1546bp為外顯子2，從1547bp至1769bp為內含子2，從1770bp至1871bp為外顯子3，從1872bp至3158bp為內含子3，
從3159bp至3209bp為外顯子4，從3210bp至3389bp為3』側翼區。來源雞血液DNA性質雞A-FABP基因序列1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201 GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261 AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321 ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381 GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441 TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501 GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561 GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621 TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681 CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741 TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801 AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861 ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921 TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981 ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041 TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101 GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161 TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221 ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281 TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341 AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401 TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461 TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521 TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581 TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641 GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701 CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761 ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTC3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC
權利要求
1.一種雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因，其特徵是它由4個外顯子、3個內含子構成。
2.根據權利要求1所述的雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因，其特徵是基因序列為1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201 GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261 AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321 ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381 GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441 TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501 GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561 GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621 TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681 CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741 TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801 AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861 ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921 TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981 ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041 TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101 GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161 TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221 ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281 TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341 AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401 TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTG3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC
3.雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的克隆，其特徵是取雞腹部脂肪組織，利用TRIZOL試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒將脂肪組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄反應體系為反應體系中包含1μl脂肪組織總RNA、1×反轉錄反應緩衝液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制劑、5U禽源反轉錄酶，加水至總體積為20ul，反應條件為42℃時溫育60分鐘，99℃時5分鐘；根據哺乳動物A-FABP基因序列的保守區設計一對引物MF和MR，對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反應緩衝液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃50秒、55℃1分鐘、72℃1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘；PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，將特異性片段回收並連接到PMD18-T載體上，之後轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，篩選出陽性克隆，測序後得到一條163bp的核苷酸序列，將其編號為MFMR；利用3』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列3』方向序列，根據MFMR核苷酸序列再設計一條上遊引物AFF2，利用反轉錄引物oligo dT-adaptor上的M4序列作為下遊引物，用這對引物對脂肪組織cDNA第一條鏈進行PCR擴增，反應體系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反應緩衝液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1 U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘；PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收特異性片段並測序，得到一條541bp的核苷酸序列，編號為AFF2M4；利用5』RACE方法獲得MFMR核苷酸序列5』方向序列，根據MFMR和AFF2M4核苷酸序列再設計三條引物，分別為AF5』F、AF5』R和AFR3，利用這三條引物將MFMR序列的5』端擴增出來；第1步，將AFR3引物5』端磷酸化，其方法為向20ul反應液中加入2ul10×T4多聚核酸激酶緩衝液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul，將上述的反應液置於37℃中溫育30分鐘後用無水乙醇沉澱，溶於5ul去離子水中備用；第2步，用5』端磷酸化AFR3引物代替oligo dT-adaptor反轉錄引物將雞脂肪組織RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄之後向反應液加入1μl RNa se H在37℃溫育60分鐘，然後用無水乙醇沉澱備用；第3步，環化cDNA第一條鏈，在已沉澱的cDNA第一條鏈的管中加入5μl 10×連接緩衝液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4連接酶，加水至50μl，將混合液置於16℃溫育24小時，然後取出備用或-20℃保存；第4步，用AF5』F、AF5』R引物對環化的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含環化的cDNA混合液2μl，1×PCR反應緩衝液，引物AF5』F和AF5』R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃ 30秒、52℃ 30秒、72℃ 1分鐘共35個循環，最後72℃延伸7分鐘；PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收特異性片段並測序，得到一條342bp的核苷酸序列，編號為AF5』FAF5』R；將上述3個片段的核苷酸序列拼接起來，得到一條完整的mRNA序列。
4.雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的鑑別方法，其特徵是將雞的基因組30ug平均分成3管，分別用限制性內切酶Bgl II單酶切，EcoR I單酶切，BamH I和HindIII雙酶切.酶切體系均為100ul，其中包含限制性內切酶10ul、10×酶切緩衝液10ul和去離子水，酶切反應條件為37℃12小時，反應結束後用無水乙醇沉澱，之後溶於30ul去離子水中備用；將酶切之後的DNA在0.8％瓊脂糖凝膠電泳後轉移到尼龍膜上，用DIG標記與檢測試劑盒將MFMR序列標記成探針，並與含有雞基因組的尼龍膜進行雜交，然後檢測雜交信號。
5.雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的鑑別方法，其特徵是取8周齡肉雞的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、小腸、腦、胸肌、腹脂10種組織，分別提取總RNA，用反轉錄試劑盒將分別將上述10種組織總RNA反轉錄為cDNA第一條鏈，反轉錄引物為oligo dT-adaptor，然後用AFF0和AFR3引物對上述10種組織的cDNA第一條鏈進行PCR擴增，擴增片斷長度358bp，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反應緩衝液，引物各5 pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘共30個循環，最後72℃延伸7分鐘；根據雞的GAPDH基因序列設計併合成引物GF和GR，同時對上述10種組織的cDNA第一條鏈在相同條件下進行PCR擴增，擴增片段長度為491bp，作為PCR擴增時的陽性對照，PCR結束後進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，並將同一組織的兩種PCR產物置於同一膠孔中同時電泳。
6.根據權利要求5所述的雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的鑑別方法，其特徵是取8周齡肉雞的腦、胸肌、肝臟、腹脂、腎臟、心臟和肺7種組織，分別提取總RNA，在1％甲醛凝膠上電泳，之後轉到尼龍膜上，用32P-dCTP將MFMR片段標記成探針，之後與尼龍膜雜交、洗膜、壓片、顯影和定影。
7.雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因的鑑別方法，其特徵是分別取6周齡、8周齡的蛋雞和肉雞脂肪組織，提取總RNA，反轉錄之後作為PCR的模板，用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物分別在同等條件下進行擴增，PCR反應體系及反應條件如下反應體系中包含相當於100ng總RNA的cDNA模板2μl，1×PCR反應緩衝液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至總體積為25ul，PCR反應條件為94℃預變性5分鐘、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘共26個循環，最後72℃延伸7分鐘，取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠上的條帶根據亮度和面積進行量化分析；將cDNA模板10倍稀釋之後繼續用雞A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物對反轉錄產物在相同條件下進行擴增，取5ulPCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，進行量化分析。
全文摘要
本發明涉及的是一種涉及的是一種雞脂肪型脂肪酸結合蛋白基因、這種基因的克隆及鑑定方法。本發明提供了一種雞A－FABP基因序列，該基因與其家族的其它基因同樣由4個外顯子和3個內含子組成。本發明還涉及到A－FABP基因在不同品種、周齡雞間的表達特點和規律，該基因只在雞的脂肪組織中表達，並且該基因在8周齡肉雞的表達量高於同周齡的蛋雞和6周齡肉雞的表達量。本發明克隆了雞A－FABP基因，並研究了該基因在不同組織中的表達特點和在不同品種、周齡間的表達規律，為進一步研究該基因序列的變異與雞重要經濟性狀間的關聯奠定了基礎，同時對研究該基因的體外表達、蛋白結構及功能具有重要意義。
文檔編號C07H21/04GK1453357SQ03111389
公開日2003年11月5日 申請日期2003年4月7日 優先權日2003年4月7日
發明者李輝, 王啟貴 申請人:東北農業大學