調節磷酸代謝,鈣代謝,鈣化和維生素d代謝的多肽及其編碼dna的製作方法

2023-11-07 14:30:32 4

專利名稱：調節磷酸代謝,鈣代謝,鈣化和維生素d代謝的多肽及其編碼dna的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種調節磷酸代謝，鈣代謝，鈣化和/或維生素D代謝的多肽，編碼所述多肽的DNA，以及含有該多肽為活性成分的藥物組合物，和識別所述多肽的抗體，以及以該抗體為活性成分的藥物組合物，利用所述抗體的診斷方法和診斷組合物。
背景技術：
無機磷酸鹽(以下也稱為磷酸鹽)是體內能量代謝和維持細胞功能所必需的，並與鈣一起對組織鈣化起著重要的作用。生物體的磷酸鹽供給情況主要取決於腸道的吸收，而磷酸鹽的排洩取決於腎臟中的尿排洩和腸道中的糞便排洩。在活的有機體中，磷酸鹽分布於體液，胞內組分和鈣化組織中。成人體內無機磷酸鹽的排洩水平與其吸收水平幾乎相同，這表明存在著一個能維持磷酸鹽代謝穩態的調節機制。眾所周知，在其分布和血液水平的穩態控制方面與磷酸鹽代謝有相似之處的鈣的代謝，在哺乳動物體內是由調控因子協同調節的，這些因子至少有比如甲狀旁腺激素，降鈣素和1α，25-二羥維生素D3。
在磷酸鹽代謝調控中，已知甲狀旁腺激素能促進腸道內磷酸鹽的排洩，1α，25-二羥維生素D3能促進腸道內磷酸鹽的吸收。這清楚地表明了磷酸鹽代謝和鈣代謝之間的密切關聯。但是，至今未能弄清調控磷酸鹽的主要物質。
目前，與磷酸鹽代謝失去穩態和血液中無機磷酸鹽水平低相關的疾病包括原發性甲狀旁腺功能亢進，遺傳性血磷酸鹽過少佝僂病和腫瘤誘發的骨軟化症。
原發性甲狀旁腺功能亢進表現為甲狀旁腺中甲狀旁腺激素過量，並且我們知道它能發展為磷酸鹽排洩增加的低磷酸鹽血症，這是由於過量的甲狀旁腺激素抑制了無機磷酸鹽在腎臟的重新吸收。
此外，已知的由於遺傳病造成的低磷酸鹽血症例子包括I型維生素D-依賴性佝僂病，II型維生素D-依賴性佝僂病和維生素D抗性佝僂病。I型維生素D-依賴性佝僂病是產生活性維生素D代謝物的合成酶遺傳性功能異常引起的疾病，II型維生素D-依賴性佝僂病是維生素D受體遺傳性功能異常引起的疾病。由於維生素D3代謝物作用減退，這兩種疾病都能發展成低磷酸鹽血症並伴有低鈣血症。相反地，對於維生素D抗性佝僂病，已知存在不同原因引起的至少兩種臨床症狀，X連鎖的染色體和常染色體血磷酸鹽過少佝僂病。
以上提及的維生素抗性佝僂病的臨床症狀都能導致低磷酸鹽血症，其特徵為腎磷酸鹽。最近，在X-連鎖的血磷酸鹽過少佝僂病(以下稱為XLH)患者中顯示這種疾病是由位於X染色體上編碼名為PHEX的類肽鏈內切酶蛋白質的基因發生突變誘發的。但是功能異常的PHEX蛋白質誘發低磷酸鹽血症的機制並未闡明。有趣的是，對患有低磷酸鹽血症的天然出現的突變小鼠(Hyp)進行基因分析揭示了這個小鼠編碼PHEX的基因發生了部分缺失。用這些小鼠進行的實驗顯示出PHEX缺陷型小鼠具備正常的腎功能，在Hyp小鼠的體液中存在一種體液因子，該因子不同於甲狀旁腺激素，但也能誘發低磷酸鹽血症。對於常染色體顯性血磷酸鹽過少佝僂病/骨軟化症(以下稱為ADHR)，正在尋找引起該病的基因，連鎖分析表明在12p13區域內存在一個這樣的基因。但是經過縮小的區域仍然太寬，含有許多基因，還沒有明確的候選基因。
腫瘤誘導的骨軟化症能發展為與腫瘤發生相關聯的低磷酸鹽血症，伴有腎磷酸鹽增加，其特徵在於通過對腫瘤進行輻射或切除腫瘤能消除低磷酸鹽血症。這種疾病被認為腫瘤產生了一種因子，由於抑制腎臟中磷酸鹽的重吸收而誘發低磷酸鹽血症。
還沒有證實引起維生素D抗性佝僂病的分子是否與腫瘤誘導性骨軟化症的誘發分子相同。但是，這兩種分子顯然均是未知的能促進尿磷酸鹽排洩的磷酸鹽代謝因子。假定的磷酸鹽代謝調控因子經常被稱為Phosphatonin。這種未知磷酸鹽代謝調控因子與維生素D抗性佝僂病或腫瘤誘導性骨軟化症的關係已經被總結為概述(Neison，A.E.，Clinical Endocrinology，47635-642，1997；Drezner，M.K.，KidneyInt.，579-18，2000)。
維生素D抗性佝僂病或腫瘤誘導性骨軟化症的另一個特徵是對骨骼鈣化的損害。受損的骨骼鈣化可以被認為是低磷酸鹽血症繼發性發展造成的。但是由於在使用Hyp小鼠的實驗中異常的骨骼鈣化，維生素D抗性佝僂病的模型小鼠表現出發育不依賴於磷酸鹽水平(Ecarot，B.，J.Bone Miner.Res.，7215-220，1992；Xiao，Z.S.，Am.J.Physiol.，E700-E708，1998)因此上述未知的磷酸鹽代謝調控因子可以直接調控骨骼組織的鈣化是可能的。
如上所述，研究資料強烈地暗示存在一種未知的調節磷酸鹽代謝的因子，但還沒有例子能在分子水平明確這種具備預期活性的實體。WO99/60017公開了一種新的多肽類激素(Phosphatonin)的新多肽序列，但它沒有公開Phosphatonin誘發低磷酸鹽血症的獨特活性。因此，可以想見在生物中存在一種未被識別的調節磷酸鹽代謝的內在因子。
從食物中攝取的維生素D2和D3，或者在皮膚中合成的維生素D3被主要存在於肝臟的維生素D-25-羥化酶水解產生25-羥基維生素D。然後，25-羥基維生素D被存在於腎臟的近端小管表皮細胞的25-羥基維生素D-1α-羥化酶水解產生1α，25-二羥基維生素D。這種物質是一種具有生理活性的礦物調節激素，它能增加血清的鈣和磷酸鹽水平，並且已知它能抑制甲狀旁腺激素的分泌，參與促進骨骼再吸收。然後，1α，25-二羥基維生素D被主要存在於腎臟和小腸的24-羥化酶體內轉化為不具有上述生理活性的代謝物。在這點上，24-羥化酶被認為是使1α，25-羥基維生素D失活的酶。另一方面，已知24-羥化酶也作用於25-羥基維生素D，將它轉化為24，25-二羥基維生素D。有報導說24，25-二羥基維生素D具有增加骨量或促進軟骨分化的生理作用，表明該酶也有產生生物活性維生素D代謝物的方面。
調節1α-羥化酶(該酶對維生素D的活化有重要作用)的表達水平的已知因子包括甲狀旁腺激素(PTH)，降鈣素，1α，25-二羥基維生素D等。血液中鈣含量的下降能促進PTH的分泌，PTH作用在存在於腎臟近端小管表皮細胞的PTH受體上從而通過提高細胞內cAMP水平促進1α-羥化酶的轉錄，使得血液中1α，25-二羥基維生素D濃度上升。1α，25-二羥基維生素D促進腸道中鈣的吸收以及腎臟中鈣的重吸收，從而提高血液中的鈣含量。此外，已有報導說1α，25-二羥基維生素D結合了維生素D受體(VDR)能作用於1α-羥化酶基因或PTH基因的啟動子區從而抑制這些基因的轉錄。具體來說，1α，25-二羥基維生素D對它的活化因子，PTH和1α-羥化酶有一個反饋調控機制。這個機制對維持鈣代謝穩態起著重要作用。
最近，有報導說血清中磷酸鹽水平下降能增強1α-羥化酶基因的表達。在磷酸鹽代謝中，估計也存在一種機制，即與血清磷酸鹽水平下降相關聯的1α-羥化酶表達的加強能提高血清1α，25-二羥基維生素D水平，從而通過促進小腸的磷酸鹽吸收修正血清磷酸鹽水平。
負責調控24-羥化酶基因表達的因子包括1α，25-二羥基維生素D和PTH。1α，25-二羥基維生素D和維生素D受體(VDR)相互作用，該複合物結合到一個存在於24-羥化酶基因啟動子區的維生素D受體應答序列從而促進轉錄。1α，25-二羥基維生素D被認為能激活24-羥化酶，然後誘導1α，25-二羥基維生素D水平由於代謝途徑被活化而降低。人們已經知道24-羥化酶基因的表達受到PTH的抑制，但不清楚其詳細的分子機制。
發明公開本發明的目的是提供一種新的能誘導血液磷酸鹽水平下降的腫瘤衍生因子。
可以想見在腫瘤誘導性骨軟化症中鑑定到的腫瘤能分泌一種有生理活性的可溶性因子，致使血液磷酸鹽水平下降。這種腫瘤衍生因子使得磷酸鹽代謝失去穩態。所以，該因子可以歸結為以下之一(1)該因子本來在體內不產生，是特定產生於腫瘤的，(2)該因子在腫瘤中過量產生，雖然在正常組織中也有，以及(3)該因子在腫瘤中不受生理控制地產生。
基於這樣一種假設，即如上所述的低磷酸鹽血症誘導的腫瘤衍生因子特徵性地產生於腫瘤誘導的低磷酸鹽血症衍生腫瘤中，我們預計在腫瘤中編碼低磷酸鹽血症誘導因子的轉錄加強或者該因子的mRNA穩定性加強。因此，為了治療目的從一個腫瘤誘導性低磷酸鹽血症患者切除了部分腫瘤組織，我們從中提取RNA之後，利用噬菌體載體和質粒載體製備了cDNA文庫，然後篩選在腫瘤中特異表達的基因片段。用於篩選的方法是挑選在腫瘤中特異表達的cDNA片段，以及挑選在腫瘤衍生cDNA文庫中不與來自腎臟近端小管表皮細胞細胞系的cDNA探針發生交叉反應的cDNA片段。我們通過驗證序列的新穎性和在腫瘤中的特異表達性進一步縮小了挑選出的cDNA片段，從而獲得了預期能編碼低磷酸鹽血症誘導因子的cDNA片段。由序列信息，我們嘗試克隆含有每個片段所在的ORF的cDNA，並且成功地獲得了編碼新多肽的DNA。我們進一步徹底地研究了這些新多肽的生物活性，所以我們通過闡明所述新多肽具有在動物中抑制磷酸鹽轉運，誘導低磷酸鹽血症和抑制骨骼組織鈣化的活性完成了本發明。
具體來說，本發明如下所述。
(1)一種編碼以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA(a)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列組成的多肽(b)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成的多肽，並且該多肽具備低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者調節體內維生素D代謝的活性，(c)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列含有以上胺基酸序列中的至少第34到第201個胺基酸，或者(d)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列(i)含有從以上胺基酸序列中第34個到第201胺基酸的胺基酸序列，(ii)由所述部分序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成，以及(iii)具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調節活性。
(2)一種DNA，其含有以下DNA(e)或(f)(e)由SEQ ID NO1所示核苷酸序列中從核苷酸133到885的核苷酸序列組成的DNA，或者由SEQ ID NO3所示核苷酸序列中從核苷酸1到681的核苷酸序列組成的DNA，或者(f)在嚴謹條件下與探針雜交，並編碼具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調節活性的多肽的DNA，所述探針由SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的全部或部分組成的DNA製得。
此處，術語「嚴謹條件」滿足鹽濃度在750mM或以上，優選900mM或以上，溫度在40℃或以上，優選42℃的條件。具體來說，嚴謹條件由6x SSC，5x Denhardt，0.5％SDS，50％甲醛和42℃組成。
(3)一種含有上述DNA的重組載體。
(4)一種含有上述重組載體的轉化子。
(5)一種多肽，它是以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)(a)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列組成的多肽，(b)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列經刪除，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成的多肽，其具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調節活性，(c)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中所述部分序列含有以上序列中至少從胺基酸34到201的胺基酸序列，或者(d)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中所述部分序列(i)含有以上序列中至少從胺基酸34到201的胺基酸序列，(ii)由所述部分序列經刪除，取代或添加一或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成，以及(iii)具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調控活性。
上述多肽還包括經至少一種物質修飾過的多肽，該物質選自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。
(6)一種含有上述多肽作為活性成分的藥物組合物。
上述藥物組合物可以用於體內調節鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或者維生素D代謝。此外，上述藥物組合物能有效地抵制低磷酸鹽血症，甲狀旁腺功能亢進，腎性骨營養不良，異位鈣化，骨質疏鬆和維生素D過多症中的至少一種症狀。
(7)一種與上述多肽或其部分片段反應的抗體。
所述抗體可以通過這樣的方法獲得，該方法包括用本發明的多肽或其部分片段作為抗原免疫動物的步驟。
(8)一種含有上述抗體作為活性成分的藥物組合物。
上述藥物組合物能夠調節體內鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或維生素D代謝，或者有效地抵制骨骼疾病。此處，骨骼疾病是骨質疏鬆，抗維生素D佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨骼疾病，鈣化不全骨病，佩吉特病和腫瘤誘導性骨軟化症中的至少一種疾病。
(9)一種診斷試劑，其含有上述抗體，用於表現為異常鈣代謝，異常磷酸鹽代謝，異常鈣化和異常維生素D代謝中的至少一種異常的疾病(例如，腎衰竭，腎磷酸鹽滲漏，腎小管性酸中毒和範科尼症候群中的一種疾病)。
(10)一種用於骨骼疾病的診斷試劑，其含有上述抗體，其中所述骨骼疾病是骨質疏鬆，抗維生素D佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨骼疾病，鈣化不全骨病，佩吉特病和腫瘤誘導性骨軟化症中的至少一種疾病。
(11)一種診斷試劑，其包含具有SEQ ID NO11所示核苷酸序列的DNA或其部分片段，該試劑用於表現為異常鈣代謝，異常磷酸鹽代謝，異常鈣化和異常維生素D代謝中的至少一種異常的疾病。
上述部分序列的一個例子具有SEQ ID NO11所示核苷酸序列中核苷酸498到12966之序列。所述疾病的一個例子是常染色體顯性的血磷酸鹽過少性佝僂病/骨軟化症。
本發明詳細解釋如下。此說明書包括日本專利申請2000-245144，2000-287684，2000-391077和2001-121527的說明書和/或附圖所公開的部分或全部內容，這些專利是本申請的優先權文本。
本說明書中使用的術語限定如下。
術語「降低血液1，25-二羥基維生素D3水平的活性」表示產生使血液1，25-二羥基維生素D3水平下降的效果的活性。
術語「低磷酸鹽血症誘發活性」表示降低血液磷酸鹽水平的活性。血液磷酸鹽水平由以下兩者間的平衡限定(i)腸道的吸收和排洩到尿和糞便，以及(ii)磷酸鹽在體內細胞中和以骨骼組織為代表的鈣化組織中的分布。因此，用於本說明書的術語「低磷酸鹽血症誘發活性」意味著降低健康的活體內血液磷酸鹽水平的活性，並不一定指引起病理性低磷酸鹽血症的活性。在組織水平上，低磷酸鹽血症誘發活性可以等同於腸道內的磷酸鹽吸收抑制活性，腎臟或腸道的磷酸鹽排洩促進活性，或者促進磷酸鹽轉移到細胞的活性。
此外，本發明中術語「磷酸鹽轉運抑制活性」表示作用於靶細胞從而抑制存在於細胞膜上的磷酸鹽轉運載體的活性的活性。可能的靶細胞主要是腎管的表皮細胞，腸或造骨細胞的表皮細胞。
另外，本發明中的術語「鈣化抑制活性」表示抑制作為骨骼組織和軟組織成分的含有鈣和磷酸鹽的結晶物質產生或積累過程的活性。
另外，術語「體內維生素D代謝調節活性」表示調控體內存在的維生素D及由它在體內合成的代謝物，在絕對量或者豐度上的變化的能力。維生素D及其代謝物的體內調控主要受以下控制(i)在腸道中的吸收或排洩和(ii)在腎臟中的重吸收或排洩，還有(iii)維生素D的體內合成，以及(iv)羥化反應導致的代謝轉化。已知由代謝轉化(iv)生成的主要代謝物有由維生素D-25-羥化酶使維生素D第25位羥基化產生的25-羥基維生素D；由25-羥基維生素D-1α-羥化酶使羥基維生素D的1α位置羥基化產生的1α，25-二羥基維生素D；或者由24-羥化酶使代謝物的第24位的羥基還原產生的24，25-二羥基維生素D或者1α，24，25-三羥基維生素D。維生素D代謝調控活性可以描述為調節參與產生這些維生素D代謝物的酶的活性，基因表達或者酶的蛋白表達量的變化的活性。
1.編碼調節磷酸鹽代謝，鈣代謝，鈣化和維生素D代謝的多肽的DNA(1)DNA克隆SEQ ID NO1所示DNA是本發明的DNA之一，它是利用從一個懷疑患有腫瘤誘導性骨軟化症的病人身上切除的腫瘤的一部分製備cDNA文庫，通過篩選該文庫得到的。
腫瘤誘導性骨軟化症是一種和腫瘤的存在相關聯的，由於骨骼組織鈣化不足導致低磷酸鹽血症和骨軟化症的疾病，其特徵是切除腫瘤症狀即消失。已有報導說，腫瘤提取物能促進小鼠尿磷酸鹽排洩(Popvtzer，M.M.等，Clinical Research 29418A，1981)，還有在一個實驗中將切除的腫瘤移植到小鼠體內時，誘發了低磷酸鹽血症(Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.6746-53，1988)。因此，考慮過可能是腫瘤產生並且分泌一種系統的未知因子。
我們使用了與Fukumoto，S等(Bone25375-377，1999)描述過的腫瘤相關的一個病例。在這個病例中，手術切除腫瘤使低磷酸鹽血症取得顯著的康復。此外，在該例中，腫瘤的大小只有直徑1釐米。基於這樣的推論，即如此小的組織能產生並分泌一種誘發低磷酸鹽血症和系統性骨軟化症的活性物質，我們預計我們所製備的腫瘤衍生cDNA文庫與其他組織所衍生的cDNA文庫相比，更可能含有編碼參與誘發這些臨床症狀的活性物質的基因的至少部分片段。相應地，為了鑑定編碼腫瘤衍生活性物質的基因的片段序列，通過差異篩選法提取了在腫瘤cDNA文庫中含量特別高的cDNA片段。
接下來，確定了所得cDNA片段的核苷酸序列，並進行了相互比較。然後根據核苷酸序列的重疊，製備了重疊群將各個被認為是來自同一基因的序列分組。對這樣得到的核苷酸序列與Genbank(由美國國家生物技術信息中心提供的資料庫，以下也稱為NCBI)中註冊的核苷酸序列進行同源性檢索。這樣，獲得了在腫瘤cDNA文庫中特別豐富的核苷酸序列，即SEQ ID NO1所示核苷酸序列中從核苷酸1522到2770的序列。這個序列與在Genbank中註冊的保藏號為AC008012的人類序列12p13BAC RPCI11-388F6的一部分相同。該註冊序列被認為代表人類染色體序列中12p13區域的部分序列。雖然在該註冊序列中顯示了預期基因的位置和核苷酸序列信息，SEQ ID NO1所示核苷酸序列中從核苷酸1522到2770的序列，以及本發明中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列並未包括在預期基因的任何指明區域內。
然後根據SEQ ID NO1所示核苷酸序列中從核苷酸1522到2770之間的核苷酸序列設計探針和PCR引物，並分離和鑑定包含在腫瘤cDNA文庫中的一個連續核苷酸序列，從而得到了本發明SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO1的核苷酸序列有一個開放讀碼框(以下也稱為ORF)，其編碼由本發明SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的多肽，該多肽預計有一個分泌信號。我們認為這是一個具有新序列的多肽，因為該多肽的胺基酸序列沒有在Genbank的胺基酸序列資料庫註冊。經過用SEQ ID NO1所示核苷酸序列和SEQ ID NO2所示胺基酸序列進行檢索，我們已經鑑定到SEQ ID NO9所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO10所示的胺基酸序列，這兩個序列被認為是所述分子的鼠直向同源物。正如下文所述，根據人的胺基酸序列製備的重組蛋白質在小鼠中有活性。因此，我們將SEQ ID NO2所示胺基酸序列與SEQ ID NO10所示胺基酸序列或小鼠全長序列(Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，277(2)，494-498)進行了比較，本發明使得能容易地評估某些蛋白質，這些蛋白質在保守胺基酸之外的一個胺基酸被取代，是否具有與本發明所述多肽相同或類似的生物活性。
(2)核苷酸序列的確定我們確定了(1)所描述的DNA的核苷酸序列。可以通過已知技術確定所述核苷酸序列，比如Maxam-Gilbert化學修飾法或利用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法。通常，測序是用自動測序儀(例如，PERKIN-ELMER生產的373A DNA測序儀)進行的。
本發明所述DNA的核苷酸序列的一個例子是SEQ ID NO1，本發明所述多肽的胺基酸序列的一個例子是SEQ ID NO2。只要由所述胺基酸序列組成的多肽具備低磷酸鹽血症誘發活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或維生素D代謝調節活性，所述胺基酸序列可以含有突變，比如刪除，取代或添加1或幾個胺基酸。
例如，可以從SEQ ID NO2所示胺基酸序列中刪除1或幾個，優選1到10個，更優選1到5個胺基酸；可以給SEQ ID NO2所示胺基酸序列添加1或幾個，優選1到10個，更優選1到5個胺基酸；或者可以用其他胺基酸取代SEQ ID NO2所示胺基酸序列中的1或幾個，優選1到10個，更優選1到5個胺基酸。
此外，作為一種取代方法，可以在能一定程度上保持胺基酸特性的一個家族內進行保守取代。通常根據胺基酸側鏈的特性分成的家族的例子如下。
(i)酸性胺基酸家族天冬氨酸，穀氨酸(ii)鹼性胺基酸家族賴氨酸，精氨酸，組氨酸(iii)非極性胺基酸家族丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸(iv)不帶電荷的極性胺基酸家族甘氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸(v)脂肪族羥基胺基酸絲氨酸，蘇氨酸(vi)含有醯氨基的胺基酸家族天冬醯胺，穀氨醯胺(vii)脂肪族胺基酸丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸(viii)芳香族胺基酸苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸(ix)疏水性胺基酸亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸
(x)小胺基酸家族丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸取代的例子是由SEQ ID NO2所示胺基酸序列用另一個胺基酸，優選用Ala，Gln或Trp取代176位的Arg和/或179位的Arg得到的序列，這樣此處的切割位點被阻止或抑制。此外，本發明所述多肽也涵蓋這樣的多肽，其由以SEQ ID NO2所示胺基酸序列從N末端，C末端或兩端刪除10個或以上胺基酸得到的胺基酸序列(末端刪除型)組成。這種末端刪除型的例子包括由SEQ ID NO2所示胺基酸序列在C末端刪除20，40，45或50個胺基酸，和/或在N末端刪除24或33個胺基酸得到的序列。末端刪除型的實施方案如下所示。

除了上述SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分片段，本發明的多肽還涵蓋由這些末端刪除型多肽經過刪除，取代或添加1或幾個胺基酸得到的突變片段。在上表中SEQ ID NO2中的胺基酸位置之後的括號中的數字表示在SEQ ID NO1所示核苷酸序列的核苷酸位置。因此，本發明也涵蓋了由這些位置所示的核苷酸序列組成的DNA或者與這些DNA在嚴謹條件下雜交的DNA。
在本發明中，為了向發明所述多肽的至少部分胺基酸序列中引入突變，採用了給編碼該胺基酸的DNA的核苷酸序列引入突變的技術。
可以通過已知技術向DNA中引入突變，比如Kunkel法或Gappedduplex法，或者相應的方法。例如，基於利用突變寡核苷酸作為引物的定點突變法引入突變。此外，也可以使用用於產生突變的試劑盒，比如Mutan-K(TAKARA)，Mutan-G(TAKARA)，LA PCR體外突變試劑盒(TAKARA)等來引入突變。
另外，本發明的DNA也涵蓋這樣的DNA，它與由本發明上述DNA(SEQ ID NO1，3，5，7和9)製備的探針在嚴謹條件下雜交，並且編碼具有低磷酸鹽血症誘發活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者維生素D代謝調節活性的多肽。此處所用的探針具有與SEQ IDNO1，3，5，7或9所示序列的全部序列或者其連續17個或更多個核苷酸(部分序列)互補的序列。
這裡，術語「嚴謹條件」滿足鹽濃度在750mM或以上，優選900mM或以上，溫度在40℃或以上，優選42℃的條件。具體來說，此處使用的嚴謹條件包括6x SSC，5x Denhardt，0.5％SDS，50％甲醛和42℃。另外，6x SSC表示900mM NaCl和90mM檸檬酸鈉。Denhardt溶液(Denhardt)含有BSA(小牛血清白蛋白)，聚乙烯吡咯烷酮和Fico11400。50x Denhardt溶液由1％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮和1％Fico11400(5x Denhardt表示50x Denhardt濃度的十分之一)組成。
本發明所述DNA的核苷酸序列一經確定，可以通過化學合成或者由已確定的核苷酸序列合成引物經PCR得到發明所述DNA。
2.含有發明所述DNA的重組載體以及轉化子的製備(1)重組載體的製備通過將本發明所述DNA連接到合適的載體中可以獲得本發明的重組載體。用於插入發明所述DNA的載體沒有特別限制，只要它能在宿主中複製。這類載體的例子包括質粒DNA和噬菌體DNA。
質粒DNA的例子包括得自大腸桿菌的質粒(例如，pBR322，pBR325，pUC118和pUC119)，得自枯草芽孢桿菌的質粒(例如pUB110和pTP5)，得自酵母的質粒(例如，YEp13，YEp24和YCp50)。噬菌體DNA的一個例子是λ噬菌體。此外，也可以使用動物病毒載體比如逆轉錄病毒，腺病毒或痘苗病毒，或者昆蟲病毒載體比如杆狀病毒。另外，可以使用連接了GST，His-tag等的融合質粒。
為了將本發明的DNA插入載體，可以使用這樣一種方法，其包括首先用適當的限制酶切割純化的DNA，並通過將切好的DNA插入適當載體DNA的限制酶位點或多克隆位點來使所得切好的DNA載體與載體連接。
本發明的DNA必須整合到載體中從而該DNA能執行其功能。對於發明所述載體，除了啟動子和本發明的DNA，如果需要可以連接上順式作用元件比如增強子，剪接信號，poly A添加信號，選擇標記和核糖體結合序列(SD序列)。此外，選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因，氨苄抗性基因和新黴素抗性基因。
(2)轉化子的製備通過將發明所述重組載體導入宿主中，使靶基因能夠表達，可以獲得本發明的轉化子。此處所用宿主沒有特定的限制，只要它能表達本發明的DNA。這類宿主的例子包括細菌埃希氏菌屬，比如大腸桿菌；芽孢桿菌屬，比如枯草芽孢桿菌；假單胞菌屬，比如惡臭假單胞菌；或者酵母比如釀酒酵母或者粟酒裂殖酵母。此外，也可以使用動物細胞，比如COS細胞，CHO細胞或者HEK293細胞，以及昆蟲細胞，比如Sf9或Sf21。
當用細胞，比如大腸桿菌作為宿主時，優選發明所述重組載體可以在細菌中自主複製，並包含啟動子，核糖體結合序列，本發明的DNA以及轉錄終止序列。另外，也可以含有調控啟動子的基因。大腸桿菌的例子包括JM109和HB101，枯草芽孢桿菌的例子是枯草芽孢桿菌。可以使用任何啟動子，只要它能在宿主，比如大腸桿菌中表達。例如，得自大腸桿菌的啟動子，例如trp啟動子，lac啟動子，PL啟動子或PR啟動子或者來源於噬菌體的T7啟動子等。也可以使用人工設計和修飾的啟動子，比如tac啟動子。此處將重組載體導入細菌所採用的方法沒有特別限制，只要它是將DNA導入細菌的方法。這類方法的例子包括使用鈣離子的方法和電穿孔法。
當使用酵母作為宿主時，可以用例如釀酒酵母，粟酒裂殖酵母和巴斯德畢赤氏酵母。這種情況下使用的啟動子沒有特別限制，只要它能在酵母中表達。這類啟動子的例子包括ga11啟動子，ga110啟動子，熱震蛋白啟動子，MFα1啟動子，PHO5啟動子，PGK啟動子，GAP啟動子，ADH啟動子和AOX1啟動子。將重組載體導入酵母的方法沒有特定限制，只要它是一種將DNA導入酵母的方法。這類方法的例子包括電穿孔法，原生質球法和醋酸鋰法。
當使用動物細胞作為宿主時，可以猴細胞COS-7，Vero，中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，小鼠L細胞，大鼠GH3細胞，人FL，HEK293，HeLa，Jurkat細胞等。作為啟動子，可以使用SRα啟動子，SV40啟動子，LTR啟動子，β-肌動蛋白啟動子等。另外，可以使用人巨細胞病毒等的早期基因啟動子。將重組載體導入動物細胞的例子包括電穿孔法，磷酸鈣法和脂質轉染法。
當用昆蟲細胞作為宿主時，可以使用Sf9細胞，Sf21細胞等。作為將重組載體導入昆蟲細胞的方法，可以使用磷酸鈣法，脂質轉染法，電穿孔法等。
3.具有低磷酸鹽血症誘發活性的多肽曾有多次嘗試從腫瘤誘導性骨軟化症中分離和鑑定具有低磷酸鹽血症誘發活性的腫瘤衍生因子。因此，本發明的多肽表現出由腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤產生的新的分泌因子的特性。該低磷酸鹽血症誘發因子的預期生物活性有如下報導。
對促進磷酸鹽排洩到尿中的影響Aschinberg，L.C.等，J.Pediatrics 9156-60，1977，Lau，K.等，Clinical Research 27421A，1979，Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.6746-53，1988對腎小管表皮細胞的磷酸鹽轉運活性的抑制Cai，Q.等，N.Engl.J.Med.3301645-1649，1994，Wilkins，G.E.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.801628-1634，1995，Rowe，P.S.N.等，Bone 18159-169，1996對25-羥基維生素D-1α-羥基酶活性的抑制Miyauchi，A.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.6746-53，1988特別是，已建議將一種直接具有抑制腎臟中磷酸鹽重吸收的未知分子稱為Phosphatonin(Econs，M.J.Drezner，M.K.，Engl.J.Med3301679-1681，1994)。還有建議說一種具有這樣的生物活性的未知分子也存在於XLH中。對XLH患者的臨床發現的特徵在於尿磷酸鹽排洩增強的低磷酸鹽血症，這是與腫瘤誘導性骨軟化症患者相同的，並且由於骨組織中鈣化不足XLH會發展成骨軟化症或佝僂病。已經證明引起XLH的基因是一個編碼類肽鏈內切酶蛋白質的基因，稱為PHEX。最近，在Hyp小鼠，即已知能表達類似於XLH的表型特徵的自然突變小鼠，中發現其編碼PHEX的基因有部分刪除，這暗示認為Hyp小鼠是XLH模型小鼠是正確的(Strom，T.M.等Human MolecularGenetics 6165-171，1997)。Hyp小鼠中的低磷酸鹽血症誘發因子是一種體液因子，這一點在使用Hyp小鼠和正常小鼠的異種共生實驗中得到證實(Meyer，R.A.等，J.Bone Miner.Res.4493-500，1989)。在這個實驗中，正常小鼠的血液磷酸鹽水平下降，尿磷酸鹽排洩增加。因此，有人認為Hyp小鼠中存在的體液低磷酸鹽血症誘發因子能作用於正常小鼠。到目前為止預期具有肽鏈切割活性的PHEX和這個未知的低磷酸鹽血症誘發因子之間的關係還不清楚。但是，也有人提出了這樣一些涉及兩者關係的假設，即PHEX可能調節未知的低磷酸鹽血症誘發因子的活性，還有這樣的可能性，在腫瘤誘導型骨軟化症中發現的低磷酸鹽血症誘發因子與在XLH中發現的因子是一樣的(Drezner，M.K.Kidney Int 579-18，2000)。根據這個假設，PHEX和低磷酸鹽血症誘發因子都常規地在相同細胞中表達，PHEX抑制性地作用於低磷酸鹽血症誘發因子。PHEX的這種功能在XLH患者中下降或消失，因此低磷酸鹽血症誘發因子的活性得以強烈表達。據認為在腫瘤誘導性骨軟化症中，PHEX和低磷酸鹽血症-誘發因子都升高，最終活性低磷酸鹽血症誘發因子在數量上超過了正常水平。也有認為該低磷酸鹽血症誘發因子抑制性地作用於NPT2的磷酸鹽轉運活性，後者是腎臟中的磷酸鹽載體之一。為了尋找這個未知的低磷酸鹽血症誘發因子人們做了許多嘗試，但都未能鑑定到該分子。根據Cai等的一項研究，預計該低磷酸鹽血症誘發因子的分子量在8kDa到25kDa(Cai，Q.等，N.Engl.J.Med.3301645-1649，1994)，但Rowe等提出56kDa和58kDa的兩個蛋白質是候選分子。最近，Rowe等提交了一份關於一種多肽的專利申請(WO99/60017)，該多肽包含430個胺基酸殘基，是用於腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤衍生磷酸鹽代謝調控因子。但是，該申請所公開的多肽是原來存在的一個蛋白質的部分序列，並且沒有公開與低磷酸鹽血症誘發活性相關的生物活性。最近，有人報導了該專利中公開的名為MEPE的全長分子所對應的多肽，但沒有同時公開其誘發低磷酸鹽血症的活性(Rowe，P.S.N.等，Genomics，6754-68，2000)。另外，該分子和本發明所述多肽之間沒有可識別的序列或結構上的相似性。
如上所述，推斷出存在一個具有誘發低磷酸鹽血症活性的生理活性因子，但至今沒有確定其身份。在本發明中，我們弄清了該多肽的實體，以及編碼該多肽的基因序列。此外，正如後面描述的，我們製備了本發明所述多肽，表明該產物可以作為磷酸鹽代謝，鈣代謝和維生素D代謝或者鈣化和骨生成的調節因子，以及該產物可以作為藥物組合物。另外，我們已經證實本發明所述抗體不僅可以用於治療，還可以用於臨床檢測和診斷。而且，我們表明編碼本發明所述多肽的DNA可用於診斷遺傳疾病，以及磷酸鹽代謝，鈣代謝和骨代謝的多態性診斷。
本發明中具有低磷酸鹽血症誘發活性的多肽可以這樣製備，即將例如含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列中核苷酸133到885的序列以能被表達的形式導入合適的宿主細胞來製備轉化子細胞，然後令導入到轉化子細胞的DNA表達。此外，以這樣方式製備的多肽鏈可以由宿主的蛋白質修飾機制被修飾，比如切割或添加糖鏈。
通過培養以上轉化子，然後從培養產物中收集可以得到本發明的多肽。術語「培養產物」意味著，除了培養物上清外，所有的培養細胞或培養微生物，或者被裂解的細胞或微生物。
本發明的轉化子可以通過任何常規的宿主培養方法來培養。
只要含有碳源，氮源，無機鹽等能被微生物同化，有效地培養轉化子，天然或合成的培養基都可用於培養利用微生物，比如大腸桿菌或酵母作為宿主得到的轉化子。碳源的例子包括碳水化合物比如葡萄糖，果糖，蔗糖或澱粉，有機酸比如醋酸或丙酸，以及醇比如乙醇或丙醇。氮源的例子包括氨，有機或無機酸的銨鹽比如氯化銨，硫酸銨，醋酸銨或磷酸銨，或其他含氮的化合物，以及蛋白腖，肉提取物，和玉米漿。礦物質的例子包括磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉，硫酸鐵，硫酸錳，硫酸銅和碳酸鈣。
培養通常在有氧條件下進行，比如於37℃下震蕩培養或通氣攪拌4到48小時。在培養過程中，pH保持在6.0到8.0之間。用無機或有機酸，鹼溶液等調節pH。培養時，如果需要可以向培養基中加入抗生素，比如氨苄青黴素或四環素。
當培養使用誘導性啟動子的表達載體轉化之微生物時，如果需要可以向培養基中加入誘導劑。例如，當培養用含有T7啟動子的表達載體轉化的微生物時，該啟動子可以用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，就可以向培養基中加入IPTG等。此外，當培養用含有trp啟動子的表達載體轉化的微生物時，該啟動子可以用吲哚乙酸(IAA)誘導，就可以向培養基中加入IAA等。
培養利用動物細胞作為宿主得到的轉化子的培養基的例子包括普遍使用的RPMI1640培養基，DMEM培養基或者補充了胎牛血清等的培養基。培養通常在37℃，5％CO2條件下進行1到10天。培養時，如果需要可以向培養基中加入抗生素，比如卡那黴素或青黴素。培養後，當本發明所述多肽產生於微生物或細胞內時，可以通過超聲，反覆凍融，勻漿處理等破碎微生物或細胞從而收集靶多肽。而當本發明所述多肽產生於細菌或細胞外部時，用全部培養液，進行離心等來除去細菌或細胞。然後，可以將分離和純化蛋白質的常規生化方法(比如硫酸銨沉澱，凝膠層析，離子交換層析和親合層析)單獨或聯合使用從上述培養產物中分離和純化本發明的多肽。
正如上面對XLH的描述，被認為是一種肽鏈內切酶的PHEX在調節低磷酸鹽血症誘發因子中有重要意義。因此，本發明中具有SEQ ID NO2的胺基酸序列的多肽有可能在進一步修飾和切割後具備變化了的活性。在本發明中，利用CHO ras-clone 1細胞作為宿主，製備了一種能產生在本發明所述多肽的C末端帶有6個連續His的重組多肽的克隆細胞系。該細胞系保藏在國立先進工業科學與技術研究院，國際專利生物保藏處(Chuo 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)(保藏號FERM BP-7273，最初保藏日2000年8月11日)。
當檢測本發明中由細胞系產生並分泌到培養液中的多肽時，利用識別His-tag序列的抗體通過Western印跡探測不同大小的基因產物，如圖2所示。分離各個條帶所對應的蛋白質並確定其N末端胺基酸序列。這樣，SEQ ID NO4和SEQ ID NO8分別代表的N末端胺基酸序列的N末端胺基酸序列是相同的。也可以認為具有前一序列的蛋白質可能對應於一個被除去信號序列的蛋白質，具有後一序列的蛋白質對應被酶，比如肽鏈內切酶切割過的蛋白質。
目前，弗林蛋白酶是已知的識別RXXR的蛋白水解酶之一。實際上，當在弗林蛋白酶缺陷型細胞系內表達本發明的多肽時，未能檢測到片段。而且，當具有弗林蛋白酶抑制活性的重組蛋白α1-PDX與本發明所示多肽共表達時，上清中被切割的產物顯著減少。
因此，本發明還涵蓋了製備發明所述多肽的一種方法，其包括培養時使用弗林蛋白酶缺陷型細胞，或與能抑制弗林蛋白酶活性的物質共存這樣的步驟。
Cai等曾提出通過培養腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤衍生細胞得到的培養液上清中的磷酸鹽轉運抑制活性，當用透析膜經分級分離法測量時顯示分子量範圍在8KDa到25KDa。同樣可以想像的是，通過將本發明具有SEQ ID NO4之胺基酸序列的多肽轉化為在SEQ ID NO2的179殘基Arg和180殘基Ser之間切割所產生的多肽，可以改變所述活性。
本發明的多肽具有抑制腎臟近端小管表皮細胞的磷酸鹽轉運活性的能力，這是低磷酸鹽血症誘發活性的一種形式，如表2所示(實施例7)。血液中的大部分游離無機磷酸鹽在腎小球中被過濾，其中大約80％到90％的無機磷酸鹽在腎臟近端小管中被重吸收。
重吸收是由近端小管腔面上存在的II型Na-依賴磷酸鹽載體經磷酸鹽轉運進行的。本發明的多肽具有抑制磷酸鹽轉運活性的能力。這意味著發明所述多肽能促進體內磷酸鹽尿排洩。因此，可以認為本發明的多肽通過發揮其抑制腎臟中磷酸鹽重吸收，特別是在近端小管腎細胞中的磷酸鹽轉運的活性，而誘發低磷酸鹽血症，所以預計本發明所述多肽與上面的Phosphatonin是相同的物質。
最近，在腸道中鑑定到了Na-依賴磷酸鹽載體。該載體被命名為IIb型，因為它與腎臟中存在的II型Na-依賴磷酸鹽載體同源性極高。可以想像與腎臟中的II型Na-依賴磷酸鹽載體類似，本發明的多肽也能抑制腸道腔面上存在的IIb型Na-依賴磷酸鹽載體。這可以看作是低磷酸鹽血症誘發活性的一種形式。
通過實驗評估本發明所述多肽的體內活性，該實驗中將表達上述多肽的重組細胞皮下移植到裸鼠中。
該實驗中的移植細胞在裸鼠的皮下空間生長，然後使其形成腫瘤。隨著腫瘤形成由該細胞產生和分泌的本發明的多肽特徵在於能釋放到小鼠的體液中，從而可以在該動物模型中再現腫瘤誘導性骨軟化症中腫瘤衍生體液因子的釋放。在這個模型實驗中，如表4所示(實施例11)，與通過移植未導入本發明DNA的CHO細胞而形成腫瘤的對照小鼠，或者不形成腫瘤的小鼠相比，移植了表達本發明多肽的細胞的小鼠發展為明顯的低磷酸鹽血症。與此對應，本發明所述多肽顯示出低磷酸鹽血症誘發活性。此外，該實驗還顯示磷酸鹽重吸收率也下降了，腎臟中的磷酸鹽重吸收被抑制。所以，結論是本發明的多肽是腫瘤誘導性骨軟化症的低磷酸鹽血症誘發因子。
另一方面，在上述模型實驗中，在移植了能產生本發明所述多肽的重組細胞的小鼠中發現了鈣不足。因此，這說明本發明的多肽也是鈣不足誘發因子。在實施例16所描述的實驗中，表達本發明所述多肽的CHO細胞被移植到裸鼠體內，該實驗顯示血清1α，25-二羥維生素D水平持續下降。如實施例19和20所述，當將本發明的導入了突變的多肽或者發明所述野生型全長多肽給予正常小鼠三次，兩者中的血清1α，25-二羥維生素D水平都下降了。此外，如實施例24所述，將本發明的多肽給藥一次後，幾小時內即觀察到血清1α，25-二羥維生素D水平下降。因此，可以想見導致1α，25-二羥維生素D水平下降的活性是發明所述多肽的主要生物或生理效應。
正如上面的描述，血清1α，25-二羥維生素D水平由1α-羥化酶和24-羥化酶調控。如實施例16所述，發明所述多肽降低血清1α，25-二羥維生素D水平的作用伴隨著這些代謝酶表達的波動。此外，如實施例24所述，在將本發明的多肽給藥後1小時，觀察到負責活性維生素D代謝物產生的1α-羥化酶的基因轉錄產物減少，分解活性維生素D代謝物的24-羥化酶的基因轉錄產物增加。這些表達情況發生波動之後，血清1α，25-二羥維生素D水平逐漸下降，這暗示著本發明所述多肽的降低1α，25-二羥維生素D水平的效應至少是由於1α-羥化酶基因表達被抑制和24-羥化酶基因表達增強。
與此相反，在一個長期移植實驗中(移植後44到46天)，該實驗中象實施例11描述過的，表達本發明所述多肽的CHO細胞被移植到裸鼠體內，1α-羥化酶基因表達升高。在此時的小鼠血清PTH水平被證明與對照組相比顯著提升。因此，可以推測1α-羥化酶基因表達增強是由於高水平的PTH效應。但有趣的是，即使在高PTH水平的條件下，24-羥化酶基因的表達持續上升，這可以理解為高PTH水平不能干擾本發明的多肽對24-羥化酶基因表達的調控。如實施例11所述，血清1α，25-二羥維生素D3水平沒有增加，儘管有小鼠表現出嚴重的類低磷酸鹽血症或類佝僂病的臨床發現。這提示了本發明的多肽具有持續增強24-羥化酶基因表達的效果。
A.Nykjaer等已經揭示了25-羥基維生素D是在腎臟近端小管被重吸收(Cell，96507-515，1999)。儘管本說明書沒有描述，但在表達發明所述多肽的CHO細胞被移植到裸鼠體內的一個實驗中，沒有發現血清25-羥基維生素D水平有顯著變化。此外，也沒有識別到本發明的多肽影響主要電解質(比如鈉，鉀或氯，主要的胺基酸或者葡萄糖)的部分排洩(用尿水平/血清水平/GFR計算出的)，這提示腎小管的重吸收功能未被破壞的事實(T.Shimada等，Proc.Natl.Acad.Sci，印刷中)。所以，這說明本發明的多肽不是通過抑制25-羥基維生素D在腎小管的重吸收，而是通過特異地作用於1α，25-二羥維生素D的合成途徑從而降低血清1α，25-二羥維生素D水平的。
已知在腫瘤誘導性骨軟化症中血清1α，25-二羥維生素D水平顯著下降。此外，在血磷酸鹽過少性抗維生素D佝僂病(XLH)或Hyp(表現XLH臨床症狀的模型小鼠)中，血清1α，25-二羥維生素D水平在正常範圍內或者稍低於正常範圍的下限，儘管血清磷酸鹽水平嚴重下降。Hyp小鼠中24-羥化酶基因表達升高也是已知的。在這些發展為低磷酸鹽血症的臨床症狀中，正常情況下，隨著血清磷酸鹽水平下降，1α-羥化酶基因表達升高，從而使血清1α，25-二羥維生素D水平上升。因此，我們認為導致這一正常生理反應喪失的任何調節系統的失靈至少是這些臨床症狀的原因之一。這些現象與實施例11，19或20描述的在小鼠中觀察到的生理反應相似，強烈地提示本發明的多肽能降低以上臨床症狀中的血清1α，25-二羥維生素D3水平。
圖5所示X光圖像清楚地顯示了與對照組相比，移植了表達發明所述多肽的重組細胞的小鼠，其骨骼組織的鈣化程度明顯下降。還觀察到胸廓變形等現象，提示本發明的多肽對骨骼形成有影響。
換句話說，可以想見本發明的多肽具有抑制骨骼組織鈣化，或者促進鈣和磷酸鹽從骨骼組織中聚集的效果。同樣可以想像血液磷酸鹽和鈣水平的顯著下降導致對骨骼組織鈣化的再次抑制。
在Hyp小鼠中，據認為骨骼衍生細胞產生一種抑制腎臟近端小管中磷酸鹽轉運活性的因子(Lajeunesse，D.等，KidneyInt.501531-1538，1996)。此外，有報導說Hyp小鼠的成骨細胞釋放鈣化抑制因子(Xiao，Z.S.，Am.J.Physiol.，E700-E708，1998)。如上所述，在XLH和腫瘤誘導性骨軟化症中，臨床症狀比如低磷酸鹽血症和骨骼組織鈣化不足彼此非常相象，並且這些臨床症狀可能由一種體液因子所誘發。歸結這些事實提示了這樣一種可能，即在這些對Hyp小鼠的研究中報導的腎臟磷酸鹽轉運抑制活性和骨骼鈣化抑制活性是由同一種因子導致的。此外，還有報導說即使在鈣和磷酸鹽水平處於正常範圍的狀態下，Hyp小鼠的成骨細胞也顯示異常的成骨功能(Ecarot，B.等，J.Bone Miner.Res.7215-220，1992)。本發明的多肽具有與上述Hyp小鼠的預期因子類似的活性。因此，可以想見本發明的多肽，除了低磷酸鹽血症誘發活性，還有不經鈣或磷酸鹽代謝介導，直接調節骨骼組織鈣化的作用。
在完成本發明的過程中，除了編碼發明所述多肽的基因，還得到了如實施例3中表1所示的牙基質蛋白-1(DMP-1)。該基因在牙質中表達豐富，其編碼的蛋白質是牙質的胞外基質蛋白，它被認為在牙質的鈣化基質形成中有重要作用。類似地，得到編碼基質胞外磷酸化蛋白(MEPE)的基因OST190。該分子的具體功能不清楚。另外類似地，還得到編碼骨橋蛋白的基因。MEPE，DMP-1和骨橋蛋白具有共同的特性，即它們是含有RGD基元序列的磷酸化蛋白質，富含能被磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸，酸性胺基酸穀氨酸和天冬氨酸含量高，表現出強的酸性蛋白質特性。一個特徵性的酸性區域，名為ASARM序列，在MEPE和DMP-1中是保守的(Rowe，P.S.N.等，Genomics 6754-68，2000)，這提示了它們生理或功能意義的相似性。在開始鈣化時與無機鈣和/或磷酸鹽的相互作用被認為是這樣的特徵蛋白質的功能之一。除了成骨細胞和破骨細胞，骨橋蛋白基因在各種細胞，比如巨噬細胞中的表達已有報導。另一方面，DMP-1在骨骼組織，特別是在骨細胞中的表達最近有報導。MEPE在骨髓組織或骨肉瘤細胞比如SaOS-2中的基因表達是已知的。在本發明過程中，與本發明所述多肽一起發現了常見於鈣化組織的酸性基質蛋白這一事實代表了本發明的多肽的作用的一個方面。具體來說，存在這樣的可能，即本發明的多肽誘導了上述分子所代表的鈣化組織特異性分子的表達，因此所述多肽以協同方式調節鈣化，鈣代謝和磷酸鹽代謝，或者被誘導的分子次級調節鈣化，鈣代謝和磷酸鹽代謝。還可以想見本發明的多肽可以通過直接作用於成骨細胞，骨細胞和破骨細胞來調節骨代謝。所以，本發明所述多肽可以用於治療骨質疏鬆症一類的代謝性骨骼疾病。
最近，具有類成骨細胞表型的細胞顯示出現在異常鈣化位點，這提示鈣化可能是通過與骨骼組織中鈣化過程類似的機制發生的。因此，可以想像本發明的多肽對於通過抑制這些負責鈣化的細胞的出現或抑制其功能來治療異常鈣化是有效的。
在本發明中，上述多肽可以被修飾。例如，可以適當地選擇聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇等使用。可以採用任何已知技術作為修飾方法。例如，在JP專利公開(PCT譯本)NO.10-510980中詳細公開的一項技術。
4.抗發明所述多肽的抗體本發明的抗體能與上述本發明的多肽特異性反應。本發明中，術語「抗體」意味著能與抗原多肽或其片段結合的整個抗體分子或其片段(例如，Fab或F(ab』)2片段)，它可以是多克隆或單克隆抗體。
本發明的抗體可以依據常規方法製備。例如，抗體可以通過體內方法製備，其包括使用抗原與佐劑以幾周間隔將動物免疫一次或幾次(加強免疫)，或者是體外方法製備，其包括分離免疫細胞並利用合適的培養系統來使免疫細胞致敏。能產生發明所述抗體的免疫細胞的例子包括脾細胞，扁桃體細胞和淋巴細胞。
用作抗原的多肽不必是完整的上述本發明的多肽。可以用該多肽的一部分作為抗原。使用短肽作為抗原時，尤其是只有大約20個胺基酸殘基那麼短的肽，這樣的肽要通過化學修飾等方法結合一個有高抗原性的載體蛋白，比如匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白，或者共價結合一個有分支骨架的肽而非載體蛋白，比如賴氨酸核心MAP肽(Posnett等，J.Biol.Chem.263，1719-1725，1988；Lu等，Mol.Immunol.28，623-630，1991；Briand等，J.Immunol.Methods 156，255-265，1992)。
作為佐劑，可以使用例如弗氏完全或不完全佐劑，氫氧化鋁膠等。用抗原免疫的動物，可以使用例如，小鼠，大鼠，兔，綿羊，山羊，雞，牛，馬，豚鼠和倉鼠。
多克隆抗體的獲得可以通過從這些被免疫動物採血，分離血清以及利用硫酸胺沉澱，陰離子交換層析和蛋白A或G層析這些方法之一或它們的適當結合來純化免疫球蛋白。當上述動物是雞時，可以從雞蛋中純化抗體。
通過純化雜交瘤的培養物上清來製備單克隆抗體，所述雜交瘤是通過將已經在體外致敏或者採自上述動物的免疫細胞與能進行培養的親代細胞融合製備的，或者從腹腔內接種雜交瘤的動物的腹水中製備所述抗體。動物，比如小鼠的常見成熟細胞系可以用作親代細胞。此處優選使用的細胞系有藥物選擇性，並具有未融合時不能在HAT選擇培養基(含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶)中存活，但在與抗體生成細胞融合的狀態能存活的特性。這類細胞系的例子包括X63，NS-1，P3U1，X63.653，SP2/0，Y3，SKO-007，GM1500，UC729-6，HM2.0和NP4-1細胞。
製備單克隆抗體的具體技術如下。
將如上所述製備的多肽或其片段作為抗原給予上述動物。當使用佐劑時每個動物的抗原劑量是1到100ug。免疫主要通過靜脈內，皮下或腹腔內注射進行。此外，免疫間隔沒有特別限定。間隔幾天到幾周，優選1到3周，免疫進行1到10次，優選2到5次。1到10天後，優選最後一次免疫後1到4天，採集抗體生成細胞。
為了獲得雜交瘤，將抗體生成細胞和親代細胞(黑素瘤細胞)融合。細胞融合在用於培養動物細胞的無血清培養基(比如DMEM或RPMI-1640培養基)中進行，通過將5×106到1×108細胞/ml抗體生成細胞與1×106到2×107細胞/ml黑素瘤細胞混合(優選的抗體生成細胞與黑素瘤細胞的比率是5∶1)，並在細胞融合促進劑存在的條件下進行融合反應。可以使用平均分子量在1000到6000道爾頓的聚乙二醇等作為融合促進劑。此外，可以用市場上的細胞融合設備(例如，電穿孔)利用電刺激將抗體生成細胞和黑素瘤細胞融合。
完成細胞融合後，從所述細胞中挑選目標雜交瘤。將細胞懸浮液適當地稀釋在，例如含有胎牛血清的RPMI-1640培養基中，以大約5×105細胞/孔的濃度接種到微量培養板中。向每個孔中加入選擇培養基，然後進行培養同時適時換選擇培養基。最終，在選擇培養基中培養大約14天後增殖的細胞可以作為雜交瘤。對已經增殖的雜交瘤的培養上清進行篩選尋找能與本發明的多肽反應的抗體。雜交瘤的篩選可以依據常規方法進行，篩選方法沒有特別限制。例如，採集一部分包含在生長雜交瘤的孔中的培養上清，然後通過酶免疫法，放射免疫法等進行篩選。
可替代地，可以通過培養永生化抗體生成細胞來製備單克隆抗體，所述抗體生成細胞是用合適的病毒(比如EB病毒)感染體外致敏的或來自上述被免疫動物的免疫細胞而得到的。
除了這些細胞工程技術，還可以通過基因工程技術獲得所述單克隆抗體。例如，可以通過PCR(聚合酶鏈式反應)從體外致敏的或上述動物的免疫細胞中擴增得到這類抗體基因。將該基因導入微生物(比如大腸桿菌)使其產生抗體，或者令噬菌體將所述抗體表達為細胞表面的融合蛋白。
使用本發明的抗體對發明所述多肽進行體內定量，這使得能夠闡明本發明的多肽與各種疾病的臨床症狀之間的關係。而且，所述抗體可以用於診斷或治療，並能有效地親合純化本發明所述多肽。
據估計，有些疾病的病因在於發明所述多肽的過分作用而導致的血清1α，25-二羥維生素D水平的下降。例如，儘管血磷酸鹽過少性抗維生素D佝僂病(XLH)能發展為嚴重的低磷酸鹽血症，沒有發現血清1α，25-二羥維生素D3水平上升。其原因被認為是維生素D代謝酶基因的異常。該病中，可能涉及本發明的多肽的過分作用。在Hyp(XLH的小鼠模型)中，有報導說24-羥化酶基因表達增強。這與本發明的多肽能誘導24-羥化酶基因表達增強的作用是一致的。因此，預計通過給予抗本發明所述多肽的抗體來使維生素D的代謝正常，從而糾正血清1α，25-二羥維生素D3的水平可以治療這種病。與XLH呈現類似的臨床表徵的一例疾病是常染色體顯性血磷酸鹽過少性佝僂病(ADHR)。在克隆本發明的多肽時，根據它在染色體上的位置，我們推斷編碼該多肽的基因就是引起ADHR的基因。最近，有人分析了引起ADHR的一個基因，報導說該病是由編碼所述多肽的基因的一個錯義突變導致的。我們進一步闡明該突變賦予了這個基因酶切抗性，並且說明這個分子的過度作用是導致該病的原因。可以想見抗本發明所述多肽的抗體通過其抑制作用能有效治療這種疾病。ADHR發展為骨軟化症，礦物質代謝紊亂和維生素D代謝異常。因此在與這些代謝途徑密切相關的代謝性骨骼疾病中，可能有一些是由本發明所述多肽引起的。可以預期到的是抗本發明所述多肽的抗體對這類病有效。已知抑制分化成脂肪細胞是1α，25-二羥維生素D的作用之一。並且人們知道骨髓中的脂肪細胞隨著年齡增加。這種情況下，由骨髓中普通的支持骨髓造血的造血細胞，脂肪細胞和基質細胞的前體細胞分化為脂肪細胞會增強。可以想見在這個過程中，本發明的多肽可能過分作用導致1α，25-二羥維生素D水平下降。所以，可以預計使用抗本發明所述多肽的抗體能提高血液或局部1α，25-二羥維生素D水平，抑制分化為脂肪細胞，提高下降的骨骼形成或造血能力。此外，預計該抗體也能有效防止肥胖。可以想見還有發明所述多肽參與的一些其他疾病。可以通過ELISA所代表的免疫定量方法結合抗本發明所述多肽的抗體來篩選這類疾病。相應地，可以確定出發明所述多肽的生理正常範圍，就可以明確偏離這一範圍的疾病。預期抗本發明所述多肽的抗體可以用於治療這樣的疾病，這些疾病中本發明所述多肽經以上方法測量，顯示出異常高的血液水平。
5.藥物組合物(1)包含本發明所述多肽的藥物組合物本發明的多肽可以作為藥物組合物用於血磷酸鹽水平不利地升高的疾病。在慢性腎衰竭中，磷酸鹽從腎臟中排洩下降導致血液磷酸鹽水平上升。高磷酸鹽血症進一步加重了腎臟功能，促進甲狀旁腺激素從甲狀旁腺分泌，從而誘發繼發的甲狀旁腺功能亢進。這種疾病導致皮膚瘙癢，以及腎臟中1α，25-二羥維生素D3合成紊亂引起的腸道鈣吸收降低。此外，血液磷酸鹽儲留造成的甲狀旁腺激素過量分泌的狀況促進鈣從骨骼組織的流失。當這種狀況持續時，會發生纖維性骨炎或甲狀旁腺增生，後者是腎臟骨營養不良的一個臨床症狀。逃避這一狀況的優選方法是提高上面提及的低磷酸鹽血症，但目前的醫療方法不能有效控制低磷酸鹽血症。在慢性腎衰竭能維持排尿功能的階段，本發明的多肽具有通過抑制腎臟近端小管表皮細胞中存在的II型Na-依賴性磷酸鹽載體從而促進磷酸鹽排洩到尿中來糾正血液磷酸鹽水平(磷酸鹽轉運抑制活性)。此外，本發明的多肽能夠作用於腸道，通過與在腎臟中類似的方式抑制II型Na-依賴性磷酸鹽載體，從而減少磷酸鹽吸收到體內來糾正血液磷酸鹽水平。
本發明的多肽還可以作為藥物組合物用於異常鈣代謝和磷酸鹽代謝所導致的疾病。術語「異常鈣代謝」表示這樣一種狀態，此時血清鈣水平偏離了臨床上界定的正常範圍，或者是血清鈣水平處於正常範圍內，但腎臟，腸道，骨骼組織和甲狀旁腺的功能異常地增強或下降了以便維持血清鈣水平，或者是調節血清鈣的激素，比如甲狀旁腺激素，1α，25-二羥維生素D3或降鈣素呈現異常數值。此外，術語「異常磷酸鹽代謝」表示這樣一種狀態，即血清磷酸鹽水平偏離臨床上界定的正常範圍，或者血清磷酸鹽水平處於正常範圍，但腎臟，腸道和骨骼組織中的磷酸鹽平衡功能異常地增強或下降了。
腎臟骨營養不良以及上述繼發性甲狀旁腺功能亢進呈現多種臨床形式，比如動力缺乏骨骼疾病，纖維性骨炎或者它們的混合表型。為了抗繼發性甲狀旁腺功能亢進，通常用1α，25-二羥維生素D3，1α-羥基維生素D3等來抑制甲狀旁腺激素。當甲狀旁腺激素的數值沒有被有效抑制，可以採取脈衝療法(以下也稱為「維生素D脈衝療法」)，它包括給予過量1α，25-二羥維生素D3或1α-羥基維生素D3。正常的血清甲狀旁腺激素水平是65pg/ml或以下。當這種病症中甲狀旁腺激素水平處於正常水平，會導致動力缺乏骨骼疾病，它是腎臟骨營養不良的一種形態。而且，當甲狀旁腺激素水平升高時，會發生與上述臨床症狀相反的纖維性骨炎。最近對這類疾病的指導方針建議將甲狀旁腺激素水平維持在大約130到260pg/ml。但是，異常代謝的根本原因仍不清楚。已知甲狀旁腺激素能被升高的血清磷酸鹽水平誘導，被升高的血清鈣水平抑制。因為本發明的多肽使血液磷酸鹽水平和血鈣水平降低，可以推斷所述多肽能改變甲狀旁腺激素的功能。此外，已有報導說在腫瘤誘導性骨軟化症患者中，1α，25-二羥維生素D3下降到測量極限或更低。因此，還可以推斷本發明的多肽可能參與調節1α，25-二羥維生素D3的活性。可以想見在伴有上述甲狀旁腺激素調節異常或活性受損的腎性骨營養不良中，本發明的多肽可以作為臨床上有用的藥物組合物用於動力缺乏性骨骼疾病或纖維性骨炎。所以，可以想見給予本發明的多肽為腎臟骨營養不良中的纖維性骨炎或動力缺乏性骨骼病提供了一種有用的療法，它們是相反的。
另外，本發明的多肽可以作為異常鈣化的藥物組合物。骨骼組織之外的組織鈣化會損害生物功能。特別是，心臟或血管鈣化導致的功能紊亂會威脅生命。這類異常鈣化的一個危險因素是血液鈣離子和磷酸鹽離子水平(以下也稱為「鈣-磷酸鹽產量」)上升。在上述繼發性甲狀旁腺功能亢進的療法中，當用維生素D脈衝療法抵制低磷酸鹽血症的臨床症狀時，鈣-磷酸鹽產量會上升從而導致異常鈣化。血液透析患者的心血管系統鈣化是一個嚴重的問題。如表4所示，本發明的多肽具有能顯著降低血清鈣水平和磷酸鹽水平的活性，因此預計它能有效地抗異常鈣化和多種疾病。
此外，本發明的多肽可以用作抗代謝性骨骼疾病的藥物組合物。本發明的多肽對鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或維生素D代謝有強調節活性。參與鈣代謝和磷酸鹽代謝的激素的例子包括降鈣素，甲狀旁腺激素和1α，25-二羥維生素D3。降鈣素有降低血清鈣的活性，而甲狀旁腺激素和1α，25-二羥維生素D3有提高血清鈣的活性。有報導說甲狀旁腺激素對磷酸鹽排洩到尿有影響，降鈣素也有類似活性。1α，25-二羥維生素D3有促進腸道磷酸鹽吸收的活性。如上所述，每種激素對維持血清鈣和磷酸鹽水平之間的平衡有不同活性，但降鈣素和1α，25-二羥維生素D被用作骨質疏鬆症的治療劑。此外，甲狀旁腺激素正被開發為骨質疏鬆症的治療藥物。
骨骼代謝的特徵在於骨骼組織的分解代謝和合成代謝，即骨骼再吸收和骨骼形成是結合在一起的。持續給予甲狀旁腺激素會導致骨質減少。但是，已知當間歇性地作用時，甲狀旁腺激素能促進骨骼形成。因為本發明的多肽有調節鈣代謝和磷酸鹽代謝的效果，可以預見到當選擇合適的方法使用所述多肽時，它能有效地抗代謝性骨骼疾病包括骨質疏鬆。
此外，本發明的多肽可以作為藥物組合物用於血清1α，25-二羥維生素D水平不利地升高的疾病或臨床症狀，或者用於伴有血清1α，25-二羥維生素D所誘發的不利生理反應的臨床症狀。
已知1α，25-二羥維生素D作用於甲狀旁腺腺體從而抑制甲狀旁腺激素(PTH)的分泌。因此，臨床上成熟的用於慢性腎衰竭中繼發性甲狀旁腺功能亢進，特別是伴有高血清PTH水平的病例的療法，包括間歇性給予高濃度1α，25-二羥維生素D。這個療法的一個弊端是它容易導致異常鈣化。在血清磷酸鹽水平高的慢性腎衰竭患者中，經常觀察到給予1α，25-二羥維生素D所引起的骨骼組織之外的組織鈣化。由於本發明的多肽有促進血清1α，25-二羥維生素D在給予所述多肽後的幾小時內快速下降的效果，該多肽可用於治療和預防1α，25-二羥維生素D水平過高引起的異常鈣化。
此外，間歇給予高濃度1α，25-二羥維生素D會過分地抑制PTH的分泌，因此它能誘發動力缺乏性骨骼疾病，發展為比如骨骼代謝停止這樣的臨床症狀。對於這種情況，可以預見到給予本發明的多肽將導致血清中的1α，25-二羥維生素D降低，促進甲狀旁腺腺體的PTH分泌正常並從動力缺乏性骨骼疾病復原。
對於血管鈣化，有報導說1α，25-二羥維生素D是其中的一個鈣化促進因子。本發明的多肽可以用於治療或預防與血管鈣化有關的臨床症狀，比如老化引起的動脈硬化，糖尿病性血管病或者透析患者的心血管系統鈣化。
已知血清中的1α，25-二羥維生素D能促進腸道中的鈣吸收。可以用本發明的多肽通過降低血清1α，25-二羥維生素D水平來糾正低磷酸鹽血症。高鈣血症的病因包括原發性甲狀旁腺功能亢進導致的PTH過量，伴有慢性肉芽瘤的1α，25-二羥維生素D濃度過高，比如肉狀瘤病或肺結核，或者惡性腫瘤產生的PTHrP引起的骨骼再吸收加速。在高血鈣症中，這種病主要是由過量的1α，25-二羥維生素D以及過量的PTH或PTHrP引起的，可以預見到給予本發明的多肽可以使血清1α，25-二羥維生素D水平下降，從而緩解高血鈣症。特別是，在慢性肉芽瘤(比如肉狀瘤病或肺結核)中被激活的巨噬細胞有1α-羥化酶活性，並過量產生1α，25-二羥維生素D3。預計本發明的多肽可以直接降低該1α-羥化酶活性。
已知1α，25-二羥維生素D能促進破骨細胞的分化，預計給予本發明的多肽可以抑制骨骼重吸收。在體外，已知1α，25-二羥維生素D是一個強的破骨細胞分化誘導因子。破骨細胞的過分骨骼重吸收會導致以骨質疏鬆為代表的骨質減少。在這類可以觀察到骨骼重吸收提高現象的疾病中，預計本發明的多肽能通過暫時降低血清1α，25-二羥維生素D水平使骨骼流通恢復正常狀況。除了抑制破骨細胞在體外的分化，在使用維生素D受體缺陷型小鼠的一個骨骼移植實驗中，1α，25-二羥維生素D還被認為是抑制體內骨骼形成的因子。從這些觀點來看，可以預見到本發明的多肽，由於它能降低1α，25-二羥維生素D，能有效地抗骨質減少的代謝性骨骼疾病。此外，有一篇報導證實給予維生素D3的代謝物之一24，25-二羥維生素D能導致骨質增加。24，25-二羥維生素D是25-羥基維生素D經24-羥化酶羥化得到的產物。因為本發明的多肽有顯著增強24-羥化酶基因表達的作用，可以預見到給予該多肽能導致在比如骨質疏鬆或者骨骼發育不良等骨骼疾病臨床狀態下，血液24，25-二羥維生素D水平上升，提高骨質。
已知PTH有強的骨骼重吸收促進作用。但是，通過間歇給予PTH可以刺激骨骼轉換，最後能達到增加骨質的效果。發明所述多肽表現出的生理或生物活性包括調節1α，25-二羥維生素D的效果；調節血清鈣和血清磷酸鹽水平的效果；和調節鈣化的效果。因此，可以想見用該多肽有效地作用於骨組織可以調節骨轉換。所以，預計所述多肽能有效地抗骨轉換增強的絕經後骨質疏鬆以及骨轉換下降的老年性骨質疏鬆。可能有其他本發明的多肽參與的疾病。可以通過以ELISA為代表的免疫化學檢測方法結合使用1個或多個抗本發明所述多肽的抗體來篩選這類疾病。
相應地，可以設置本發明的多肽的生理正常範圍，確認所述蛋白質的水平偏離了該範圍的疾病。可以預見到本發明的多肽能用於治療經以上方法測量，該多肽顯示異常低的血液水平的疾病。
(2)含有發明所述抗體的藥物組合物本發明的抗體可以作為藥物組合物用於抗維生素D佝僂病和腫瘤誘導性骨軟化症。通過上面提及的製備抗體的方法可以得到多克隆或單克隆形式的所述多肽的中和抗體。用抗體作為藥物的更合適的方法，可以製備人型抗體或人源化抗體。通過抑制本發明所述多肽的過度活性可以治療或改善腫瘤誘導性骨軟化症的低磷酸鹽血症和骨軟化症。預期給予抗本發明所述多肽的中和抗體可以改善腫瘤誘導性骨軟化症候。此外，因為XLH的低磷酸鹽血症誘發因子和鈣化抑制因子被認為等同於本發明的多肽，所述中和抗體也可以作為抗維生素D性佝僂病包括XLH的治療劑。
本發明的抗體可以作為藥物組合物用於鈣或磷酸鹽代謝異常的疾病，或者與存在過量的發明所述多肽有關的代謝性骨疾病。如上所述，在慢性腎衰竭或血液透析患者中，維持鈣代謝或磷酸鹽代謝穩態的機制發生異常，這些異常可能是由於過量產生或積累了本發明所述多肽。已知本發明多肽調節骨代謝。因此可以預見也存在由於本發明多肽的過量存在導致的代謝性骨疾病。在這種情況下，可以預見到能用抗本發明所述多肽的抗體治療或改善這些臨床症狀。
可以應用本發明所述抗體的疾病的例子包括至少一種骨骼疾病，比如骨質疏鬆，抗維生素D佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關的骨骼疾病，高血鈣骨病，佩吉特病和腫瘤誘導性骨軟化症。此處，所述骨骼疾病可以是單獨一種病，或者併發症，或者與上述疾病以外的病並發的骨骼疾病。
(3)給藥方案以本發明的多肽或其抗體為活性成分的藥物組合物可以含有醫藥上可接受的載體和添加劑。這類載體和添加劑的例子包括水，醫藥上可接受的有機溶劑，膠原，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧基乙烯聚合物，藻酸鈉，水溶性葡聚糖，羧甲基鈉澱粉，果膠，黃原膠，阿拉伯樹膠，酪蛋白，白明膠，瓊脂，甘油，丙二醇，聚乙二醇，凡士林，石蠟，十八烷醇，硬脂酸，人血清白蛋白，甘露糖醇，山梨醇，乳糖和可作為醫藥上可接受的添加劑的表面活性劑。根據本發明採用的劑量形式，此處使用的添加劑選自以上單獨一種物質或其組合。
當本發明的多肽或抗體用作骨骼疾病的預防或治療劑時，所述多肽或抗體的使用對象沒有特定限制。
本發明的多肽可以用作調節生物組織中的鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或維生素D代謝的藥物組合物。
本發明的抗體如上所述可以特別用於治療或預防至少一種骨骼疾病，比如骨質疏鬆，抗維生素D性佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨疾病，伴有低血鈣的骨病，佩吉特病，腫瘤誘導性骨軟化症。本發明的多肽或抗體可以應用的骨骼疾病，可以是一種疾病，其併發症，或者與這些疾病之外的病並發的骨疾病。
含有本發明所述多肽或抗體的預防劑或治療劑，對於多肽可以口服或腸胃外給藥，對於抗體可以腸胃外給藥。
當口服本發明的多肽時，採用的劑量形式可以是固體製劑，比如片劑，顆粒，粉末或藥丸，或者液體製劑，比如液體藥或糖漿等。特別是，顆粒和粉末可以製成單位劑量形式，即膠囊。對於液體製劑，可以配製成重新溶解使用的乾產品。
在這些劑量形式中，用於口服的固體製劑通常在其組合物添加劑中含有經常在醫藥上採用的，比如粘合劑，賦形劑，潤滑劑，崩解劑或潤溼劑。此外，口服的液體製劑通常在其組合物添加劑中含有經常在醫藥上採用的，比如穩定劑，緩衝液，矯味劑，防腐劑，調味劑或著色劑。
當腸胃外給予本發明的多肽或抗體時，可以將其配製成針劑，栓劑等。
對於注射劑，通常以單位劑量安瓿一或多次劑量的容器提供，或者可以作成粉末形式，使用時重新溶解於合適的載體，比如不含熱原物質的滅菌水。這些劑型通常在其組合物添加劑中含有經常在醫藥上採用的，比如乳化劑或懸浮劑。注射程序的例子包括靜脈滴注，靜脈注射，肌內注射，腹膜注射，皮下注射或皮內注射。此外，劑量差異取決於使用對象的年齡，給藥途徑和用藥頻率，可以變化很大。
這種情況下，有效的給藥量是有效量的本發明所述多肽或抗體和合適的稀釋劑以及醫藥上使用的載體的結合，對於多肽，為0.01到100μg，優選0.5到20μg/次/kg體重。此外，對於抗體，有效劑量是0.1μg到2mg，優選1到500μg/次/kg體重。
6.疾病診斷劑(1)本發明所述抗體或多肽本發明的抗體可以用於對血液或尿中存在的本發明所述多肽或者代謝物進行檢測或定量，從而可以闡明本發明的多肽與臨床症狀之間的關係，所述抗體可以作為相關疾病的診斷劑。
術語「相關疾病」意味著骨骼疾病或者發展出至少一種下列異常的疾病異常鈣代謝，異常磷酸鹽代謝，異常鈣化和異常維生素D代謝。這類疾病的例子包括骨質疏鬆，抗維生素D性佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨骼疾病，伴有低血鈣的骨病，佩吉特病，腎衰竭，腎性磷酸鹽滲漏，腎小管性酸中毒和範科尼症候群。
利用抗體對結合分子進行定量的方法是常規的，比如放射免疫法或酶免疫法。通過這些方法測定的血液或尿中的本發明所述多肽的水平可以指導新的臨床診斷。例如，當佝僂病患者顯示出其血液中本發明所述多肽的水平比正常對象高，很可能有XLH或ADHR。此外，根據本發明所述多肽的血液水平的變化，可以對慢性腎衰竭患者作出發展為繼發性甲狀旁腺功能亢進的預後。
對於腫瘤誘導性骨軟化症，通常很難發現腫瘤。但是，使用本發明的抗體能建立有用的診斷措施。例如，當一個沒有佝僂病或骨軟化症家族史的患者，其發明所述多肽在血液中含量顯示出比正常個體顯著高時，可以懷疑患有腫瘤誘導性骨軟化症。
(2)本發明的DNA本發明中，在一個磷酸鹽代謝異常或鈣代謝異常，或者有代謝性骨骼疾病的患者中檢測本發明的異常DNA可以用於診斷和預防疾病。
在Genbank核苷酸序列資料庫中檢索本發明的DNA的核苷酸序列表明，該核苷酸序列(三個片段)與人12p13 BAC RPCI11-388F6(保藏號AC008012)序列吻合。這種分段情況說明本發明的DNA的核苷酸序列是染色體序列的剪切產物。這樣很明顯編碼本發明的多肽的DNA包含SEQ ID NO11所示序列中至少核苷酸498到12966之間的序列或其部分片段。在這個範圍內的核苷酸的取代，插入或缺失將導致本發明所述多肽的生物和生理活性的增強，下降或消失。本發明的多肽對磷酸鹽代謝，鈣代謝，骨骼代謝以及維生素D代謝有很強的影響。所以，當SEQ ID NO11所示核苷酸序列或其部分區域(例如核苷酸498到12966之間的序列)中的部分核苷酸由於取代，插入，缺失等顯示出基因多態性或突變，就有可能對伴有異常磷酸鹽代謝和鈣代謝的疾病，或發展成異常骨骼代謝的疾病，或者發展成異常維生素D代謝的疾病進行診斷和預防。
目前基於對患有ADHR的家族進行連鎖分析的結果有報導，引起ADHR的基因位於12p13(Econs，M.J.等，J.Clin.Invest.1002653-2657，1997)。在這篇報導中，還顯示所述基因位於微衛星標記D12S100和D12S397之間18釐米的範圍。我們通過與該報導位置進行比較確定了本發明的DNA所在的位置。編碼本發明所述多肽的DNA的區域與引起ADHR的基因所在的區域相同。根據本發明所述多肽的生物活性和該基因在染色體上的位置，可以想見本發明的多肽是引起ADHR的基因所編碼的。這一點可以通過從ADHR患者血液中分離細胞成分，從細胞成分分離染色體DNA，然後尋找SEQ ID NO11所示區域內核苷酸序列發生的突變得到證實。因此，可以將含有上述核苷酸序列區域的基因作為常染色體顯性血磷酸鹽過低性佝僂病，X-連鎖的血磷酸鹽過低性佝僂病，血磷酸鹽過低性骨骼疾病，骨質疏鬆等。
在編碼本發明所述多肽的DNA區域的外顯子1和2之間，存在一個STS序列，我們已在NCBI Genbank以保藏號G19259註冊。這個標記被認為在研究DNA和遺傳特徵間的關係中非常重要。
本發明將極大地改變對鈣代謝，磷酸鹽代謝，骨骼代謝和維生素D代謝的傳統理解。根據本發明，可以延遲到達慢性腎衰竭的血液透析階段，或者為磷酸鹽代謝相關的和鈣代謝相關的疾病，以及代謝性骨骼疾病提供了新治療和診斷方法。此外，本發明還可以用於改善或支持已有治療方法。
附圖簡述

圖1包括顯示經瓊脂糖電泳分析的擴增產物的照片。為了研究OST311的腫瘤特異性，用從腫瘤組織提取的第一鏈cDNA和從對照骨骼組織提取的第一鏈cDNA作為模板，用SEQ ID NO22和23所示的OST311特異引物和SEQ ID NO26和27所示的G3PDH特異引物進行PCR。
圖2的照片顯示對洗脫組分作Western印跡檢測到了重組OST311，所述組分是將重組OST311用鎳樹脂進行親合純化，然後用強陽離子交換樹脂SP-5PW分離和純化製備的。
圖3A顯示具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽的預期位點，這適合用於利用MacVector6.5.1版本的計算功能製備肽抗體。
圖3B顯示利用MacVector6.5.1版本的計算功能預測的具有SEQID NO2所示胺基酸序列的多肽的疏水度。
圖4顯示移植CHO-OST311H細胞31天後，在無腫瘤組(avr.-代表的線)和具有腫瘤組(avr.+代表的線)之間平均體重隨時間的改變。
圖5包括一些X光照片，它們顯示了對照CHO ras克隆1細胞移植的具有腫瘤的個體，CHO-OST190H細胞移植的具有腫瘤的個體，以及CHO-OST311H細胞移植的具有腫瘤的個體的全副骨骼軟X光相片。
圖6顯示人OST311多肽和小鼠OST311多肽的胺基酸序列比對結果。
圖7顯示無腫瘤組(n＝6)，CHO ras克隆-1腫瘤組(n＝10)，CHO-OST190H腫瘤組(n＝10)以及CHO-OST311H腫瘤組-1(n＝6)和CHO-OST311H腫瘤組-2(n＝6)的血清磷酸鹽水平，血清鈣水平和血清鹼性磷酸酶活性測量結果。血液在第44到46天，採自每個個體的心臟。
圖8包括的照片顯示了，Western印跡法測量的鈉-磷酸鹽協同轉運蛋白(NaPi-7)表達水平的比較。具體來說，近端小管表皮細胞的刷毛邊層膜是從CHO-OST311H腫瘤個體和無腫瘤個體切除的腎臟製備的，然後通過Western印跡法比較NaPi-7的表達水平。
圖9A包括的照片顯示，通過Northern印跡法檢測的腎臟鈉-磷酸鹽協同轉運蛋白(NaPi-IIb)的mRNA水平的變化。腎臟採自腫瘤移植後第44到46天處死的小鼠。
圖9B包括的照片顯示，通過Northern印跡法檢測的小鼠小腸中的鈉-磷酸鹽協同轉運蛋白(NaPi-IIb)的mRNA水平變化。小腸採自腫瘤移植後第44到46天處死的小鼠。
圖9C包括的照片顯示，通過Northern印跡法檢測的小鼠腎臟維生素D代謝酶(1αOHase，240Hase)的mRNA水平的變化。腎臟採自腫瘤移植後第44到46天處死的小鼠。
圖10顯示的X光相片展示了採自腫瘤移植後第44到46天處死的小鼠的腿節。
圖11A包括的圖表顯示了移植PBS，CHO ras克隆-1細胞和CHO-OST311H細胞的裸鼠(6周齡，BALB/c，雄性)在移植後第2天，血清磷酸鹽水平和血清鈣水平的比較。
每個數值以均值±標準差表示。
圖11B包括的圖表顯示了移植PBS，CHO ras克隆-1細胞和CHO-OST311H細胞的裸鼠(6周齡，BALB/c，雄性)在移植後第6天，血清磷酸鹽水平和血清鈣水平的比較。
每個數值以均值±標準差表示。
圖12包括的照片顯示了純化CHO-OST311H細胞培養上清並利用抗His6抗體和抗OST311肽抗體(311-114)對洗脫組分進行Western印跡所得到的結果。左欄顯示檢測到31126-179，中間是31125-179，右側是311180-251。標有*(在膠相片的上半部分)的組分用於在正常小鼠上進行單劑量檢測。
圖13包括的照片顯示經Villanueva-Goldner染色的未脫礦質切片。所述未脫礦質部分是取自CHO-OST311H細胞移植的小鼠和無腫瘤小鼠的脛骨的近端幹骺端。
圖14包括的照片顯示從CHO-OST311H細胞移植的小鼠和對照小鼠切除的腎臟中維生素D代謝酶基因產物的Northern印跡結果。
圖15A顯示實驗1的時間表，在該實驗中將產生CHO的重組OST311H全長蛋白給予正常小鼠。圖15B包括的圖表顯示每次採血時血清磷酸鹽水平，圖15C包括的圖表顯示在同一時刻血清鈣水平。
圖16A顯示實驗2的時間表，在該實驗中將產生CHO的重組OST311H全長蛋白給予正常小鼠。圖16B包括的圖表顯示每次採血時的血清磷酸鹽水平，圖16C包括的圖表顯示在同一時刻的血清鈣水平。
圖17的照片顯示對產生突變重組OST311RQH的CHO-OST311RQH細胞和OST311RQH/pEAK rapid細胞的培養液上清做Western印跡時，在培養液上清中檢測到的重組蛋白質。
圖18A顯示將突變重組OST311RQH給予正常小鼠的實驗的時間表。圖18B包括的圖表顯示每次採血時的血清磷酸鹽水平，圖18C包括的圖表顯示在同一時刻的血清鈣水平。
圖19A顯示在CHO-OST311RQH細胞移植實驗中移植後第2天的血清磷酸鹽水平。圖19B顯示同一實驗中血清鈣水平。
圖20包括的照片顯示利用抗OST311部分肽的兔抗血清經Western印跡在CHO-OST311H細胞的無血清培養液上清中檢測到的重組OST311H。
圖21A的表顯示利用6種抗OST311肽多克隆抗體進行夾心ELISA時，每種結合情況中檢測到重組OST311水平。
圖21B的圖表描繪了純化重組OST311H的濃度與其對應的測量值之間的關係，所述數值是利用ELISA系統結合使用311-48抗體或311-180抗體作為固定抗體，311-148抗體作為檢測抗體獲得的。
圖22A顯示了將重組OST311蛋白或載體給予小鼠後1，3和8小時經Western印跡分析的腎臟NaPi-7的表達量。圖22B顯示了遵循類似處理過程，利用腎臟總RNA經Northern印跡分析的腎臟NaPi-7的表達量。
圖23顯示了將重組OST311蛋白或載體給予小鼠後1，3和8小時血清1，25-二羥維生素D3水平的變化。
圖24顯示了將重組OST311蛋白或載體給予小鼠後1，3和8小時，利用腎臟總RNA經Northern印跡分析的25-羥基維生素D-1-α-羥化酶(1αOHase)或25-羥基維生素D-24-羥化酶(24OHase)基因的表達。
圖25顯示將CHO-ras克隆-1細胞移植組中細胞移植3天後血清磷酸鹽平均水平認為是100％時，每組的血清磷酸鹽平均水平。
圖26顯示質粒OST311/pET28編碼的重組His-OST311的核苷酸序列和胺基酸序列，以及質粒pET22-MK-OST311編碼的重組MK-OST311的DNA序列和胺基酸序列。
圖27顯示利用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，日本)對重組重摺疊His-OST311進行HPLC純化時的洗脫樣式。
圖28顯示利用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，日本)對重組重摺疊MK-OST311進行HPLC純化時的洗脫樣式。
圖29顯示利用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，日本)對PEG化的重組MK-OST311進行HPLC純化時的洗脫樣式。
圖30包括的圖表顯示給予一次(A)大腸桿菌產生的His-OST311重組體或(B)PEG化的MK-OST311重組體後8或9小時的血清磷酸鹽水平。
圖31顯示給予一次大腸桿菌產生的His-OST311重組體後1和4個小時，經Northern印跡法對腎臟中維生素D代謝酶基因表達的變化進行分析的結果。
圖32顯示給予一次大腸桿菌產生的His-OST311重組體後1，4和9個小時，血清1，25-二羥維生素D3水平的變化。
圖33顯示在OST311的胺基酸174和180引入突變，然後在pEAK細胞中表達該基因從而使突變OST311重組體分泌到細胞上清時，Western印跡所檢測到的突變OST311重組體。
實施發明的最佳方式通過以下實施例更詳細地描述本發明。這些實施例不是用於限制發明範圍。
實施例1人腫瘤誘導性骨軟化症衍生的腫瘤cDNA文庫的構建將液氮冷凍的腫瘤組織在5ml ISOGEN(NIPPON GENE，Japan)溶劑中勻漿，然後按照所附的製造商使用說明製備到大約0.13mg總RNA。使用SMART cDNA文庫製備試劑盒(CLONTECH，USA)根據所附的製造商使用說明由1.5ul總RNA合成cDNA。以下該cDNA稱為cDNA#2。將該cDNA#2連接上EcoRI接頭，然後插入預先用限制酶EcoRI消化的？ZAPII噬菌體載體(STRATAGENE，USA)。用Gigapack III Gold噬菌體包裝試劑盒(STRATAGENE，USA)根據所附的製造商使用說明構建腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤噬菌體文庫。所得文庫包含總共大約600,000獨立克隆。更進一步，用上述噬菌體文庫感染大腸桿菌菌株XLI-Blue MRF』，然後倒到20個平板(15cm)上。將這些平板在37℃培養10小時以形成噬菌斑。將全部噬菌斑吸取到SM緩衝液中，從而構建腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA噬菌體文庫。
實施例2腫瘤cDNA正篩選方案概要腫瘤誘導性骨軟化症可以通過手術切除腫瘤得到治癒這一事實說明可能在腫瘤中有致病基因高度和特異地表達。此外，有報導說到目前為止腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤經常由中胚層，特別是間葉細胞構成。因此，有必要鑑定這樣一群基因，它們在正常中胚層衍生組織中表達低，只在腫瘤組織中特異和高度地表達。所以，如下所述，應用cDNA減法技術進行了正篩選。從分離自作為對照的骨骼組織cDNA中扣除腫瘤組織衍生cDNA，從而使在骨骼組織中不表達，而僅在腫瘤組織中特異和高度表達的基因得到富集。用扣除cDNA組作為探針與腫瘤cDNA噬菌體文庫進行雜交，從而獲得在腫瘤中特異表達的基因片段。
(1)對照人骨骼組織cDNA的構建將液氮冷凍的人骨骼組織在5ml ISOGEN(NIPPON GENE，Japan)溶劑中勻漿，然後按照所附的製造商使用說明製備到大約0.011mg總RNA。使用SMART cDNA文庫製備試劑盒(CLONTECH，USA)根據所附的製造商使用說明由3ul總RNA合成cDNA。以下該cDNA稱為cDNA#4。
(2)腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA和對照骨骼組織cDNA的扣除為了富集在實施例1所述cDNA高度表達的基因，使用PCR-SelectcDNA扣除試劑盒(CLONTECH，USA)根據所附的製造商使用說明將cDNA#2和實施例2(1)中描述的cDNA#4進行雜交，從而從cDNA#2中扣除包含在cDNA#4中的基因片段。然後根據所附的製造商使用說明經PCR擴增扣除的cDNA#2，這樣就得到了扣除cDNA組(A)。
另一方面，由於扣除試劑盒的特點是雜交過程只進行兩次，這比一般的技術少，所以很難通過該試劑盒完全扣除大量存在於兩種材料中的基因。相應地，當腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤cDNA文庫與作為探針的扣除cDNA組(A)進行雜交時，不能被完全扣除的基因也被認為是陽性克隆。所以，用同樣的方法從實施例2(1)描述的cDNA#4中扣除cDNA#2，然後通過PCR擴增扣除的cDNA#4，這樣製備扣除cDNA組(B)作為對照探針。腫瘤cDNA文庫與扣除cDNA組(B)和前面描述過的扣除cDNA組(A)分別進行雜交，比較兩個信號就能分離腫瘤誘導性骨軟化症中特異包含的基因。
(3)腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤cDNA文庫的示差雜交用實施例1中描述的腫瘤誘導性骨軟化症的腫瘤cDNA噬菌體文庫感染大腸桿菌菌株XLI-Blue後，將被感染的大腸桿菌重新接種以形成每平板(15cm)3000個噬菌斑，然後於37℃培養8小時。然後將每個平板上的噬菌斑轉移到兩張Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech，USA)尼龍膜上。根據所附的製造商使用說明對轉移了噬菌斑的尼龍膜進行DNA固定化處理，然後分別用實施例2(2)中描述的扣除cDNA(A)和cDNA(B)作為探針進行篩選。
用Alphos Direct系統(Amersham Pharmacia Biotech，USA)根據製造商使用說明進行探針標記，雜交和信號檢測。實施例2(2)中描述的扣除cDNA(A)和cDNA(B)各100ng作為探針，然後根據實驗方案用螢光素標記所述探針。將探針分別加入50ml Alphos Direct系統所提供的雜交液，同時，根據實驗方案將兩組各8張轉移有噬菌斑的尼龍膜進行雜交和洗滌。洗滌後，讓尼龍膜進行發光反應，對ECL膠片(Amersham Pharmacia Biotech，USA)曝光2小時，用一臺自動處理器(FUJI FILM，Japan)顯影，然後分析結果。
結果，從視覺上選擇當cDNA(A)作為探針時，曝光後嚴重烤焦，而以cDNA(B)為探針時沒有烤焦的那部分中的獨立噬菌斑，從平板上刮下來，然後懸浮在0.5ml SM緩衝液中。將懸浮液在4℃放置2小時或以上，提取噬菌體。
(4)陽性克隆的核苷酸序列分析用0.5ul實施例2(3)中獲得的含有陽性克隆的噬菌體溶液作為模板，噬菌體載體內部序列的T7引物(TAATACGACTCACTATAGGG)(SEQID NO24)和T3引物(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)(SEQ ID NO25)，以及LA-taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)，進行35輪PCR，每個循環包括96℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。將PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。利用PCR擴增片段作為模板，用ABI377 DNA測序儀(PE Applied systems，USA)對只看到一條清晰條帶的克隆進行測序。
當看到兩條條帶時，用QIAquick Gel Extraction試劑盒(QIAGEN，Germany)分別從相應條帶的膠中提取PCR產物，然後經ABI377 DNA測序儀測序。
對341000個腫瘤誘導性骨軟化症噬菌體文庫的噬菌斑進行示差雜交的結果，鑑定到456個陽性噬菌斑，確定了所有這些噬菌斑的核苷酸序列。
實施例3縮小人低磷酸鹽血症誘導因子候選基因的範圍用實施例2中獲得的456個陽性克隆的序列信息對Genbank中(NCBI提供的核苷酸序列資料庫)註冊的核苷酸序列進行了同源性檢索。結果，得到了表1所示的一組基因，它們是出現頻率高的已有基因。此外，資料庫檢索的結果，有100個克隆是不清楚其生物活性的未知基因片段。對於這些未知基因片段的核苷酸序列信息，進一步將克隆間的重疊抽象為頻率信息。在它們中，得到了最常重疊的基因，包括7個順序形成一個毗連序列群的克隆的OST311序列。此處獲得的核苷酸序列從SEQ ID NO1的核苷酸1522到2770。當在已有資料庫中檢索OST311的一個基因片段時，沒有將它註冊為cDNA或EST，而只是對應一個基因組序列。所述相關基因組序列是AC008012，已有報導說它位於染色體的12p13。但是，在所得序列中沒有發現編碼蛋白質的區域(ORF)，所以預計該序列對應3』-非翻譯區域。因此，對腫瘤誘導性骨軟化症cDNA文庫進行了全長cDNA的克隆。此外。利用DNASIS-Mac3.7版本的ORF預測功能預測了ORF。
表1

實施例4全長OST311的克隆根據實施例3中獲得的OST311序列，合成了以下引物。然後，利用腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA文庫作為模板，做35輪PCR，每個循環包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。
311-U65TTCTGTCTCGCTGTCTCCC(SEQ ID NO12)311-L344CCCCTTCCCAGTCACATTT(SEQ ID NO13)將PCR產物做2％瓊脂糖凝膠電泳，證實擴增了預期大小的PCR產物，然後用MicroSpin柱子S-300HR(Amersham PharmaciaBiotech，USA)純化PCR產物。用Alphos Direct系統(AmershamPharmacia Biotech，USA)根據所附的廠商說明將所得PCR產物進行螢光標記。然後，用這些標記的產物作為探針對腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA文庫的20000個克隆進行噬菌斑雜交。
用T7和T3將獲得的40個陽性克隆以實施例2(4)中描述的方式經PCR擴增。根據所得PCR產物的核苷酸序列，合成引物311-L296(SEQID NO14，GGGGCATCTAACATAAATGC)。利用311-U65(SEQ ID NO12)和311-L344(SEQ ID NO13)探針擴增得到PCR產物，以其為探針再次對腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA文庫的20000個克隆進行噬菌斑雜交。對62個陽性克隆，確定利用T7和311-L296(SEQ ID NO14)引物擴增得到的PCR產物的核苷酸序列。將確定的序列與已經確定的核苷酸序列連接。因此得到SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。很顯然OST311的ORF啟始於位於SEQ ID NO1核苷酸133處的一個啟始密碼子。此外，合成了以下引物以便最終確定ORF的序列。
311-F1AGCCACTCAGAGCAGGGCAC(SEQ ID NO15，核苷酸112到131)311-F2GGTGGCGGCCGTCTAGAACTA(SEQ ID NO16，載體序列)311-F3TCAGTCTGGGCCGGGCGAAGA(SEQ ID NO17，核苷酸539到559)311-L1CACGTTCAAGGGGTCCCGCT(SEQ ID NO18，核苷酸689到708)311-L3TCTGAAATCCATGCAGAGGT(SEQ ID NO19，核苷酸410到429)311-L5GGGAGGCATTGGGATAGGCTC(SEQ ID NO20，核苷酸200到220)311-L6CTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO21，核苷酸868到888)利用311-F2(SEQ ID NO16)和311-L6(SEQ ID NO21)引物，腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA文庫為模板，以及Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)，進行35輪PCR，每個循環包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。
將PCR產物做2％瓊脂糖凝膠電泳時，證實是一個大約980核苷酸鹼基對的片段。然後利用上述引物(SEQ ID NO15到21)確定擴增片段的核苷酸序列。這樣確定到的編碼SEQ ID NO2所示多肽的ORF區域(SEQ ID NO1)位於SEQ ID NO1的核苷酸133處的啟始密碼子ATG和核苷酸886處的終止密碼子TAG之間。
實施例5 OST311抗腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤的特異性為了研究OST311的腫瘤特異性，用從腫瘤組織和對照骨骼組織中提取的第一鏈cDNA作為模板，以下所示OST311特異引物(SEQ ID NO22和23)進行了35輪PCR。每輪PCR包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。此外，向每份反應液中加入DMSO至終濃度為2％，酶使用LA-taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)。其次，作為一個內標，利用G3PDH的特異引物(FWACCACAGTCCATGCCATCAC(SEQ ID NO26)，RVTCCACCACCCTGTTGCTGTA(SEQ ID NO27))在類似條件下進行PCR。
311F1EcoRICCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(SEQ ID NO22)311LHisNotATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO23)如圖1所示，將這些PCR產物做2％瓊脂糖凝膠電泳。使用OST311引物時，僅在腫瘤組織作為模板的情況下觀察到預期大小的PCR產物。相反，當使用G3PDH引物時，在腫瘤組織和對照骨骼組織中均觀察到相同水平的預期大小PCR產物。從這些結果可以證實OST311在腫瘤組織中特異性表達。
實施例6分離穩定表達OST311的CHO細胞(1)OST311表達載體的構建用實施例5中所示的311F1EcoRI(SEQ ID NO22)和311LHisNot(SEQ ID NO23)引物，腫瘤誘導性骨軟化症腫瘤cDNA文庫作為模板，進行35輪PCR，每個循環(過程)包括96℃30秒，55℃30秒，72℃30秒。此外，向每份反應液中加入DMSO至終濃度為2％，酶使用LA-taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZ0，Japan)。311F1EcoRI引物退火到位於Kozak序列上遊的SEQ ID NO1的核苷酸111，311LHisNot引物退火到SEQ ID NO1的核苷酸871。編碼SEQ ID NO2所示全長多肽的區域可以利用這兩個引物經PCR擴增。此外，311LHisNot引物包含這樣一個核苷酸序列，它在SEQ ID NO2的胺基酸251後面添加了6個組氨酸殘基，並在最後一個組氨酸密碼子後加了一個終止密碼子。因此，翻譯後的重組蛋白質在C末端有一個His6標記，這可用於抗體識別重組體，以及利用鎳樹脂來純化重組體。
用限制酶EcoRI和NotI消化後，將所述PCR產物連接到經EcoRI和NotI類似地消化過的質粒載體pcDNA3.1Zeo(INVITROGEN，USA)上用於在動物細胞中進行表達。這樣得到的重組載體被導入大腸桿菌菌株DH5α。在3ml含有100mg/ml氨苄青黴素的LB培養基中培養大腸桿菌，然後用GFX質粒純化試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech，USA)純化質粒。通過常規方法確定插入基因的序列。這樣，證實了該序列與SEQ ID NO1中的等同部分是一樣的，緊接終止密碼子之前加上了編碼His6標記序列的一段核苷酸序列。
(2)穩定表達OST311的CHO細胞的分離用限制酶FspI消化大約20ug插入了實施例6(1)中製備的OST311ORF部分的質粒，以使切割在載體內的氨苄抗性基因的位點。然後將切割好的載體進行乙醇沉澱，然後溶於10ul超純水。隨後，用GenePulserII(BioRad，USA)通過電穿孔將全部體積的溶液導入宿主細胞。CHO Ras克隆-1細胞(Shirahata，S.，Biosci.Biotech.Biochem，59(2)345-347，1995)作為宿主細胞。將CHO Ras克隆-1細胞於5％CO2和100％溼度下，培養在含有補充了10％FCS的MEMα培養基的一個75cm2培養瓶中直至細胞生長覆蓋接近90％的培養面積。然後通過胰蛋白酶處理使附著的細胞脫離，得到大約1×107細胞。將所得細胞重懸於0.8mlPBS中，與經FspI消化的質粒混合，然後在冰上冷卻10分鐘。含有質粒的細胞被轉移到4毫米寬的玻璃管中。施加設置值(0.25kV和975uF)的電脈衝之後，再將玻璃管冷卻10分鐘。將轉移了基因的細胞在含有10％FCS的MEMα培養基中培養24小時。然後，向培養基中加入Zeosin(INVITROGEN，USA)至終濃度0.5mg/ml，然後再培養1周。隨後，對於顯示藥物抗性的克隆細胞，通過有限稀釋法將這些細胞以0.2細胞/孔重新接種在96孔培養板中，然後在有終濃度為0.3mg/ml的zeosin的條件下培養大約3周，這樣獲得了35個藥物抗性菌株的克隆。
(3)穩定表達OST311的CHO細胞產生重組體的證明對35個顯示藥物抗性的克隆，通過Western即跡法證實了條件培養基中存在重組體OST311。
用ultra-free MC M.W.5000截留膜系統(MILLIPORE，USA)將收集到的0.2ml條件培養基濃縮至大約40到50ul。向濃縮液中加入10ul含有1M Tris-ClpH6.8，5％SDS，50％甘油和100mM DTT的樣品緩衝液，然後於95℃加熱5分鐘。然後通過梯度為10到20％的聚丙烯醯胺電泳分離條件培養液中的蛋白質。之後，用一個半乾印跡系統(OwlSeparation Systems，USA)將凝膠中的蛋白質轉移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。該PVDF膜與在TTBS緩衝液(Sigma，USA)中1/5000稀釋的抗His(C-末端)抗體(INVITROGEN，USA)一起在室溫下保溫1小時。然後，用ECL系統(Amersham PharmaciaBiotech，USA)將膜曝光5分鐘，並用自動處理儀(FUJIFILM，Japan)顯影。結果分離到克隆#20，其最強的信號在大約32kDa和10kDa。此後，#20細胞命名為CHO-OST311H，並保藏在國立先進工業科技研究所，國際專利生物保藏處(Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki 1-1-1)(保藏號FERM BP-7273)。
實施例7 CHO-OST311H的磷酸鹽攝取抑制活性的測量條件培養基將CHO-OST311H於37℃在5％CO2和100％溼度下，培養在含有補充了10％FCS的MEMα培養基的一個225cm2培養瓶中直至細胞生長覆蓋接近80％的瓶面積。然後，用30ml無血清培養基CHO-S-SFM II(LIFETECHNOLOGY，USA)替換培養基。48小時後，收集該條件培養基。將所述條件培養基於1200g離心5分鐘以便除去懸浮的細胞等，然後用Minisart-plus 0.22um濾膜(Sartorius，Germany)過濾。
利用該條件培養基，檢測了它對人腎臟近端小管細胞系(CL-8細胞)磷酸鹽攝取活性的影響。所述人腎臟近端小管細胞繫於37℃在5％CO2和100％溼度下，培養在含有10％FCS(LIFE TECHNOLOGY)的DMEM培養基中。為了測量磷酸鹽攝取活性，先將所述人腎臟近端小管細胞系培養在含有10％FCS的DMEM培養基48孔培養板(CORNING，USA)中。當開始培養3天後細胞生長至覆蓋了培養板的整個底部表面，用200ul無血清培養基CHO-S-SFM II(LIFE TECHNOLOGY，USA)替換培養基，隨後繼續培養20到24小時。用處於這個狀態的細胞進行以下實驗來測量磷酸鹽攝取活性(實驗1和2)。
(1)實驗1除去CHO-S-SFM II培養基，然後向每孔中加入200ul在CHO-S-SFM II中製備的上述CHO-OST311H細胞的條件培養基。作為對照孔，3個含有沒有替換CHO-S-SFM II的培養基的孔，以及以及3個孔，其含有的培養基分別補充了200ul以製備CHO-OST311H類似的方式製備的CHO-OST190H細胞的條件培養基。上述CHO-OST190H細胞是通過與製備CHO-OST311H細胞類似的方式，即將OST190H導入CHOras克隆-1使OST190H得以表達。與OST311H類似，表達的CHO-OST190H含有一個加在多肽C-末端的His6標記序列，這與Rowe，P.S.N等(Genomics6754-68，2000)報導的名為MEPE的多肽相同。加入每個樣品後，在CO2培養箱中再培養26小時，通過以下測量磷酸鹽攝取活性的方法測定每個孔中細胞的磷酸鹽攝取活性。
(2)試驗2從200μl正在培養的CHO-S-SFMII培養基中吸出100μl培養液。對這些培養物，向3個孔中分別加入100μlCHO ras克隆-1細胞的條件培養基，另外3個孔中分別加入100μlCHO-OST311H細胞的條件培養基。然後，在CO2培養箱中培養24小時。隨後，通過以下測量磷酸鹽轉運活性的方法測定每個孔中細胞的磷酸鹽攝取活性。
磷酸鹽攝取活性的測量方法加入條件培養基並進行培養後，用不含磷酸的緩衝液(150mMNaCl，1mM CaCl2，1.8mM MgSO4，10mM HEPES，pH7.4)將細胞洗下來，然後在同樣的溶液中於室溫下保溫10分鐘。吸去溶液，然後加入一種分析溶液，該溶液是通過向緩衝液中加入放射性KH2PO4(NEN)至濃度為0.105mM製備的。該溶液在室溫下培養10分鐘。培養後，吸去分析液立即用已經冷凍的終止液(150mM CaCl2，1.8mM MgSO4，10mM HEPES，pH7.4)將細胞洗3次。吸去該洗滌液，向細胞中加入80μl 0.2N NaOH，然後於室溫下培養10分鐘，從而使細胞裂解。為了測定細胞裂解液中的放射性，將所述溶液轉移到ReadyCap(Beckman)中，於50℃乾燥，然後放在玻璃管中。然後，用閃爍計數器(Wallac1410，Pharmacia)測定放射性。每項試驗中的磷酸鹽攝取活性示於表2，其中未補充條件培養基的對照的平均攝取活性視為100％。CHO-OST311H細胞的條件培養基明顯地抑制了人腎臟近端曲小管表皮細胞的磷酸鹽攝取活性。
表2 OST311抗腎管表皮細胞磷酸鹽攝取的活性試驗1樣品 磷酸鹽攝取活性±SEM t-檢驗未補充 100±1.9 -CHO-OST190H 103.8±0.9不顯著CHO-OST311H 87.4±0.2 P＜0.01
試驗2磷酸鹽攝取活性±SEM t-檢驗 條件的CHO的培養基 100±1.5-CHO-OST311H 87.2±1.2 p＜0.01實施例8從CHO-OST311H條件培養基中部分純化重組體OST311通過以下方法從按照實施例7描述的方式製備的條件培養基中部分純化重組體OST。過程1)和4)在層析室中於4℃進行。
1)用ProBond鎳樹脂填充一個可降解的聚丙烯柱子(INVITROGEN，USA)，使其床體積達到3ml，然後洗滌並用30ml緩衝液1(表3)平衡。
2)將120ml以實施例7中描述的方式製備的條件培養基通過自由下降上樣到上述鎳樹脂柱子中，使重組體OST311結合。
3)用30ml表3所示的緩衝液2來除去非特異性吸附的蛋白質。
4)將3ml表3所示的緩衝液3分4次加入，從而使重組體OST311洗脫。這4個流分各取20ul直接以實施例6(3)中描述的方式進行Western印跡。這樣，用抗His抗體嘗試檢測OST311。
結果，在第二個流分中觀察到強烈的大約32kDa和10kDa信號。
5)將上述第二個流分上樣到NAP25和NAP10柱子(AmershamPharmacia Biotech，USA)中，用表3所示緩衝液4替換溶劑。
6)利用高效液體層析(Hitachi，Japan)將已經用緩衝液4替換溶劑的重組體OST311以1ml/分鐘的流速上樣到SP-5PW(強陽離子交換樹脂，TOSOH，Japan)中。以1％/分鐘的梯度加入表3所示緩衝液5進行洗脫，這樣從每個流分中採集2ml。如圖2所示，以實施例8(5)描述的方式對每個洗脫流分進行Western印跡，以便嘗試檢測OST311。大約10kDa信號隨280mM左右的NaCl洗脫，大約32kDa信號隨400mM左右的NaCl洗脫.對相應流分進行SDS聚丙稀醯胺凝膠電泳，然後用銀染試劑盒(Daiichi Chemicals，Japan)染色。含有約10kDa和32kDa信號的流分的純度為70％或以上。
表3

Na/Pi磷酸鈉緩衝液實施例9部分純化的重組體OST311的N末端胺基酸序列分析將通過實施例8所述方法獲得的部分純化流分中被抗His抗體識別的大約10kDa和32kDa信號進行SDS聚丙稀醯胺凝膠電泳。隨後，用一個半乾印跡系統(Owl Separation System，USA)將凝膠中的蛋白質轉移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。該PVDF膜用CBB染色，將大約10kDa和32kDa的條帶剪下，然後用蛋白質測序儀492型(PE Applied Systems，USA)確定N末端胺基酸序列。
結果，很顯然約35kDa條帶的N末端胺基酸序列是從SEQ ID NO2的第25個殘基Tyr開始的OST311序列。根據這個結果，證實了從SEQ ID NO2的第一個殘基Met到第24號殘基Ala這段序列作為分泌信號序列被切除了。另一方面，約10kDa條帶的N末端胺基酸序列是從SEQ ID NO2的第180個殘基Ser開始的OST311序列。緊挨殘基180Ser之前存在一個含有RRXXR的基元表明重組體OST311被某些CHO細胞產生的蛋白酶所切割。
如上所述，CHO-OST311細胞產生的重組體OST311在分泌後至少以3種多肽存在從殘基25 Tyr到251 Ile的多肽(SEQ ID NO4)，從殘基25 Tyr到179 Arg的多肽(SEQ ID NO6)，以及從序列SEQIDNo2的殘基180 Ser到251 Ile的多肽(SEQ ID NO8)。
實施例10抗OST311部分肽多克隆抗體的製備利用MacVector6.5.1版本的計算功能預測SEQ ID NO2多肽的疏水性，從而推測出適用於製備肽抗體的抗原位點(圖3A和B)。此處，合適的位點是根據這樣一個觀點預測的，即疏水性強的位點不容易發生糖鏈修飾和磷酸化。因此，被選擇和合成作為抗原的是311-48(SEQ ID NO28)，它是通過在合成階段給一個從序列SEQ ID No2的殘基48Arg開始的包括20個胺基酸的肽的C末端人工添加一個半胱氨酸殘基製備的，以及類似地通過在始自殘基114 Arg的包括20個胺基酸的肽添加半胱氨酸殘基製備的311-114(SEQ ID NO29)。具體來說，在合成階段給兩個肽的C末端人工添加半胱氨酸殘基，這樣產物可以與載體蛋白(牛甲狀腺球蛋白)耦合。耦合載體蛋白以及兔子的免疫委託給IBL，CO.，Ltd.(1091-1，Fujioka-shi，Gunma，Japan)(委託號1515)。
311-48RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC(SEQ ID NO28)311-114RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC(SEQ ID NO29)實施例11將CHO-OST311H細胞移植到裸鼠中的實驗為了檢驗OST311是否是腫瘤誘導性骨軟化症的致病因子，將CHO-OST311H細胞移植到6周齡BALB/c裸鼠(雄性)體內誘發腫瘤，從而建立一個從腫瘤中持續分泌重組體OST311的鼠腫瘤誘導性骨軟化症模型。作為試驗對照，將CHO ras克隆-1細胞和實施例7描述的CHO-OST190H類似地用於移植試驗。
(1)CHO細胞的移植經胰蛋白酶處理將CHO-OST311H細胞從培養瓶上打散，以1×108細胞/ml懸浮於PBS。將懸浮液各0.1ml皮下注射到裸鼠的兩個latera(2×107細胞/鼠)。此外，作為對照組，以同樣方式皮下注射相同數量的CHO ras克隆-1細胞。注射後大約1個月，將5隻裸鼠關在一個塑料籠中，允許接觸固體食物CE-2(CLEAJAPAN，Japan)和自來水，隨意。移植兩周後，在75％的對照組和66.7％OST311組中觀察到腫瘤發生。
(2)體重變化的比較移植CHO-OST311H細胞後，比較無腫瘤組(圖表中avr.-所指示的線)和CHO-OST311H細胞腫瘤組(圖表中avr.+所指示的線)之間在31天內的平均體重變化。如圖4所示，CHO-OST311H細胞腫瘤組與無腫瘤組相比，顯示出體重增長被抑制，並且兩組間有顯著的區別(24.1±1.5g vs.26.7±1.0g，p＜0.001，第31天)。相反，在CHO ras克隆-1細胞腫瘤組和無腫瘤組之間，平均體重沒有看到類似的差異(27.0±1.8g vs.26.7±1.0g，無顯著差異，第31天)。
(3)血清磷酸鹽和鈣，以及尿磷酸鹽和鈣的測量細胞移植後第30和40天，將裸鼠在金屬籠中關24小時。收集尿後，在裸鼠被乙醚(diethylethel)麻醉的狀態下從其心臟或眼框採血。用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)從外周血製備血清。測量體積後，將尿液離心來收集上清。利用P-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)測量血清和尿液磷酸鹽水平，血清和尿液鈣水平用鈣-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)測量，血清和尿液肌氨酸酐水平用CRE-EN KAINOS(KAINOS，Japan)測量。
試驗1細胞移植後第34天，測量無腫瘤組，CHO ras克隆-1細胞腫瘤組，CHO-OST190H細胞腫瘤組，以及CHO-OST311H細胞腫瘤組的血清磷酸鹽水平。
試驗2細胞移植後第44到46天，測量無腫瘤組和CHO-OST311H細胞腫瘤組的血清和尿液磷酸鹽水平，鈣水平和肌氨酸酐水平。用磷酸鹽或鈣清除除以肌氨酸酐清除來確定磷酸鹽和鈣的腎臟部分排洩。
測量結果示於下表4。
表4細胞移植小鼠中的血清和尿液磷酸鹽和鈣實驗1組別小鼠數量血清磷酸鹽水平±SEM t-檢驗(mg/dl)無腫瘤小鼠 7 8.17±0.60-CHO ras克隆-1 4 8.50±0.38無顯著差異CHO-OST190H 4 9.49±0.52無顯著差異CHO-OST311H 9 4.39±0.23p＜0.001實驗2組別無腫瘤 CHO-OST311H t-檢驗小鼠數量4 6 -血清磷酸鹽水平 8.29±0.59 4.25±0.15p＜0.001±SEM(mg/dl)磷酸鹽的腎部分排洩 0.23±0.02 0.44±0.06p＜0.05血清Ca水平±SEM 6.72±0.27 4.61±0.19p＜0.001(mg/dl)鈣的腎部分排洩 0.0040±0.0006 0.0059±0.0010 無顯著差異
(4)全副骨骼的軟X光照片移植CHO-OST311H細胞後，確認已形成腫瘤，並且與無腫瘤個體或者對照CHO ras克隆-1移植個體相比，在身體狀況和行走功能上表現出顯著異常的個體。因此，預計腫瘤個體發生骨骼異常。然後，從對照CHO ras克隆-1移植組，CHO-OST190H細胞移植組和CHO-OST311H細胞移植組中隨機挑選確信已形成腫瘤的個體，然後使用放射線照相系統uFX-100(PUJI FILM，Japan)根據所附的廠商使用說明拍攝X光照片。拍攝X光照片的條件是X-射線管電壓25kV，電流0.1mA，曝光時間10秒。將所述個體對成像板曝光，然後用BAS2000(FUJI FILM，Japan)進行圖像分析。
結果如圖5所示，CHO-OST311H細胞移植個體的全副骨骼的軟X光照片亮度下降，因此驗證了礦化發生缺陷。此外，也驗證了骨骼畸形，比如肋骨籠的變形。
(5)血清磷酸鹽和鈣水平以及鹼性磷酸酶活性的測定細胞移植後第44和46天從心臟中採血，從中得到的血清保存於-20℃。將血清樣品一起融化，再次測量每份血清中的磷酸鹽和鈣水平，同時測定鹼性磷酸酶活性。利用P-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)測量磷酸鹽水平，鈣水平用鈣-test Wako(WakoPure Chemical Industries，Japan)測量，鹼性磷酸酶活性用鈣鹼性磷B-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)測定。將結果分為無腫瘤組(n＝6)，CHO腫瘤組(n＝10)，CHO-OST190H細胞腫瘤組(n＝10)以及CHO-OST311H腫瘤組(n＝6×2)。將CHO-OST311H組分為兩組一組在第44天處死(CHO-OST311H-1:n＝6)，一組在第46天處死(CHO-OST311-2:n＝6)。如圖7所示，在CHO-OST311H腫瘤組中可以看到顯著的變化，包括血清磷酸鹽水平下降(圖7A)，血清鈣水平下降(圖7B)，血清鹼性磷酸酶活性提高(圖7C)。
(6)鈉-磷酸鹽協同載體蛋白(NaPi-7)在腎臟近端小管的表達i)近端小管表皮細胞刷狀緣膜(以下稱為BBM)的製備從利用二乙醚麻醉的CHO-OST311H腫瘤個體和無腫瘤個體切除腎臟。將每個腎臟切成兩半得到冠狀切面(實驗16個CHO-OST311H腫瘤個體和4個無腫瘤個體。實驗26個CHO-OST311H腫瘤個體和2個無腫瘤個體)。使用從每個個體切除的腎臟的各一半，根據Kessler等(Biochem.Biophys.Acta.506，136-154)報導的方案製備BBM。
將腎臟在3ml勻漿緩衝液(50mM甘露醇，2mM Tris/HEPES pH7.5)用一個玻璃勻漿器，以1300rpm勻漿2分鐘從而獲得勻質的腎臟提取物。向提取物中加入CaCl2至終濃度為10mM後，將溶液在4℃攪拌15分鐘，然後於4℃，4900g離心15分鐘。用Kimwipe過濾所得上清，然後於4℃，16200g離心60分鐘，使含有大量BBM的部分沉澱。將沉澱重新懸浮於5ml懸浮緩衝液(50mM甘露醇，2mM Tris/HEPES pH7.5)中，然後再於4℃，16200g將該溶液離心60分鐘。該步驟重複兩次，然後將產物重新懸浮於0.1ml懸浮緩衝液中。通過標準方法測定這樣得到的溶液的蛋白質濃度為3到4mg/ml。
ii)BBM蛋白質的Western印跡如上所述，將得自每隻小鼠的BBM蛋白質分別用懸浮緩衝液稀釋到10ug/ul。然後向稀釋過的溶液中加入2.5ul含有1M Tris-Cl，pH6.8，5％SDS，50％甘油和100mM DTT的樣品緩衝液。將該溶液在95℃加熱5分鐘後，經梯度為10到20％的聚丙烯醯胺電泳分離BBM溶液中的蛋白質。隨後，用半乾印跡系統(Owl SeparationSystems，USA)將凝膠中的蛋白質轉移到Immobilon PVDF膜(MILLIPORE，USA)上。將PVDF膜與1/2000稀釋在TTBS緩衝液(Sigma，USA)中的抗NaPi-7多克隆抗體於室溫保溫3小時。所述抗體是用與小鼠NaPi-7C-末端位點對應的合成肽通過KIRIN BREWERYCO.，LTD，Pharmaceutical Research Laboratories，PharmaceuticalDivision的標準方法免疫兔子得到的多克隆抗體。與該抗體反應後，將所述反應產物繼續與結合了辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔IgG二抗(DAKO，Denmark)保溫，然後用ECL系統(Amersham PharmaciaBiotech，USA)檢測條帶。
在還原性狀態下，所述抗體檢測到大約80kDa和35kDa的條帶以及170kDa到200kDa的高分子成片條帶(圖8)。這些條帶圖案與Tatsumi等(J.Biol.Chem273，28568-28575，1998)報導的相同，並且這些條帶被證實隨著小鼠或兔從食物中攝取磷酸鹽的量而統一變化。由這些事實，證明所述條帶是衍生自NaPi-7的多肽。如圖8所示，對於所有上述片段(標有箭頭的條帶)，得自CHO-OST311H腫瘤個體的BBM蛋白質中含有的NaPi-7信號比得自無腫瘤個體的顯著減少。這些結果在分別進行的實驗1和2可以重複。另一方面，將這些BBM蛋白質經梯度為10到20％的聚丙烯醯胺電泳分離，然後用CBB染色。每個個體的BBM蛋白質同等地染色，說明Western印跡中的信號下降是NaPi-7所特有的(圖8)。根據這一事實，推斷OST311蛋白作用在腎臟近端小管細胞，在蛋白質水平上下調NaPi-7的表達，從而誘發低磷酸鹽血症。
(7)腎臟和小腸中磷酸鹽載體蛋白和維生素D代謝酶的mRNA變化分析i)總RNA的製備從細胞移植後第44到46天處死的小鼠中切除小腸和腎臟。迅速將腎臟在乾冰中冷凍。冰凍的腎臟在-80℃的低溫冷庫中冷藏待用。將一個冷凍腎臟在5ml ISOGEN(Nippon Gene，Japan)中勻漿，然後根據所附的廠商說明製備總RNA。取15ug總RNA根據標準方法經1％瓊脂糖含有甲醛的變性膠電泳，然後通過毛細轉移法過夜轉移到Hybond-N+(Amersham Pharmacia，USA)上。用UV照射轉移了RNA的膜，利用Stratakinker(STRATAGENE，USA)固定轉移的RNA，用2xSSC洗滌，風乾，然後室溫保存待用。用生理鹽水清洗小腸以除去內容物，然後翻過來。隨後，用一種製劑刮來採集小腸表皮，然後用液氮快速冷凍。將凍好的小腸表皮在-80℃超低溫冷庫冷藏待用。冷凍的小腸表皮在5mlISOGEN(Nippon Gene，Japan)中勻漿，然後按照所附的廠商說明製備總RNA。取20ug總RNA根據標準方法經1％瓊脂糖含有甲醛的變性膠電泳，然後通過毛細轉移法過夜轉移到Hybond-N+(AmershamPharmacia，USA)上。用UV照射轉移了RNA的膜，利用Stratalinker(STRATAGENE，USA)固定轉移的RNA，用2xSSC洗滌，風乾，然後室溫保存待用。
ii)製備探針的模板DNA取5ug從小鼠(小鼠1)中製備的總RNA在20ul反應溶液(50mMTris(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，25g/ml(dT)18，2.5mMdNTP，200單位MMLV逆轉錄酶(TOYOBO，Japan))中，於37℃ 1小時合成cDNA，然後將反應溶液在70℃保溫15分鐘滅活酶。將合成的cDNA稀釋5倍，用於以下反應。
下列引物由在GenBank(NCBI，USA)註冊過的序列合成，然後用於PCR反應用於獲得小鼠GAPDH cDNA的合成引物mGAPDHFW TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC(SEQ ID NO30)mGAPDHRV CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC(SEQ ID NO31)用於獲得小鼠Npt-1 cDNA的合成引物mNPt1FW GTAAAGAACCCTGTGTATTCC(SEQ ID NO32)mNpt1RV CTGCCTTAAGAAATCCATAAT(SEQ ID NO33)用於獲得小鼠NaPi-7 cDNA的合成引物mNaPi7FW GAGGAATCACAGTCTCATTC(SEQ ID NO34)mNaPi7RV CTTGGGGAGGTGCCCGGGAC(SEQ ID NO35)用於獲得小鼠NaPi-2b cDNA的合成引物mNaPi2bFW TCCCTCTTAGAAGACAATACA(SEQ ID NO36)mNaPi2bRV GTGTTTAAAGGCAGTATTACA(SEQ ID NO37)用於獲得小鼠維生素D1α羥化酶cDNA的合成引物m1 a OHaseFW CAGACAGAGACATCCGTGTAG(SEQ ID NO38)m1 a OHaseRV CCACATGGTCCAGGTTCAGTC(SEQ ID NO39)用於獲得小鼠維生素D24羥化酶cDNA的合成引物m24OHaseFW GACGGTGAGACTCGGAACGT(SEQ ID NO40)m24OhaseRV TCCGGAAAATCTGGCCATAC(SEQ ID NO41)按照TakaLa LA-Taq(TAKARA SHUZO，Japan)所附的廠商說明製備反應溶液。將1μl cDNA和上述引物各10pmol加入50ml反應溶液。將該溶液在94℃保持1分鐘，然後進行40輪擴增，每個保溫循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。然後經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的條帶，用Gene Clean II(Bio101，USA)回收靶片段。就GAPDH而言，利用以上獲得的片段作為模板和Megaprimer Labeling試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，USA)製備32P標記的探針，然後用於以下雜交。對於其他基因，將得到的PCR片段連接到pGEM-T載體(Promega，USA)，然後導入大腸桿菌DH5α。向PCR反應液中加入T7(SEQ ID NO42)和SP6引物(SEQ ID NO43)各10pmol，然後同樣加入轉化的大腸桿菌。將所述溶液在94℃保持10分鐘後，進行40輪擴增，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。反應液經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的條帶，用Gene Clean樣的方法得到膠版印刷用塗布紙。
以上的結果示於表1表1

實施例7向由微粒白土[IMERYS公司制的DB-GRAZE]26份、一級白土(IMERYS公司制的DB-PRIME)26份、二級白土(J.M.HUBER公司制的HS-H)26份、微粒重質碳酸鈣(FIMATEC公司制的FMT-90)22份構成的顏料中添加作為分散劑的聚丙烯酸鈉相對於顏料0.2份，在Cellier混合機中分散，調整成固形成分濃度為70％的顏料漿。向所得顏料漿中添加苯乙烯-丁二烯膠乳(玻璃化轉變溫度20℃)16份、PVA(KURARAY公司制的PVA117)0.5份、再加水得到固形成分濃度為60％的塗布液。在坪量62g/m2的中等紙上為使每面的塗布量以固形成分計成為12.0g/m2，用1200m/min塗布速度的傳遞輥塗布機做兩面塗布。乾燥使紙的水含量成為5.5％。使傳遞輥塗布機的塗布輥∶內輥∶外輥的周速比固定在100∶70∶70，各輥之間的壓力也保持恆定，藉助變更塗布液濃度來調整塗布量。
接著，在輥溫度130℃、線壓200kg/cm、供紙速度400m/min條件下以2夾區做軟質夾輥壓光處理，得到膠版印刷用塗布紙。
實施例8實施例7中，除把每面的塗布量改為以固形成分計14g/m2做兩面塗對照組和OST311組的血清1，25-二羥維生素D水平分別為28.0pg/ml和23.9pg/ml。如上所述，即使觀察到低磷酸鹽血症和低鈣血症的情況下，1，25-二羥維生素D水平也沒有提高。這個結果清楚地表明維生素D代謝受到的影響是由於OST311的作用。
(9)腿節的軟X光照片無腫瘤小鼠以及CHO ras克隆-1，CHO-OST190H或者CHO-OST311H-移植小鼠在移植後第44天到46天處死，採集腿節，然後將腿節在4％中性福馬林中固定3天。接下來，去除骨骼周圍的軟組織。從每組中隨機挑選兩個，然後使用放射線照相系統uFX-100(FUJIFILM，Japan)在以下條件下照射X光X-射線管電壓25kV，電流0.1mA，曝光時間5秒，然後對成像板曝光。結果示於圖10。在CHO-OST311H組中觀察到皮質骨的骨柱(bone trabecula of the corticalbone)減少。
實施例12 OST311核苷酸序列同源性和基因組區域的分析使用SEQ ID NO2所示胺基酸序列以及SEQ ID NO1所示核苷酸序列的至少一部分序列，可以從多個物種中檢索到與OST311對應的分子。用SEQ ID NO1的部分核苷酸序列檢索了小鼠的基因組序列資料庫，這樣在小鼠第6染色體的序列中發現了一個與OST311有極高同源性的序列，其在Genbank的保藏號為AC015538。由該序列得到的小鼠OST311的部分多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO10所示，與部分cDNA序列對應的核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。圖6顯示了人OST311多肽和小鼠OST311多肽之間的胺基酸同源性比較結果。正如實施例11所顯示的，顯然含有人胺基酸序列的OST311多肽在小鼠中具有明顯的生物活性。這些結果表明該活性很容易得以保留，即使圖6所示的胺基酸序列中同源性低的區域中的那些胺基酸被取代，缺失或插入。
我們比較了SEQ ID NO1所示核苷酸序列和人12p13 BACRPCI11-388F6(保藏號AC008012)，後者是利用資料庫發現它有一個區域與SEQ ID NO1的一部分相吻合，這樣就確定出編碼OST311的區域的序列。與OST311基因相鄰的核苷酸序列示於SEQ ID NO11。TATAA盒位於SEQ ID NO11的核苷酸498到502。與cDNA序列(SEQ ID NO1)匹配的第一序列從SEQ ID NO11的核苷酸1713開始並延續到核苷酸2057。與SEQ ID NO1所示核苷酸序列匹配的下一個部分從SEQID NO11的核苷酸8732到8833。該部分被認為是外顯子2。與SEQ IDNO1所示核苷酸序列匹配的最後一個部分始於SEQ ID NO11的核苷酸10644，結束於核苷酸12966。SEQ ID NO11中核苷酸498到12966這部分序列可以認為至少是編碼OST311的基因的一部分。此外，顯然在Genbank中以G19259註冊的STS序列位於外顯子1和2之間。OST311位於12p13區域。根據Econs，M.J.等(J.Clin.Invest.1002653-2657，1997)，從連鎖分析的結果可以推斷導致常染色體抗維生素D佝僂病(ADHR)的基因位於D12S100和D12S397之間的18cM區域，即12p13的微衛星標記(特別是D12S314和D12S397之間的一個約10cM的區域)。我們評估了OST311的物理位置和上述第12染色體的微衛星標記。結果，D12S100和D12S314在一個4602到6129kb的區域內，OST311在一個8958到9129kb的區域內，而D12S397在16280到16537kb的區域內。基於這些結果以及OST311的強磷酸鹽代謝調控活性，我們發現OST311就是導致ADHR的基因。
實施例13移植CHO-OST311H細胞到裸鼠體內的短期實驗將CHO-OST311H細胞皮下移植到裸鼠(6周齡，BALB/c，雄性)的背部。移植後第2和第6天，測量血清磷酸鹽和鈣水平，檢驗重組體OST311的短期效應。類似地使用CHO ras克隆-1細胞作為該移植實驗的對照。
(1)CHO細胞的移植以實施例11(1)描述的方法相類似的方式，給裸鼠(n＝6)各皮下移植2×107CHO-OST311H細胞和2×107CHO ras克隆-1細胞。此外，類似地皮下移植等量PBS(n＝6)。每組的6隻裸鼠被關在一個塑料籠子中，允許隨意接觸固體食物CE-2(CLEA JAPAN，Japan)和自來水。移植後的6天，沒有觀察到明顯的腫瘤形成。
(2)細胞移植後第2天血清磷酸鹽和鈣水平的測定細胞移植後的第2天，從被二乙醚麻醉的小鼠眼窩中採血。用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)從外周血中分離血清。利用P-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Japan)測量血清磷酸鹽水平，血清鈣水平用鈣-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)測量。如圖11A所示，與PBS給藥組和CHO ras克隆-1細胞移植組相比，在CHO-OST311H細胞移植組全部成員中都觀察到了血清磷酸鹽水平的明顯下降。相反，血清鈣水平沒有變化。這些結果清楚地表明OST311在給藥後第二天僅導致血清磷酸鹽水平的下降。
(3)細胞移植後第6天血清磷酸鹽和鈣水平的測定細胞移植後的第6天，從被二乙醚麻醉的小鼠心臟中採血。如上所述，測定每組的血清磷酸鹽和鈣水平。如圖11B所示，與移植後第2天類似，較之PBS給藥組和CHO ras克隆-1細胞移植組，在CHO-OST311H細胞移植組全部成員中都觀察到了血清磷酸鹽水平的明顯下降。相反，在CHO-OST311H細胞移植組中血清鈣水平只有輕微下降。
實施例14重組體OST311的純化使CHO-OST311H細胞在37℃，5％CO2和100％溼度下，生長在一個225cm2培養瓶中含有10％FCS的MEMα培養基中。當細胞生長至覆蓋瓶子的大約80％區域，用50ml無血清培養基CHO-S-SFM II(LIFETECHNOLOGY，USA)替換培養基，48小時後，收集條件培養基。用這樣獲得的共1000ml條件培養基通過以下方法純化重組體OST311。
將1000ml條件培養基於4℃，16200g離心15分鐘以除去懸浮細胞，然後將上清上樣到裝在一個玻璃柱子(內徑30mm×200mm長)中的SP-sepharose FF(Amersham Pharmacia，USA)。將從柱子中流出的組分吸附到Talon Superflow(金屬螯合樹脂，CLONTECH，USA)上。用含有50mM磷酸鹽鈉緩衝液(pH6.6)和0.3M NaCl的洗滌緩衝液除去非特異性吸附，然後用50mM磷酸鹽鈉緩衝液(pH6.7)和0.2M咪唑進行洗脫。圖12右欄顯示利用抗His6抗體(INVITROGEN，USA)經Western印跡檢測到的洗脫流份。這些流份含有一個實施例9中描述的包括胺基酸殘基180(Ser)到251(Ile)的部分多肽(SEQ ID NO8)。另一方面，利用0到0.7M NaCl濃度梯度，上述條件培養基中含有的吸附在SP-sepharose FF上的蛋白被50mM磷酸鹽鈉緩衝液(pH6.7)洗脫。圖12左欄顯示利用抗His6抗體(INVITROGEN，USA)經Western印跡檢測到的洗脫流份。這些在大約0.3M NaCl被洗脫的流份含有一個實施例9中描述的包括胺基酸殘基25(Tyr)到251(Ile)的部分多肽(SEQ ID NO4)。此外，圖12中間一欄顯示利用實施例10中描述的由OST311部分肽(SEQ ID NO29)製備的多克隆抗體(311-114)經Western印跡檢測到的洗脫流份。這些流份在大約0.4M NaCl被洗脫，其含有一個實施例9中描述的包括胺基酸殘基25(Tyr)到179(Arg)的部分肽(SEQ ID NO6)。因此，含有三種OST311部分肽的流份，具體來說是SEQ ID NO4(以下記為31125-251)，SEQ IDNO6(以下記為31125-179)和SEQ ID NO8(以下記為311180-251)被純化和分離開，然後用超濾分子量為10000的VIVASPIN柱子(Sartorius，USA)進行濃縮，隨後用含有1ml 5mM HEPES(pH6.9)和0.1M NaCl的溶劑置換。
實施例15未去礦化骨骼切片的組織學分析處死實施例11中製備的CHO-OST311H細胞移植小鼠和無腫瘤小鼠時，切除其右腿節和脛骨，保持膝關節的連接完整。切下脛骨軸和腿節軸後，立即將腿節和脛骨保存在預先準備好的冰中性福馬林中。這樣就製備了未去礦化標本。製備去礦化標本的方法如下所述。
用Villanueva骨骼染料將骨骼組織預先染色3到7天。將組織通過一系列乙醇梯度脫水，然後用丙酮取代溶劑。加入丙酮單體和單體後(After acetone monomer and then monomer were applied)，將組織樣品包埋在樹脂中。甲基丙烯酸甲酯(MMA)樹脂用於包埋樣品。將組織樣品放在約35℃的培養箱中以便完全聚合。這時，通過適當加入MMA使組織徹底包埋在樹脂中。此處用於包埋樣品的MMA這樣製備的，在100ml MMA單體(Wako Pure Chemical Industries，Japan)中加入並完全溶解40g MMA聚合物(Wako Pure Chemical Industries，Japan)，然後以每份溶液1g的速率添加並溶解Benzoyl過氧化物(Nacalai Tesque，Japan)。製備脛骨的標本。為了能觀察脛骨的骨松質，修剪額切面，然後用硬組織所用的切片機(RM2065 super cut，Leica)製備4um厚的額切面。用Villanueva-Goldner進行後染色。用二甲苯將這樣得到的切片透明化，然後用CLEAR SEAL(MARUTO，Japan)和ONE LIGHT(MARUTO，Japan)封存。
所述切片的顯微圖像示於圖13。與對照組相比，在CHO-OST311H細胞移植腫瘤小鼠中觀察到生長板寬度增加。此外，在幹骺端觀察到顯著增加的前骨質和下降的礦化區域。沒有骨炎成纖維(ostitisfibrosa)的跡象，從CHO-OST311細胞移植的腫瘤小鼠採集的骨骼表現出典型的骨軟化症特徵。
實施例16移植CHO-OST311H細胞後早期對維生素D代謝的檢驗為了檢驗OST311對維生素D代謝的影響，以實施例13描述的方法類似的方式進行向裸鼠(6周齡，BALB/c，雄性)移植CHO-OST311H細胞的實驗。建立了兩個實驗對照組以便於比較，其包括一個類似地移植CHO ras克隆-1細胞的組，和一個給予與細胞懸浮液劑量相同的PBS的組。將每組的6隻小鼠關在塑料籠子裡，可隨意攝取自來水和包含1.03％無機磷酸鹽和1.18％鈣的固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。移植後第1，2，3和6天檢驗了血清1，25-羥基維生素D水平的波動和維生素D代謝酶表達的變化。
(1)血清1，25-二羥維生素D水平的測定細胞移植後第1，2，3和6天，從分別被二乙醚麻醉的PBS給藥組，CHO ras克隆-1細胞移植組和CHO-OST311H細胞移植組小鼠的心臟中採血，然後用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)分離血清。將採自每隻小鼠的相同體積的血清混合在一起，使每組總體積為0.25ml。用1，25(OH)2D RIA-試劑盒，「TFB」(TFB，Japan)測定其中的1，25-二羥維生素D水平。結果，如表6所示，與PBS給藥組和CHO ras克隆-1細胞移植組相比，在CHO-OST311H細胞移植組中移植後第1天就觀察到1，25-二羥維生素D水平顯著下降。移植後第2，3和6天也觀察到這一下降的效果。這些結果與血清1，25-二羥維生素D水平下降是一致的，這也正是腫瘤誘導性骨軟化症的典型臨床發現。
表6細胞移植小鼠中的血清1，25-二羥維生素D水平

(2)腎臟中維生素D代謝酶基因的表達分析為了研究上述1，25-二羥維生素D3下降的效果是否是25-羥基維生素D-1-α-羥化酶(1αOHase)基因或25-羥基維生素D-24-羥化酶(240Hase)基因的波動造成的，移植後第3天，從PBS給藥組，CHO-ras克隆-1細胞移植組和CHO-OST311H細胞移植組中各隨機挑選3或4隻小鼠。切除腎臟，根據實施例11(7)描述的步驟製備總RNA，然後用同一實施例中描述的探針進行Northern印跡。結果示於圖14。與PBS給藥組和CHO-ras克隆-1細胞移植組相比，CHO-OST311H細胞移植組中1αOHase基因的mRNA表達水平顯著減弱。這個結果暗示了OST311直接或間接抑制該基因表達，從而抑制血清1，25-二羥維生素D生物合成的可能性。另一方面，與PBS給藥組和CHO-ras克隆-1細胞移植組相比，CHO-OST311H細胞移植組中240Hase基因的mRNA表達水平顯著增加。該結果暗示了OST311直接或間接增強該基因表達，從而促進血清1，25-二羥維生素D失活的可能性。
在實施例11(8)中，與對照組相比，移植後第44天和46天沒有觀察到血清1，25-二羥維生素D水平有顯著差異。另一個結果與本實施例的不同之處在於1αOHase mRNA表達水平有增長的趨勢。至少一個可能的解釋是這一差異是由於實施例17中描述的血清甲狀旁腺激素的影響。
實施例17移植CHO-OST311H細胞後的早期對血清甲狀旁腺激素水平的檢驗實施例11，13和16中描述的在移植CHO細胞後的第1，2，3，6和45天，將採集的每份等體積小鼠血清混合到一起，使總體積為0.15ml。然後用Rat PTH IRMA試劑盒(Nihon Medi-Physics，Japan)根據所附的廠商說明測定血清甲狀旁腺激素水平。如表7所示，在CHO-OST311移植組中觀察到血清甲狀旁腺激素水平顯著上升，差異在移植後第45天很明顯。
表7細胞移植小鼠中的甲狀旁腺激素水平

1使用無腫瘤小鼠(n＝6)時的測量值。2n＝10，3n＝12.
實施例18給予正常小鼠CHO產生的重組體OST311H全長蛋白的實驗為了研究CHO產生的重組體OST311H全長蛋白對正常小鼠(BALB/c，雄性，6周齡)的影響，通過實施例14(1)描述的純化方法將C末端帶有一個組氨酸標記的多肽部分純化，所述多肽包括第25個胺基酸殘基，Tyr到殘基251Ile(SEQ ID NO4)。將純化的組分以每次0.1ml腹膜內給予正常小鼠。根據Western印跡得到的螢光強度，估計該純化組分含有大約0.15到0.75ug重組體OST311。與實施例14類似，將0.1ml溶劑(5mM HEPES緩衝液/0.1M NaCl，pH7.0)腹膜內給予對照組。OST311給藥組和對照組分別包括5隻小鼠。將每組的5隻小鼠關在塑料籠子內，允許隨意攝取自來水和含有1.03％無機磷酸鹽和1.18％鈣的固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
實驗概要示於圖15A。第一次腹膜內給藥後第5，10，23，28和33小時另外給藥。這樣，總共進行6次腹膜內給藥。隨後，第一次腹膜內給藥後第36，47和71小時用玻璃毛細管從眼窩採血，然後用Microtainer(Beckton Dickinson，USA)分離血清。
利用P-檢驗Wako或鈣-檢驗Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)根據所附的廠商說明確定這樣獲得的血清中的磷酸鹽和鈣水平。如圖15B所示，第一次給藥後第36小時在OST311給藥組觀察到血清磷酸鹽水平顯著下降的效果(t-檢驗**p＜0.001，*p＜0.01)。此外，這一效果在該時刻後維持了11個小時(第一次給藥後47小時)。另一方面，第一次給藥後71小時這樣的活性消失(最後一次給藥後38小時)。另外，任何時刻都沒有發現血清鈣水平有顯著變化(圖15C)。
實驗概要示於圖16A。第一次腹膜內給藥後第5和11小時另外給藥。這樣，總共進行3次腹膜內給藥。隨後，第一次腹膜內給藥後第13和24小時用玻璃毛細管從眼窩採血，然後用Microtainer(BecktonDickinson，USA)分離血清。利用P-檢驗Wako或鈣-檢驗Wako根據所附的廠商說明確定這樣獲得的血清中的磷酸鹽和鈣水平。如圖16B所示，第一次給藥後13小時在OST311給藥組觀察到血清磷酸鹽水平顯著下降的效果(t-檢驗**p＜0.05，*p＜0.01)。此外，這一效果在該時刻後維持了11個小時。另外，任何時刻都沒有發現血清鈣水平有顯著變化(圖16C)。
實驗1和2的結果揭示了將CHO產生的重組體OST311蛋白的全長組分腹膜內給予正常小鼠能誘發低磷酸鹽血症，在第一次給予後第13小時已經觀察到血清磷酸鹽水平下降，這一活性能在給藥停止後維持11個小時。
實施例19向OST311導入突變如實施例9顯示，CHO-OST311H細胞產生的部分重組體OST311在其分泌過程中被切割為一個具有第25位Tyr到第179位Arg胺基酸殘基之序列的多肽(SEQ ID NO6)，和一個具有第180位Ser到第251位Ile胺基酸殘基之序列的多肽(SEQ ID NO8)。
所述切割可能是由於一個能識別剛好位於第180位胺基酸殘基Ser之前，包含RXXR序列或RRXXR序列的基元的蛋白酶。將全長重組體給予活的有機體時，該重組體被認為有可能進行這種切割活類似的降解。因此，製備了基因OST311RQ以便導入突變，所述基因編碼以Gln取代第176位的Arg和第179位的Arg胺基酸殘基的序列。
(1)OST311/pCAGGS質粒的製備以OST311H/pcDNA3.1質粒為模板，311F1EcoRI(SEQ ID NO22)和311LNot(SEQ ID NO44)為引物，經LA Taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)進行PCR。將溫度維持在94℃1分鐘後，進行25輪反應，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘。反應完成後，用T4 DNA聚合酶(Roche，Swiss)將PCR產物降解為平末端，然後進行酚-氯仿處理使酶失活。用乙醇沉澱DNA，然後用多核苷酸激酶(Roche，Swiss)使DNA末端磷酸化。經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離靶DNA片段，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。用EcoRI消化質粒載體pCAGGS(Niwa H等，Gene1991 12月15；108(2))，然後用Klenow片段(Roche，Swiss)平端化。隨後用牛小腸鹼性磷酸酶(TAKARASHUZO，Japan)使DNA末端去磷酸化。經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離靶DNA片段，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。用DNA連接試劑盒(第2版)(TAKARA SHUZO，Japan)根據所附的廠商說明，將這樣得到的OST311cDNA連接到預先消化好的pCAGGS質粒上。將產物導入大腸桿菌DH5α進行克隆，這樣即得到相關的質粒。該質粒用於製備OST311RQH基因。
311LNotATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(SEQ IDNO44)(2)OST311RQH基因的製備合成以下引物。
OST311ME1ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(SEQ IDNO45)OST311HNtATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO46)OST311RQFATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(SEQ ID NO47)OST311RQRCTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(SEQ ID NO48)OST311ME1是含有OST311的打頭亮氨酸的部分的正向引物，OST311HNt是在OST311的3』端添加了6個組氨酸的反向引物，OST311RQF和OST311RQR是用於引入突變的正向和反向引物，分別以腺嘌呤替換在OST311 cDNA編碼區第527和536位的鳥嘌呤(對應SEQID NO1的第659和668位鳥嘌呤)，從而以穀氨醯胺取代胺基酸176和179的精氨酸。根據所附的廠商說明利用pfu DNA聚合酶(Promega，USA)製備兩種反應溶液各20ul。另一方面，終濃度0.2uM的OST311ME1和OST311RQR作為引物，10ng實施例6(1)中描述的OST311表達載體用做模板。將溫度維持94℃1分鐘後，進行25輪PCR反應，每循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。另外，終濃度0.2uM的OST311RQF和OST311HNt作為引物，10ng OST311/pCAGGS質粒作為模板。將溫度維持94℃1分鐘後，進行35輪PCR反應，每循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。將以上兩種反應產物分別稀釋10倍，然後各取1ul溶液加入50ul根據所附的廠商說明利用LA Taq聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)製備的反應液中。將溫度維持94℃1分鐘後，利用LA Taq聚合酶，以終濃度0.2uM的OST311ME1和OST311HNt作為引物進行25輪PCR反應，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。PCR反應完成後，將溶液在72℃維持7分鐘。對這樣得到的反應產物進行酚/氯仿處理，去蛋白，乙醇沉澱，然後用EcoRI和NotI消化。經2％瓊脂糖凝膠電泳分離一個大約800bp的DNA片段，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收。將得到的DNA片段插入載體IRES-EGFP-pEAK8的EcoRI和NotI位點，從而獲得OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8質粒，其中所述IRES-EGFP-pEAK8載體是通過給質粒pEAK8(EdgeBioSystems，USA)連接了一個內部核糖體進入位點(IRES)和增強的綠色螢光蛋白(EGFP)製備的。按照標準方法製備質粒DNA，然後用ABI3700螢光DNA測序儀(PE AppliedSystems，USA)確定核苷酸序列，這樣證實了該序列編碼一個導入了R176Q和R179Q突變的多肽，並且在C末端加上了組氨酸標記。由該基因編碼的多肽以下稱為OST311RQH。
(3)穩定表達OST311RQH的CHO細胞的分離用Transfectam(Promega，USA)根據所附的廠商說明將OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8質粒導入CHO-ras克隆-1細胞。在含有5ug/ml嘌呤黴素和10％FCS的MEMα培養基上挑選藥物抗性細胞。然後用FACS vantage(Beckton Dickinson，USA)淘選GFP(綠色螢光蛋白)螢光強度高的細胞，然後克隆。當克隆細胞長滿時，用無血清DF培養基(DMEM/F-12)替換培養基，然後在換培養基後2天收集條件培養基。用一個96孔的可變濾膜系統(Lifetechoriental，USA)將50ul收集到的條件培養基吸附到Immobilon P濾膜(Millipore，USA)上。用TBS和TTBS洗滌製備好的濾膜，然後用Blockace(DaiichiPharmaceutical，Japan)在室溫下封閉1小時。封閉後，使膜與經Blockace稀釋5000倍的HRP標記的抗His6單克隆抗體(Invitrogen，USA)反應1小時。反應後，用TTBS和TBS洗滌濾膜，然後用ECL(Amersham Pharmacia，USA)根據所附的廠商說明檢測信號。根據信號強度，挑選高表達克隆CHO-OST311RQH。
(4)OST311RQH pEAK快速細胞的條件培養基的製備將pEAK快速細胞(EdgeBioSystems，USA)接種在20瓶組織培養瓶(225cm2，CORNING，USA)中。根據pEAK系統(EdgeBioSystems，USA)所附的廠商說明經磷酸鈣法將0.48mg OST311RQH/IRES-GFP/pEAK8質粒轉染所述細胞。將細胞放置4小時。接下來，用50ml無血清MEMα培養基替換每個瓶中的培養基，將細胞於37℃培養2天，然後收集條件培養基。
(5)重組體OST311RQH表達的證實得自上述兩種CHO-OST311RQH細胞克隆和pEAK快速細胞短暫表達的條件培養基，各取10ul以實施例6(3)描述的方式進行Western印跡，從而檢驗培養上清中是否存在重組體OST311RQH。抗His(C-末端)抗體(Invitrogen，USA)用作檢測抗體。如圖17所示，在所有培養液上清中都觀察到與實施例6(3)描述的約32kDa條帶處於相同位置的一個強信號。並且，對於所有條件培養基，Western印跡沒有觀察到約10kDa的信號。從這些結果可以推斷，引入突變R176Q和R179Q導致預期在這些位置發生的多肽的切割被抑制或減弱，因此具有從胺基酸180 Ser到251 Ile之序列的多肽比率顯著下降。
實施例20正常小鼠的重組體OST311RQH給藥實驗根據實施例14(1)描述的方法，從500ml實施例19(5)中製備的培養液上清得到含有約2.8ug/ml重組體OST311RQH蛋白的純化組分。將所述純化組分以0.1ml/次連續地腹膜內給予正常小鼠(BALB/c，雄性，6周齡)，然後測量血清磷酸鹽，鈣和1，25-二羥維生素D水平。對於對照組，類似地分別腹膜內給予0.1ml載體(5mM HEPES緩衝液/0.1M NaCl pH＝7.0)。OST311RQH-給藥組和對照組各包括6隻小鼠。將每組的6隻小鼠關在一個塑料籠子中，允許隨意攝取自來水和含有1.03％無機磷酸鹽和1.18％鈣的固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
實驗方案如圖18A所示。第一次給藥後第5，10，24，29和34小時進行額外的給藥。因此，總共連續給藥6次。在上述過程中，第一次給藥後第24小時(第4次給藥前)，用玻璃毛細管從被二乙醚麻醉的小鼠的眼窩採血，第一次給藥後第48小時從心臟採血。
(1)血清磷酸鹽和鈣水平的測量第一次給藥後24和48小時採集血清，通過實施例14(3)描述的方法測量血清磷酸鹽水平。結果，在任何時間採血，OST311RQH給藥組均表現為顯著的低磷酸鹽血症，如圖18B所示(t-檢驗**p＜0.01，*p＜0.05)。相反，血清鈣水平沒有明顯波動(圖18C)。
(2)血清1，25-二羥維生素D水平的測量第一次給藥後48小時，將各組採自每隻小鼠的等體積血清混合在一起。然後，通過實施例16(1)描述的方法測量血清1，25-二羥維生素D水平。對照組顯示的結果為244.7pmol/L，而OST311RQH給藥組表現出明顯的下降，即24.6pmol/L。
實施例21 CHO-OST311RQH細胞移植實驗類似於實施例13描述的方法進行這樣一個實驗，其中將實施例19(3)描述的穩定表達OST311RQH的細胞移植給裸鼠(7周齡，BALB/c-nude，雄性，n＝8).類似地移植CHO ras克隆-1細胞作為對照組(n＝6)。將每組裸鼠關在一個塑料籠子中，允許隨意攝取自來水和含有1.03％無機磷酸鹽和1.18％鈣的固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
細胞移植後第2天，用玻璃毛細管從眼窩採血，然後通過實施例14(3)描述的類似方法測量血清磷酸鹽和鈣水平。如圖19A所示，在CHO-OST311RQH細胞移植組中觀察到血清磷酸鹽水平顯著下降(t檢驗*p＜0.001)，而血清鈣水平沒有明顯變化(圖19B)。
實施例22抗OST311部分肽多克隆抗體的製備(2)以實施例10描述的類似方式製備了4種部分OST311肽。用這些肽作為抗原免疫兔子，然後用得到的抗血清根據實施例6(3)描述的方法進行Western印跡，這樣在CHO-OST311H細胞的條件培養基中檢測到了重組體OST311H。抗體反應在溶液中於4℃攪拌過夜，所述溶液是將每種肽的抗血清用TTBS稀釋250倍製備的。洗滌後，向溶液中加入鹼性磷酸酶標記的羊抗兔抗體(DAKO，Denmark)進行結合，然後用鹼性磷酸酶染色試劑盒(BIO-RAD，USA)檢測重組體OST311(圖20)。
部分肽311-148GMNPPPYSQFLSRRNEC(SEQ ID NO49)311-170CNTPIPRRHTR(SEQ ID NO50)311-180SAEDDSERDPLNVLKC(SEQ ID NO51)311-210LPSAEDNSPMASDC(SEQ ID NO52)實施例23 檢測OST311蛋白的ELIST系統的構建(1)從抗OST311部分肽的兔抗血清中純化抗體將Econo-Pac可降解層析柱(BIO-RAD，USA)填充3ml蛋白Asepharose4FF(Amersham Pharmacia，USA)漿，然後用10ml 0.1M鹽酸甘氨酸緩衝液(pH3.3)和20ml PBS洗滌。加入實施例10描述的兩種兔抗血清和實施例22描述的4種兔抗血清各800-900ul，從而使抗體組分吸附到樹脂上。用9ml PBS洗柱子以便除去汙染物，然後各加入1ml0.1M鹽酸甘氨酸緩衝液(pH3.3)得到IgG洗脫流份。進行洗脫時，根據需要向每個流份中加入10ul中和緩衝液(1M Tris)來中和溶液。測量280nm處的光吸收以便確定洗脫流份中含有的抗體的濃度(光吸收吸收計算為1.34(mg/ml)-1.(cm)-1)。然後，將一些流份一起上樣到NAP25柱子，用50mM碳酸氫鈉溶液替換溶劑。結果從每份肽抗血清中得到5到15mg抗體(這些多克隆抗體以下分別稱為311-48抗體，311-114抗體，311-148抗體，311-170抗體，311-180抗體和311-210抗體)。
(2)抗OST311IgG的生物素化將上述6種抗OST311肽的多克隆抗體在50mM碳酸氫鈉溶液中稀釋至1mg/ml。然後將溶解在10ul二甲基甲醯胺中的每種抗體各1mg與Biotin-AC5-Osu溶液(1.82ug/ml)(Japan，Dojindo)通過於4℃倒置2小時混合均勻。隨後，用NAP10柱子除去混勻溶液中未反應的Biotin-AC5-Osu，並以PBS置換溶劑，從而得到6種生物素化的抗OST311肽的多克隆抗體。
(3)用抗OST肽的兔多克隆抗體經夾心ELISA法檢測表達OST311細胞的條件培養基中的OST311將用於固定的6種抗OST311肽多克隆抗體和上述6種用於檢測的生物素化抗體結合起來構建了一個夾心ELISA系統。這樣，檢查了對OST311表達細胞條件培養基中的OST311蛋白的檢測。
將上述通過純化蛋白A得到的用於固定的6種抗OST311肽多克隆抗體在50mM碳酸氫鈉溶液中稀釋至10ug/ml。各取50ul稀釋液加入96孔ELISA板Maxisorp(Nunc，USA)的每個孔中，然後於37℃放置1小時，以便固定IgG。接下來，吸去反應液，然後向每個孔中加入50ul溶於TBS的Superblock封閉緩衝液在室溫下封閉10分鐘。吸去溶液後，加入實施例19(5)描述的OST311RQH峰值快速培養上清或者作為對照的MEMα培養基，每孔50ul，然後在室溫下放置1小時使之與固定化抗體結合。抗體反應後，用TTBS將溶液洗3次，向每孔中加入各50ul在TTBS中稀釋至10ug/ml，含有10％Blockace(DainipponPharmaceutical，Japan)的上述6種生物素化抗OST311抗體(311-48，311-114，311-148，311-170，311-180和311-210)，然後在室溫放置30分鐘，進行第二抗體反應。用TTBS將每個孔洗3次，然後各加入50ul用TTBS稀釋10000倍含有10％Blockace的HRP標記的鏈黴親合素(DAKO，Denmark)，然後在室溫放置30分鐘使之與生物素化抗體結合。然後用TTBS將每個孔洗3次，每孔加入50μl四甲基對二氨基聯苯，加入過氧化物酶生色底物(DAKO，Denmark)，然後在室溫成色5分鐘。隨後每個孔中加入50μl 0.5M磺酸溶液終止反應。用適用於96孔板的光吸收測量系統MTP300(CORONA ELECTRIC，Japan)進行測量，用450nm處光吸收除以570nm處光吸收。當只加入MEMα作為對照時，每例中450nm/570nm得到的值均為0.22或以下。相反，如圖21A所示，固定化311-48抗體，用311-180抗體檢測結合使用時，或者固定化311-180抗體，用311-148抗體檢測結合時，可以檢測到條件培養基中的OST311RQH比對照組明顯高。並且，固定用311-48抗體，用311-148抗體檢測這樣的組合時，可以推斷不僅可以檢測全長多肽，也可以檢測N-末端部分多肽片段，因為兩種抗體的抗原位點都包含在實施例9描述的OST311蛋白切割位點後的N-末端部分肽(SEQ ID NO6)。相反，用311-210抗體固定，用311-80抗體檢測這樣的組合時，可以推斷不僅能檢測全長多肽，也能檢測實施例9描述的切割位點後的C末端部分肽(SEQ ID NO8)。因此，這些組合方式的多項用途使得能測量樣本，比如生物樣品中OST311全長多肽和部分多肽的絕對量以及比率。
(4)利用抗OST311肽的兔多克隆抗體經夾心ELISA法定量重組體OST311蛋白濃度在上述ELISA系統中，以311-48抗體或311-180抗體作為固定抗體，311-148作為檢測抗體這樣的組合來考察對純化重組體OST311的檢測，其中OST311包括了1，0.67，0.33，0.1，0.067，0.033和0.01μg/ml這樣一系列稀釋。如圖21B所示，在0.1到1μg/ml的範圍內可以得到很好的線性(311-48:R2＝0.990，311-180:R2＝0.996)。該結果揭示了至少可以檢測在這個濃度範圍內的重組體OST311。
實施例24一次給予重組體OST311蛋白的效果的者察為了檢驗CHO產生的重組體OST311H全長蛋白對正常小鼠(BALB/c，雄性，6周齡)的短期效應，將純化的重組體OST311H全長蛋白以每隻小鼠5.0ug/0.1ml經尾部靜脈給藥一次。對於對照組，經尾部靜脈每隻小鼠給予0.1ml載體(PBS)。給藥後1，3和8小時，從心臟中採血並進行解剖，測量血清磷酸鹽，鈣和維生素D水平，然後分析鈉-磷酸鹽協同載體蛋白在腎近端小管上的表達量。OST311給藥組和對照組分別包括6隻小鼠。將每組的6隻小鼠關起來，允許隨意攝取自來水和含有1.03％無機磷酸鹽和1.18％鈣的固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan)。
(1)血清磷酸鹽水平隨時間的變化如表8所示，一次給予OST311蛋白後1和3小時，沒有觀察到血清磷酸鹽水平的顯著變化，給藥後8小時，觀察到明顯下降。這個結果闡明了OST311的效果需要3到8小時來降低血清磷酸鹽水平。另一方面，任何時候都沒有觀察到血清鈣水平的變化。
表8血清磷酸鹽水平

(2)鈉-磷酸鹽協同載體蛋白在腎臟近端小管上的表達根據實施例11(6)描述的方法，將各組在給藥後1，3和8小時採集的腎臟混合在一起，然後製備近端小管的刷緣膜(BBM)。經Western印跡法分析得到的BBM中的鈉-磷酸鹽協同載體蛋白(NaPi7)的比率。如圖22A所示，給藥後1和3小時，NaPi7的表達量與載體給藥組相當，給藥後8小時，與載體給藥組相比，OST311給藥組中的NaPi7明顯下降。同時，為了驗證NaPi7蛋白的減少是否與RNA轉錄調控有關，根據實施例11(7)中描述的步驟，由每隻小鼠切除的腎臟中製備總RNA，並用同一實施例中描述的探針進行Western印跡。因此，如圖22B所示，給藥後1和3小時，NaPi7的mRNA水平與載體給藥組相當，但給藥後8小時，與載體給藥組相比，OST311給藥組中的NaPi7明顯下降。以上結果清楚地表明血清磷酸鹽水平的下降是由於重組體OST311蛋白直接或間接的影響，它下調腎小管上的鈉-磷酸鹽協同載體蛋白，對NaPi7在mRNA轉錄水平上的抑制至少是蛋白水平下調的一個因素。
(3)血清1，25-二羥維生素D3水平隨時間的變化通過實施例16(1)描述的方法測量給藥後1，3和8小時血清1，25-二羥維生素D3水平。如圖23所示，在OST311給藥組中，給藥後3小時即觀察到血清1，25-二羥維生素D3水平的顯著下降，給藥後8小時觀察到進一步下降。
(4)維生素D代謝酶基因的表達變化為了闡明血清1，25-二羥維生素D3水平的下降是否由於腎臟中25-羥基維生素D-1-α-羥化酶(1αOHase)或25-羥基維生素D-24-羥化酶(24OHase)基因表達的波動，根據實施例11(7)描述的步驟在給藥後1，3和8小時，從腎臟製備總RNA，然後用該實施例描述的探針進行Western印跡。如圖24所示，在給藥後1小時，即觀察到1αOHase基因的mRNA水平下降，24OHase基因的mRNA水平提高。給藥後8小時這一趨勢表現地更明顯。在圖24中，載體表示重組體OST311蛋白的溶劑，其包含20mM磷酸緩衝液(pH6.7)和0.3M NaCl。
這些結果顯示OST311通過調節25-羥基維生素D-1-α-羥化酶(1αOHase)或25-羥基維生素D-24-羥化酶(240Hase)基因在腎臟中的表達降低血清1，25-二羥維生素D3水平。
實施例25C-末端缺失的OST311的活性的檢驗(1)缺少C末端部分的OST311表達系統的構建合成以下引物。
OST311R693 ATGCGGCCGCTATCGACCGCCCCTGACCACCCC(SEQ ID NO53)OST311R633 ATGCGGCCGCTACGGGAGCTCCTGTGAACAGGA(SEQ ID NO54)OST311R618 ATGCGGCCGCTCAACAGGAGGCCGGGGCCGGGGT(SEQ ID NO55)OST311R603 ATGCGGCCGCTCACGGGGTCATCCGGGCCCGGGG(SEQ ID NO56)OST311R693，OST311R633，OST311R618和OST311R603是用於從OST311的3』端分別缺失20，40，45和50個胺基酸殘基，並引入一個終止密碼子和NotI識別序列的反向引物。將這些反向引物中的每一個與實施例19中描述的含有OST311起始亮氨酸以及EcoRI識別序列的正向引物OST311ME1(SEQ ID NO45)結合在一起，使終濃度為0.2uM。利用這些引物，Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)和100ng實施例19(2)描述的OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8質粒DNA作為模板，溫度維持94℃1分鐘後進行25輪PCR反應。每個循環包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘。將得到的反應產物進行酚/氯仿處理，去蛋白，然後乙醇沉澱。然後用EcoRI和NotI消化反應產物，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，以便分離各DNA片段並用Gene CleanII(BIO101，USA)回收。將得到的DNA片段連接到用EcoRI和NotI消化好的pEAK8載體(EdgeBioSystems，USA)，從而得到pPKOST311-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45，-ΔC50質粒。經標準方法製備質粒DNA，然後用ABI3700螢光DNA測序儀(PE Applied Biosystems，USA)確定核苷酸序列，從而證實已經按照需要從OST311RQH基因的3』端刪除了鹼基對。
(2)穩定表達重組體的CHO細胞的分離用Transfectam(Promega，USA)按照所附的廠商說明將pPKOST311-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45，-ΔC50質粒DNA分別導入CHO ras克隆-1細胞。得到在含有5ug/ml嘌呤黴素和10％FCS的MEMα培養基上顯示藥物抗性的CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50細胞。將這些細胞分別接種24孔培養板，然後在含有5ug/ml嘌呤黴素和10％FCS的MEMα培養基上培養至長滿。隨後，用無血清DF(DMEM/F-12)培養基替換培養基。3天後，收集條件培養基。將所述條件培養基用實施例22描述的OST311-特異性多克隆抗體311-148或311-180進行Western印跡，以便證實對應預計分子量的位置的相關蛋白質得到了表達。
(3)表達C末端缺失OST311的CHO細胞的移植試驗將表達上述缺失20，40，45和50個殘基的OST311的CHO細胞以實施例13所述方法類似的方式分別腹膜下移植給裸鼠(6周齡，BALB/c-nude，雄性，每組6隻)。作為對照組，分別腹膜下移植表達全長OST311RQH的CHO細胞和CHO ras克隆-1細胞(n＝6)。將每組小鼠關在塑料籠子裡，允許隨意攝取自來水和固體食物CE2(CLEAJAPAN，Japan)。
移植後第3天，從心臟採血，然後通過實施例20所述類似的方法測量血清磷酸鹽，鈣以及1，25-二羥維生素D3水平。如圖25所示，在所有CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50細胞移植組中，都觀察到血清磷酸鹽水平與移植了表達全長OST311RQH的細胞的組相當，都有顯著下降(t檢驗，**p＜0.001)。並且，在CHO-OST311RQ-ΔC20，-ΔC40，-ΔC45和-ΔC50細胞移植組中，還觀察到血清1，25-二羥維生素D3水平顯著下降(CHO ras克隆-1移植組的平均血清水平界定為100％時，全長3.1％，ΔC409.4％，ΔC4510.0％以及ΔC5068.1％)。這些結果清楚地顯示即使從OST311蛋白的C末端刪除50個胺基酸，仍保留了它的血清磷酸鹽-降低活性或血清1，25-二羥維生素D3水平降低活性。
實施例26 N末端缺失OST311的活性檢驗(1)缺少N末端9個胺基酸殘基的OST311表達系統的構建合成以下寡DNA。
OST311SGFWaattccaccATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCTTGTGCAGCGTCTGCAGCATGAGCGTCCTgcatGC(SEQ ID NO57)OST311SGRVaattGCatgcAGGACGCTCATGCTGCAGACGCTGCACAAGGCACAGACCCAGAGCCTGAGGCGGGCCCCCAACATggtgg(SEQ ID NO58)OST311SGFW是包括從OST311起始亮氨酸到SEQ ID NO2的第24個胺基酸Ala這些胺基酸殘基的寡DNA，它含有編碼信號肽的基因序列，在5』端有一個EcoRI識別序列。OST311SGRV是OST311SGFW的互補鏈，5』端含有EcoRI識別序列。此外，在OST311SGFW的3』方向和OST311SGRV的5』方向導入了限制酶SphI的識別位點。導入SphI識別位點使信號肽序列中的第23個胺基酸Arg被His所取代。按照標準方法將上述寡DNA退火，從而得到這樣一個雙鏈DNA片段，它的兩端均含有EcoRI識別序列，與信號肽第23個胺基酸殘基對應的位置有一個SphI識別序列，編碼從OST311起始亮氨酸開始的全長信號肽並含有一個修飾過的殘基。將得到的DNA片段插入pEAK8載體(EdgeBioSystems，USA)。然後選擇EF1啟動子和上述DNA片段均以正向存在於載體中的質粒DNA，從而得到質粒pPKFGSG。
接下來，合成以下引物。
OST311dN9ATATGCATGCCTCCAGCTGGGGTGGCCTGATCCAC(SEQ ID NO59).
OST311dN9是一個設計成這樣的正向引物，其5』端含有SphI識別位點，SEQ ID NO2的第24個胺基酸殘基Ala後面是從SEQ ID NO2的第34個胺基酸殘基Ser開始的胺基酸序列。聯合使用該引物與反向引物OST311HNt(實施例19，SEQ ID NO46)(該反向引物含有一個NotI識別序列，C末端添加了6個組氨酸殘基，隨後是一個終止密碼子)，以實施例19(2)描述的OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8質粒DNA為模板，按照實施例25(1)描述的方式進行PCR擴增。用SphI和NotI消化得到的PCR產物，然後根據標準方法插入以上描述的SphI-和NotI-消化的質粒載體pPKFGSG。
利用ABI3700螢光DNA測序儀(PE Applied Biosystems，USA)確定所得質粒OST311ΔN9-pPKFGSG的核苷酸序列，從而證實插入的基因序列含有從起始亮氨酸到OST311RQH基因的第24個胺基酸Ala的信號肽(其中第23個胺基酸Arg被His取代)，缺失第25個胺基酸Tyr到第33個胺基酸Gly這9個胺基酸殘基對應的基因序列，並編碼從第34個胺基酸Ser到含有終止密碼子的組氨酸標記的全部序列。
(2)穩定表達重組體OST311ΔN9的CHO細胞的分離用Transfectam(Promega，USA)按照所附的廠商說明將OST311ΔN9-pPKFGSG質粒DNA導入CHO ras克隆-1細胞，然後得到在含有5ug/ml嘌呤黴素和10％FCS的MEMα培養基上顯示藥物抗性的CHO-OST311RQ-ΔN9細胞。以實施例25描述的方式由所得細胞收集條件培養基。然後利用實施例22描述的OST311特異多克隆抗體311-148或者用SEQ ID NO2中胺基酸237Gly到251Ile的部分多肽免疫兔子得到的多克隆抗體311-237進行Western印跡。這樣，證實了在預期分子量所對應的位置的蛋白質得以表達。這些結果揭示OST311信號肽，在SEQ ID NO2的胺基酸23 Arg被His取代的情況下，仍能保證分泌OST311重組體蛋白質，並且即使刪除了至少從胺基酸25 Tyr到33 Gly這一部分，重組體蛋白還能在培養基中一定程度上穩定地存在。
(3)表達N末端缺失9個胺基酸的OST311的細胞的移植試驗以實施例13所述方法類似的方式將以上CHO-OST311RQ-Δ9細胞腹膜下移植給裸鼠(8周齡，BALB/c-nude，雄性，每組6隻)。作為對照組，分別類似地腹膜下移植表達全長OST311RQH的CHO細胞和CHO ras克隆-1細胞(n＝6).將每組的小鼠關在塑料籠子裡，允許隨意攝取自來水和固體食物CE2(CLEA JAPAN，Japan).
細胞移植後4天，用玻璃毛細管從眼窩採血，然後以實施例20所述類似的方式測量血清磷酸鹽水平.在CHO-OST311RQΔ9細胞移植組觀察到血清磷酸鹽水平顯著下降(CHO ras克隆-1組6.85±0.12mg/dl，CHO-OST311RQH組3.91±0.23mg/dl(p＜0.001，相對CHO-ras克隆-1組)，CHO-OST311RQΔ9組4.33±0.15(p＜0.001，相對CHO-ras克隆-1組))，其與表達全長重組體的細胞移植組相當.
這些結果顯示即使將包括SEQ ID NO2的至少胺基酸25 Tyr到33 Gly這9個胺基酸殘基刪除，OST311的生物活性還完好無損.
實施例27產生OST311重組體的大腸桿菌的檢驗(1)OST311大腸桿菌表達載體OST311/pET3a的構建合成以下引物.
OST311NTGTATCCCAATGCCTCCCCACTG(SEQ ID NO60)OST311BmATGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO61)用實施例19中製備的OST311/pCAGGS質粒作為模板，OST311N(SEQ ID NO60)和OST311Bm(SEQ ID NO61)引物和pfu DNA聚合酶(Promega，USA)進行PCR.將溫度在94℃維持1分鐘後，進行35輪反應，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘.反應完成後，進行酚/氯仿處理來滅活酶，然後經乙醇沉澱回收DNA.用BamHI消化DNA，經2％瓊脂糖凝膠電泳分離目標OST311 cDNA片段，然後用GeneClean II(BIO101，USA)回收.同時，用NdeI消化質粒載體pET3a(Novagen，USA)，然後用Klenow片段(Roche，Swiss)使之平端化.所述載體進一步用BamHI消化，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離所得質粒DNA片段，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收.用DNA連接試劑盒版本2(TAKARA SHUZO，Japan)將得到的OST311cDNA片段連接到消化好的質粒pET3a上.然後將產物導入大腸桿菌DH5α進行克隆，提取質粒.測定質粒的核苷酸序列確保OST311 cDNA已經如期插入pET3a.該質粒命名為OST311/pET3a.
(2)用於在大腸桿菌中表達OST311的OST311/pET28載體的構建合成以下引物.
OST311NdATCATATGTATCCCAATGCCTCCCCACTG(SEQ ID NO62)OST311NotATGCGGCCGCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG(SEQ ID NO63)用OST311/pET3a質粒為模板，OST311Nd(SEQ ID NO62)和OST311Not(SEQ ID NO63)引物和LA Taq(TAKARA SHUZO，Japan)進行PCR.將溫度在94℃維持1分鐘後，進行35輪反應，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘.反應完成後，進行酚/氯仿處理來滅活酶，然後經乙醇沉澱回收擴增的DNA片斷.用NdeI和NotI消化DNA，經2％瓊脂糖凝膠電泳分離目標OST311 cDNA片段，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收.同時，用NdeI和NotI消化質粒載體pET28(Novagen，USA)，然後用牛小腸鹼性磷酸酶(TAKARASHUZO，Japan)去磷酸化.然後經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離產物，然後用Gene Clean II(BIO101，USA)回收消化好的質粒.用DNA連接試劑盒版本2(TAKARA SHUZO，Japan)將得到的OST311cDNA連接到消化好的質粒pET28上.然後將連接產物導入大腸桿菌DH5α進行克隆，提取質粒.測定質粒的核苷酸序列確保能表達在N末端添加His標記序列的重組體OST311的OST311cDNA已經插入pET28.該質粒被命名為OST311/pET28.該載體編碼的重組體His-OST311的胺基酸序列和核苷酸序列如圖26所示。
(3)重組體His-OST311在大腸桿菌中的表達和製備將質粒OST311/pET28導入大腸桿菌BL21(DE3)Codon PlusRP(STRATAGENE，USA)進行轉化，然後獲得克隆。將所得大腸桿菌克隆接種到100ml含有10mg卡那黴素(SIGMA，USA)的LB培養基中，於37℃培養過夜。將細菌細胞懸浮液接種1L LB培養基至A600＝0.1，然後用一個3L Sakaguchi瓶於37℃振蕩培養。隨時間測量培養液的光吸收。當達到A600＝0.6到1.0時，加入異丙基-1-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(Wako Pure Chemical Industries，Japan)至1mM。4小時後，離心(7700g×15分鐘)回收細胞。將回收的細胞懸浮於20ml含有1mM DTT的0.1M Tris鹽酸緩衝液(pH7.5)中，然後用FrenchPress破碎。將含有被破碎細胞的溶液離心(7700g×15分鐘)，然後將沉澱懸浮在15ml 0.1M Tris鹽酸緩衝液(pH7.5)中.向懸液中加入DNaseI(Roche，Swiss)至0.1mg/ml，然後在4℃振蕩1小時。接下來，進行離心(23400g×15分鐘)，然後收集包含體形式的沉澱組分。將所得包含體懸浮在10ml含有0.75M尿素和1％Triton-X的20mMTris鹽酸緩衝液(pH8)中以便洗滌，然後離心(23400g×15分鐘)來收集沉澱。洗滌過程重複兩次。
將洗好的包含體懸浮在5ml變性溶液(含有1mM DTT和6M鹽酸胍的50mM磷酸緩衝液(pH8))中，然後在37℃振蕩1小時使之溶解。經離心(23400g×15分鐘)除去形成沉澱的不溶物，然後用含有6M鹽酸胍的50mM磷酸緩衝液(pH6)平衡該溶液。將溶解好的樣品上樣到填充Ni-NTA Agrose(QIAGEN，Germany)的柱子，然後用含有6M鹽酸胍的50mM磷酸緩衝液(pH6)洗。用含有500mM咪唑(NacalaiTesque，Japan)和6M鹽酸胍的50mM磷酸緩衝液(pH4.5)洗脫吸附到柱子上的蛋白，從而純化變性His-OST311.根據純化樣品在280nm的UV吸收得知其濃度，然後向樣品中加入含有6M鹽酸胍的50mM磷酸緩衝液(pH6)使終濃度為2mg/ml，從而製備到變性His-OST311的溶液。將半胱氨酸作為還原劑加入樣品至終濃度1mM，用含有0.6M鹽酸胍和0.1％Tween20的20mM磷酸緩衝液(pH6)稀釋100倍以便重新摺疊。保溫在4℃進行3天或以上。
將重摺疊溶液在4℃對0.1M醋酸鹽緩衝液(pH4.8)進行透析。用超濾膜將透析過的重摺疊溶液濃縮約10倍，然後用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，Japan)經HPLC純化。用含有甘油的20mM磷酸鹽緩衝液(pH6)以0.5M到2M的線性NaCl梯度洗脫蛋白質。洗脫方式如圖27所示。SDS-PAGE分析和質譜測量顯示在洗脫下來的兩類蛋白質峰中，His-OST311包含在較低鹽濃度洗脫下來的峰中。如上所述，從大約1L培養細胞中可以製備約0.6mg最終的純化產物，His-OST311。
(4)構建表達MK-OST311的pET22b-MK-OST311載體合成以下引物。
OST311MK1gaattcatatgaaatacccgaacgcttccccgctgctgggctccagctg(SEQ ID NO64)OST311MK2cccaagcttgcggccgcctagatgaacttggc(SEQ ID NO65)用以上His-OST311表達質粒OST311/pET28作為模板，OST311MK1(SEQ ID NO64)和OST311MK2(SEQ ID NO65)作為引物，經PCR擴增靶序列。在通過該過程獲得的OST311 cDNA中，啟始密碼子(ATG)後面的27個核苷酸已經轉換為大腸桿菌的密碼子。用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，Germany)純化所述PCR產物，然後用限制酶NdeI(TAKARA SHUZO，Japan)和NotI(TAKARA SHUZO，Japan)於37℃消化1小時。消化好的PCR產物經瓊脂糖電泳分離，然後用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，Germany)純化。所得DNA片段用限制酶NdeI和NotI於37℃消化1小時，然後用DNA連接試劑盒Ver2(TAKARASHUZO，Japan)在16℃與經瓊脂糖電泳分離和純化的質粒載體pET22b(Novagen，USA)連接15分鐘。將連接好的產物導入大腸桿菌JM109(TAKARA SHUZO，Japan)進行克隆，然後通過標準方法提取質粒。確定所得質粒的核苷酸序列以確保得到的OST311cDNA已經插入了pET22b載體。該質粒被命名為pET22-MK-OST311。該載體所編碼的重組體MK-OST311的核苷酸序列和胺基酸序列如圖26所示。
(5)MK-OST311在大腸桿菌中的表達和製備將質粒pET22-MK-OST311導入大腸桿菌BL21(DE3)Codon PlusRP(STRATAGENE，USA)，然後獲得轉化克隆。將所得大腸桿菌克隆接種到含有10mg氨苄青黴素的100ml LB培養基中，然後於37℃培養過夜。將細菌的細胞懸浮液接種在1L LB培養基中至A600＝0.1，然後用一個3L Sakaguchi瓶於37℃震蕩培養。向細菌細胞培養液中加入IPTG來誘導重組體的表達，然後通過與以上製備His-OST311的方法類似的方式製備包含體。
將洗過的包含體懸浮在5ml變性溶液(含有1mM DTT和6M鹽酸胍的50mM磷酸鹽緩衝液(pH8))中，然後將懸浮液在37℃震蕩1小時使之溶解。用變性溶液將溶解好的產物稀釋2倍，然後用含有0.6M鹽酸胍和0.1％Tween20的20mM磷酸鹽緩衝液稀釋100倍使之開始重新摺疊。在4℃溫育3天或以上。已知在添加氧化劑和pH為7或以上的條件下，蛋白質會沉澱因此重摺疊效率明顯下降。將重摺疊溶液在4℃對0.1M醋酸鹽緩衝液(pH4.8)進行透析。用超濾膜將透析過的重摺疊溶液濃縮約10倍，然後用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，Japan)經HPLC純化。用含有10％甘油的20mM磷酸鹽緩衝液(pH6)以0.5M到2M的線性NaCl梯度洗脫蛋白質。如圖28所示，有兩個蛋白質洗脫峰，並且SDS-PAGE分析和質譜測定顯示MK-OST311包含在較低鹽濃度洗脫下來的峰中。這樣從大約1L培養細胞中可以製備約0.6mg最終的純化產物，MK-OST311。
(6)MK-OST311的PEG化用10％乙酸將10ml經離子交換柱純化的MK-OST311(0.05mg/ml)調節至pH4.8。向該溶液中邊攪拌邊加入25mg溶解在10mM醋酸緩衝液(pH4.8)中，分子量為20000的活化的PEG(Sharewater，USA)。15分鐘後，將溶於10mM醋酸緩衝液(pH4.8)的1M氰基氫硼化鈉(Nacalai Tesque，Japan)加入該溶液使終濃度為15mM，然後將溶液在4℃攪拌16小時。通過該反應PEG化的OST311用陽離子交換柱SP-5PW(TOSOH，Japan)經HPLC純化。用含有10％甘油的20mM磷酸鹽緩衝液(pH6)以0.5M到2M的線性NaCl梯度洗脫蛋白質。如圖29所示，與MK-OST311相比，PEG化的MK-OST311洗脫為較低離子強度處的一個峰。
(7)His-OST311重組體活性的檢測為了檢驗純化His-OST311重組體的生物活性，通過實施例24描述的方式經尾靜脈將重組體蛋白質以4.5ug/0.1ml的劑量一次給予正常小鼠(5周齡，BALB/c，雄性，每組六隻)。9個小時後，通過與實施例20所述類似的方法測量血清磷酸鹽和1，25-二羥維生素D3水平。對一個陽性對照組進行了相同劑量得自CHO-OST311H細胞的純化重組體的單次給藥，還對一個載體給藥組，以0.1ml每隻的量進行了包括20mM磷酸鹽緩衝液(pH6.9)和0.3M NaCl的載體單次給藥，兩組都是經尾靜脈給藥。
如圖30A所示，給藥9小時後與載體給藥組相比，在His-OST311給藥組中觀察到明顯的降低血清磷酸鹽水平的效果。下降的程度與CHO產生的重組體蛋白給藥組相當。此外，如圖32所示，給藥9小時後，His-OST311給藥組中的血清1，25-二羥維生素D3水平也有顯著下降。
如實施例24(3)和(4)所述，一次給予CHO細胞產生的OST311蛋白後4小時就觀察到血清1，25-二羥維生素D3水平明顯下降。在這個時間之前，給藥後1小時，在腎臟中觀察到25-羥基維生素D-1-α-羥化酶(1αOHase)表達下降，25-羥基維生素D-24-羥化酶(24OHase)表達增強。因此，將His-OST311以每隻4.5ug/0.1ml經尾靜脈一次給予BALB/c小鼠(5周齡，雄性)，然後在1和4小時後切除腎臟。通過Northern印跡法分析腎臟中1αOHase和24OHase的表達的變化。對一個陽性對照組進行了相同劑量得自CHO-OST311H細胞的純化重組體的單次給藥，還對一個載體給藥組，以0.1ml每隻的量進行了包括20mM磷酸鹽緩衝液(pH6.9)和0.3M NaCl的載體單次給藥，兩組都是經尾靜脈給藥。如圖31所示，與CHO產生的重組體類似，給藥1小時後，His-OST311即導致1αOHase基因表達的下降和24OHase基因表達的增強。這揭示了His-OST311具有與CHO產生的重組體相當的活性，能調節維生素D代謝酶基因的表達。此外，如圖32所示，給予所述重組體後4小時，血清1，25-二羥維生素D3水平顯示中等下降，8小時顯示更明顯的下降。這揭示了該變化的方式與實施例24(3)描述的給予CHO產生的重組體實驗中觀察到的變化幾乎是一致的。
由以上結果揭示出大腸桿菌產生的重組體His-OST311至少具有血清磷酸鹽降低活性和維生素D代謝調節活性，這與CHO-OST311H細胞產生的分泌重組體的活性相當。
(8)PEG化MK-OST311的活性的檢測PEG化MK-OST311的生物活性的檢測是通過將PEG化MK-OST311以每隻5.0ug/0.1ml的量一次給予正常小鼠(5周齡，BALB/c，雄性，每組8隻)，給藥是以實施例24描述的方式經尾靜脈進行的，然後通過與實施例20類似的方法在給藥9後9小時測定血清磷酸鹽水平。還對一個載體給藥組，以0.1ml/鼠的量經尾靜脈單次給予包括20mM PB(pH6.0)，10％甘油，1M NaCl和0.1％Tween的載體單次給藥。給藥後8小時，用玻璃毛細管從眼窩採血，然後測定得到的血清中的無機磷酸鹽水平。如圖30B所示，在PEG化MK-OST311給藥組中觀察到明顯的降低血清磷酸鹽水平的效果。這個結果揭示了大腸桿菌產生的重組體被PEG化時，其生物活性沒有被抑制。
實施例28向切割位點導入胺基酸突變正如實施例9所述，OST311在SEQ ID NO2中的胺基酸殘基179(Arg)和180(Ser)之間被切割。同時，在實施例19中證實，將OST311的176(Arg)和179(Ser)位胺基酸殘基同時用Gln替代能抑制該切割。這些事實暗示了這樣一種可能性，即該切割是由於某些識別包含相鄰RXXR和RRXXR序列的基元的蛋白酶。而且，體內給予由SEQ ID NO4所示多肽構成的全長重組體時，可能會發生與上述相同或類似的切割。因此，將SEQ ID NO2的175到180位胺基酸殘基分別以Ala，Gln和Trp替代，然後檢驗這些替代如何影響突變重組體在CHO細胞中的表達和分泌方式。
(1)切割位點突變的OST311基因的構建合成以下引物。
pyh23PA1F AACACCCCCATAGCACGGCGGCACA(sEQ ID NO66)pyh23PA1R TGTGCCGCCGTGCTATGGGGGTGTT(SEQ ID NO67)pyh23RA1F ACCCCCATACCAGCGCGGCACACCCG(SEQ ID NO68)pyh23RA1R CGGGTGTGCCGCGCTGGTATGGGGGT(SEQ ID NO69)pyh23RA2F CCCATACCACGGGCGCACACCCGGAG(SEQ ID NO70)pyh23RA2R CTCCGGGTGTGCGCCCGTGGTATGGG(SEQ ID NO71)pyh23HA1F ATACCACGGCGGGCCACCCGGAGCGC(SEQ ID NO72)pyh23HA1R GCGCTCCGGGTGGCCCGCCGTGGTAT(SEQ ID NO73)pyh23TA1F CCACGGCGGCACGCCCGGAGCGCCG(SEQ ID NO74)pyh23TA1R CGGCGCTCCGGGCGTGCCGCCGTGG(SEQ ID NO75)pyh23RA3F CGGCGGCACACCGCGAGCGCCGAGGA(SEQ ID NO76)pyh23RA3R TCCTCGGCGCTCGCGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO77)pyh23SA1F CGGCACACCCGGGCCGCCGAGGACGA(SEQ ID NO78)pyh23SA1R TCGTCCTCGGCGGCCCGGGTGTGCCG(SEQ ID NO79)pyh23RKQ1F ACCCCCATACCACAGCGGCACACCCG(SEQ ID NO80)pyh23RKQ1R CGGGTGTGCCGCTGTGGTATGGGGGT(SEQ ID NO81)pyh23RKQ2F CCCATACCACGGCAGCACACCCGGAG(SEQ ID NO82)pyh23RKQ2R CTCCGGGTGTGCTGCCGTGGTATGGG(SEQ ID NO83)pyh23RKQ3F CGGCGGCACACCCAGAGCGCCGAGGA(SEQ ID NO84)pyh23RKQ3R TCCTCGGCGCTCTGGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO85)pyh23RWF CGGCGGCACACCTGGAGCGCCGAGG(SEQ ID NO86)pyh23RWR CCTCGGCGCTCCAGGTGTGCCGCCG(SEQ ID NO87)pyh23PA1F和pyh23PA1R是用於導入突變的正向和反向引物，其中以鳥嘌呤替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的第652胞嘧啶導致SEQID NO2的胺基酸殘基174(Pro)被Ala取代。以下，該突變稱為P174A。
pyh23RAlF和pyh23RAlR是用於導入突變的正向和反向引物，其中分別以鳥嘌呤和胞嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的655胞嘧啶和656鳥嘌呤導致SEQ ID NO2的胺基酸殘基175(Arg)被Ala取代。以下，該突變稱為R175A。
pyh23RA2F和pyh23RA2R是用於導入突變的正向和反向引物，其中分別以鳥嘌呤和胞嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的658胞嘧啶和659鳥嘌呤導致SEQ ID NO2的胺基酸殘基176(Arg)被Ala取代。以下，該突變稱為R176A。
pyh23HAlF和pyh23HAlR是用於導入突變的正向和反向引物，其中分別以鳥嘌呤和胞嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的661胞嘧啶和662腺嘌呤導致SEQ ID NO2的胺基酸殘基177(His)被Ala取代。以下，該突變稱為H177A。
pyh23TA1F和pyh23TA1R是用於導入突變的正向和反向引物，其中以鳥嘌呤替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的664腺嘌呤導致SEQ IDNO2的胺基酸殘基178(Thr)被Ala取代。以下，該突變稱為T178A。
pyh23RA3F和pyh23RA3R是用於導入突變的正向和反向引物，其中分別以鳥嘌呤和胞嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的667胞嘧啶和668鳥嘌呤導致SEQ ID NO2的胺基酸殘基179(Arg)被Ala取代。以下，該突變稱為R179A。
pyh23SA1F和pyh23SA1R是用於導入突變的正向和反向引物，其中分別以鳥嘌呤和胞嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的670腺嘧啶和671鳥嘌呤導致SEQ ID NO2的胺基酸殘基180(Ser)被Ala取代。以下，該突變稱為S180A。
pyh23RKQ1F和pyh23RKQ1R是用於導入突變的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的656鳥嘌呤導致SEQID NO2的胺基酸殘基175(Arg)被Gln取代。以下，該突變稱為R175Q。
pyh23RKQ2F和pyh23RKQ2R是用於導入突變的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的659鳥嘌呤導致SEQID NO2的胺基酸殘基176(Arg)被Gln取代。以下，該突變稱為R176Q。
pyh23RKQ3F和pyh23RKQ3R是用於導入突變的正向和反向引物，其中以腺嘌呤替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的668鳥嘌呤導致SEQID NO2的胺基酸殘基179(Arg)被Gln取代。以下，該突變稱為R179Q。
pyh23RWF和pyh23RWR是用於導入突變的正向和反向引物，其中以胸腺嘧啶替換OST311 cDNA(SEQ ID NO1)的659胞嘧啶導致SEQ IDNO2的胺基酸殘基179(Arg)被Trp取代。以下，該突變稱為R179W。
(1)-1 OST311P174AH基因的構建用Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)根據所附的廠商說明製備兩種反應液(各100ul)。一種反應液，OST311ME1(SEQ IDNO45)和pyh23PA1F(SEQ ID NO66)用作引物，終濃度為0.2uM，對於另一種反應液，pyh23PA1R(SEQ ID NO67)和OST311HNt(SEQ IDNO46)作為引物，終濃度為0.2uM。向每種反應液中加入10ng實施例19(1)描述的OST311/pCAGGS質粒作為模板，然後將反應液在94℃維持1分鐘。然後進行40輪PCR反應，每個循環包括94℃20秒，55℃30秒，72℃1分鐘。將這兩種反應液分別稀釋10倍，然後各取1ul加入100ul根據Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA SHUZO，Japan)所附的文件製備的反應液中。加入OST311ME1(SEQ ID NO45)和OST311HNt(SEQ ID NO46)至終濃度為0.2uM作為引物，然後將溶液在94℃維持1分鐘。然後進行3O輪PCR反應，每個循環包括94℃20秒，55℃30秒，72℃1分30秒。PCR反應後，將溶液繼續在72℃保持7分鐘。用Gene Clean II(BIO101，USA)根據所附的廠商說明收集這樣得到的反應產物。然後用EcoRI和NotI消化產物，然後進行2％瓊脂糖凝膠電泳來分離大約800bp的DNA片段。用Gene CleanII(BIO101，USA)收集該片段。將得到的DNA片段插入pEAK8載體(EdgeBio，USA)的EcoRI和NotI位點，從而得到質粒OST311P174AH-pEAK8。按照標準方法製備質粒DNA，用ABI3700螢光DNA測序儀(PE Applied Systems，USA)確定其核苷酸序列。這樣證實了突變P174H以被導入。並且，還證實了在C-末端添加了一個組氨酸標記。由含有此處導入的P174A的突變基因編碼的多肽稱為OST311P174AH。
(1)-2 OST311R175AH基因的製備用pyh23RA1F(SEQ ID NO68)和pyh23RA1R(SEQ ID NO69)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R175AH基因。
(1)-3 OST311R176AH基因的製備用pyh23RA2F(SEQ ID NO70)和pyh23RA2R(SEQ ID NO71)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R176AH基因。
(1)-4 OST311H177AH基因的製備用pyh23HA1F(SEQ ID NO72)和pyh23HA1R(SEQ ID NO73)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311H177AH基因。
(1)-5 OST311T178AH基因的製備用pyh23TA1F(SEQ ID NO74)和pyh23TA1R(SEQ ID NO75)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311T178AH基因。
(1)-6 OST311R179AH基因的製備用pyh23RA3F(SEQ ID NO76)和pyh23RA3R(SEQ ID NO77)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R179AH基因。
(1)-7 OST311S180AH基因的製備用pyh23SA1F(SEQ ID NO78)和pyh23SA1R(SEQ ID NO79)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311S180AH基因。
(1)-8 OST311R175QH基因的製備用pyh23RKQ1F(SEQ ID NO80)和pyh23RKQ1R(SEQ ID NO81)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R175QH基因。
(1)-9 OST311R176QH基因的製備用pyh23RKQ2F(SEQ ID NO82)和pyh23RKQ2R(SEQ ID NO83)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R176QH基因。
(1)-10 OST311R179QH基因的製備用pyh23RKQ3F(SEQ ID NO84)和pyh23RKQ3R(SEQ ID NO85)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R179QH基因。
(1)-11 OST311R179WH基因的製備用pyh23RWF(SEQ ID NO86)和pyh23RWR(SEQ ID NO87)作為引物，通過與(1)-1類似的方法製備OST311R179WH基因。
(2)切割位點突變的OST311基因的瞬時表達和調節培養基的製備將pEAK快速細胞(EdgeBiosystems，USA)接種到12孔板。按照pEAK系統(EdgeBiosystems，USA)所附的文件通過磷酸鈣法將以上突變體OST311的11種表達質粒轉染細胞。將細胞放置4小時，用1.5ml無血清MEMα培養基替換培養基，將細胞在37℃培養2天，然後收集條件培養基。
(3)切割位點突變的OST311基因的表達的評估將得到的條件培養基以實施例6(3)描述的類似方式進行Western印跡，然後檢驗條件培養基中是否存在切割位點突變的OST311重組體。實施例22中描述的OST311特異多克隆抗體，311-148用於檢測。因此，如圖33所示，與野生型類似，在胺基酸殘基174到180發生的取代中，導入突變P174A，R175A，R175Q，H177A，T178A或S180A的OST311重組體在大約16kDa均觀察到一個含有SEQ ID NO6所示多肽的降解產物。但是，在導入突變R176A，R179A，R176Q，R179A或R179W的OST311重組體中沒有觀察到降解產物。這些結果暗示了，特別是胺基酸殘基176(Arg)和179(Arg)對發生在胺基酸殘基179(Arg)和180(Ser)之間的切割起著重要作用。這就是說，至少用Ala，Gln或Trp中的任何胺基酸取代這兩個殘基時，能夠消除或抑制切割。因此，利用這個發現能促進全長多肽的產量。
實施例29如實施例6所示，在通過在CHO細胞或COS細胞中表達OST311得到的重組體產物在位於實施例9所示的RXXR基元後面的179(Arg)和180(Ser)胺基酸殘基之間被切割。實施例18清楚地顯示了，OST311蛋白的低磷酸鹽血症誘發活性保留在該位點沒有切割的全長蛋白質中。此外，從實施例19和28所示的突變導入實驗可以清楚的看到RXXR基元參與了該切割。為了有效地產生和獲得重組體OST311，避免該切割是一個重要課題，如實施例28所示在RXXR基元中導入突變是有效的方法之一。弗林蛋白酶是已知識別RXXR基元的一個蛋白酶。該酶位於高爾基體外側，被認為是通過在分泌過程中識別RXXR基元來切割翻譯後蛋白質。
(1)弗林蛋白酶參與OST311的切割用Transfectum(Promega，USA)將OST311/pCAGGS質粒導入弗林蛋白酶缺陷的LoVo細胞。然後將該細胞培養8天。用311-148抗體通過Western印跡分析瞬時表達並分泌到培養液中的OST311蛋白時，沒有檢測到被切割過的產物。這個結果表明產生OST311時，弗林蛋白酶參與了觀察到OST311的切割。
(2)避免OST311的切割由以上結果推斷，抑制弗林蛋白酶的活性能有效地促進在胺基酸179(Arg)和180(Ser)之間沒有切割的OST311的產量。與此相應，可以想見，在諸如LoVo細胞等沒有弗林蛋白酶活性的宿主中表達OST311，或者在通過加入弗林蛋白酶抑制劑來抑制弗林蛋白酶活性的條件下。為了抑制CHO-OST311H細胞的弗林蛋白酶活性，按照Benjannet S等報導的方法(J Biol Chem 27226210-8，1997)瞬時表達α1-抗胰蛋白酶Portland(α1-PDX)，然後收集條件培養基。與沒有該基因的對照CHO-OST311H細胞的條件培養基相比，重組體產物中的全長多肽比率提高。相應地，可以得出結論，可以通過外部或內在地引入抑制弗林蛋白酶活性的物質來提高全長OST311蛋白的生產效率。
文中引用的所有出版物，專利和專利申請均全文引入本申請。
工業應用根據本發明，提供了一種調節磷酸鹽代謝，鈣代謝和/或鈣化的多肽，編碼該多肽的DNA，含有所述多肽為活性成分的藥物組合物，識別所述多肽的抗體，含有該抗體作為活性成分的藥物組合物，利用該抗體的診斷方法以及診斷組合物。
序列說明SEQ ID NO12合成DNASEQ ID NO13合成DNASEQ ID NO14合成DNASEQ ID NO15合成DNASEQ ID NO16合成DNASEQ ID NO17合成DNASEQ ID NO18合成DNASEQ ID NO19合成DNASEQ ID NO20合成DNA
SEQ ID NO21合成DNASEQ ID NO22合成DNASEQ ID NO23合成DNASEQ ID NO24合成DNASEQ ID NO25合成DNASEQ ID NO26合成DNASEQ ID NO27合成DNASEQ ID NO28合成肽SEQ ID NO29合成肽SEQ ID NO30合成DNASEQ ID NO31合成DNASEQ ID NO32合成DNASEQ ID NO33合成DNASEQ ID NO34合成DNASEQ ID NO35合成DNASEQ ID NO36合成DNASEQ ID NO37合成DNASEQ ID NO38合成DNASEQ ID NO39合成DNASEQ ID NO40合成DNASEQ ID NO41合成DNASEQ ID NO42合成DNASEQ ID NO43合成DNASEQ ID NO44合成DNASEQ ID NO45合成DNASEQ ID NO46合成DNASEQ ID NO47合成DNASEQ ID NO48合成DNASEQ ID NO49合成肽
SEQ ID NO50合成肽SEQ ID NO51合成肽SEQ ID NO52合成肽SEQ ID NO53合成DNASEQ ID NO54合成DNASEQ ID NO55合成DNASEQ ID NO56合成DNASEQ ID NO57合成DNASEQ ID NO58合成DNASEQ ID NO59合成DNASEQ ID NO60合成DNASEQ ID NO61合成DNASEQ ID NO62合成DNASEQ ID NO63合成DNASEQ ID NO64合成DNASEQ ID NO65合成DNASEQ ID NO66合成DNASEQ ID NO67合成DNASEQ ID NO68合成DNASEQ ID NO69合成DNASEQ ID NO70合成DNASEQ ID NO71合成DNASEQ ID NO72合成DNASEQ ID NO73合成DNASEQ ID NO74合成DNASEQ ID NO75合成DNASEQ ID NO76合成DNASEQ ID NO77合成DNASEQ ID NO78合成DNA
SEQ ID NO79合成DNASEQ ID NO80合成DNASEQ ID NO81合成DNASEQ ID NO82合成DNASEQ ID NO83合成DNASEQ ID NO84合成DNASEQ ID NO85合成DNASEQ ID NO86合成DNASEQ ID NO87合成DNA
序列表110麒麟麥酒株式會社120調節磷酸代謝、鈣代謝，鈣化和維生素D代謝的多肽及其編碼DNA130PH-1268PCT140
141
150JP2000-2451441512000-08-11150JP2000-2878641512000-09-21150JP2000-3910271512000-12-22150JP2001-1215271512001-04-1916087170PatentIn Ver.2.021012112770212DNA213人220
221CDS222(133)..(885)4001gaatccagtc taggatcctc acaccagcta cttgcaaggg agaaggaaaa ggccagtaag 60gcctgggcca ggagagtccc gacaggagtg tcaggtttca atctcagcac cagccactca 120gagcagggca cg atg ttg ggg gcc cgc ctc agg ctc tgg gtc tgt gcc ttg 171
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223合成DNA40043gatttaggtg acactatag 192104421134212DNA213人工序列220
223合成DNA40044ataagaatgc ggccgctcag atgaacttgg cgaa 342104521133212DNA213人工序列
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223合成DNA40045atgaattcca ccatgttggg ggcccgcctc agg 332104621149212DNA213人工序列220
223合成DNA40046atgcggccgc ctaatgatga tgatgatgat ggatgaactt ggcgaaggg 492104721130212DNA213人工序列220
223合成DNA40047ataccacggc agcacaccca gagcgccgag 302104821130212DNA213人工序列220
223合成DNA40048ataccacggc agcacaccca gagcgccgag 302104921117212PRT213人工序列
220
223合成肽40049Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu1 5 10 15Cys2105021111212PRT213人工序列220
223合成肽40050Cys Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg1 5 102105121116212PRT213人工序列220
223合成肽40051Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Cys1 5 10 152105221114212PRT213人工序列220
223合成肽40052
Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Cys1 5 102105321133212DNA213人工序列220
223合成DNA40053atgaattcca ccatgttggg ggcccgcctc agg 332105421133212DNA213人工序列220
223合成DNA40054atgcggccgc tatcgaccgc ccctgaccac ccc 332105521133212DNA213人工序列220
223合成DNA40055atgcggccgc tacgggagct cctgtgaaca gga 332105621134212DNA213人工序列
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223合成DNA40056atgcggccgc tcacggggtc atccgggccc gggg 342105721179212DNA213人工序列220
223合成DNA40057aattccacca tgttgggggc ccgcctcagg ctctgggtct gtgcttgtgc agcgtctgca 60gcatgagcgt cctgcatgc 792105821180212DNA213人工序列220
223合成DNA40058aattgcatgc aggacgctca tgctgcagac gctgcacaag gcacagaccc agagcctgag 60gcgggccccc aacatggtgg 802105921135212DNA213人工序列220
223合成DNA
40059atatgcatgc ctccagctgg ggtggcctga tccac 352106021123212DNA213人工序列220
223合成DNA40060tgtatcccaa tgcctcccca ctg 232106121129212DNA213人工序列220
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223合成DNA40062atcatatgta tcccaatgcc tccccactg292106321131212DNA213人工序列
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223合成DNA40063atgcggccgc ctagatgaac ttggcgaagg g 312106421149212DNA213人工序列220
223合成DNA40064gaattcatat gaaatacccg aacgcttccc cgctgctggg ctccagctg 492106521132212DNA213人工序列220
223合成DNA40065cccaagcttg cggccgccta gatgaacttg gc322106621125212DNA213人工序列220
223合成DNA40066aacaccccca tagcacggcg gcaca25
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223合成DNA40067tgtgccgccg tgctatgggg gtgtt 252106821126212DNA213人工序列220
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223合成DNA
40070cccataccac gggcgcacac ccggag 262107121126212DNA213人工序列220
223合成DNA40071ctccgggtgt gcgcccgtgg tatggg 262107221126212DNA213人工序列220
223合成DNA40072ataccacggc gggccacccg gagcgc 262107321126212DNA213人工序列220
223合成DNA40073gcgctccggg tggcccgccg tggtat 262107421125212DNA213人工序列
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223合成DNA40074ccacggcggc acgcccggag cgccg 252107521125212DNA213人工序列220
223合成DNA40075cggcgctccg ggcgtgccgc cgtgg 252107621126212DNA213人工序列220
223合成DNA40076cggcggcaca ccgcgagcgc cgagga 262107721126212DNA213人工序列220
223合成DNA40077tcctcggcgc tcgcggtgtg ccgccg 26
2107821126212DNA213人工序列220
223合成DNA40078cggcacaccc gggccgccga ggacga 262107921126212DNA213人工序列220
223合成DNA40079tcgtcctcgg cggcccgggt gtgccg 262108021126212DNA213人工序列220
223合成DNA40080acccccatac cacagcggca cacccg 262108121126212DNA213人工序列220
223合成DNA
40081cgggtgtgcc gctgtggtat gggggt 262108221126212DNA213人工序列220
223合成DNA40082cccataccac ggcagcacac ccggag 262108321126212DNA213人工序列220
223合成DNA40083ctccgggtgt gctgccgtgg tatggg 262108421126212DNA213人工序列220
223合成DNA40084cggcggcaca cccagagcgc cgagga 262108521126212DNA213人工序列
220
223合成DNA40085tcctcggcgc tctgggtgtg ccgccg 262108621125212DNA213人工序列220
223合成DNA40086cggcggcaca cctggagcgc cgagg 252108721125212DNA213人工序列220
223合成DNA40087cctcggcgct ccaggtgtgc cgccg 2權利要求
1.一種編碼以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA(a)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列組成的多肽(b)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成的多肽，並且該多肽具備低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者調節體內維生素D代謝的活性，(c)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列含有以上胺基酸序列中的至少第34到第201個胺基酸，或者(d)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列(i)含有所述胺基酸序列中第34個到第201胺基酸的胺基酸序列，(ii)由所述部分序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成，以及(iii)具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調控活性。
2.一種DNA，其含有以下DNA(e)或(f)(e)由SEQ ID NO1所示核苷酸序列中從核苷酸133到885的核苷酸序列組成的DNA，或者由SEQ ID NO3所示核苷酸序列中從核苷酸1到681的核苷酸序列組成的DNA，或者(f)在嚴謹條件下與探針雜交，並編碼具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調節活性的多肽的DNA，所述探針由SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的全部或部分組成的DNA製得。
3.一種重組體載體，其含有權利要求1或2的DNA。
4.一種轉化子，其含有權利要求3的重組體載體。
5.一種多肽，其是以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)(a)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列組成的多肽(b)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成的多肽，並且該多肽具備低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者調節體內維生素D代謝的活性，(c)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列含有以上胺基酸序列中的至少第34到第201個胺基酸，或者(d)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列(i)由從以上胺基酸序列中第34個到第201胺基酸的胺基酸序列組成，(ii)由所述部分序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成，以及(iii)具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調節活性。
6.權利要求5的多肽，是經選自聚乙二醇，葡聚糖，聚(N-乙烯-吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物和聚乙烯氧化物的共聚物，聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇的至少一種物質修飾過的多肽。
7.一種藥物組合物，其含有權利要求5或6所述多肽作為活性成分。
8.一種藥物組合物，其含有權利要求5或6所述多肽作為活性成分，並且能調節體內鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或者維生素D代謝。
9.一種藥物組合物，其含有權利要求5或6所述多肽作為活性成分，並且能有效地抵制低磷酸鹽血症，甲狀旁腺功能亢進，腎性骨營養不良，異位鈣化，骨質疏鬆和維生素D過多症中的至少一種症狀。
10.一種抗體，其與權利要求5或6的多肽或其部分片段反應。
11.一種產生權利要求10所述抗體的方法，其包括用權利要求5或6的多肽或其部分片段作為抗原免疫動物的步驟。
12.一種藥物組合物，其含有權利要求10的抗體作為活性成分。
13.一種藥物組合物，其含有權利要求10的抗體作為活性成分，並能調節體內鈣代謝，磷酸鹽代謝，鈣化或維生素D代謝。
14.一種藥物組合物，其含有權利要求10的抗體作為活性成分，並能有效地抵制骨骼疾病。
15.權利要求14的藥物組合物，其中所述骨骼疾病是骨質疏鬆，抗維生素D佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨骼疾病，鈣化不全骨病，佩吉特病和腫瘤誘導性骨軟化症中的至少一種疾病。
16.一種診斷試劑，其含有權利要求10所述抗體，用於導致異常鈣代謝，異常磷酸鹽代謝，異常鈣化和異常維生素D代謝中的至少一種異常的疾病。
17.權利要求16的診斷試劑，其中所述骨骼疾病是腎衰竭，腎磷酸鹽滲漏，腎小管酸中毒和範科尼症候群的鹽中的至少一種疾病。
18.一種用於骨骼疾病的診斷試劑，其含有權利要求10所述抗體。
19.權利要求18的診斷試劑，其中所述骨骼疾病是骨質疏鬆，抗維生素D佝僂病，腎性骨營養不良，透析相關性骨骼疾病，鈣化不全骨病，佩吉特病和腫瘤誘導性骨軟化症中的至少一種異常的疾病。
20.一種診斷試劑，其含有具有SEQ ID NO11所示核苷酸序列的DNA或其片段，並且用於導致異常鈣代謝，異常磷酸鹽代謝和異常鈣化中的至少一種異常的疾病。
21.權利要求20的診斷試劑，其中所述部分片段具有SEQ ID NO11所示核苷酸中核苷酸498到12966之序列。
22.權利要求20或21的診斷試劑，其中所述疾病是常染色體顯性的血磷酸鹽過少性佝僂病/骨軟化症。
全文摘要
一種編碼以下多肽(a)，(b)，(c)或(d)的DNA(a)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列組成的多肽(b)由SEQ ID NO2或4所示胺基酸序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列組成的多肽，並且該多肽具備低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者調節體內維生素D代謝的活性，(c)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列含有以上胺基酸序列中的至少第34到第201個胺基酸，或者(d)由SEQ ID NO2所示胺基酸序列的部分序列組成的多肽，其中上述部分序列(i)含有所述胺基酸序列中第34個到第201胺基酸的胺基酸序列，(ii)含有由所述部分序列經缺失，取代或添加1或幾個胺基酸得到的胺基酸序列，以及(iii)具有低磷酸鹽血症誘導活性，磷酸鹽轉運抑制活性，鈣化抑制活性或者體內維生素D代謝調控活性。
文檔編號A61P19/08GK1633499SQ0181729
公開日2005年6月29日 申請日期2001年8月10日 優先權日2000年8月11日
發明者山下武美, 島田孝志, 水谷悟, 福本誠二 申請人:麒麟麥酒株式會社