特異識別AFB1的納米抗體的製作方法
2023-11-07 14:19:07 2
本發明涉及單域重鏈抗體技術(又稱納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術，特別是針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體或多肽。
技術背景
黃麴黴毒素(aflatoxin)是由黃麴黴(aspergillusflavus)、寄生麴黴(aspergillusparasiticus)、集蜂麴黴(aspergillusnomius)和溜麴黴(aspergillustamarii)等真菌產生的次級代謝產物，具有強致癌性和強免疫抑制性。黃麴黴毒素是一類化學結構類似的二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃麴黴毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)、g2(afg1)和m1(afm1)等。在已發現的黃麴黴毒素中，黃麴黴毒素b1的毒性最強，被世界衛生組織的癌症研究機構劃定為ⅰ類致癌物。產毒真菌菌株廣泛存在於自然界中，糧食油料等農產品在生產、加工以及儲藏等過程中均可能受到汙染，導致黃麴黴毒素超標。我國是黃麴黴毒素汙染情況較為嚴重的地區。因此，開發穩定、快速、高靈敏、高通量的黃麴黴毒素檢測方法，對於保障我國食品安全、減少由此帶來的損失具有重要意義。
現有的黃麴黴毒素檢測方法主要有免疫分析法、儀器分析法以及薄層層析法。其中免疫分析法可避免其它兩類方法存在的一些缺陷，具有靈敏度高、成本低以及可現場檢測等優點。免疫分析法的原理是基於抗原抗體的特異性識別，抗體的性能是免疫分析方法靈敏度、準確度等指標的決定性因素。因此獲得針對黃麴黴毒素的抗體是建立相關免疫學檢測技術的前提和關鍵。
單域重鏈抗體(又稱納米抗體)是由羊駝重鏈抗體的可變區組成，又稱為納米抗體，具有耐酸鹼、耐高溫以及易於生產等特性。這些特性對於黃麴黴毒素的低成本、可重複使用的免疫學檢測方法有重要的實用價值。
技術實現要素：
本發明的目的是提供針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體，可以被用於製備檢測黃麴黴毒素的試劑和工具。
本發明提供一個針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體(即本發明能特異識別afb1的納米抗體，下同)，具有seqidno.:1、seqidno.:3、seqidno.:5、seqidno.:7、seqidno.:9、seqidno.:11、seqidno.:13所示的胺基酸序列。
其胺基酸序列的imgt編號和結構域的劃分包括四個框架區(frameworkregion,fr)和三個互補決定區(complementarity-determiningregion,cdr)。
本發明提供一個核酸分子，其特徵是編碼seqidno.:1，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。
本發明還提供一個核酸分子，其特徵是編碼seqidno.:1、seqidno.:3、seqidno.:5、seqidno.:7、seqidno.:9、seqidno.:11、seqidno.:13部分結構域，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。對應的，可以為seqidno.:2、seqidno.:4、seqidno.:6、seqidno.:8、seqidno.:10、seqidno.:12、seqidno.:14核酸分子。
本發明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統進行表達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。
本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由於遺傳密碼子具有簡併性，該核酸序列可以根據不同的應用目的而不同。
本發明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體。
本發明還提供一種檢測黃麴黴毒素的方法，含有本發明所述針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體。基於本發明提供的針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體與黃麴黴毒素特異性結合的能力，建立黃麴黴毒素的檢測方法。其中，優選的方法包括酶連免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，螢光免疫法(fluoroimmunoassay,fia)，免疫晶片法，親和層析法和免疫層析法等。
本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體。
本發明還涉及前述針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體在免疫檢測、黃麴黴毒素富集以及純化中的應用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。
本發明所敘述的一些術語具有如下含義：
結構域：蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。
imgt編號：imgt資料庫(theinternationalimmunogeneticsdatbase)中的一種已經標準化的抗體胺基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(ehrenman,f.,q.kaas,et.al.(2010).imgt/3dstructure-dbandimgt/domaingapalign：adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,tcellreceptors,mhc,igsfandmhcsf.nucleicacidsres38(databaseissue):d301-307.lefranc,m.p.,c.pommie,etal.(2003).imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomainsdevcompimmunol27(1):55-77.)中的描述。
密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(tripletcode)，指對應於某種胺基酸的核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種胺基酸插入生長中多肽鏈的位置。
具體實施方式
下面通過單域重鏈抗體(多肽)的製備、分析及應用，對本發明做進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用範圍。
實施例1：
抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體(即針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體)免疫文庫的構建
將黃麴黴毒素b1與匙孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)共價偶聯，得到黃麴黴毒素人工抗原afb1-klh，取300μgafb1-klh與弗氏完全佐劑乳化後，對羊駝(lamapacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫採用150μgafb1-klh與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進行，每次免疫7天後靜脈取血，採用間接elisa法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取rna。
rna的提取參照takara公司rnaiso試劑說明書進行。以rna為模板，oligodt為引物，參照takara公司反轉錄酶說明書合成cdna第一鏈。
採用primestar高保真dna聚合酶，經巢式pcr獲得重鏈抗體的可變區編碼基因(採用的引物見表1)。第一輪pcr分別以引物alpvh-ld和ch2-r擴增cdna，反應條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪pcr產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的dna片段，作為第二輪pcr的模板，分別用引物alpvh-sfii和alpvhhr1-noti，alpvh-sfii和alpvhhr2-noti，進行擴增，反應條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環，98℃，10s，68℃，40s，30個循環，72℃延伸10min。經dna片段回收試劑盒回收、定量，於-20℃保存備用。將噬菌粒phen1和pcr擴增產物分別用sfii、noti雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量後，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。
表1文庫構建及鑑定所用的引物
註：下劃線表示限制性內切酶識別序列
連接產物經乙醇沉澱後，溶於10μl無菌水，分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌tg1。取10μl電擊、培養後的菌液倍比稀釋，塗布氨苄青黴素2×yt培養板，37℃，倒置培養12～16h，採用引物m13-r和phen-r進行菌落pcr，計算庫容；其餘部分全部塗布於24cm×24cm氨苄青黴素2×yt培養板，37℃，倒置培養12～16h。用10ml，2×yt培養基將培養板上的菌苔刮洗後，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存備用。
根據計算的庫容量結果，接種10倍庫容量的活細胞於20ml的2×yt(含2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青黴素)，30℃，220r/min培養至od600達0.5，按感染複數20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養物離心，用50ml的2×yt(含100μg/ml氨苄青黴素和50μg/ml卡那黴素)重懸沉澱，30℃，220r/min過夜培養後，3000g離心取上清，加入5×peg/nacl溶液，冰上放置1h或4℃過夜，12000rpm離心30min，重懸沉澱於含10％甘油的磷酸緩衝液(pbs，0.01m，ph7.4)，即得到抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體免疫文庫，取10μl測定滴度，其餘分裝於-80℃保存備用。
實施例2：
抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體的淘選與鑑定
採用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體免疫文庫文庫中淘選針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體。將afb1與卵清白蛋白(albumin，ova)共價偶聯，得到人工抗原afb1-ova。每孔加入100μl用pbs稀釋的人工抗原afb1-ova，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/ml；吸出包被液，pbs洗板3次，每孔加入300μl3％bsa-pbs，37℃，封閉2h；pbs洗板6次，加入100μl噬菌體抗體文庫(約含2×1011cfu)，37℃，孵育1.5h；吸出未結合的噬菌體，用pbst(含0.5％tween-20)洗板5次(逐輪增加5次)，再用pbs洗板10次(洗板次數逐輪增加5次)；以100μl洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ph2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50μltris-hcl(1mol/l，ph8.0)中和洗脫物，取10μl用於滴度測定，其餘洗脫物擴增後用於下一輪淘選。第二輪和第三輪淘選採用競爭洗脫，分別用50和25ng/ml的afb1溶液在37℃，孵育1h。
經三輪淘選後，採用輔助噬菌體km13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用間接phage-elisa和間接競爭phage-elisa測定噬菌體顆粒的結合活性和特異性，實驗設定陰性對照及背景對照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-elisa加樣表
將elisa陽性克隆送生物技術服務公司進行序列測定，得到插入片段的dna序列，其編碼針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體，具體如下：
g8(seqidno.:2):
cagttgcagctcgtggagtcagggggaggattggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactctttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccacgtattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
g4(seqidno.:4)：
caggtgcagctcgtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctacgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattactactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
d7：(seqidno.:6)：
cagttgcagctcgtggagtccggtggaggcttggtgcaggttggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatttggtggactgttggtgctccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaatagcctgaaagttgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttaattactactcctcaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
c6:(seqidno.:8)：
caggtgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
h4:(seqidno.:10)：
cagttgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
h8：(seqidno.:12)：
caggtgcagctcgtggagtcggggggaggagcggtgcaggctgggggctctttgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggacttttgatgccccatactatgcagactccgtgaagggtcgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctacaaatgaacaacctgagccctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccgctccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
e12:(seqidno.:14)：
cagttgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcagcctggggggtctctcacactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcacaacgtatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatgtggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatcactagagacagcgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgttagatacccgccgcagttatgttgattaccgctcctcaagtgagtatgattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
依據dna測序結果及密碼子表可獲得相應的針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體的胺基酸序列：
g8(seqidno.:1)：
qlqlvesggglvqagdslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatlwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtatyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
g4(seqidno.:3)：
qvqlvesggglvqaggstrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyysvseydywgqgtqvtvss
d7：(seqidno.:5)：
qlqlvesggglvqvggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkvedtaiyycaldnrrsyvnyyssseydywgqgtqvtvss
c6:(seqidno.:7)：
qvqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
h4:(seqidno.:9)：
qlqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
h8:(seqidno.:11)：
qvqlvesgggavqaggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtfdapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnnlspedtaiyycaldnrrsyvdyrsvseydywgqgtqvtvss
e12:(seqidno.:13)：
qlqlvesggglvqpggsltlscaasgrtfttygmgwfreapgkerefvatmwwtvgapyyadsvkgrftitrdsakntvylqmnslkpedtavyycaldtrrsyvdyrssseydywgqgtqvtvss
採用間接競爭phage-elisa法對陽性克隆與幾種不同黃麴黴毒素亞型的交叉反應率進行測定，將afb1、afb2、afg1、afg2和afm1五種標準品稀釋至12個不同的工作濃度，在同樣的條件下進行間接競爭phage-elisa測定，分別繪製競爭elisa曲線，計算抑制率為50％時的標準品濃度(ic50)，按照公式：交叉反應率(％)＝(afb1ic50/類似物ic50)×100％，所述類似物為afb2、afg1、afg2或afm1，得到本發明陽性克隆(針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體)對於afb1的50％抑制濃度。結果表明，本發明陽性克隆(針對黃麴黴毒素的單域重鏈抗體)對於afb1具有較好的特異性，對afg1和afg2也有一定的結合能力。
實施例3：
抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體的規模製備
編碼抗afb1單域重鏈抗體的dna片段的獲取：1.採用限制性內切酶sfii/noti，雙酶切噬菌粒phen-抗afb1單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗afb1單域重鏈抗體基因；2.直接將抗afb1單域重鏈抗體編碼序列送生物技術服務公司進行化學合成；3.設計特異性引物，通過pcr技術從羊駝(lamapacos)來源的cdna庫中擴增。
將得到的抗afb1單域重鏈抗體基因片段克隆至表達載體pet25，經pcr和酶切鑑定，構建完成抗afb1單域重鏈抗體的大腸桿菌表達質粒。
將表達質粒轉化至大腸桿菌bl21，挑取單菌落進行誘導表達。將單菌落接入4mllba(luria-bertanibrothwith100μg/mlampicillin)液體培養基中，37℃、250r/min振蕩培養12h；以1％培養基體積的接種量將其轉接到50mllba液體培養基中，37℃、250r/min振蕩培養至od600達到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mm的iptg，30℃、200r/min誘導培養。
誘導培養物8000r/min離心，在細胞沉澱中加入20ml磷酸緩衝液(ph7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細胞沉澱；在細胞沉澱中加入10ml相同緩衝液，混勻，冰上超聲波細胞破碎處理，超聲破碎條件為200w，破碎2s，間歇3s，共240個循環，在4℃下對細胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進行親和層析純化和sds-page電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存於-20℃冰櫃待用。
通過優化誘導表達條件(如宿主菌、表達載體、誘導培養時間、溫度以及iptg濃度等)，可以進一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達量，為大量製備抗afb1單域重鏈抗體提供了途徑。
實施例4：
抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體的融合表達
將本發明抗afb1單域重鏈抗體基因克隆至融合表達載體pap，經pcr和酶切鑑定，構建完成抗afb1單域重鏈抗體的鹼性磷酸酶融合表達質粒。
鹼性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機磷酸和相應的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號標籤用於elisa、免疫印跡、組織化學等檢測方法。融合表達質粒將抗afb1單域重鏈抗體融合於鹼性磷酸酶的n端，參考應用實例2中的表達方法，可以在大腸桿菌中表達、純化出融合蛋白ap-抗afb1單域重鏈抗體基因。
實施例5：
抗黃麴黴毒素單域重鏈抗體用於黃麴黴毒素b1的檢測
樣品準備：稱取不含黃麴黴毒素的花生、玉米樣品各三份，分別加入afb1標準品10μg/kg,50μg/kg,100μg/kg，用25ml60％的甲醇-pbs溶液渦旋振蕩15min，9000g離心10min，上清經pbs稀釋後待用。
間接競爭酶聯免疫檢測：
用pbs(0.01m，ph7.4)將afb1人工抗原稀釋至0.25μg/ml，100μl/孔，包被於酶標板，4℃過夜，含0.5％tween-20(v/v)的磷酸緩衝液(pbst)洗板5次，拍幹板條，加入3％脫脂牛奶(w/v)，300μl/孔，37℃封閉2h。pbst洗板3次後，每孔加入50μl加入本發明針對afb1單域重鏈抗體和50μlafb1標準品溶液或待測樣品，水平方向輕輕混勻，37℃溫育1h。pbst洗板5次，拍幹，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗histag標籤抗體，100μl/孔，37℃溫育1h。pbst洗板5次，拍幹，加入100μl/孔tmb顯色液，37℃避光顯色5min。加入50μl/孔終止液(2mh2so4)，酶標儀讀數。根據測定的吸光值計算樣品中afb1的含量。
sequencelisting
南昌大學
特異識別afb1的納米抗體
2015
21
patentinversion3.3
1
125
prt
人工序列
1
glnvalglnleuvalgluasnglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
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202530
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dna
人工序列
2
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prt
人工序列
3
glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnalaglygly
151015
serthrargleusercysalaalaserglyargthrglythriletyr
202530
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378
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