一種從蛇毒中分離l－胺基酸氧化酶的方法
2023-12-03 13:51:21 1
專利名稱：一種從蛇毒中分離l－胺基酸氧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種L-胺基酸氧化酶，具體地說涉及一種L-胺基酸氧化酶的分離方法。
背景技術：
L-胺基酸氧化酶能催化L-胺基酸的脫氨基作用，生成相應的α-酮酸，氨和過氧化氫。在工業生產上，L-胺基酸氧化酶被用來生產α-酮酸；在L-胺基酸和D-胺基酸混和物中能降解L-胺基酸，從而分離出D-胺基酸。L-胺基酸氧化酶還可用來製備測定L-胺基酸的酶電極。蛇毒是L-胺基酸氧化酶的主要來源之一。蛇毒的黃色就是L-胺基酸氧化酶產生的。目前已經從蛇毒中分離到多個L-胺基酸氧化酶，並對它們的理化性質以及生理活性進行了大量的研究，發現L-胺基酸氧化酶有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抑制或者誘導血小板聚集等活性，這些活性直接或者間接與其酶反應產生的過氧化氫有關。
蛇毒L-胺基酸氧化酶具有許多共同特徵它們都是由兩個相同亞基構成，表觀分子量在120kD左右；每個亞基在60kD左右；都含有兩個非共價結合的輔基FAD或者FMN。研究表明冷凍和pH變化使輔基脫離而導致酶活性的降低甚至喪失。目前報導的L-胺基酸氧化酶分離工藝中，大多數都包括濃縮和透析換緩衝體系的步驟，這必然造成對該酶活性的影響，從而影響對該酶酶學性質和生理活性的研究以及在工業上的應用。因此，尋找一種能夠在較短時間內，沒有濃縮和緩衝體系變化的L-胺基酸氧化酶分離方法對於該酶的深入研究和開發利用有著極為重要的作用。
發明內容
本發明的目的在於針對現有L-胺基酸氧化酶分離技術中包括濃縮和透析換緩衝體系，從而對L-胺基酸氧化酶酶活性造成影響的問題，提供一種沒有濃縮和透析換緩衝體系的L-胺基酸氧化酶分離方法。
本發明的技術方案是這樣實現的一種從白眉蝮蛇蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特點在於通過親和層析和離子交換層析兩步層析法實現。
其中，上述的親和層析為肝素親和層析；上述的離子交換層析為陰離子交換層析。
上述的肝素親和層析包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解於Tris-HCl緩衝液中，離心，取上清液；(2)裝柱流動相A液為Tris-HCl緩衝液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過上述樣品處理的蛇毒樣品上清液；(3)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然後用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；
(4)收集檢測收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測洗脫液。上述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解於25mmol/L Tris-HCl緩衝液中，pH＝8.5，在4℃條件下，10000r/min離心10min，取上清液；(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose FastFlow，流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到電導值不變化時，再上經樣品處理的蛇毒樣品；(3)洗脫先用50mL A液洗脫後，再以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，然後用100％B洗柱50mL，流速為2mL/min；(4)收集檢測用分步收集器收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測蛋白質含量。
上述的陰離子交換層析包括如下步驟(1)裝柱流動相A液為Tris-HCl緩衝液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過權利要求(4)所述親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然後用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(3)檢測收集收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測洗脫液，收集含L-胺基酸氧化酶的洗脫液上述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用100mL A液洗脫後，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然後用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測收集用部分收集器收集洗脫液，在波長為280nm下檢測洗脫液，收集含L-胺基酸氧化酶的洗脫液。
上述的肝素親和層析和陰離子交換層析都是在AKTA Prime設備上進行。
本發明的有益效果本發明通過肝素親和層析和陰離子交換層析兩步柱層析法從蛇毒中分離出L-胺基酸氧化酶。所分離的L-胺基酸氧化酶在SDS-PAGE電泳圖中呈現一條帶，分子量約為58000。本發明方法簡單、耗時短、回收率高，並且無濃縮和緩衝體系變換的步驟，有效避免了冰凍和pH變化對酶活性的影響，便於推廣，可線形放大到生產工藝中。
圖1為蛇毒樣品在Heparin-Sepharose Fast Flow上的分離圖；圖2為LAO活性峰在Q-Sepharose High Performace上的分離圖譜；圖3為LAO在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳圖譜。
其中，圖1中，L-胺基酸氧化酶活性在穿透峰中；圖3中，1為標準蛋白，2為白眉蝮蛇粗毒，3為Heparin-Sepharose Fast Flow下穿透峰，4為Q-Sepharose High Performace分離後的活性峰，SDS-PAGE凝膠濃度為12.5％。
具體實施例方式
實施例1、肝素親和層析(1)樣品處理稱取白眉蝮蛇蛇毒200mg，溶解於5mL 25mmol/LTris-HCl緩衝液中(pH8.5)中，在4℃條件下，10000r/min離心10min。取上清液。
(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose Fast Flow。流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.5)，B液為含有1mol/L的NaCl的A液。用A液充分平衡到電導值不變化時，上蛇毒樣品。
(3)洗脫A液50mL後，以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，再用100％B洗柱50mL；流速為2mL/min。
(4)收集檢測用分步收集器收集洗脫液，每管收集3mL，在280nm的光吸收下檢測蛋白質含量。整個層析過程在AKTA Prime設備上進行。
2、陰離子交換層析，(1)裝柱色譜柱體積為75ml，流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過親和層析的蛇毒樣品；
(2)洗脫先用100mL A液洗脫後，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然後用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測收集用部分收集器收集洗脫液，每管收集4ml，在波長為280nm下檢測洗脫液，收集含L-胺基酸氧化酶的洗脫液。整個層析過程在AKTA Prime設備上進行。
權利要求
1.一種從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)親和層析；(2)離子交換層析。
2.根據權利要求1所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於步驟(1)所述的親和層析為肝素親和層析。
3.根據權利要求1所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於步驟(2)所述的離子交換層析為陰離子交換層析。
4.根據權利要求2所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於所述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解於Tris-HCl緩衝液中，離心，取上清液；(2)裝柱流動相A液為Tris-HCl緩衝液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過上述樣品處理的蛇毒樣品上清液；(3)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然後用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(4)收集檢測收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測洗脫液。
5.根據權利要求3所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於所述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動相A液為Tris-HCl緩衝液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然後用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(3)檢測收集收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測洗脫液，收集含L-胺基酸氧化酶的洗脫液。
6.根據權利要求4所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於所述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解於25mmol/L Tris-HCl緩衝液中，pH＝8.5，在4℃條件下，10000r/min離心10min，取上清液；(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose FastFlow，流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到電導值不變化時，再上經樣品處理的蛇毒樣品；(3)洗脫先用50mL A液洗脫後，再以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，然後用100％B洗柱50mL，流速為2mL/min；(4)收集檢測用分步收集器收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測蛋白質含量。
7.根據權利要求5所述的從蛇毒中分離L-胺基酸氧化酶的方法，其特徵在於所述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動相A液為25mmol/L Tris-HCl緩衝液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導值不變化時，再上經過親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用100mL A液洗脫後，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然後用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測收集用部分收集器收集洗脫液，在波長為280nm下檢測洗脫液，收集含L-胺基酸氧化酶活性的洗脫液。
全文摘要
本發明公開了一種從白眉蝮蛇蛇毒中分離L－胺基酸氧化酶的方法。本發明的特點是通過Heparin－Sepherose Fast Flow和QSepherose Fast Flow兩步柱層析法從長白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化出L－胺基酸氧化酶。該方法中不含有濃縮和緩衝體系變換的步驟，有效避免了冰凍和pH變化對酶活性的影響。本發明的方法簡單、耗時短、回收率高，便於推廣。
文檔編號C12N9/02GK1614012SQ200410052289
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月19日 優先權日2004年11月19日
發明者何韶衡, 魏繼福 申請人:汕頭大學醫學院