一種複合中草藥飼料添加劑及其製備方法與流程
2023-12-05 11:14:26 2
本發明屬於動物飼料領域，具體涉及一種複合中草藥飼料添加劑及其製備方法。
背景技術：
現代人們對食品安全高度重視，對肉產品品質要求不斷提高，防病促生長的激素及抗生素等易產生抗藥性和藥物殘留的飼料添加劑逐步受到限制甚至被陶汰。在保證飼料添加劑符合國家規定的基礎上，天然的中草藥飼料添加劑逐漸體現出了自己的優勢。銀杏和杜仲均為傳統的中藥，它們除具有一般樹葉的營養外，還富含黃酮類化合物、萜內酯、綠原酸、聚戊烯醇等對人和畜禽具有顯著生物活性的化合物。這些活性物質能有效增強動物機體的免疫功能，促進機體免疫器官的發育；能抑制雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌等多種病原微生物；並具有提高動物的繁殖能力和生長性能等作用。近年來的研究表明了以銀杏葉、杜仲葉及其提取物作為家禽、家畜、水產品的飼料添加劑，不僅能預防動物疾病的發生，調節動物免疫功能，減少預防用藥，增加食用安全性，還能提高食用品質，增強口感。
技術實現要素：
本發明針對現有動物飼料添加劑存在的問題，提供一種綠原酸、黃酮類等活性成分含量高的發酵中草藥添加劑，在補充飼料營養的同時，增強動物機體免疫力，增加食品安全性，改善食用品質。
一種複合中草藥飼料添加劑，主要由以下重量組份原料經葡萄牙棒孢酵母和黑麴黴發酵而成：銀杏葉和杜仲葉50-60％，水30-35％，麩皮5-12％，葡萄糖1-2％，氮源1-2％，緩衝劑和無機鹽1-2％；所述銀杏葉：杜仲葉重量比＝0.5-4:1。
進一步地，葡萄牙棒孢酵母的接種量為葡萄牙棒孢酵母乾粉佔銀杏葉和杜仲葉總乾重的0.25-2％，黑麴黴的接種量為黑麴黴孢子佔銀杏葉和杜仲葉總乾重的0.5-4％。
上述組份中添加了適量的葡萄糖和氮源，可以啟動葡萄牙棒孢酵母加速進入對數生長期，葡萄牙棒孢酵母在生長過程中會產生碳源和氮源等營養成分。黑麴黴利用葡萄牙棒孢酵母生長產生的營養成份和麩皮提供較易分解的纖維素營養來啟動快速繁殖，進而分解銀杏葉和杜仲葉中的纖維素、半纖維素等物質。葡萄牙棒孢酵母和黑麴黴協同生長、代謝，可以分解、轉化中藥中的纖維素、糖類、蛋白質等成分，使中藥細胞破壁，使綠原酸、黃酮類物質等活性物質釋放出來，且微生物在生長代謝過程中產生的一些代謝產物可以改變中藥的活性成分，提高產品的功能性，同時提升葉子的可消化吸收性。
進一步地，所述氮源包括(NH4)2SO4、NH4NO3等。
進一步地，所述緩衝劑包括KH2PO4、K2HPO4等。
進一步地，所述無機鹽包括MgSO4、MgCl2等。
進一步地，所述發酵溫度為23-32℃，更優選28℃。
進一步地，所述發酵時間為48-120h，更優選96h。
進一步地，所述添加劑餵養動物的添加量為0.5-4g/100g基礎飼料，更優選1g/100g。
上述複合中草藥飼料添加劑的製備方法，包括以下步驟：
(1)發酵原料的配製：將50-60％的銀杏葉和杜仲葉、5-12％麩皮、1-2％葡萄糖、1-2％氮源、1-2％緩衝劑和無機鹽以及餘量水按比例混合均勻，滅菌；
(2)以銀杏葉和杜仲葉總乾重計接種葡萄牙棒孢酵母乾粉0.25-2％及黑麴黴孢子0.5-4％，進行發酵。
進一步地，滅菌條件為121℃下滅菌20-30min。
本發明以銀杏葉與杜仲葉為原料復配培養基，並聯合葡萄牙棒孢酵母、黑麴黴複合菌固態發酵，製備得到的飼料添加劑，其主要營養成份、以總黃酮和綠原酸為主的活性物質含量大大提高，添加到飼料中後使風味和適口性有了較大改善。在補充飼料營養的同時，有效增強動物機體免疫力，增加食品安全性，提高食用品質，增強口感。
附圖說明
圖1實施例1銀杏與杜仲葉配比對總黃酮和綠原酸含量的影響；
圖2實施例2黑麴黴接種量對總黃酮和綠原酸含量的影響；
圖3實施例3培養溫度對總黃酮和綠原酸含量的影響；
圖4實施例4培養時間對總黃酮和綠原酸含量的影響。
生物材料樣品保藏信息：
葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No.9836；
黑麴黴(Aspergillus.niger)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No.9776。
具體實施方式
下面結合具體實施例及附圖對本發明做進一步詳細說明。
材料準備：
銀杏葉：2014年10月採集於南京林業大學銀杏園，幹制葉；杜仲葉：2014年12月採集於河南理工大學杜仲園，自然落葉收集，自然晾曬後；麩皮：市售。以上試驗材料均60℃烘乾、磨成粉，過40目篩，密封保存備用。
總黃酮、綠原酸的提取：稱取乾燥複合中藥發酵物5.0g，在超聲波功率500W條件下，固液比1:15、乙醇濃度70％、提取溫度為50℃條件下，提取20min，累計提取兩次，合併提取液。
總黃酮含量的測定：(1)蘆丁對照品溶液製備：精密稱取在120℃乾燥至恆重的蘆丁對照品20mg，置100ml容量瓶中，加70％乙醇適量，置水浴鍋上微熱(40℃)使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，搖勻，即得0.2mg/ml的蘆丁對照品溶液。(2)可見光度法掃描及標準曲線的製備：分別移取蘆丁對照品溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置25ml的容量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亞硝酸鈉溶液1.0ml，混勻，放置6min，加10％硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min。以0.0ml蘆丁配置溶液為空白，在200～800nm的範圍內進行光譜掃描，得505nm處為可見光最大吸收峰。以空白試劑為參比，將6個標準品溶液分別在505nm下測定吸光度，以蘆丁對照品的濃度為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪製標準曲線，得回歸方程A1＝11.1556C1+0.0061，R＝0.9997。蘆丁濃度在0.0～48.0mg/L範圍線性關係良好。(3)將提取液離心、抽濾後，全部定容到200ml容量瓶中，分別準確量取2.5ml、5ml到25ml的容量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亞硝酸鈉溶液1.0ml，混勻，放置6min，加10％硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min。在505nm處測量其吸光值，根據其標準曲線回歸方程計算提取液中總黃酮濃度C1(mg/L)。
綠原酸含量的測定：(1)綠原酸對照品溶液的製備：精密稱取在120℃乾燥至恆重的綠原酸對照品20mg，置100ml容量瓶中，加分析純乙醇適量，置水浴鍋上加熱(60℃)使溶解，放冷，加分析純乙醇至刻度，搖勻，即得0.2mg/ml的綠原酸對照品溶液。(2)可見光度法掃描及標準曲線的繪製：分別移取0.0ml、0.8ml、1.6ml、2.4ml、3.2ml、4ml、4.8ml上述對照品溶液到25ml的容量瓶中，用0.2mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，此為標準系列溶液。以0.0ml蘆丁配置溶液為空白，在200～800nm的範圍內進行光譜掃描，得328nm處為可見光最大吸收峰。在328nm處測定吸光值，以綠原酸標準品的濃度為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪製標準曲線，得回歸方程：C2＝19.0490A1-0.0744，R＝0.9984。綠原酸濃度在0.0～38.4mg/L範圍線性關係良好。(3)將提取液離心、抽濾後，全部定容到200ml容量瓶中，分別準確量取2.5ml、5ml到25ml的容量瓶中，用0.2mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，在328nm處測量其吸光值，根據其標準曲線回歸方程計算提取液中綠原酸濃度C2(mg/L)。
實施例1-15均按照以下步驟製備複合中草藥飼料添加劑：
(1)發酵原料的配製：向54％的銀杏葉和杜仲葉(銀杏葉：杜仲葉重量比＝0.5-4:1)中添加31.5％的水，10％的麩皮、1.5％的葡萄糖、1％的(NH4)2SO4、1％的KH2PO4和1％的MgSO4·7H2O，混合均勻，121℃下滅菌20-30min；
(2)無菌環境中接種1％的葡萄牙棒孢酵母乾粉及0.5-4％的黑麴黴孢子(以銀杏葉和杜仲葉總乾重計)；
(3)23-32℃培養箱中培養48-120h。
實施例1銀杏葉與杜仲葉配比對總黃酮和綠原酸含量的影響
在其它條件(黑麴黴接種量2％，發酵溫度28℃，發酵時間96h)確定的情況下，考察銀杏葉與杜仲葉質量比例(0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結果如圖1，隨著銀杏葉質量比重的增加，總黃酮含量較明顯增加，綠原酸含量有所降低，在比例2:1開始，綠原酸含量降低明顯。分析可能是杜仲葉中杜仲膠較大比例存在時，抑制了菌類的生長。
實施例2黑麴黴接種量對總黃酮和綠原酸含量的影響
在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質量比例2:1，發酵溫度28℃，發酵時間96h)確定的情況下，考察黑麴黴接種量(0.5％、1％、2％、3％、4％)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結果如圖2，隨著黑麴黴接種量的增加，總黃酮和綠原酸的含量均出現明顯提升趨勢，當接種量達到2％時，總黃酮量增勢減緩，對綠原酸的影響較小。
實施例3培養溫度對總黃酮和綠原酸含量的影響
在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質量比例2:1，黑麴黴接種量2％，發酵時間96h)確定的情況下，考察培養溫度(23℃、25℃、28℃、30℃、32℃)對對總黃酮和綠原酸含量的影響，結果如圖3，隨著培養溫度的升高，總黃酮和綠原酸的先升後降。
實施例4培養時間對總黃酮和綠原酸含量的影響
在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質量比例2:1，黑麴黴接種量2％，發酵溫度28℃)確定的情況下，考察培養時間(48h、72h、84h、96h、120h)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結果如圖4，隨著培養時間的延長，總黃酮和綠原酸的含量均有明顯提升，而後出現不同程度的下降。
實施例5-15
採用不同的因素參數組合製備發酵物，涉及到的參數如表1所示，各實施例所採用的參數及總黃酮、綠原酸的測定結果如表2所示。
表1銀杏-杜仲葉複合中草藥發酵工藝因素
表2銀杏-杜仲葉複合中草藥發酵工藝及結果
從表2中可以看出，實施例10得到的固態發酵產品總黃酮含量為2.124％，綠原酸的含量為0.421％，均最高，因此發酵的最佳工藝條件為：銀杏葉：杜仲葉2：1，黑麴黴接種量2％，培養溫度28℃，培養時間96h。
從上述實施例結果來看：當杜仲葉比例較高時，微生物的停滯期略長，可能是由於杜仲葉中含有杜仲膠的原因，由此推測可能當杜仲膠含量降低到一定水平的時候對微生物生長的影響可以忽略。微生物比例超過一定量或者培養時間長到一定時間時，總黃酮和綠原酸含量不升反降，應該是由於微生物生長過程中會部分消耗黃酮類物質和綠原酸，而且微生物的不同生長階段消耗黃酮類物質和綠原酸的比例也有變化。
將實施例10的產品添加到動物飼料中，以預飼7日的白羽雞為餵養試驗對象，分對照組和試驗組，試驗組的投入量為四個梯度0.5％、1.0％、1.5％、2％(g/g基礎飼料重量)，餵養45日後，通過測量體重、脾臟、胸腺、法氏囊質量和小腸長度等，來計算餌料轉化率，分析不同劑量複合中草藥發酵產物對白羽雞在促生長、提升免疫力和抗應激能力等方面的效果及合適的投放量。
從表3的結果來看，實驗組比對照組的餌料轉化率、末重、胸腺指數和法式囊指數分別有明顯提高，說明對於白羽雞的中樞免疫器官產生了明顯影響，提升了雞的免疫力。同時，從色澤和肌質看雞肉品質也有所改善。
表3相對於對照組，不同添加劑量的各種指數提升比例