免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法
2023-12-09 06:33:56
專利名稱：免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法
技術領域：
本發明涉及的是一種檢測技術領域的方法，具體是一種免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法。
背景技術：
膠體金粒子作為標記物應用於免疫分析是20世紀70年代由Faulk等發明的，主要是利用它的光學性能，即膠體金粒子本身有顏色，可通過肉眼觀察免疫分析結果。目前應用較多的分析方法為斑點免疫金滲濾法和膠體金免疫層析法，該技術已經在臨床醫學檢驗中得到了廣泛應用，有大量的報導，其基本原理是以微孔膜為固相載體，包被目標物(即被測物)的抗原或抗體，加入待測樣本後，經微孔膜的滲濾作用或毛細管虹吸作用使標本中的目標物與膜上包被的抗原或抗體結合，再通過膠體金標記物與之反應形成紅色的可見結果。但是這兩種方法要求固相載體膜必須有較好的蛋白結合力、合適的孔徑大小、較好的抗張強度，對膜的要求較高，目前應用的膜大多是從國外進口，成本高，另一方面，單純以膠體金顯色深淺來判斷結果，只能進行定性或半定量測定，靈敏度低，對於某些抗原或抗體含量極低的樣本，會造成假陰性，檢出率較低。
經對現有技術的文獻檢索發現，為了改進上述方法的缺陷，中國專利名稱「免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記快速診斷試劑盒」，公開號CN 1335503A，該專利將磁珠和膠體金同時標記在目標物的抗體或抗原上，通過免疫反應與膜上包被的抗原或抗體結合，形成一檢測帶，用肉眼對檢測帶進行初步定性或半定量檢測的基礎上，以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測，該方法提供了定量檢測的思路，但需要價格昂貴的超微量磁定量檢測儀，且對於極微量磁珠的檢測靈敏度低。
發明內容
本發明針對現有技術的不足和缺陷，提供一種免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，使其利用膠體金的螢光淬滅特性，對被測物進行定量檢測，檢測靈敏度高，定量範圍廣，方法簡單，成本低。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明將目標物(即被測物)的抗體或抗原連接在微小顆粒或微孔上形成固相載體，加入被測樣品，再加入過量膠體金標記物，樣品中的目標物與固定在微顆粒或微孔板上的抗體或抗原進行免疫反應，形成抗原抗體的固相載體複合物即結合物，及未反應的膠體金標記物即游離物，分離結合物與游離的膠體金標記物，在游離物中加入螢光物質，使得螢光信號淬滅，信號淬滅的程度與體系中游離的金標記物量相關，游離物的量與目標物的量相關，從而對目標物進行定量檢測。
所述的微小顆粒可以選用磁性顆粒、聚丙烯醯胺顆粒、聚苯乙烯顆粒、玻璃顆粒、聚丙烯顆粒、矽橡膠顆粒、纖維素顆粒、交聯葡聚糖顆粒、金黃色葡萄球菌的菌體中的任意一種，顆粒粒徑根據原料和製備方法的不同可以是納米至毫米級。
所述的微孔可以選用塑料製品做成的小試管、離心管、微孔板中的任意一種，孔徑是毫米級。
所述的固相載體形成是通過常規方法即靜電作用、疏水作用、生物分子間的特異作用、化學連接劑將目標物的抗體或抗原連接到微小顆粒或微孔載體的表面。
所述的膠體金標記物的製備，首先用氯金酸(HAuCl4)通過檸檬酸三鈉還原法製備膠體金粒子，再用膠體金粒子標記抗體，標記的方法有三種，一是當pH＝9時通過靜電作用使抗體和膠體金粒子相互結合；二是將抗體水解使抗體的Fab』片斷上的巰基裸露出來，能夠和膠體金粒子形成穩定的Au-S共價鍵，將膠體金標記在抗體上；三是使用含巰基的連接劑將膠體金粒子標記到抗體上。
所述的螢光物質可以是螢光素、羧基螢光素、2-甲氧基螢光素、4，5-二甲氧基螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(10nm以下的半導體材料)等通過光激發可發出螢光信號，且用膠體金粒子可以使其螢光信號淬滅的物質。
本發明將免疫反應的高特異性與膠體金的螢光淬滅性相結合，建立高效、特異、定量的膠體金免疫檢測方法，通過螢光物質與免疫反應中游離的膠體金標記物作用使得螢光信號減弱，根據信號減弱的大小對被測物進行定量檢測，檢測靈敏度高，定量範圍廣，方法簡單，成本低，適用於血樣、尿樣、唾液等樣本，可應用於激素、蛋白質、病毒、毒品、細菌、環境汙染等檢測，常規的生化實驗室都具備實驗條件，便於推廣。
具體實施例方式
實施例1，對於納米顆粒，以磁性顆粒為例，建立免疫膠體金螢光淬滅測量方法，採取如下步驟1、免疫磁顆粒的製備首先用硫酸亞鐵和三氯化鐵在鹼性條件下製備納米四氧化三鐵(Fe3O4)粒子，再採用有機分子處理納米Fe3O4粒子使其表面帶有功能基團(羧基、氨基、醛基、巰基等)。這裡選用表面帶有羧基的磁粒子粒徑為100納米左右，在連接劑碳二亞胺的作用下與抗癌胚抗原(CEA)的單抗連接，製得固相免疫磁顆粒。
2、膠體金標記抗體的製備首先用氯金酸(HAuCl4)通過檸檬酸三鈉還原法製備膠體金粒子，通過調節原料比可得到粒徑不同的納米金顆粒，使用時用0.1摩爾濃度的Na2CO3調節pH9，再加入抗癌胚抗原(CEA)的多抗，在室溫下反應1小時，9500轉/分離心分離，得到膠體金標記的多抗。
3、建立測量方法在試管中加入100μL癌胚抗原(CEA)的標準品(濃度梯度為0，10，20，40，80，120ng/mL)或待測樣品(血清)，200毫克(0.1mL)單抗包被的磁顆粒，以及50μL膠體金標記的多抗，室溫反應3小時，在外加磁場下分離磁顆粒，上清液中加入螢光物質，因為上清液中有游離的膠體金標記物能使螢光信號淬滅，金粒子的量與螢光信號淬滅程度成正相關。這裡螢光物質選用螢光素，用螢光光度計測螢光信號的強度，激發波長為490nm，發射波長為520nm，通過測發射光的強度值對CEA濃度作標準曲線，根據標準曲線求得待測樣品中CEA的含量。該檢測方法的靈敏度為3.8ng/ml，平均回收率98.7％，批內誤差小於7％，批間誤差小於10％。
實施例2，對於微米顆粒，以金黃色葡萄球菌的菌體為例，建立免疫膠體金螢光淬滅測量方法，採取如下步驟1、膠體金標記抗原的製備首先用氯金酸(HAuCl4)通過檸檬酸三鈉還原法製備膠體金粒子，使用時用0.1摩爾濃度的Na2CO3調節pH 8，再加入甲胎蛋白(AFP)，在室溫下反應1小時，9500轉/分離心分離，得到膠體金標記的甲胎蛋白(AFP)。
2、建立測量方法在試管中加入100μL甲胎蛋白(AFP)的標準品(濃度梯度為0，15，30，100，200，400ng/mL)或待測樣品(血清)，100μL兔抗人AFP的多抗(滴度為1∶15000)，以及50μL膠體金標記的AFP，37℃反應2小時，再加入0.1mL含有金黃色葡萄球菌的菌體的溶液，室溫下反應15分鐘，3000轉/分離心，因為金黃色葡萄球菌可分泌蛋白A在細胞壁的黏膜上，蛋白A能與AFP的多抗結合，通過離心可分離結合物和游離物，取上清液，加入螢光物質，因為上清液中有游離的膠體金標記物能使螢光信號淬滅，這裡螢光物質選用藻紅蛋白，用螢光光度計測螢光信號的強度，激發波長為490nm，發射波長為595nm，通過測發射光的強度值對AFP濃度作標準曲線，根據標準曲線求得待測樣品中AFP的含量。該檢測方法的靈敏度為8.6ng/ml，平均回收率101.7％，批內誤差小於10％，批間誤差小於10％。
實施例3，對於微孔，以聚苯乙烯製成的塑料試管為例，建立免疫膠體金螢光淬滅測量方法，採取如下步驟1、試管抗體的包被在聚苯乙烯的試管中加入0.5mL用碳酸鹽緩衝液(pH9.5)配成的抗癌胚抗原(CEA)的單抗(4μg/mL)，4℃下反應過夜，倒掉液體，用磷酸緩衝液洗3次後，加入含1％牛血清白蛋白的磷酸緩衝液封閉1小時，得到包被抗體的反應試管。
2、建立測量方法在包被抗體的試管中加入100μL癌胚抗原(CEA)的標準品(濃度梯度為0，10，20，40，80，120ng/mL)或待測樣品(血清)，100μL膠體金標記的多抗(實施例1中方法製備的)，室溫反應3小時，取反應管中150μL上清液，再加入螢光物質，因為上清液中有游離的膠體金標記物能使螢光信號淬滅，這裡的選用螢光物質量子點CdTe，用螢光光度計檢測溶液的螢光強度，激發波長為450nm，發射波長為560nm，通過測發射光的強度值對CEA濃度作標準曲線，根據標準曲線求得待測樣品中CEA的含量。該檢測方法的靈敏度為5.2ng/ml，平均回收率97.1％，批內誤差小於10％，批間誤差小於15％。
權利要求
1.一種免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵在於，將目標物即即被測物的抗體或抗原連接在微小顆粒或微孔上形成固相載體，加入被測樣品，再加入過量膠體金標記物，樣品中的目標物與固定在微顆粒或微孔板上的抗體或抗原進行免疫反應，形成抗原抗體的固相載體複合物即結合物，及未反應的膠體金標記物即游離物，分離結合物與游離的膠體金標記物，在游離物中加入螢光物質，使得螢光信號淬滅，信號淬滅的程度與體系中游離的金標記物量相關，游離物的量與目標物的量相關，從而對目標物進行定量檢測。
2.根據權利要求1所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的微小顆粒選用磁性顆粒、聚丙烯醯胺顆粒、聚苯乙烯顆粒、玻璃顆粒、聚丙烯顆粒、矽橡膠顆粒、纖維素顆粒、交聯葡聚糖顆粒、金黃色葡萄球菌的菌體中的任意一種。
3.根據權利要求2所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的顆粒粒徑是納米至微米級。
4.根據權利要求1所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的微孔選用塑料製品做成的小試管、離心管、微孔板中的任意一種，
5.根據權利要求4所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的微孔，孔徑是毫米級。
6.根據權利要求1所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的固相載體形成是通過靜電作用、疏水作用、生物分子間的特異作用、化學連接劑將目標物的抗體或抗原連接到微小顆粒或微孔載體的表面。
7.根據權利要求1所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的螢光物質是指發射的光譜能被膠體金顆粒吸收的螢光物質。
8.根據權利要求1或者7所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的螢光物質，是螢光素、羧基螢光素、2-甲氧基螢光素、4，5-二甲氧基螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點中的任意一種。
9.根據權利要求1所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的膠體金標記物的製備，首先用氯金酸HAuCl4通過檸檬酸三鈉還原法製備膠體金粒子，再用膠體金粒子標記抗體。
10.根據權利要求9所述的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，其特徵是，所述的用膠體金粒子標記抗體，標記的方法有三種，一是當pH＝9時通過靜電作用使抗體和膠體金粒子相互結合；二是將抗體水解使抗體的Fab』片斷上的巰基裸露出來，能夠和膠體金粒子形成穩定的Au-S共價鍵，將膠體金標記在抗體上；三是使用含巰基的連接劑將膠體金粒子標記到抗體上。
全文摘要
一種檢測技術領域的免疫膠體金粒子螢光淬滅的測量方法，將目標物即被測物的抗體或抗原連接在微小顆粒或微孔上形成固相載體，加入被測樣品，再加入過量膠體金標記物，樣品中的目標物與固定在微顆粒或微孔板上的抗體或抗原進行免疫反應，形成抗原抗體的固相載體複合物即結合物，及未反應的膠體金標記物即游離物，分離結合物與游離的膠體金標記物，在游離物中加入螢光物質，使得螢光信號淬滅，信號淬滅的程度與體系中游離的金標記物量相關，游離物的量與目標物的量相關，從而對目標物進行定量檢測。本發明檢測靈敏度高，定量範圍廣，方法簡單，成本低。
文檔編號G01N33/52GK1773281SQ200510030659
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月20日 優先權日2005年10月20日
發明者高峰, 崔大祥, 賀蓉, 敖麗梅, 潘碧峰 申請人:上海交通大學