基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法

2023-12-09 02:00:46 1

專利名稱：：基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法
技術領域：
：本發明屬藥物篩選方法領域，涉及應用細胞顯微圖像信息的自動化技術和光學標記、光學測量技術來記錄多孔板內的細胞圖像，通過分析圖像信息來獲取抗腫瘤化合物篩選評價的指標。
背景技術：
：癌症嚴重地威脅著人們的健康，其中肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病是幾種發病率較高的癌症。肺癌已成為我國第一大癌症，且發病率及死亡率增長最為迅速。肝癌發病率則僅次於肺癌，某些地區肝癌發病率呈逐年增高的趨勢，全世界每年死於肝癌的患者約26萬人，我國近10萬人。統計資料顯示，幾乎所有人群的乳腺癌發病率都在上升，平均每年約升高1%，估計全球每年發病患者超過100萬人。儘管對乳腺癌的治療已經取得了很大的進步，但仍然有25%的患者死於該病。而白血病則是20歲以下青年死亡的主要病因之一。白血病的化學治療一直是醫學和藥學研究的重點領域，早期開發的白血病化療藥物特異性不強，既能有效的殺滅腫瘤細胞，又對正常人體細胞有殺傷作用，毒副反應較大，病人很難堅持長期用藥。腫瘤細胞對於藥物或化合物的敏感性通常通過細胞毒試驗得到。細胞毒試驗有很多方法，較為常見的是通過染色手段將細胞的活性信息轉化為光學信號，經檢測光學信號推導出活細胞的數量，從而判斷用藥物產生的細胞毒性。目前，MTT、SRB法是最普遍、最常用的細胞毒實驗方法，已有很多研究者採用該方法進行藥物篩選，但是，這些方法存在速度慢、靈敏度差、自動化程度低等缺陷，難以滿足高通量藥物篩選的需要。其它用於細胞毒性檢測的方法包括HPLC檢測法、同位素標記檢測法和流式細胞儀法等，這些方法存在分別存在手段繁瑣、具有放射性汙染和適用細胞類型有限等不足之處。因此，尋找快速、準確、穩定的藥物篩選方法成為目前腫瘤化療領域中亟待解決的關鍵技術問題。高內涵篩選(highcontentscreening,HCS)是通過顯微成像和掃描的方法來記錄孔板內的細胞圖像，並分析圖像中的空間分辨信息的技術。高內涵篩選通過分析和統計圖像中各個細胞的形態、結構等參數來表徵細胞的生理或病理特徵，其優點在於它能夠很快區分出具有所需生物學效應的化合物和非特異性作用的化合物。例如，凋亡的過程伴隨著很多胞內的代謝途徑的變化，也包含眾多藥物作用的靶標，高內涵篩選應用於藥物誘導細胞凋亡過程的研究，可觀察和區分細胞凋亡過程中的形態學變化標誌，如細胞縮小、染色質濃縮、核膜和核的破裂、凋亡小體形成等。HCS系統可以快速、準確地對各種規格的孔板內經由螢光標記細胞的活性進行定量分析，動態監控細胞在藥物作用下的活性改變，因此本發明中的多維方法可通過測量化合物對多細胞參數的影響來篩選抗腫瘤化合物。
發明內容本發明的目的是提供基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，是運用一套篩選和評價硬體系統，通過不同螢光染料標記和測量細胞內多細胞參數變化實現對抗腫瘤藥物評價和篩選。該篩選和評價硬體系統由高精度電動水雲平臺，螢光視覺系統，圖像採集與處理系統，工作站組成，具體通過以下步驟實現(1)二乙酸螢光素(fluoresceindiacetate,FDA)染色測量活細胞數法FDA本身沒有螢光，它能通過完整細胞膜，在細胞內被酯酶酶切而產生螢光物質。該螢光物質不能通過細胞膜，能在細胞膜完好的細胞內存留，在細胞膜不完整的細胞內散失很快。因此活細胞量等於發射綠色螢光的細胞數量。準確稱取FDAlmg溶於0.1ml二甲亞碸(DMSO)中配成FDA儲備液，分裝於0.5ml離心管中，置於-20'C儲存。臨用前，用PBS稀釋FDA儲備液1000倍待用。A)FDA染色測量活細胞數法線性範圍取對數生長期的人口腔鱗狀細胞(KB)細胞，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化後，以5xl04、lxl04、5xl03、lx103、2xl02、4xl01細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100培養液，每個細胞密度設6個復孔，在37。C、100%溼度、含5%(:02和95%空氣的條件下培養24h。測試前棄去孔內培養液，每孔加入FDA的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)溶液50nL，4'C培養30min後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，拍攝參數為綠色通道(激發光450-490nm、發射光"10nm)，物鏡放大倍數5倍，每孔攝取1幅圖像，然後使用篩選和評價系統的工作站分析所得圖像，計算孔內細胞數。B)FDA染色測量活細胞數法實驗質量控制取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以3"03細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100培養液，在37'C、100%溼度、含5%(:02和95%空氣的條件下培養24h。用lxl(T7M長春新鹼(VCR)作為陽性對照，0.1。/。DMSO作為陰性對照，設4個平行孔，每孔加入200pL培養液。孵育48h後，棄去培養液，每孔加入FDA的PBS溶液50pL，4。C培養30min後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後後使用工作站分析所得圖像，計算孔內細胞數和Z'因子。(2)Hoechst33342和碘化丙啶(propidiumiodide，PI)雙染法評價藥物誘導細胞凋亡細胞發生凋亡時，染色質會固縮。Hoechst33342可以穿透細胞膜，染色後凋亡細胞螢光會比正常細胞明顯增強。PI則不能穿透細胞膜，對於具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對於壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，PI可以染色壞死細胞。上述兩種染料雙染後，使用螢光顯微鏡檢測時，正常細胞為弱紅色螢光+弱藍色螢光，凋亡細胞為弱紅色螢光+強藍色螢光，壞死細胞為強紅色螢光+強藍色螢光。取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以2><103細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100jaL培養液，在37。C、100%溼度、含5%0)2和95%空氣的條件下培養24h後，棄去培養液。分別將不同濃度的長春新鹼(2xl(T7、2xl(T6M)加入孔內，每一藥物濃度設4個平行孔，每孔加入200pL培養液。孵育48h後，棄去培養液，每孔加入細胞凋亡與壞死檢測試劑50pL，4。C培養30min後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後使用工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、紅色螢光強度。(3)FDA、Hoechst33342和PI三染法分析藥物誘導凋亡作用模式雖然Hoechst33342、PI雙染法可以區分藥物作用後細胞凋亡發生的情況，但是由於Hoechst33342、PI兩種都是核染料，因此在藍紅兩個通道下都無法得到細胞的形態學信息，然而區別細胞凋亡最重要的標誌是細胞形態學特徵的變化，如細胞縮小、染色質濃縮、核膜和核的破裂、凋亡小體形成等。為了獲得更多細胞形態學特徵，還需要另一種螢光染料對整個細胞進行標記。FDA的酯酶酶切產物能在活細胞內聚集，因此整個細胞可見綠色螢光。根據表1可知FDA的激發和發射波長與PI和Hoechst都沒有重疊，因此能夠通過不同的濾光片對三種螢光加以區分。表1Hoechst33342、FDA、PI螢光激發和發射波長參數tableseeoriginaldocumentpage7取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以2xl(^細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100pL培養液，在37。C、100%溼度、含5%032和95%空氣的條件下培養24h後，棄去培養液。分別將各種中藥組分和長春新鹼(陽性對照)加入孔內。每一藥物濃度設3個平行孔，每孔加入200]uL培養液。孵育48h後，棄去培養液，每孔加入含FDA的細胞凋亡與壞死檢測試劑50pL，4。C培養30min後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後使用工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、綠色、紅色螢光強度。本發明的篩選和評價硬體系統主要包括高精度電動水雲平臺，螢光視覺系統，圖像採集與處理系統，工作站，其各部分的主要功能分別為(1)高精度電動水雲平臺用來裝載試驗所需的多個由不同藥物處理過的細胞樣本對象，該平臺由步進電機實現控制，能在X-Y兩個方向內以指定步長精確移動，可實現程序控制，將指定孔中的觀測樣本送至顯微鏡觀測處。(2)螢光視覺系統主要部分為具有自動對焦功能的倒置螢光相差顯微鏡。通過顯微鏡將螢光染色過的細胞放大，達到觀測和成像所需要的要求。(3)圖像採集與處理系統主要部分為電耦合圖像傳感器(chargecoupleddevice,CCD)及相應的圖像採集卡(1394卡)，它能夠將顯微鏡的觀測成像，並將簡單處理後的圖像通過所提供的應用程式接口傳送給上位機。(4)工作站包括數據存儲、分析與可視化系統和控制系統。主要用於將取得的原始圖像數據預處理，並存入資料庫，通過圖像處理算法測量細胞統計狀況，得出表徵藥物療效的相關參數指標，並將所成圖像與分析結果可視化，含生成實驗結果報表。控制系統以設計友善的圖形用戶界面的形式體現，為用戶對系統所提的各種具體需求提供接口。在本發明的方法中，表達至少一種靶標或具有靶細胞器的細胞或細胞亞群的至少一種細胞參數在化合物存在或不存在時得以通過光學測量結果的差異來表徵。這些方法可以使用細胞系、穩定或瞬時轉染的細胞或原代細胞，它們表達一種或多種靶標受體或具有靶細胞器。優選地，至少兩種細胞參數得以測量。更優選的，至少三種細胞參數得以測量。本發明的另一個目的是提供基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法在篩選藥物和評價藥物毒性中應用。本發明的有益之處是與傳統的藥物篩選方法相比，本發明提供的基於細胞顯微圖像信息的藥物篩選和評價系統和基於該系統設計的不同螢光染料標記及測量細胞內多細胞參數變化的抗腫瘤藥物篩選和評價方法可使用單個細胞的形態、結構等多方面的信息來表徵細胞的生理或病理特性。因此能夠快速區分出具有所需生物學效應的化合物和非特異性作用的化合物。利用本發明提供的篩選和評價系統及方法能開展亞細胞群的觀察，例如某個分裂周期的細胞、成熟與非成熟細胞，活細胞與死細胞，細胞與細胞碎片等。從原理上來說，只要顯微鏡能夠觀察到的細胞或亞細胞級的形態變化和運動，並可以通過算法加以識別，就可以用本發明提供的篩選和評價系統來進行研究。腫瘤細胞對於藥物或化合物的敏感性通常通過細胞毒試驗得到。然而目前使用較多的MTT、SRB法存在速度慢、靈敏度差、自動化程度低等缺陷，本發明提供的基於細胞顯微圖像信息的藥物篩選和評價系統和FDA染色測量活細胞數法具的線性範圍達到了4個數量級(4xl0^5xl(^細胞/孔)大大超過了MTT、SRB法的動態範圍。且該方法為均相方法，無需分離染料和背染色細胞，因此能夠實現快捷的自動化分析。該方法的線性限低達10i細胞/孔數量級，因此不但可以用於96孔板的篩選，還可以用於通量更高的384孔板、1536孔板的篩選。在優化實驗和拍攝方法後，基於本篩選和評價系統和FDA標記活細胞篩選藥物的方法的Z'因子達到了0.820，是高質量的藥物篩選方法。細胞凋亡指的是細胞程序性死亡的過程，區別細胞凋亡最重要的標誌是細胞形態學特徵的變化，如細胞縮小、染色質濃縮、核膜和核的破裂、凋亡小體形成等[9]。誘導細胞凋亡是廣泛關注的抗腫瘤藥物作用的機理之一。所以，快速檢測化合物是否能誘導細胞凋亡是判斷該化合物是否具有進一步抗腫瘤藥物開發價值的重要判斷標準之一。本發明提供的篩選和評價系統及Hoechst33342、PI雙染法能夠有效的分析藥物作用對核染色體產生的影響，因此可作為藥物誘導細胞凋亡的評價方法。而FDA、Hoechst33342、PI三染法則可作為高內涵藥物作用模式分析評價方法。應用此方法對初級篩選出的有效中藥組分進行研究可以為這藥物組分所含化合物與陽性模型藥的抑制腫瘤生長的機制異同提供了線索，也為進一步分離、純化有效化合物提供了依據。本發明提供的篩選和評價系統和各種螢光標記染法還應用於藥物毒性的篩選和評價。FDA染色測量活細胞數法可用於評價化合物對於細胞的毒性；Hoechst33342、PI雙染法和FDA、Hoechst33342、PI三染法能夠用於分析化合物產生毒性的機理。本發明設計合理，提供的篩選和評價系統結構完整、具有很高的應用價值，填補了國內同類設備的技術空白。在本發明的系統基礎上設計的螢光標記方法既能夠用於進行藥物作用機理的研究，也能夠用於高內涵藥物篩選和毒性分析。圖1基於細胞顯微圖像信息的藥物篩選和評價系統整體系統構架示意圖。圖2工作站界面。圖3FDA標記的不同細胞密度圖像。圖4計算細胞數與初始細胞數關係。圖5Hoechst33342、PI雙染法觀察藥物誘導細胞凋亡。圖6Hoechst33342、PI雙染法分辨不同亞群細胞。圖7FDA、Hoechst33342、PI三染法細胞螢光圖像。圖8FDA、Hoechst33342、PI三染法分辨不同藥物作用模式。具體實施方式下面將結合附圖和實施例進一步詳細說明本發明的實質內容及有益效果，該實施例僅用於說明本發明而非對本發明的限制。試劑-RPMI-1640、DMEM培養基GIBCORL公司；小牛血清GIBCORL公司；硫酸鏈黴素華北製藥有限公司；青黴素鈉江西東風藥業股份有限公司；長春新鹼(vincristine,VCR):HanyePharmaceutical公司；二乙酸螢光素(fluoresceindiacetate,FDA):Sigma-Aldrich,Inc.;細胞凋亡與壞死檢測試劑盒碧雲天公司；其它試劑均為國產分析純。儀器LeikaDM6000型倒置相差螢光顯微鏡、DFC300CCD:德國Leika公司；二氧化碳培養箱ThermoFormaSeriesIIWaterJacketedC02Incubator;SB-840-2型單人雙面淨化工作檯上海博迅實業有限公司醫療設備廠；XW-80A型旋渦混合器上海精科實業有限公司。實施例1細胞顯微圖像信息的藥物篩選和評價系統設計參見圖1，是本發明篩選和評價系統的構架，主要包括高精度電動水雲平臺，螢光視覺系統，圖像採集與處理系統，工作站。參見圖1、圖2，基於細胞顯微圖像信息的藥物篩選和評價系統的各部分的主要功能和性能指標分別為(1)高精度電動水雲平臺用來裝載試驗所需的多個由不同藥物處理過的細胞樣本對象，該平臺由步進電機實現控制，能在X-Y兩個方向內以指定步長精確移動，可實現程序控制，將指定孔中的觀測樣本送至顯微鏡觀測處。平臺最小步長20nm、重複精度lpm。(2)螢光視覺系統主要部分為具有自動對焦功能的倒置螢光相差顯微鏡。通過顯微鏡將螢光染色過的細胞放大，達到觀測和成像所需要的要求。顯微鏡放大倍數x4、xlO、x20、x40、x60，配置電動物鏡轉盤、電動聚光鏡。(3)圖像採集與處理系統主要部分為CCD圖像傳感器及相應的圖像採集卡(1394卡)，它能夠將顯微鏡的觀測成像，並將簡單處理後的圖像通過所提供的應用程式接口傳送給上位機。CCD性能參數為1392x1040像素、16位色深、低於環境溫度20"C。(4)工作站包括數據存儲、分析與可視化系統和控制系統。主要用於將取得的原始圖像數據預處理，並存入資料庫，通過圖像處理算法測量細胞統計狀況，得出表徵藥物療效的相關參數指標，並將所成圖像與分析結果可視化，含生成實驗結果報表。控制系統以設計友善的圖形用戶界面的形式體現，為用戶對系統所提的各種具體需求提供接口。實施例2FDA染色測量活細胞數法1.實驗方法準確稱取FDA1mg溶於0.1mlDMSO中配成FDA儲備液，分裝於0.5ml離心管中，置於-2(TC儲存。臨用前，用PBS稀釋FDA儲備液1000倍待用。a)FDA染色測量活細胞數法線性範圍取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以5xl04、lxl04、5xl03、lx103、2xl02、4xli細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100pL培養液，每個細胞密度設6個復孔，在37°C、100%溼度、含5%C02和95%空氣的條件下培養24h。測試前棄去孔內培養液，每孔加入FDA的PBS溶液50pL，4'C培養30min後用篩選和評價系統採集孔內細胞圖像，拍攝參數為綠色通道(激發光450-490nm、發射光〉510nm)，物鏡放大倍數5倍，每孔攝取1幅圖像。然後使用篩選和評價系統的工作站分析所得圖像，計算孔內細胞數。b)FDA染色測量活細胞數法實驗質量控制取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以3><103細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100pL培養液，在37'C、100%溼度、含5%0.5)，說明FDA染色法測量活細胞數的方法具有有很好的實驗質量，適合進行高通量篩選。表2FDA染色法測量細胞存活率tableseeoriginaldocumentpage12本篩選和評價系統進行細胞或亞細胞水平形態分析的基礎就是細胞或細胞結構的自動化分割、識別。本發明以FDA染色法標記活細胞為實例測試了本發明的篩選和評價系統的軟體預處理圖像和分割、識別單個細胞的能力。雖然實驗結果表明細胞分割、識別仍存在一些誤差，但是本篩選和評價系統已經能夠滿足細胞分割和識別的需求。細胞分割、識別誤差主要來源為實驗方法和軟體兩方面(1)接種細胞時細胞密度是由血球計數板進行計數，所以在細胞密度低於1000細胞/孔時，"初始細胞密度"只是是一個近似值，並不能十分準確的反映孔內的細胞密度，而且孔與孔之間細胞密度的差異也會比較大。因此在細胞密度比較低的情況識別細胞密度的方差較大，而且與"初始細胞密度"存在的偏差也比較大。(2)本發明的工作站識別細胞的誤差。主要的識別誤差為漏識別。這種情況在圖片邊緣的區域裡比較明顯，主要原因是顯微鏡的螢光激發光光源強度不均勻，造成邊緣區域較暗使螢光發射強度較低，細胞與背景之間差異太小。同時CCD曝光參數設置不當也造成在高細胞密度時，照片中央部分曝光過度活邊緣部分曝光不足，也會增加識別的誤差。因此降低識別的誤差的主要需要在實驗和拍攝方法上進行優化(1)實驗方法的優化主要表現在選擇適當細胞密度和螢光染色方法上。實驗表明細胞密度在lxl0。3-1xl0。4細胞/孔時，細胞間隙較大，易於識別，且孔間初始細胞密度差異小，實驗質量高。FDA染色後按照常規的37'C培養30min，由於螢光物質產生過快，滲透到胞外溶液中的螢光物質多，背景螢光較強，降低了信噪比；而在4。C培養30min後胞內綠色螢光明顯，且滲透到胞外溶液中的螢光物質少，細胞-背景差異大，具有很好的信噪比。(2)拍攝方法的優化主要是在改進汞燈照明均一度和CCD曝光參數選擇兩個方面。選取放大倍數較小的C接口(Cmount)或者截取圖像中間部分進行分析，可以避免照明均一度的影響，但分析等量細胞數所需的圖像數要增加。而通過使用Leika提供的SDK中自動選擇CCD曝光參數的模塊能夠進一步優選出好的曝光參數進行拍攝。通過優化實驗和拍攝方法，我們建立了基於本發明的篩選和評價系統和FDA標記活細胞的藥物篩選方法，該方法Z'因子達到了0.820，是高質量的藥物篩選方法。實施例3Hoechst33342和碘化丙瞎(propidiumiodide，PI)雙染法測量藥物誘導細胞凋亡1.實驗方法取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以2X103細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100pL培養液，在37。C、100%溼度、含5%(]02和95%空氣的條件下培養24h後，棄去培養液。分別將不同濃度的長春新鹼(2xl(T7、2xl0"6M)加入孔內，每一藥物濃度設4個平行孔，每孔加入200^L培養液。孵育48h後，棄去培養液，每孔加入細胞凋亡與壞死檢測試劑50pL(C1056-l細胞染色緩衝液50fxL，C1056-2Hoechst33342染色液0.25pL，C1056-3PI染色液0.25pL)，4。C培養30min後用Di-HCS採集孔內細胞圖像，拍攝參數為藍色通道(激發光340380nrn、發射光〉400nm)，紅色通道(激發光515560、發射光>590nm)，物鏡放大倍數5倍，每孔同一視野下各通道攝取1幅圖像。然後使用Di-HCS工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、紅色螢光強度。2.結果用CCD攝取藍色和紅色兩個通道下，不同濃度藥物處理後細胞的圖像如圖5A、B所示。參見圖6，表明經Hoechst33342、PI雙染後，在螢光顯微鏡下可以區分藥物誘導細胞凋亡發生的情況。傳統的流式細胞儀法在凋亡細胞的分析中具有廣泛應用，運用細胞儀對Hoechst33342、PI雙染的細胞進行凋亡分析的優點在於可對單個細胞進行分析；可同時對凋亡細胞、活細胞和死細胞進行分析；可用來分析凋亡細胞的百分比；檢測靈敏度高[2]。但是流式細胞儀所需樣品量較大，操作過程繁瑣，特別是對於貼壁細胞需要使用酶消化、懸浮後才能進行檢測，破壞了細胞原有生長狀態，並且無法進行大規模自動化分析。基於本篩選和評價系統的Hoechst33342、PI雙染法不但保留了流式細胞儀進行凋亡分析的優點，而且克服了其分析貼壁細胞操作繁瑣的缺點，直接對孔板內原位生長的細胞凋亡情況進行了分析。使用篩選和評價系統的工作站對兩通道螢光圖像進一步分析可得細胞螢光強度的二元分布圖(參見圖7)，可同時分辨3種不同亞群細胞弱紅色螢光+弱藍色螢光為正常細胞(左下)；弱紅色螢光+強藍色螢光為早期凋亡細胞(右下)；強紅色螢光+強藍色螢光為晚期凋亡和壞死細胞(右上)。用2x10—7、2xl0—6M長春新鹼處理KB細胞48h後，早期凋亡細胞的百分比分別增加了3.49%禾口6.92%，晚期凋亡和壞死細胞的百分比分別增加了14.37%和15.18%，而正常細胞的百分比分別下降了9.23%和17.83%,說明長春新鹼誘導KB細胞產生了凋亡和壞死。實驗結果表明基於本篩選和評價系統的Hoechst33342、PI雙染法可以有效分析藥物作用後多孔板上貼壁細胞的凋亡發生的情況，並可同時分析凋亡細胞、活細胞和死細胞，其分析的靈敏度達到了單細胞水平。實施例4FDA、Hoechst33342和PI三染法分析藥物誘導凋亡作用模式1.實驗方法取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，以2乂103細胞/孔的密度接種於96孔培養板上，每孔含100pL培養液，在37"C、100%溼度、含5%(302和95%空氣的條件下培養24h後，棄去培養液。分別將中藥組分65-15(2(ig/mL)，62-15(2pg/mL)，14B05(2jig/mL)和長春新鹼(lxl(T7M，陽性對照)加入孔內。每一藥物濃度設3個平行孔，每孔加入200pL培養液。孵育48h後，棄去培養液，每孔加入含FDA的細胞凋亡與壞死檢測試劑50pL(C1056-l細胞染色緩衝液50pL，C1056-2Hoechst33342染色液0.25jiL，C1056-3PI染色液0.25pL,FDA儲備液0.05^L)，4。C培養30min後用Di-HCS採集孔內細胞圖像，拍攝參數為藍色通道(激發光340380nm、發射光〉400nm)，綠色通道(激發光450-490nm、發射光〉510nm)、紅色通道(激發光515~560、發射光〉590nm)，物鏡放大倍數5倍，每孔同一視野下各通道攝取l幅圖像。然後使用Di-HCS工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、綠色、紅色螢光強度。2.結果通過篩選和評價系統攝取藍色、綠色和紅色三個通道下細胞的原始圖像參見圖8A、B、C所示。因為篩選和評價系統使用的發射光濾光片為低通濾光片，所以在藍色通道中綠色和紅色螢光對藍色螢光有較大幹擾；而由於FDA的螢光強度大於PI的螢光強度，綠色通道中紅色螢光對綠色螢光只有較弱幹擾。因此需要通過圖像處理算法進行校正，以消除螢光交叉幹擾。使用篩選和評價系統的工作站消除螢光交叉幹擾後的圖像參見圖8D、E、F所示，在藍色、和綠色通道中其他螢光的影響已經基本除去。消除螢光交叉幹擾後，可使用工作站對三通道螢光圖像進行綜合分析得到的細胞螢光強度的三元分布圖(參見圖9)。它作為區分藥物誘導細胞凋亡模式的依據從圖9A可以看出陰性對照組的細胞多分布在高細胞活性區域(強綠色螢光)，而早期凋亡細胞(強藍色螢光+弱紅色螢光)較少，死細胞或晚期凋亡細胞(強紅色螢光+強紅色螢光)較早期凋亡細胞多。lxl(T7M作用後(參見圖9B)，細胞在低細胞活性區域(弱綠色螢光)分布明顯增加，且早期凋亡細胞(強藍色螢光+弱紅色螢光)比例高。通過比較三元分布圖可以對不同劑量中藥組分誘導細胞凋亡的模式進行分析(1)組分65-15的作用後早期凋亡細胞、死細胞或晚期凋亡細胞比例無明顯提高，但高活性細胞比例有所下降。(2)組分14B05使早期凋亡細胞和死細胞或晚期凋亡細胞比例增加，高活性細胞比例有所下降。(3)組分62-15顯著增加早期凋亡細胞比例，細胞基本分布在低活性區域。以上分析可知組分65-15的誘導細胞凋亡模式與長春新鹼有較大相似性，而組分14B05和組分62-15的作用模式與長春新鹼差異較大，提示了它們所含化合物抑制腫瘤生長的機制可能與長春新鹼有較大區別。實驗結果表明基於本篩選和評價系統的FDA、Hoechst33342、PI三染法能夠在細胞水平分析藥物抑制細胞生長的作用模式，為藥物作用機制的研究提供線索。本發明涉及的參考文獻[1]ZhangJH，ChungTDY，OldenburgKR.Asimplestatisticalparameterforuseinevaluationandvalidationofhighthroughputscreeningassays.JournalofBiomolecularScreening1999;4:67-73.[2]慈雲祥，張春陽，馮軍.細胞凋亡分析測試方法的研究進展.化學進展1998;10:451-9.權利要求1.一種基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，其特徵是包括由高精度電動水雲平臺，螢光視覺系統，圖像採集與處理系統，工作站組成的篩選和評價硬體系統，通過不同螢光染料標記和測量細胞內多細胞參數變化實現，具體通過以下步驟實現(1)二乙酸螢光素染色測量活細胞數法準確稱取二乙酸螢光素1mg溶於0.1ml二甲亞碸(DMSO)中配成儲備液，分裝於0.5ml離心管中，置於-20℃儲存，臨用前，用PBS稀釋儲備液1000倍待用，A)二乙酸螢光素染色測量活細胞數法線性範圍取對數生長期的KB細胞，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化後，接種於96孔培養板上，每孔含100μL培養液，每個細胞密度設6個復孔，培養24小時，測試前棄去孔內培養液，每孔加入二乙酸螢光素的PBS溶液50μL，4℃培養30分鐘後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後使用篩選和評價系統的工作站分析所得圖像，計算孔內細胞數，B)二乙酸螢光素染色測量活細胞數法實驗質量控制取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，接種於96孔培養板上，每孔含100μL培養液，培養24小時，用1×10-7M長春新鹼作為陽性對照，0.1％二甲亞碸作為陰性對照，設4個平行孔，每孔加入200μL培養液，孵育，棄去培養液，每孔加入二乙酸螢光素的PBS溶液，培養30分鐘後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後後使用工作站分析所得圖像，計算孔內細胞數和Z′因子；(2)Hoechst33342和碘化丙啶雙染法評價藥物誘導細胞凋亡取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，接種於96孔培養板上，每孔含100μL培養液，培養24小時後，棄去培養液，分別將2×10-7、2×10-6M不同濃度的長春新鹼加入孔內，每一藥物濃度設4個平行孔，每孔加入200μL培養液，孵育48小時後，棄去培養液，每孔加入細胞凋亡與壞死檢測試劑50μL，培養30分鐘後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後使用工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、紅色螢光強度；(3)二乙酸螢光素、Hoechst33342和碘化丙啶三染法分析藥物誘導凋亡作用模式取對數生長期的KB細胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化後，接種於96孔培養板上，每孔含100μL培養液，培養24小時後，棄去培養液，分別將各種中藥組分和作為陽性對照的長春新鹼加入孔內，每一藥物濃度設3個平行孔，每孔加入200μL培養液，孵育48小時後，棄去培養液，每孔加入含二乙酸螢光素的細胞凋亡與壞死檢測試劑50μL，培養30分鐘後用篩選和評價硬體系統採集孔內細胞圖像，然後使用工作站分析所得圖像，並統計每個細胞的藍色、綠色、紅色螢光強度。2.根據權利要求1所述的基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，其特徵是篩選和評價硬體系統中螢光視覺系統主要部分為具有自動對焦功能的倒置螢光相差顯微鏡。3.根據權利要求1所述的基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，其特徵是篩選和評價硬體系統中圖像採集與處理系統主要部分為電耦合圖像傳感器及相應的圖像採集卡。4.根據權利要求1所述的基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，其特徵是工作站包括數據存儲、分析與可視化系統和控制系統，控制系統以設計友善的圖形用戶界面的形式體現，為用戶各種具體需求提供接□。5.根據權利要求1所述的基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法在篩選藥物和評價藥物毒性中應用。全文摘要本發明提供基於細胞顯微圖像信息的抗腫瘤藥物評價和篩選方法，是運用一套篩選和評價硬體系統，通過不同螢光染料標記和測量細胞內多細胞參數變化實現對抗腫瘤藥物評價和篩選。該篩選和評價硬體系統由高精度電動水雲平臺，螢光視覺系統，圖像採集與處理系統，工作站組成。通過二乙酸螢光素染色測量活細胞數法；Hoechst33342和碘化丙啶雙染法評價藥物誘導細胞凋亡；FDA、Hoechst33342和PI三染法分析藥物誘導凋亡作用模式。本發明可對表達不同靶標細胞器的至少兩種單細胞或兩種細胞亞群進行測量，方法設計合理，既能用於藥物作用機理的研究，也能用於高內涵藥物篩選和毒性分析，可在篩選藥物和評價藥物毒性中應用。文檔編號G01N15/10GK101149327SQ20071015650公開日2008年3月26日申請日期2007年11月6日優先權日2007年11月6日發明者周晨光,程翼宇,欣黃申請人:浙江大學