標記分析固相材料表面活化方法

2023-12-09 04:39:51 2

專利名稱：標記分析固相材料表面活化方法
技術領域：
本發明屬於生物標樣(血、尿及其他)標記分析材料的製備方法。固相法是當今標記分析的發展方向，標誌著標記分析的水平。與液相法比，固相法特別是夾心固相法，更靈敏，更準確，操作更簡單，更適合自動化。固相法的基礎是固相表面的活化技術。人們創造了許多活化方法。其中JeanCause的方法，是近年被推祟的。它是利用苯乙烯-順丁二酸酐共聚體包被塑料。具體方法是將順丁烯二酸酐溶於苯乙烯中，加入過氧化苯甲醯作催化劑，在85℃水浴條件下聚合。馬上放到冰水中冷卻。多聚體溶解在丁酮中，用乙腈改變溶解性。每支聚苯乙烯管加1ml活化液，即刻吸出。管子經24小時自然乾燥即為活化管。JeanCause採用二氧六環-乙酸處理管子隨後加甲醇-乙酸酐，馬上水洗達到活化管子的目的。Butter J.E.利用濃硝酸處理聚苯乙烯管變聚苯乙烯管表面為硝化聚苯乙烯，在強鹼性條件下，用硫代硫酸鈉還原成氨基聚苯乙烯。在酸性條件下，經亞硝酸進一步還原成偶氮聚苯乙烯，可以連結抗體。氨基聚苯乙烯與蛋白質結合的方法很多，可以首先與溴乙烯溴，二氟二硝基苯，碘化乙醯酐，氯化苯偏二酸酐、戊二醛、碳化二亞胺等結合，形成可以與蛋白的氨基相結合的集團。Parsons J Barrett、George等均提出了用戊二醛活化固相表面或聚合蛋白達到抗體蛋白結合到固相表面的目的。Bondet F在免疫學方法雜誌上介紹了紫外光處理聚苯乙烯管，以企增加抗體的結合，用於酶聯分析。綜上所述，活化固相表面的方法很多但都離不開強酸、強鹼、易燃、易爆、劇毒物質，生產工藝複雜，成本高，有廢水、廢物產生，而且結合容量小。
本發明的目的就是為克服上述現有技術的不足，發明一種不用強酸、強鹼和易燃、易爆、劇毒物質，而且工藝簡單，成本低廉，不產生廢物，廢水的標記分析固相材料活化法。
本發明是在大量試驗的基礎上，發現了在弱鹼性條件下，用丙烯醛的飽和水溶液，可以在固相表面聚合形成一個帶有活性醛基的包層。本發明就是在此發現的基礎上提出了新的固相材料表面活化法，本發明的技術方案如下(1). 被活化表面的材質本方法可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龍等固相材料表面。其材質可以做成管、球、珠、柱、片狀物體，其表面部可以用本發明活化(2)活化試劑①PH8.6的無氨離子及氨化合物的緩衝液；②丙烯醛；③活化液的配製加0.5克丙烯醯胺到100ml PH8.6 0.04M巴比妥緩衝液中，再加0.5ml丙烯醛混合，出現凝聚可濾除。
(3)固相表面活化方法可用自動或手工，加一毫升活化液到聚苯乙烯管內。不要觸及管壁，不要傾斜，在室溫下靜置1-4小時，用泵吸去活化液，自然乾燥，即為活化管。這種活化液可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龍等多種材質，可以活化管、球、珠、環、片等形體表面。
(4).活化表面的用途經表面活化的管子、球、珠、環、片、柱等固體表面，有一層能夠結合抗原、抗體或其他含有氨基的物質。這種結合了抗原抗體的固相材料可用於放射性標記分析、酶標記分析、螢光標記分析、DNA分析測定。下面具體介紹本發明的操作條件一.活化條件的優選與確定1.丙烯醛濃度對活化效果的影響以不同濃度的活化劑活化試管，以最適包被條件包被抗體，比較各種濃度的活化劑活化試管結合的放射性。
活化劑濃度(％) 0.1 0.25 0.5 1 2結合放射性Kcpm 16 15.5 15.5 16.5 16.5上述結果說明，活化劑濃度相差20倍對活化效果無影響。
2.活化酸度對活化效果的影響活化酸度(PH) 6.4 7.4 8.6 9.2 9.8 10.3結合放射性(Kcpm) 3.6 3.9 9.3 8.9 8.6 9.0上述結果說明，最佳活化酸度為PH8.63.穩定劑0.5％丙烯醯胺對包被抗體穩定性的影響加有穩定劑的活化管，在最適宜條件下包被並加表面處理，乾燥後，開放常溫保存一定時間，加相應標記抗原，過夜，棄液體，水洗後測放射性。
包被管存放時間(月) 0 1 2 3加穩定劑 (Kcpm)43.5 38.3 3734.2不加穩定劑(Kcpm)43.5 3.1 1.0-從上表可以看出不加穩定劑保存一個月活性損失90％以上，加了穩定劑保存三個月活性無變化，若塑封低溫避光保存，活性保存更好。
4.活化時間對活化效果的影響活化時間(小時)2 4 624活化效果(Kcpm) 55 58 58.8 58活化時間在2-24小時之間對活化效果無影響5.活化劑存放時間對活化效果的影響存放時間即刻一天二天一周(Kcpm) 10.111.212.412.2活化劑存放一周對活化效果無影響6.活化溫度對活化效果的影響20℃ 活化14.6Kcpm37℃ 活化13.7Kcpm活化溫度在20℃及37℃活化效果無影響7.活化管的穩定性活化管開放保存一段時間，包被抗體後，測結合的放射性(Kcpm)，每次都以新活化管對照，數據經規一處理列表如下存放時間(月) 0 123結合的放射性(Kcpm)2.69 2.65 2.57 2.49總結以上，在PH8.6的條件下，活化劑濃差20倍，活化劑保存一周，活化溫度在20-37℃之間，活化時間在2-24小時之間，活化效果一致，說明活化條件寬鬆。
二.包被條件的選擇1.包被酸度對包被效果的影響包被液酸度3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8包被抗體活性 5.8 7.1 8.1 9.5 10.3 10.3 8.7(Kcpm)包被液以PH4.5為好2.包被溫度、時間對包被效果的影響包被時間(小時)0.5 1234 682437℃(Kcpm)2.3 4.0 4.5 4.8 4.2 4.0 3.8 3.945℃(Kcpm)2.5 4.0 4.7 4.9 4.3 3.4 4.0 3.6包被時間以2-3小時為好，37℃與45℃對包被效果無影響。
3.包被抗體濃度對包被效果的影響蛋白含量0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0(抗人IgGμg/ML)結合標記放射性 0.2 3.0 6.7 7.2 9.2 9.8(Kcpm)包被抗體重，隨包被液抗體含量增加而增加，無倒鉤現象。
三.包被抗體的表面處理抗體在乾燥過程中失活很嚴重，對這個問題進行了研究。
1.利用不同濃度的甘油處理包被管與不處理的包被管幹燥後，在相同條件下與標記抗原結合甘油濃度(％) 01.25 2.5 5結合放射性(Kcpm) 8.86 15.416.016.01.25-5％甘油可以有效避免抗體失活1％的明膠與1.25％-5％甘油處理效果相同。
2.競爭法需要標記抗原與被測物都加入後，同時啟動反應，用1％的明膠解決了這個問題。明膠可以在包被管的表面形成一個薄層，在樣品和標記加入後，不經混旋，室溫靜置相當一段時間無反應，可以有一個從容的操作時間，保證競爭反應同時啟動。放置時間(分) 20 40 60 120靜置室溫 (Kcpm)0.2 0.2 0.3 0.3混旋後37℃(Kcpm)3.5 4.4 4.6 10.6四.包被管性能試驗1.包被管變異任取十支包被管利用加心法測定變異，求平均值與標準差。
58874 56565 56936 56989 5527556518 55673 54774 55321 53980M 55790.5SD 983.0GV 1.76％2.包被抗體量Barrel根據理論計算，若抗體蛋白均以長軸結合在固相上，每平方釐米表面最多可結合1.5μg蛋白，若均以短軸結合則最多0.075μg，本發明的活化、包被技術每平方釐米可結合0.2μg。接近理論值，因為抗體在固相表面結合併非全是短軸或全是長軸，分子間還有間距。
3.結合的牢固性結合標記抗原經常規三次洗滌後，再經3000轉混旋洗滌一分鐘，放射性無明顯降低(在放射性測量的統計漲落範圍內)。
4.包被管透明度無變化，可用於酶標及時間分辨螢光分析。
一.活化包被實例1.活化試劑配製溶0.5克丙烯醯胺於100ml0.04M PH8.6巴比妥緩衝液，加0.5ml丙烯醛，振蕩將大片聚合物濾除即可應用。冰箱保存一周活化效果無影響，隨著時間延長可能出現混濁無礙使用2.活化操作根據需要，準確加入0.5或1ml活化液於聚苯乙烯管內，其他材質試管也可以。加樣頭直插管底切勿觸及管壁，加樣量要準確一致，不可搖動，37℃3小時吸出活化試劑，自然或減壓乾燥後，即為活化試管，室溫保存至少叄個月。
3.包被方法根據被測物的含量，抗體效價，總蛋白含量及分析方法——加心法以投入抗體多為好，競爭法則需要通過實驗確定一個最佳值。包被液PH4.5枸櫞酸鹽或醋酸鹽緩衝液均可。提純的IgG可以提高有效抗體的結合量。向活化聚苯乙烯管內，準確加入1ml稀釋抗體，37℃3小時，吸去包被液。
4.包被聚苯乙烯管的表面處理根據不同需要有以下兩種方法。
①.用於夾心法的包被管的處理，加1ml0.2％牛白蛋白混勻37℃3小時抽出，再加2％甘油1ml混勻抽出，自然乾燥，塑封、避光、4℃保存三個月以上。
②.適用於競爭法也可用作夾心法包被管的處理向包被聚苯烯管內加入1％明膠1ml混勻，吸乾，自然或減壓乾燥，塑封、避光、4℃保存至少可以應用三個月。
應用實例一.固相競爭法測尿中IgG。
1.試劑①125碘標記人IgG本院標記，用0.2％牛白蛋白的0.1MPH7.4PB稀釋成每毫升30000cpm。
②標準人IgG，用0.2％牛白蛋白稀釋成每毫升1、2、4、8、16、32μg。
③包被抗入IgG抗體聚苯乙烯管，本院按照上述方法製備。
2.方法①向包被聚苯乙烯管內分別加入0.1ml標準或檢樣向非特異管加PH7.4PB②向上述各加入1ml稀釋標記試劑③37℃過液後吸除標記試劑④γ計數測量各管放射性
⑤計算機做數據處理和運算3.結果①零管計數 非特異計數＞100②變異 3.3％-3.7％③與常規法相關良好，相關係數0.96④批內質量變異係數≤0.12⑤批間質量變異係數≤0.08二.夾心法以CEA測定為例1.試劑①標記CEA單克隆抗體20bq/10μg/ml②標準CEA 0 2.5 5 10 20 40 ng/ml③抗CEA多克隆抗體包被聚苯乙管2.方法①向抗CEA多克隆抗體包被管內入0.1ml樣品或標準②再加0.1ml標記抗CEA眷單克隆抗體③37℃過夜④水冼兩次γ計數器測量⑤計算3.結果①.零管計數/非特異管行數＞100②.變異3.3％-3.7％③.與常規法相關良好，相關係數0.95④.批內質量變異係數≤0.06⑤.批間質量變異係數≤0.10三.應用本發明活化包被的聚苯乙烯、聚丙烯管、珠曾用於加心法、競爭法法測定AIB、IgGβ2-MG AFP CEA Fer TSH等均取得滿意結果。
本發明的優點
1.本發明不需要大量強酸、強鹼、易燃、易爆、劇毒物。
2.不產生廢物。
3.操作工藝簡單、便於機械化。
4.成本低廉。
5.活性表面可以長時保存而不失活。
6.本發明適用於多種材質如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龍等表面活化。本發明適用於多種形體固相表面如管、球、環、片、等表面活化。
7.結合容量大，每平方釐米可結合有效抗體0.2微克以上接近理論值。
8.可以直接包被抗原抗體，不必象氨基聚苯乙烯管那樣，需要通過「橋」聯接。
權利要求
1.一種標記分析固相材料表面的活化方法，適用於活化聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、尼龍等材質的固相表面，用於放射性標記分析、酶標記分析、螢光標記分析等，其特徵在於用丙烯醛溶液直接活化固相表面，形成活性醛基。
2.根據權利要求1所述的標記分析固相材料表面的活化方法，利用丙烯醯胺作穩定劑，濃度在0.1-3％。
3.按照權利要求1和2所述的標記分析固相材料表面的活化方法，其特徵在於固相材料表面最佳活化條件為PH8.6，丙烯醛最佳濃度在0.1-2％，溫度在20-50℃，時間在1-4小時，穩定劑丙烯醯胺濃度0.5％。
4.根據權利要求1所述的標記分析固相材料表面的活化方法，其特徵在於，在製備的活性表面上，包被抗體、抗原等生物活性物質的條件為PH4.5為好，包被管用甘油或明膠處理，保護抗原或抗體活性。
全文摘要
本發明是一種固相標記分析中使用的固相材料表面活化方法，適用於多種材質如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍等製成的試管、球、珠、環、片等表面活化。其原理是在弱鹼性條件下用丙烯醛在固相材料表面聚合，形成一個活性醛基的薄層。活化後的固相表面每平方釐米可結合有效抗體蛋白0.2μg以上，變異4％以下，活化條件寬鬆，可以滿足夾心法，競爭法標記分析的需要。
文檔編號G01N33/48GK1149721SQ9511709
公開日1997年5月14日 申請日期1995年10月27日 優先權日1995年10月27日
發明者張興祥 申請人:首鋼總公司, 張興祥, 王俐敏