一種豬環曲病毒rt-pcr檢測試劑盒及其檢測方法

2023-12-09 09:11:16

專利名稱：一種豬環曲病毒rt-pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及豬的一種病毒抗原檢測試劑盒，具體說是一種豬環曲病毒核酸RT-PCR快速診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
豬環曲病毒(Porcine Torovirus,PToV)為冠狀病毒科,環曲病毒屬成員。基因組為單股正鏈RNA，大小約為25-30kb。根據國際病毒分類委員會確認環曲病毒屬主要有馬環曲病毒(Equine Torovirus,EToV)、豬環曲病毒、牛環曲病毒(Bovine Torovirus,BToV)和人環曲病毒(Human Torovirus,HToV)。有報導指出，環曲病毒在全世界範圍內廣泛分布,從1987年首次報導豬環曲病毒以來，在荷蘭、加拿大、南非、美國、匈牙利和英格蘭等國家相繼被報導。目前，普遍認為環曲病毒與腹瀉相關，但在其病毒結構和功能、發病機理、致病性等 方面還存在許多問題尚未得到解決。豬環曲病毒感染主要引起一些亞臨床症狀，病毒在糞便中存在的時間相對較短，目前還無法在培養的組織細胞中生長繁殖。因此，研發一種針對豬環曲病毒的快速準確RT-PCR檢測試劑盒，對於我國豬群中環曲病毒分子流行病學調查和其他相關研究意義重大。

發明內容
本發明的目的在於提供一種豬環曲病毒核酸RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。根據豬環曲病毒保守的S蛋白區域，設計特異性病毒核酸引物，用RT-PCR的方法，對豬群中豬環曲病毒的感染情況進行監測。該試劑盒所用時間相對較少，靈敏度較高，適用於豬環曲病毒病原的快速診斷，可為豬環曲病毒的分子流行病學調查及相關研究提供技術支持。為了達到以上目的，本發明採取以下技術方案一種豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒，按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成包括陽性對照模板對豬環曲病毒的陽性樣品抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul,每次 Iul ；陰性對照樣品SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積=
O.5 I. O I 加入 PBS 混勻，3000r/min 離心 15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次用Iul ；上遊引物Pl :5』 -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3』，下遊引物 P2 :5』-AGCACGACGTTGTCTRCGTGT-3』，上遊引物 Pl 和下遊引物 P2 濃度均為 10pmol/ul，各 30ul，每個樣品各用O. 5ul ；2XTaq PCR Master Mix :300ul,每個樣品用 IOul ；ddH20 :200ul,每個樣品用 8ul。所述的豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，反應體系2XTaq PCR MasterMix 10ul、ddH20 8ul、上遊引物PU下遊引物P2各O. 5ul、反轉錄模板Iul ；PCR反應條件950C lmin, 95°C 5s,50°C 10s、72°C 30s 反應 30 個循環，最後 72°C延伸 3min。本發明與現有技術相比有以下優點靈敏度較高，最低可以檢測IOpg病毒核酸；檢測時間短，可用於大批樣品的檢測。


圖I是目的基因PCR擴增的結果，其中M marker DL2000 ；1 :PCR擴增產物；2 :陰性對照； 圖2M marker DL2000 ；I :豬環曲病毒；2 :豬崎病毒；3 :豬偽狂大病毒；4 :豬傳染性胃腸炎病毒；5 :豬流行性腹瀉病毒；6 :A群豬輪狀病毒；7 :豬瘟病毒；8 :豬沙門氏菌；9 豬大腸桿菌；10 :陰性對照；圖3 是敏感性實驗PCR 結果，其中 M :marker DLlOOO ；1 100ng ；2 10ng ；3 lng ；4 IOOpg ；5 10pg ；6 lpg ；7 :H20。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例I(I)設計病毒特異引物根據豬環曲病毒S基因序列設計一對特異PCR引物，上遊引物Pl 5』 -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3』，下遊引物 P2 :5』 -AGCACGACGTTGTCTRCGTGT-3』，目的片段擴增大小為451bp。(2)病毒總RNA提取採集腹瀉仔豬糞便，取O. 5-lg糞渣加入Iml PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液O. 3ml進行RNA提取。首先在上清液中加入750ul trizol變性液，振搖直至變粘稠，室溫放置5min ；4°C, 12000r/min離心5min ;取上清液加入1/5體積(約O. 2ml)氯仿，劇烈振蕩15s,室溫靜置5min ；4°C, 12000r/min離心15min ;取上層水相,加入等體積(約600ul)異丙醇，室溫靜置IOmin ；4°C, 12000r/min離心lOmin，沉澱RNA ;小心棄盡上清，用冰冷的75%乙醇Iml洗漆沉澱,混懸後，4°C, 12000r/min離心5min。小心棄盡上清；超淨臺內風乾RNA沉澱，直至沒有酒精氣味；用無Rnase的滅菌雙蒸水20ul溶解沉澱，4°C保存備用。(3)逆轉錄，反應體系5XBuffer 2ul、RT Enzyme Mix 0. 5ul、Oligo dTPrime (50uM) 0. 5ul> Random 6mers (IOOuM) 0. 5ul> Total RNA 3ul、RNase Free ddH202. 5ul、dNTP Iul ;反應條件37°C 20min、85°C 2min。(4)PCR 反應體系2XTap PCR Master Mix 10ul、ddH20 8ul、上下遊引物 PUP2(濃度為lOpmol/ul)各0. 5ul、反轉錄模板lul。PCR :反應條件95°C lmin, 95 °C 5s、50°C 10s、72°C 30s (反應 30 個循環)，最後72°C延伸3min。I %瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，結果(見圖I)顯示約在450bp出現特異性擴增條帶。(5)特異性實驗用以上方法對豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus)、豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis ofswine virus, TGEV)、豬流行性腹灣病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、A 群豬輪狀病毒(Group A Porcine Rotavirus A, PRoV A)、豬痕病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)、沙門氏菌(Stptococcus suisre)和大腸桿菌(Escherichia Coli)陽性模板板進行PCR擴增，驗證本方法特異性。結果(見圖2)顯示本方法能夠特異性的擴增豬環曲病毒基因，而其他陽性模板均未見擴增產物出現。(6)敏感性實驗將提取的病毒核酸用紫外分析儀測定濃度後，用雙蒸水做10倍倍比稀釋，取每個稀釋度的病毒模板按上述體系及方法進行PCR反應，驗證本方法的敏感性。結果(見圖3)顯示本方法可以有效檢測出豬環曲病毒最低核酸濃度為10pg。實施例2試劑盒的組成按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成包括 陽性對照模板豬環曲病毒陽性樣品抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次 Iul ；陰性對照樣品SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積=
0.5 I. O I加入PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共 20ul，每次用 Iul ；上遊引物Pl和下遊引物P2濃度均為10pmol/ul，各30ul，每個樣品各用0. 5ul ；2XTaq PCR Master Mix :300ul,每個樣品用 IOul ；ddH20 :200ul，每個樣品用 8ul ；2.使用方法反應體系2XTaqPCR Master Mix IOuUddH2O 8ul、上遊引物P1、下遊引物P2各
0.5ul、反轉錄模板Iul ；PCR 反應條件95°C lmin，95°C 5s、50°C 10s、72°C 30s (反應 30 個循環)，最後 72°C延伸3min。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒，其特徵在幹，按照每個試劑盒檢測20個樣品計，毎次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成包括 陽性對照模板對豬環曲病毒的陽性樣品抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次 Iul ； 陰性對照樣品=SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積=0.5 1.0 I 加入 PBS 混勻，3000r/min 離心 15min, 取上清液抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次用Iul ； 上遊引物 Pl :5』 -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3』，下遊引物 P2 :5』-AGCACGACGITGTCTRCGTGT-3』，上遊引物 Pl 和下遊引物 P2 濃度均為 IOpmo 1/ul，各 30ul，甸個樣品各用0. 5ul ； 2 X Taq PCR Master Mix :300ul，每個樣品用 IOul ；ddH20 :200ul,姆個樣品用 8ul。
2.根據權利要求I所述的豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於，反應體系2XTaq PCR Master Mix 10ul、ddH20 8ul、上遊引物 PI、下遊引物 P2 各 0. 5ul、反轉錄模板Iul ;PCR反應條件95°C lmin，95°C 5s, 50 °C 10s、72°C 30s反應30個循環，最後72°C 延伸 3min。
全文摘要
本發明公開了一種豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，試劑盒組成包括陽性對照模板對豬環曲病毒的陽性樣品抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次1ul；陰性對照樣品SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量∶PBS的體積＝0.5～1.0∶1加入PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄後獲得的cDNA，共20ul，每次用1ul；上遊引物P1和下遊引物P2濃度均為10pmol/ul，各30ul，每個樣品各用0.5ul；2×Taq PCR Master Mix300ul，每個樣品用10ul；ddH2O200ul，每個樣品用8ul。本發明與現有技術相比有以下優點靈敏度較高，最低可以檢測10pg病毒核酸；檢測時間短，可用於大批樣品的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102952898SQ201210398440
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者朱玲, 徐志文, 周璐 申請人:四川農業大學