一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法

2023-12-02 22:21:41

專利名稱：一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法
一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法技術領域
本發明屬於生物中檢測細胞活性方法的技術領域，具體是一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法。
背景技術：
黃連(Coptis Chinensis Franch)是一味常用中藥,黃連中主要含有的生物鹼有小檗鹼、黃連鹼、藥根鹼、巴馬汀等。近年來研究表明，小檗鹼、黃連鹼等具有一定的抗腫瘤作用，可抑制和殺傷多種癌細胞，如肝癌H印G2細胞、肺癌GLC-82細胞、胃癌MGC-803細胞等。尋找具有抗腫瘤活性的中藥單體受到越來越多的關注，評價各種中藥單體是否具有滅殺腫瘤細胞的作用，則要依靠對其抗腫瘤活性的檢測來判斷。目前，這種在體外檢測中藥單體抗腫瘤實驗以傳統的斷點檢測方法為主，如MTT法、螢光染色法、3H-Tdr (3H-Thymidine, 三氫胸腺嘧啶核苷)摻入法等。這些方法以給藥前後細胞增殖和存活能力變化作為評價指標，需要進行特定的標記和處理，操作繁瑣，靈敏性較差且只能局限於特定時間點觀察，無法得到藥物作用的直觀動態過程。發明內容
為解決上述技術缺陷，本發明公開了一種檢測黃連生物鹼單體抗腫瘤活性的方法，該方法可實時反映給藥前後的腫瘤細胞經歷的生長、伸展、形態變化、死亡生理狀態，具有高度的靈敏性和可重複性，無需標記，檢測結果穩定、精確。
實現上述目的技術方案是，本發明設計的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤作用的方法，包括以下步驟，(I)分別製備不同濃度的腫瘤細胞懸液、黃連生物鹼單體藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度腫瘤細胞懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳`給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的腫瘤細胞生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對腫瘤細胞的作用。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的腫瘤細胞培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2 的體積濃度為5%，溫度為37°C 設置信號採集頻率為I次/min，測量實時細胞分析儀未有腫瘤細胞時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準分別將100 μ I 不同細胞濃度的腫瘤細胞懸液加入每個檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為I次/5min，測量實時細胞分析儀有腫瘤細胞時培養液中的細胞生長指數分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線，選擇腫瘤細胞加入到腫瘤細胞培養液後最快經過潛伏期進入對數生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到IOOh時腫瘤細胞仍能處於對數生長期所對應的腫瘤細胞懸液細胞濃度，即為用於確定檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細胞濃度的腫瘤懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為I的時間點，即為添加黃連生物`鹼單體藥液的最佳給藥時間點。步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線時，不同濃度腫瘤懸液的腫瘤細胞濃度為2X104、4X104、5X104、8X104的細胞懸液的細胞生長指數做分析比較，上述腫瘤細胞濃度的單位為個/ml。步驟④確定的用於檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度為4X IO4個/ml。確定用於實時細胞分析儀檢測時的細胞懸液濃度依據是細胞添加到培養液中能較快經過潛伏期進入對數生長期，且實時細胞分析儀檢測結束時細胞仍處於對數生長期。依據腫瘤細胞的對數生長期作為判斷細胞懸浮液濃度指標的原因是，對數生長期是細胞活力最好時期，是進行實驗的最佳時期，細胞濃度過小則細胞需要經過較長時間的潛伏期才能進入對數生長期，導致試驗周期過長；細胞濃度過大則營養物質消耗快，且細胞易粘連、疊加，則細胞很快經過對數生長期並開始脫落、死亡。在選擇用於檢測的最佳細胞濃度時，一般選擇腫瘤細胞進入對數生長期的1/3 2/3細胞的生長率顯著增高的時段，同時為了方便後續不同濃度黃連生物鹼單體藥液添加到腫瘤細胞懸液中的細胞生長曲線好擬合對t匕，綜合考察，一般細胞指數為I的時間點，為最佳的給藥時間。所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的腫瘤細胞培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設置信號採集頻率為I次/min，實時細胞分析儀檢測未有腫瘤細胞時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準將步驟(2)確定的最佳細胞濃度的腫瘤細胞懸液100 μ I加入到每個檢測板板孔的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為I次/15min，實時細胞分析儀對培養液中腫瘤細胞的細胞生長指數進行監測；③待細胞生長到步驟(2)確定的最佳給藥時間點時，吸棄檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液，再向每個板孔中加入200 μ I不同濃度的黃連生物鹼單體藥液，另設置2個板孔，添加200 μ I腫瘤細胞培養液，即為空白對照板孔設定信號採集頻率為I次/min，細胞實時分析儀監測黃連生物鹼單體藥液中腫瘤細胞生長指數。步驟①中基準的測定是為了扣除細胞培養液本身所帶電荷可·能產生的背景數值，有效保證了結果的準確性及可重複性。本發明中的黃連生物鹼單體藥液的配製方法是，黃連生物鹼單體用腫瘤細胞培養液超聲溶解10 20min，再用孔徑為0.2 μ m的微孔濾膜過濾除菌得到母液，用腫瘤細胞培養液將母液稀釋，得到不同濃度的黃連生物鹼單體藥液。利用培養液作為黃連生物鹼單體的溶劑，防止其它化學試劑破壞細胞的黏性、彈性，避免了細胞破裂、聚堆不好觀察現象的發生。上述的黃連生物鹼單體為小檗鹼、巴馬汀或非洲防己鹼、黃連鹼、藥根鹼或表小檗鹼。本發明檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用的方法，採用的是DP型實時細胞分析儀。DP型號是羅氏公司推出的最新型號的實時細胞分析儀，新的DP型實時細胞分析儀利用無標記、非侵入性電極阻抗測量得出細胞生長指數值，提供了實時的細胞分析，並對平行進行短期和長期的分析研究者來說具有高度的靈活性，DP型的實時細胞分析儀的檢測板共3塊16個孔板，可由三個不同的用戶同時操作，由於其體積小，檢測板可放入標準的培養箱中，輕鬆實現最優的培養的條件。
本發明檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用的方法，具體的是對肝癌IfepG2細胞做進行的檢測。綜上，本發明利用實時細胞儀檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法有益效果是，1、在本發明中所使用的方法能夠將藥物對細胞作用的全過程進行實時在線監測，無需標記、靈敏專屬、而且能節約大量的人力物力；
2、通過對不同濃度細胞懸液中腫瘤細胞生長情況進行監測，對比不同濃度下的腫瘤細胞增殖曲線，能夠篩選出檢測時所使用的腫瘤細胞的最佳濃度和給藥時間；
3、對本發明方法所得到的圖譜及數據進行分析，能夠得到各種生物鹼單體、不同濃度的一個生物鹼單體滅殺腫瘤細胞數值一半的時間，進而得到各種單體、不同濃度一個生物鹼單體的作用強弱順序；
4、通過對比不同藥物的圖譜之間的差異也能對其作用機制研究提供支持；
5、本發明的技術方案具有定性定量、簡便快捷、易於推廣的優點。


圖1為DP實時細胞分析儀監測的不同濃度小檗鹼藥液中肝癌細胞HepG2的細胞生長指數值譜圖，該譜圖以時間橫軸，細胞生長指數Cl值為縱軸；
圖2為DP實時細胞分析儀監測的不同濃度黃連鹼藥液中肝癌細胞HepG2的細胞生長指數值譜圖，該譜圖以時間橫軸，細胞生長指數Cl值為縱軸；
圖3為DP實時細胞分析儀監測的不同濃度巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數值譜圖，該譜圖以時間橫軸，細胞生長指數Cl值為縱軸； 其中，曲線I為DP實時細胞分析儀監測小檗鹼藥液對肝癌細胞H印G2的作用情況時，設置的空白對照組的細胞生長指數曲線；
曲線2為質量濃度250ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線3為質量濃度120ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線4為質量濃度85ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線5為質量濃度65ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞ItepG2的細胞生長指數；
曲線6為質量濃度55ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞IfepG2的細胞生長指數；
曲線7為質量濃度45ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞IfepG2的細胞生長指數；
曲線8為質量濃度40ug/ml的小檗鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線9為DP實時細胞分析儀監測黃連鹼藥液對肝癌細胞HepG2的作用情況時，設置的空白對照組的細胞生長指數曲線；
曲線10為質量濃度60ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線11為質量濃度50ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線12為質量濃度40ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線13為質量濃度30ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線14為質量濃度20ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線15為質量濃度10ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線16為質量濃度5ug/ml的黃連鹼藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；
曲線17為DP實時細胞分析儀監測巴馬汀藥液對肝癌細胞H印G2的作用情況時，設置的空白對照組的細胞生長指數曲線；曲線18為質量濃度500ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；曲線19為質量濃度450ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；曲線20為質量濃度400ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；曲線21為質量濃度350ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；曲線22為質量濃度300ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數；曲線24為質量濃度200ug/ml的巴馬汀藥液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數。
具體實施方式
以下結合具體實施例來進一步說明發明內容。
實施例一:本發明利用實時細胞儀檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法， 腫瘤細胞具體的為肝癌細胞IfepG2;黃連生物單鹼體常見的有小檗鹼、巴馬汀、非洲防己鹼、黃連鹼、藥根鹼、表小檗鹼，本發明方法可同時對不同濃度、各種生物鹼單體對肝癌細胞 H印G2的作用進行監測，實施例一列舉的是對於不同濃度的小檗鹼藥液對肝癌細胞HepG2 的作用情況，本實施例中用到的實時細胞分析儀均是DP型實施細胞分析儀。
1、試驗中所用到的儀器:RTCA DP (德國Roche公司)；E_Plate 16檢測板(6x6 plates,德國Roche公司);恆溫培養箱(5410型，美國Napco公司);冷凍離心機(HC-3018R 型，安徽中科中佳科學儀器有限公司);電子天平(AL-204型，梅特勒-託利多儀器(上海)有限公司);吉爾森移液器(P100型、PlOOO型，法國GILSON公司);微孔濾膜(0.20 ym，美國 Millipore 公司);培養瓶(25cm、75cm,美國 Corning 公司);離心管(2mL、5mL、IOmL>5OmL,美國Corning公司)。
2、供試藥液:小檗鹼(純度均大於98%)由中國藥品生物製品檢定所提供；3、檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法步驟為，(I)分別製備不同濃度的肝癌細胞HepG2懸液、小檗鹼藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度肝癌細胞HepG2懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測小檗鹼藥液對肝癌細胞H印G2作用時，所使用的肝癌細胞HepG2懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的肝癌細胞HepG2生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對腫瘤細胞的作用。
步驟(I)中製備不同濃度的肝癌細胞H印G2懸液時，利用現有的方法對肝癌H印G2 細胞培養，肝癌細胞株H印G2用的培養液是含10%胎牛血清的DMEM培養液，用體積濃度為5%C02，溫度為37°C的恆溫培養箱中培養，製備腫瘤細胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2 細胞培養液中生長狀態良好的HepG2細胞，用質量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入 HepG2細胞培養液終止消化、吹打初步得到細胞懸液，再轉移至離心管離心5min，離心後加入H印G2細胞培養液並吹勻，此時得到的H印G2細胞懸液中的細胞呈分散的單個細胞狀態。 根據加入的ifepG2細胞培養液的量，分別製備肝癌細胞H印G2濃度為5 X 103、5 X 104、2 X 10- 4、4Χ104、8Χ104、1.6Χ105、3.2Χ105、6.4Χ IO5 個/ml 的肝癌細胞 H印G2 懸液。
上述步驟(I)中製備不同濃度的小檗鹼藥液的具體操作步驟是:精密稱取小檗鹼粉末，加入腫瘤細胞培養液中，超聲溶解15 min，用0.20 μ m微孔濾膜過濾除菌得到含250 μ g/ml小檗鹼母液，取母液，用腫瘤細胞培養液依次稀釋成以下6個濃度:120、85、65、55、45、40 μ g/ml，本步驟所用的腫瘤細胞培養液就是肝癌細胞株HepG2的培養液。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設置信號採集頻率為I次/min,測量實時細胞分析儀未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準分別將100 μ I不同細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液加入每個檢測板板孔中的肝癌細胞 H印G2培養液中，設定信號採集頻率為I次/5min，測量實時細胞分析儀有肝癌細胞H印G2 時培養液中的細胞生長指數分析比較不同濃度肝癌細胞HepG2懸液的細胞生長指數曲線，選擇肝癌細胞H印G2加入到肝癌細胞H印G2培養液後最快經過潛伏期進入對數生長期， 且當實時細胞分析儀檢測時間到IOOh時腫瘤細胞仍能處於對數生長期所對應的肝癌細胞 HepG2懸液細胞濃度，即為用於確定檢測小檗鹼藥液對肝癌細胞HepG2作用時，所使用的肝癌細胞H印G2懸液的最佳細胞濃度； 分析④步確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為I的時間點，即為添加小檗鹼藥液的最佳給藥時間點。
根據步驟(2)的方法，經過大量的試驗表明，用於確定檢測小檗鹼藥液對肝癌細胞 HepG2作用時，所使用的肝癌細胞IfepG2懸液的最佳細胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個/ ml範圍內選取，最佳的細胞濃度為4X IO4個/ml，最佳給藥時間點為細胞在肝癌細胞HepG2 培養液生長24h時。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設置信號採集頻率為I次/min,實時細胞分析儀檢測未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準；②將步驟(2)確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液100 μ I加入到每個檢測板板孔的肝癌細胞H印G2培養液中，設定信號採集頻率為I次/15min，實時細胞分析儀對培養液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數進行監測；③待細胞生長到步驟(2)確定的最佳給藥時間點時， 吸棄檢測板板孔中的肝癌細胞H印G2培養液，再向每個板孔中加入200μ I不同濃度的小檗鹼，另設置2個板孔，添加200 μ I肝癌細胞H印G2培養液，即為空白對照板孔；④設定信號採集頻率為I次/min，細胞實時分析儀監測腫瘤細胞在小檗鹼藥液中的細胞生長指數。
本發明選用的實時細胞分析儀，實際上就是一種細胞實時在線監測技術，是近年研製成功的一種建立在阻抗基礎上的瞬時細胞電感應連續記錄系統，這種分析儀器的核心是把微電子細胞傳感器晶片整合到表面適於細胞貼附與生長的細胞檢測板的底部。微電子晶片測定的電阻抗反映了細胞生長、伸展、形態變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態。 通過檢測板板孔底下的微陣列的電極設計，該技術能全面實時的監控細胞群落的變化，並具有高度的靈敏性性和可重複性，無需標記，其檢測結果被證明與其他傳統分析得到結果 —致。
向檢測板的板孔中加入黃連生物鹼單體藥液和腫瘤細胞懸液，檢測板底部的微陣列電極會檢測細胞生長時的電極阻抗，根據電極阻抗機器內部通過計算公式計算細胞生 長指數值，直接在生成的細胞生長圖譜上顯示出來，所用到的計算公式如下:Cl= ma>: —§—■ -1 %6j) _
其中，i為信號採樣頻率數，Rrell(fi)的檢測板板孔中腫瘤細胞接種到藥液後的電極阻抗，Rb (A)是檢測板板孔中未有腫瘤細胞時培養液的電極阻抗，也作為基準阻抗，Cl是細胞生長指數值。在沒有腫瘤細胞的培養液中，檢測板孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻，我們所檢測到的基準電極阻抗為零，Cl值為零。當檢測板板孔中是腫瘤細胞接種到藥液中時，細胞接觸板孔的電極表面開始貼附、生長，電極阻抗值升高，DP實時細胞分析儀系統所響應的Cl值開始增加；當細胞生長覆蓋度達到100%後，由於板孔面積的局限、細胞生長所需的營養物質等有限及細胞間的相互接觸抑制，或者對細胞給予一定藥物刺激後，細胞開始死亡，電極阻抗開始減小，DP實時細胞分析儀系統所響應的Cl值也開始減小，如果時間足夠長，細胞將全部死亡，阻抗值不斷減小直至為零，DP實時細胞分析儀所響應的Cl值也將減小至零，所以，細胞生長指數值判斷黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞的作用情況時，細胞生長指數值越小，說明作用越強。如圖1所示的在250、120、86、65、55、45、40 μ g/ml六個濃度下小檗鹼藥液對HepG2細胞作用的情況，可以看出前期未用藥時細胞迅速生長，用藥後藥液的濃度越高，腫瘤細胞生長指數值越小，因此對腫瘤細胞的作用越強。實施例二:本實施例列舉的是不同濃度下黃連鹼藥液對肝癌細胞IfepG2的作用情況，所用的試驗儀器同實施例一，黃連鹼對照品(純度大於98%)，購於成都曼斯特生物科技有限公司。檢測不同濃度下黃連鹼藥液對肝癌細胞H印G2作用的方法步驟為，(I)分別製備不同濃度的肝癌細胞HepG2懸液、黃連鹼藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度肝癌細胞H印G2懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測黃連鹼藥液對肝癌細胞H印G2作用時，所使用的肝癌細胞HepG2懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的肝癌細胞HepG2生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對肝癌細胞HepG2的作用。步驟(I)中製備不同濃度的肝癌細胞H印G2懸液時，利用現有的方法對肝癌H印G2細胞培養，肝癌細胞株HepG2用的培養液是含10%胎牛血清的MEM培養液，用體積濃度為5%C02，溫度為37 °C的恆溫培養箱中培養，製備腫瘤細胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2細胞培養液中生長狀態良好的HepG2細胞，用質量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2細胞培養液終止消化、吹打初步得到細胞懸液，再轉移至離心管離心5min，離心後加入HepG2細胞培養液並吹勻，此時得到的HepG2細胞懸液中的細胞呈分散的單個細胞狀態。根據加入的ifepG2細胞培養液的量，分別製備腫瘤細胞濃度為5X103、5X104、2X104、4X 104、8Χ 104、1.6X 105、3.2Χ 105、6.4Χ IO5 個 /ml 的腫瘤細胞懸液。上述步驟(I)中製備不同濃度的黃連鹼藥液的具體操作步驟是:精密稱取黃連鹼粉末，加入肝癌H印 G2細胞培養液中，超聲溶解15 !1^11，用0.20 ym微孔濾膜過濾除菌得到含100 μ g/ml黃連鹼母液，取母液，用肝癌IfepG2細胞培培養液依次稀釋成以下7個濃度:60、50、40、30、20、10、5 μ g/ml。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設置信號採集頻率為I次/min,測量實時細胞分析儀未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準分別將100 μ I不同細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液加入每個檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為I次/5min，測量實時細胞分析儀有肝癌細胞H印G2時培養液中的細胞生長指數分析比較不同濃度肝癌細胞H印G2懸液的細胞生長指數曲線，選擇肝癌細胞HepG2加入到肝癌細胞HepG2培養液後最快經過潛伏期進入對數生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到IOOh時肝癌細胞H印G2仍能處於對數生長期所對應的肝癌細胞 HepG2懸液細胞濃度，即為用於確定檢測黃連鹼藥液對肝癌細胞HepG2作用時，所使用的肝癌細胞H印G2懸液的最佳細胞濃度； 分析④步確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為I的時間點，即為添加黃連鹼藥液的最佳給藥時間點。
根據步驟(2)的方法，經過大量的試驗表明，用於確定檢測黃連鹼藥液對肝癌細胞 HepG2作用時，所使用的肝癌細胞IfepG2懸液的細胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個/ml均可，最佳的細胞濃度為4X IO4個/ml，最佳給藥時間點為細胞在肝癌細胞HepG2培養液生長 24h 時。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設置信號採集頻率為I次/min,實時細胞分析儀檢測未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準；②將步驟(2)確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液100 μ I加入到每個檢測板板孔的肝癌細胞H印G2培養液中，設定信號採集頻率為I次/15min，實時細胞分析儀對培養液中肝癌細胞H印G2的細胞生長指數進行監測；③待細胞生長到步驟(2)確定的最佳給藥時間點時， 吸棄檢測板板孔中的肝癌細胞H印G2培養液，再向每個板孔中加入200μ1不同濃度的黃連鹼藥液，另設置2個板孔，添加200 μ I肝癌細胞H印G2培養液，即為空白對照板孔；④設定信號採集頻率為I次/min，細胞實時分析儀監測黃連鹼藥液中腫瘤細胞生長指數。
監測結束後，將結果倒入到實時細胞分析儀Softwarel.2.1中進行分析，數據用 0rigin8.5作圖，得到黃連鹼藥液對肝癌HepG2細胞作用的實時在線圖譜，見圖2。由圖中可知，前期細胞迅速生長時期為未用藥的階段，曲線9 16為用藥後的細胞生長曲線。
實施例三:本實施例列舉的是不同濃度下巴馬汀藥液對肝癌細胞H印G2的作用情況，所用的試驗儀器同實施例一，巴馬汀對照品(純度大於98%)，購於成都曼斯特生物科技有限公司。
檢測不同濃度下巴馬汀藥液對肝癌細胞HepG2作用的方法步驟為，(I)分別製備不同濃度的肝癌細胞H印G2懸液、巴馬汀藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃巴馬汀懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測巴馬汀藥液對肝癌細胞H印G2作用時，所使用的肝癌細胞HepG2懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的腫瘤細胞生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對腫瘤細胞 的作用。
步驟(I)中製備不同濃度的肝癌細胞H印G2懸液時，利用現有的方法對肝癌H印G2細胞培養，肝癌細胞株HepG2用的培養液是含10%胎牛血清的MEM培養液，用體積濃度為5%C02，溫度為37 °C的恆溫培養箱中培養，製備腫瘤細胞懸液的具體步驟為選取在!fepG2細胞培養液中生長狀態良好的HepG2細胞，用質量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2細胞培養液終止消化、吹打初步得到細胞懸液，再轉移至離心管離心5min，離心後加入HepG2細胞培養液並吹勻，此時得到的HepG2細胞懸液中的細胞呈分散的單個細胞狀態。根據加入的ifepG2細胞培養液的量，分別製備腫瘤細胞濃度為5X103、5X104、2X104、4X 104、8Χ 104、1.6X 105、3.2Χ 105、6.4Χ IO5 個 /ml 的腫瘤細胞懸液。上述步驟(I)中製備不同濃度的巴馬汀藥液的具體操作步驟是:精密稱取巴馬汀粉末，加入肝癌H印G2細胞培養液中，超聲溶解15 min，用0.20 μ m微孔濾膜過濾除菌得到含500 μ g/ml巴馬汀母液，取母液，用肝癌H印G2細胞培養液依次稀釋成以下6個濃度:450、400、350、300、250、200μ g/ml。所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設置信號採集頻率為I次/min,測量實時細胞分析儀未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準分別將100 μ I不同細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液加入每個檢測板板孔中的肝癌細胞HepG2培養液中，設定信號採集頻率為I次/5min，測量實時細胞分析儀有肝癌細胞H印G2時培養液中的細胞生長指數分析比較不同濃度肝癌細胞H印G2懸液的細胞生長指數曲線，選擇肝癌細胞H印G2加入到肝癌細胞H印G2培養液後最快經過潛伏期進入對數生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到IOOh時腫瘤細胞仍能處於對數生長期所對應的肝癌細胞HepG2懸液細胞濃度，即為用於確定檢測巴馬汀藥液對肝癌細胞HepG2作用時，所使用的肝癌細胞H印G2懸液的最佳細胞濃度； 分析④步確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞H印G2懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為I的時間點，即為添加巴馬汀藥液的最佳給藥時間點。

根據步驟(2)的方法，經過大量的試驗表明，用於確定檢測巴馬汀藥液對肝癌細胞HepG2作用時，所使用的肝癌細胞IfepG2懸液的細胞濃度一般在2 X IO4 8 X IO4個/ml均可，最佳的細胞濃度為4X IO4個/ml，最佳給藥時間點為細胞在肝癌細胞HepG2培養液生長24h 時。所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100 μ I的肝癌細胞H印G2培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設置信號採集頻率為I次/min,實時細胞分析儀檢測未有肝癌細胞H印G2時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準；②將步驟(2)確定的最佳細胞濃度的肝癌細胞HepG2懸液100 μ I加入到每個檢測板板孔的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為I次/15min，實時細胞分析儀對培養液中肝癌細胞HepG2的細胞生長指數進行監測；③待細胞生長到步驟(2)確定的最佳給藥時間點時，吸棄檢測板板孔中的肝癌細胞H印G2培養液，再向每個板孔中加入200 μ I不同濃度的巴馬汀藥液，另設置2個板孔，添加200 μ I肝癌細胞H印G2培養液，即為空白對照板孔；④設定信號採集頻率為I次/min，細胞實時分析儀監測巴馬汀藥液中的肝癌細胞H印G2生長指數。
監測結束後，將結果倒入到實時細胞分析儀Softwarel.2.1中進行分析，數據用0rigin8.5作圖，得到巴馬汀藥液對肝癌HepG2細胞作用的實時在線圖譜，見圖3。由圖中可知，肝癌細胞H印G2不斷生長期時是未用藥的情況，曲線17 24為用藥後細胞受到藥的作用後的細胞生長指數曲線。利用DP型實時細胞分析儀監測非洲防己鹼、藥根鹼、表小檗鹼對肝癌HepG2細胞作用的方法同上述實施例，本發明的方法還可用於監測同一濃度下、不同種類的黃連生物鹼單體對肝癌H印G2細胞作用，還可用於不同濃度、不同種類的黃連生物鹼單體對肝癌HepG2細胞作用，以上僅為說明發明內容所列舉出的幾個實施例而已，一切基於本發明實質內容所做出成份、數量等·簡單的變化，均應落在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟，(I)分別製備不同濃度的腫瘤細胞懸液、黃連生物鹼單體藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度腫瘤細胞懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的腫瘤細胞生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對腫瘤細胞的作用。
2.根據權利要求I所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入 100 μ I的腫瘤細胞培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C 設置信號採集頻率為I次/min，測量實時細胞分析儀未有腫瘤細胞時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準分別將100 μ I不同細胞濃度的腫瘤細胞懸液加入每個檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為 I次/5min，測量實時細胞分析儀有腫瘤細胞時培養液中的細胞生長指數分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線，選擇腫瘤細胞加入到腫瘤細胞培養液後最快經過潛伏期進入對數生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到IOOh時腫瘤細胞仍能處於對數生長期所對應的腫瘤細胞懸液細胞濃度，即為用於確定檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細胞濃度的腫瘤懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為I的時間點，即為添加黃連生物鹼單體藥液的最佳給藥時間點。
3.根據權利要求2所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於， 步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線時，不同濃度腫瘤細胞懸液的腫瘤細胞濃度為2X104、4X104、5X104、8X104的細胞懸液的細胞生長指數做分析比較，上述腫瘤細胞濃度的單位為個/ml。
4.根據權利要求2或3所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，步驟④確定的用於檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度為4X IO4個/ml。
5.根據權利要求I所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入 100 μ I的腫瘤細胞培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO2的體積濃度為5%，溫度為37°C，設置信號採集頻率為I次/min，實時細胞分析儀檢測未有腫瘤細胞時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準將步驟(2)確定的最佳細胞濃度的腫瘤細胞懸液100 μ I加入到每個檢測板板孔的腫瘤細胞培養液中，設定信號採集頻率為I次/15min，實時細胞分析儀對培養液中腫瘤細胞的細胞生長指數進行監測；③待細胞生長到步驟(2)確定的最佳給藥時間點時，吸棄檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液，再向每個板孔中加入200 μ I不同濃度的黃連生物鹼單體藥液，另設置2個板孔，添加 200 μ I腫瘤細胞培養液，即為空白對照板孔；@設定信號採集頻率為I次/min，細胞實時分析儀監測黃連生物鹼單體藥液中腫瘤細胞生長指數。
6.根據權利要求1、2、5中任意一項所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述黃連生物鹼單體藥液的配製方法是，黃連生物鹼單體用腫瘤細胞培養液超聲溶解10 20min，再用孔徑為O. 2 μ m的微孔濾膜過濾除菌得到母液，用腫瘤細胞培養液將母液稀釋，得到不同濃度的黃連生物鹼單體藥液。
7.根據權利要求1、2、5中任意一項所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述的實時細胞分析儀為DP型實時細胞分析儀。
8.根據權利要求I所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述腫瘤細胞為肝癌HepG2細胞。
9.根據權利要求I所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述腫瘤細胞培養液為質量濃度10%胎牛血清的DMEM培養液或質量濃度10%胎牛血清的MEM培養液。
10.根據權利要求6所述的檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，其特徵在於，所述黃連生物鹼單體為小檗鹼、巴馬汀或非洲防己鹼、黃連鹼、藥根鹼或表小檗鹼。
全文摘要
本發明公開的一種檢測黃連生物鹼單體對腫瘤細胞作用的方法，包括以下步驟，(1)分別製備不同濃度的腫瘤細胞懸液、黃連生物鹼單體藥液；(2)利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度腫瘤細胞懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測黃連生物鹼單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；(3)利用實時細胞分析儀檢測給藥前後的腫瘤細胞生長指數值，根據細胞生長指數值。判斷藥液對腫瘤細胞的作用本發明的優點是，該方法可實時反映給藥前後的腫瘤細胞經歷的生長、伸展、形態變化、死亡生理狀態，具有高度的靈敏性和可重複性，無需標記，檢測結果穩定、精確。
文檔編號C12Q1/02GK103255196SQ20131021006
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月31日 優先權日2013年5月31日
發明者鄢丹, 張樂樂, 馬麗娜, 章從恩, 熊呤, 肖小河 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫院