家蠶葡萄糖基轉移酶基因的製作方法

2023-12-10 01:43:16 2

專利名稱：家蠶葡萄糖基轉移酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及來自於經濟動物家蠶的可以轉移葡萄糖殘基的 一種葡萄糖基轉移酶基因。
背景技術：
糖類化合物作為自然界中含量最豐富的生物大分子之一，行使著重要的生物學功能。 可以作為能源的儲存物，維持細胞的結構，構成胞外填充物，行使細胞間的信號識別和 傳導功能等。另外，很多的蛋白質以糖蛋白的形式存在，它們包括酶、免疫球蛋白、載體 蛋白、激素、毒素、凝集素和結構蛋白，功能涉及細胞識別、信息傳遞、激素調節、受 精、發生、發育、分化、神經系統和免疫系統恆態維持等各個方面。而且病菌、病毒的侵 染，癌細胞的增殖及轉移，自身免疫疾病等都與細胞表面的糖密切相關。糖的多樣性決 定了在催化其合成中起關鍵作用的糖基轉移酶的多樣性。在原核生物和真核生物中都有種 類繁多的糖基轉移酶存在。
糖基轉移酶是一群超家族的酶，它們普遍存在於動物，植物，細菌和病毒中。這些酶 能夠催化核苷糖的糖基轉移到一些小的疏水性的分子(糖苷配基)上，形成親水性的化合 物，便於排洩，因此在抑制和排除一系列內生和外生的有毒化合物過程中起了重要作用。 昆蟲一般利用尿苷二磷酸一葡萄糖作為糖的供體，因此稱為葡萄糖基轉移酶。昆蟲的葡萄 糖基轉移酶在許多過程中起重要作用，包括使作用物解毒，角質層形成，色素形成和嗅覺 方面。
生成綠繭的色素是黃酮類色素，是以桑葉中的黃酮類物質為前體，由蠶體自身合成的。 中間的代謝過程就有葡萄糖基轉移酶的參與，說明蠶體內的糖基轉移酶基因與繭色的形成 有關。
植物和哺乳動物的糖基轉移酶基因研究的較多，而昆蟲中研究的很少。在家蠶中僅報 道過一個糖基轉移酶基因。隨著糖組學的提出，糖基轉移酶已成為人們的研究熱點。糖基 轉移酶的催化活性及其高度的底物專一性都與其結構密切相關。糖基轉移酶在糖類酶促合 成中具有應用前景。

發明內容
本發明的目的在於提供一種家蠶葡萄糖基轉移酶基因，通過對該基因功能的更深入研
究，可為培育彩色繭蠶品種，生產天然彩色絲綢奠定基礎。
本發明申請人根據同源序列比對，在家蠶基因組中找到了葡萄糖基轉移酶基因，然後 進行了基因克隆。具體方法如下
(1) 序列比對果蠅的葡萄糖基轉移酶基因與家蠶基因組進行同源性比對，得到的序 列於NCBI中進行反比，進一步確定為葡萄糖基轉移酶基因；
(2) PCR擴增根據比對序列設計引物Pl (5，ATGTGGTTAAAGTTTTTCTACTT3， )、 P2 (5， TTACAAAGCCTTGAATTTTCC 3，)，以5齡第3天的絲腺cDNA為模板進行PCR擴增；
(3) 基因的克隆擴增片斷克隆到pMD18-T載體上，然後進行序列測定(上海Sangon)
(4) 序列同源性分析相似性比較在NCBI站點上用BLAST完成，BLAST分析表明，家 蠶葡萄糖基轉移酶與蛻皮甾類葡萄糖基轉移酶基因有一定的序列相似性；
(5) 基因外源表達表達的蛋白對其進行活性測定，結果表明這個酶催化一系列化合物 發生糖基化作用，對黃酮類化合物發生糖基化率最高。
本發明的優點是
酶活性測定實驗表明，該酶可以使黃酮類化合物發生糖基化作用，表明其可以改變黃 酮類化合物的生物活性，比如溶解性及穿越組織的特性。通過對該基因功能的更深入研究， 可為培育彩色繭蠶品種，生產天然彩色絲綢奠定基礎。
具體實施例方式
Trizol法提取家蠶5齡三天絲腺組織的RNA，反轉錄成cDNA;以此為模板用特異性引 物進行擴增，擴增的片斷克隆到pMD18-T載體上，序列測定(上海Sangon)表明擴增的 片斷為編碼葡萄糖基轉移酶的全長cDNA基因，包含完整的開放閱讀框；在NCBI站點上用 BLAST完成序列同源性分析，表明這個葡萄糖基轉移酶是家蠶中未報導的新基因。 上述方法獲得的家蠶葡萄糖基轉移酶全長cDNA基因及推測胺基酸序列如下 GGAATCGAATTCGTCAGTCACAACTAGTCACTTTTGGTGTAGTGTCCGTTTTCTCCACA ATG TGG CTG AAA TTT TTT TAT TTT TTT AGC CTG GTG CTG TGC (XG MWLKFFYFFSLVLCP TGC TAT GCG GCG CAG GGC GCG AGC ATT CTG GCG GTG TTT AGC AGC CYAA(JGASILAVFSS CTG AGC TAT AGC GAT CAT CTG GTG TTT CGT GGC TAT GTG AGC CTG LSYSDHLVFRGYVSL CTG GCG CAG CGT GGC CAT AGC GTG GTG GTG atg ACC CCG TAT CCG LAQRGHSVVVMTPYP GGC GAA TTT CAG TAT CCG GAA GTG GAA AAC ATT ATT GAA CTG GAT
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權利要求
1、一種家蠶葡萄糖基轉移酶基因，其特徵在於其序列如下GGAATCGAAT TCGTCAGTCA CAACTAGTCA CTTTTGGTGT AGTGTCCGTT TTCTCCACAA 60TGTGGCTGAA ATTTTTTTAT TTTTTTAGCC TGGTGCTGTG CCCGTGCTAT GCGGCGCAGG 120GCGCGAGCAT TCTGGCGGTG TTTAGCAGCC TGAGCTATAG CGATCATCTG GTGTTTCGTG 180GCTATGTGAG CCTGCTGGCG CAGCGTGGCC ATAGCGTGGT GGTGatgACC CCGTATCCGG 240GCGAATTTCA GTATCCGGAA GTGGAAAACA TTATTGAACT GGATGTGAGC CAGGAAAGCG 300CGCCGTTTTG GGAAGAATAT AAACGTCTGa tgACCAACAC CGATGATTAT TATCCGCGTC 360TGAAAGCGCT GAACGAACTG AGCCTGAAAA TTGCGATTGC GCAGCTGAAA AGCAAACAGa 420tgACCGCGCT GCTGATTAAC CCGAACGTGA AATTTGATCT GGTGATTACC GAAGCGGATG 480TGCCGCTGCT GTATGCGCTG GCGGATAAAT ATCAGACCCC GCATATTACC ATTAGCACCT 540TTAACGGCAA AATTCATCAG TATGAAGCGA AAGGCAACCC GATTCATCCG ATTCTGTATC 600CGGATGTGAA CAGCCTGAAC TATGGCAACC TGACCCGTTG GCAGAAAATT ATTGAATTTT 660ATCGTCATAT TCAGACCAAA ACCGAATTTT ATAACAACTA TCTGCCGCTG TGCGATGTGG 720CGGCGAAAAA AATTCTGGGC CTGAAACGTG ATCTGCAGGA AGTGGAATAT GATATTGATa 780tgCTGTTTAT TGCGAGCAAC CCGCTGCTGA TTGGCAACCG TCCGGTGGTG CCGGCGATTC 840AGTTTGTGGA TCGTatgCAT ATTAAACCGC GTatgAGCCT GCCGCAGAAC CTGCAGAGCC 900TGCTGGATAG CCAGACCAAA GGCGTGATTT ATTTTAGCCT GGGCACCCTG CAGGAAGCGG 960AAAAACTGAG CGTGAAAACC CTGCAGGTGT TTGCGGATGC GTTTCGTGAA CTGCCGTTTA 1020CCGTGCTGTG GAAAATTGGC AAAatgAGCA CCCTGAAACT GAGCGATAAC GTGATTACCG 1080ATGTGTGGTT TCCGCAGCAG CAGCTGCTGG CGCATAAAAA CGTGCGTGCG TTTATTACCC 1140ATGGCGGCCC GCGTAGCCTG GAAGAAGCGC TGTTTTATGA AGTGCCGATT ATTGGCTTTC 1200CGCTGATTAC CAGCCGTAAA ATTTTTATTC GTGAACTGAC CAAATATGGC GCGGGCGAAA 1260TTCTGGATCC GCTGCATATT GATAAACAGA CCCTGAAACA GGTGATTAGC ACCGTGGCGA 1320CCGATGAAAA ATATAAAAAA GCGATTATTA AACTGAAAGG CatgGTGGTG GATCCGCTGA 1380TTAGCGGCCC GGATAACGCG GTGTGGTGGA CCGAATATGT GCTGCGTAAC CGTGGCGCGC 1440AGCATCTGCG TAGCCCGGTG GTGGGCGTGA CCTTTATTAA ATATTATatg CTGGATATTC 1500TGACCTATAT TCTGGCGGTG GTGCTGTTTC TGCTGTATCT GACCTTTCTG GTGCTGAAAT 1560GCATTTATCG TCGTCTGCGT GCGCGTTTTG TGCTGCGTAC CGGCCAGGGC CCGGAAGGCA 1620AATTTAAAGC GCTGTAAATC CATCTTTTGT TGGTTTTATC GAATTAAAAT GTTTATTTAG 1680TATCGATAAT ATTAAACATA TTCGTGTGAA AAACAAAACA AAAAAAAAAA AAAAAAAA1738。
2、 一種家蠶葡萄糖基轉移酶基因編碼的蛋白質，其特徵在於其序列如下MWLKFFYFFS LVLCPCYAAQGASILAVFSS30LSYSDHLVFRGYVSLLAQRGHSVVVMPYP60GEFQYPEVENIIELDVSQESAPFWEEYKRL90MTNTDDYYPRLKALNELSLKIAIAQLKSKQ120MTALLINPNVKFDLVITEADVPLLYALADK150YQTPHITISTFNGKIHQYEAKGNPIHPILY180PDVNSLNYGNLTRWQKIIEFYRHIQTKTEF210YNNYLPLCDVAAKKILGLKRDLQEVEYDID240MLFIASNPLLIGNRPWPAIQFVDRMHIKP270RMSLPQNLQSLLDSQTKGVIYFSLGTLQEA300EKLSVKTLQV FADAFRELPFTVLWKIGKMS330TLKLSDNVITDVWFPQQQLLAHKNVRAFIT360HGGPRSLEEALFYEVPIIGFPLITSRKIFI390RELTKYGAGEILDPLHIDKQTLKQVISTVA420TDEKYKKAIIKLKGMWDPLISGPDNAVWW450TEYVLRNRGAQHLRSPVVGVTFIKYYMLDI480LTYILAWLFLLYLTFLVLKCIYRRLRARF510VLRTGQGPEGKFKAL525。
全文摘要
一種家蠶葡萄糖基轉移酶基因，根據同源序列比對，在家蠶基因組中找到並克隆得到。酶活性測定實驗表明，該酶可以使黃酮類化合物發生糖基化作用，表明其可以改變黃酮類化合物的生物活性，比如溶解性及穿越組織的特性。通過對該基因功能的更深入研究，可為培育彩色繭蠶品種，生產天然彩色絲綢奠定基礎。
文檔編號C12N15/54GK101205540SQ20071009255
公開日2008年6月25日 申請日期2007年8月7日 優先權日2007年8月7日
發明者向仲懷, 夏慶友, 成 魯, 黃飛飛 申請人:重慶拓桑生物科技有限公司