一種乳酸菌啟動子探針載體及其構建方法

2023-12-10 06:22:42 1

專利名稱：一種乳酸菌啟動子探針載體及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種乳酸菌啟動子探針載體及其構建方法， 為高效乳酸菌啟動子的篩選提供有效的工具。
背景技術：
乳酸菌是一類能利用可發酵糖產生大量乳酸的細菌通稱，廣泛應用於食品、醫藥 和飼料工業，尤其發酵乳製品生產。隨著基因工程技術的發展，改良乳酸菌發酵性能和益生 性能工程菌株的構建已取得了可喜進展。高效穩定的表達載體是乳酸菌工程菌株獲得的基 礎，而啟動子是決定外源基因表達效率的關鍵遺傳元件。因此，為了構建具有自主智慧財產權 的高效乳酸菌表達系統，廣譜高效乳酸菌啟動子的獲得尤為重要。目前資料報導的乳酸菌啟動子的篩選方法主要包括構建基因組文庫、構建人工啟 動子文庫以及通過已知基因推測其啟動子三種方法，但是無論哪種篩選啟動子的方法皆依 賴於啟動子探針載體來驗證啟動子的功能和分析啟動子的活性。所謂啟動子探針載體是指 攜帶報告基因、抗性標記和轉錄終止子，但無啟動子的克隆載體。因此，將一段已知的核苷 酸序列插入報告基因上遊時，可通過檢測報告基因的表達情況判斷插入序列是否具有啟動 子活性，並可通過定量分析報告基因的表達量確定啟動子的強度。因此，啟動子探針載體的 構建為篩選高效啟動子奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種乳酸菌啟動子探針載體。本發明的另一個目的在於提供構建上述啟動子探針載體的方法。本發明乳酸菌啟動子探針載體，其以乳酸菌表達載體為出發載體，插入報告基因， 同時刪除該表達載體上的啟動子獲得。在本發明優選的實施方式中，所述乳酸菌表達載體為pMG36e，所述報告基因為 gusA，刪除的表達載體自身啟動子為P32，構建得到乳酸菌啟動子探針載體pMGPP。本發明還提供上述探針載體的構建方法，其以乳酸菌表達載體為出發載體，插入 報告基因，同時刪除該表達載體上的啟動子獲得。在本發明的一個實施方案中，以乳酸菌表達載體pMG36e為出發載體，插入β -葡 萄糖醛酸酶基因gusA作為報告基因，並刪除該表達載體自帶啟動子Ρ32。上述gusA基因可以以植物表達載體PBI121為模板，用下述引物擴增得到上遊弓丨物gus-F5，-TCATTTGGAGAGAACACGGG-3，下遊弓丨物gus-R5，-CCCAAGCTTAATCATAAAAACCCAT-3，進而，通過酶切位點Xba I和Hind III將擴增得到的gusA基因與乳酸菌表達載體 pMG36e進行連接，得到質粒pMG36e⑶S。最後，啟動子P32的刪除是利用EcoR I和BamH I雙酶切質粒pMG36e⑶S，回收的 大片段用Klenow Fragment進行平滑化形成鈍端，進一步用T4DNA連接酶連接而實現。
將已知的嗜酸乳桿菌S-Iayer蛋白基因啟動子sIpA插入到pMGPP無啟動子的 gusA基因上遊驗證其功能，⑶S染色結果表明pMGPP在大腸桿菌KWl (購自瓦赫寧根大學) 和植物乳桿菌中皆具有啟動子探針載體的功能。因此，具有自主智慧財產權的啟動子探針載 體pMGPP的構建不僅為篩選乳酸菌啟動子提供了有效的工具，同時為高效乳酸菌表達載體 的構建奠定基礎。


圖1為重組質粒pMG36e⑶S的酶切鑑定圖，其中，M =DNA分子量標準DL15000 ；1 基因gusA的PCR產物；2 載體pMG36e雙酶切/Xba I和Hind III ；3 重組質粒pMG36e⑶S 雙酶切 /Xba I 和 Hind III。圖2為啟動子探針載體pMGPP構建流程圖。圖3為重組質粒pMGGS PCR鑑定圖，其中，M :DNA分子量標準DL2000 ； 1 :slpA啟動 子擴增產物；2 陰性對照；3 以pMG36e⑶S為模板slpA擴增產物；4 以pMGGS為模板slpA 擴增產物。圖4pMGPP在大腸桿菌KWl中功能驗證，其中1 空E.coliKWl ；2 攜帶pMGPP E. coli Kffl ；3 攜帶 pMGGS E. coli Kffl0圖5pMGPP在植物乳桿菌中功能驗證，其中，1 空植物乳桿菌；2 攜帶pMGPP的植 物乳桿菌；3 攜帶pMGGS的植物乳桿菌。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明 的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1乳酸菌啟動子探針載體pMGPP的構建1、攜帶報告基因的乳酸菌表達載體pMG36e⑶S的構建以植物表達載體pBI121為模板，利用PCR技術擴增gusA基因上遊弓丨物gus-F5，-TCATTTGGAGAGAACACGGG-3，下遊弓丨物gus-R5，-CCCAAGCTTAATCATAAAAACCCAT-3，建立50 μ 1的PCR反應體系5 μ 1 IOXEx Taq緩衝液；1 μ 1模板；1 μ 1上遊引物 (25 μ Μ) ；1 μ 1 下遊弓丨物(25 μ Μ) ；2μ 1 dNTPs (2. 5mM, each) ；0. 25 μ 1 Ex Taq DNA 聚合酶 (5U/y 1)；滅菌的蒸餾水39. 75μ 1。離心混勻，在HYBAID PCR儀中94°C預變性5min後，按 以下程序進行PCR擴增94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸1. 5min,共30個循環，最後 72°C延伸 IOmin0PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約2. Okb的擴增條帶，與預期大小相 符，經序列分析結果表明其與大腸桿菌gusA的同源性達100%。採用Xba I和Hind III雙酶 切回收的gusA基因和乳酸菌表達載體pMG36e，將酶切後gusA基因和載體在T4DNA連接酶 作用下進行連接，獲得的重組質粒pMG36e⑶S經酶切鑑定獲得預期大小2kb的目的片段，證 明該攜帶報告基因的乳酸菌表達載體構建成功(圖1)。
2、利用平滑化技術製備乳酸菌啟動子探針載體pMGPP利用EcoR I和BamH I雙酶切質粒pMG36e⑶S，目的是刪除表達載體自帶的啟動 子P32，回收的大片段用Klenow Fragment進行平滑化形成鈍端，進一步用T4DNA連接酶連 接，篩選得到的重組質粒即為啟動子探針載體PMGPP，啟動子探針載體構建策略如圖2。以 probe-R5，-ACATCGGCTTCAAATGGCGT-3，為引物對pMGPP進行測序鑑定，pMGPP經測序後和 pMG36e⑶S比對證明質粒上原有的啟動子P32被刪除，啟動子探針載體pMGPP構建成功。實施例2乳酸菌啟動子探針載體pMGPP的功能驗證1、攜帶嗜酸乳桿菌啟動子slpA重組質粒pMGGS的構建以嗜酸乳桿菌基因組為模板，利用PCR技術擴增嗜酸乳桿菌S-Iayer蛋白基因啟 動子，引物序列如下上遊引物slp-E:5，-GGAATTCTGCTTGTGG GGGTAAGCGG-3，下遊引物slp-B5，-CGGGATCCATATAAAAAAATGTAATAGGCC-3，建立50μ 1的PCR反應體系5μ 1 10XEx Taq緩衝液；1 μ 1模板；1 μ 1上遊引 物(25 μ Μ) ；1 μ 1 下遊引物(25 μ Μ) ；2μ 1 dNTPs (2. 5mM, each) ；0. 25 μ 1 Ex Taq DNA 聚 合酶(5U/y 1)；滅菌的蒸餾水39. 75μ 1。離心混勻，在HYBAID PCR儀中94°C預變性5min 後，按以下程序進行PCR擴增94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共30個循環，最 後 72°C延伸 IOmin0PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測可見約300bp片段，與預期大小相符，測序結果 與GenBank發表序列的同源性為97%。分析結果表明該序列具有啟動子保守的-10區 (TAAAAT)和-35區(TTGCTA)以及核糖體結合位點SD序列。進一步將slpA啟動子序列插 入啟動子探針載體PMGPP的EcoR I和BamH I位點，採用PCR方法鑑定重組子，從圖3中可 見攜帶嗜酸乳桿菌啟動子slpA重組質粒pMGGS的構建正確。2、乳酸菌啟動子探針載體pMGPP的功能驗證植物乳桿菌感受態細胞的製備方法為過夜培養的菌體接種到含0.3M蔗糖和 1. 0%甘氨酸的MRS培養基中，培養至OD值達0. 40-0. 60 ；離心收集的菌體用預冷的漂洗液 (0. 3M蔗糖，mM MgCl2)洗滌兩次，並用200 μ 1預冷的電擊緩衝液(30% PEG-1500)重懸； 將40 μ 1感受態細胞和0. 5 μ g純化的質粒混合併轉移到預冷的2mm電轉杯中，電轉參數為 1. 5kV，400 Ω，25 μ F ；電擊後立即加入Iml復甦液(含有0. 3Μ蔗糖和0. IM MgCl2的MRS培 養基)，於37 °C培養兩小時。復甦後的轉化子在含5 μ g/ml紅黴素的MRS固體培養基上進 行篩選。同時啟動子探針載體利用熱激的方法轉化大腸桿菌。將攜帶pMGGS和pMGPP的大 腸桿菌KWl和植物乳桿菌離心後，菌體進行GUS染色，實驗結果見圖4和圖5，從圖中可以看 出，僅攜帶PMGGS載體的大腸桿菌和植物乳桿菌染色後呈藍色。染色的結果表明載體pMGPP 在大腸桿菌和植物乳桿菌中具有啟動子探針載體的功能。
權利要求
一種乳酸菌啟動子探針載體，其以乳酸菌表達載體為出發載體，插入報告基因，同時刪除該表達載體上的啟動子獲得。
2.如權利要求1所述的載體，其特徵在於，所述乳酸菌表達載體為pMG36e。
3.如權利要求1或2所述的載體，其特徵在於，所述報告基因為gusA。
4.如權利要求2所述的載體，其特徵在於，所述表達載體啟動子為P32。
5.權利要求1所述探針載體的構建方法，其以乳酸菌表達載體為出發載體，插入報告 基因，同時刪除該表達載體上的啟動子獲得。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，以乳酸菌表達載體pMG36e為出發載體，插入 β -葡萄糖醛酸酶基因gusA作為報告基因，並刪除該表達載體自帶啟動子P32。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，以植物表達載體pBI121為模板，用下述引物 擴增得到gusA 上遊引物 gus-F5，-TCATTTGGAGAGAACACGGG-3』下遊引物 gus-R5，-CCCAAGCTTAATCATAAAAACCCAT-3，
8.如權利要求7所述的方法，通過酶切位點XbaI和Hind III將擴增得到的gusA基因 與乳酸菌表達載體pMG36e進行連接，得到質粒pMG36e⑶S。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，啟動子P32的刪除是利用EcoRI和BamH I 雙酶切質粒pMG36e⑶S，回收的大片段用Klenow Fragment進行平滑化形成鈍端，進一步用 T4DNA連接酶連接而實現。
10.權利要求1 4任一項所述的乳酸菌啟動子探針載體在篩選乳酸菌啟動子中的應
全文摘要
本發明提供了一種乳酸菌啟動子探針載體，其以乳酸菌表達載體為出發載體，插入報告基因，同時刪除該表達載體上的啟動子獲得。本發明構建的啟動子探針載體pMGPP，不僅為篩選乳酸菌啟動子提供了有效的工具，同時為高效乳酸菌表達載體的構建奠定基礎。另外，本發明還提供了一種該載體的構建方法。
文檔編號C12N15/65GK101942479SQ201010253279
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月16日 優先權日2010年8月16日
發明者姚璐, 張維, 羅雲波, 郝彥玲 申請人:中國農業大學