基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法
2023-12-10 04:31:01 3
基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法
【專利摘要】本發明提供基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行，向小球藻反應器中分別加入鋅銅離子進行培養；微孔濾膜濃縮；小球藻常壓破壁；葉綠素的提取；金屬硫蛋白的提取。金屬硫蛋白的來源拓寬到藻類，顯著降低金屬硫蛋白生產成本；利用小球藻提取金屬硫蛋白具有突出優點，生長迅速，積累量大，加工容易；利用本方法提取出金屬硫蛋白後的藻乾粉可用於製備畜牧業的飼料；先利用乙醇對小球藻內的葉綠素進行提取，降低葉綠素對於金屬硫蛋白提取分離過程的影響，提高金屬硫蛋白的質量；採用鋅、銅交替脅迫誘導製備金屬硫蛋白，得到金屬硫蛋白的產率高達10g/250kg，純化後可得到更高純度的金屬硫蛋白。
【專利說明】基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及金屬硫蛋白製備【技術領域】，更具體地說涉及一種基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法。
【背景技術】
[0002]金屬硫蛋白(metalloth1nein)是由微生物和動植物產生的金屬結合蛋白，富含半胱氨酸的短肽，對多種重金屬有高度親和性。它是分子質量較低，半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質。與其結合的金屬主要是鎘、銅和鋅，廣泛地存在於從微生物到人類各種生物中，其結構高度保守。
[0003]根據金屬硫蛋白在化妝品、保健品和新醫藥等三個領域的應用發展情況，結合我國消費者的實際水平，以及新醫藥發展的步驟和速度，化妝品行業年需求20公斤左右，嬰幼兒食品添加年需求10公斤左右，中老年保健食品年需求10-20公斤，新醫藥年需求20公斤左右，而產量為:2003年為6.8公斤，2004年為8.6公斤，2005年為9.5公斤，遠遠不能滿足實際需求。2005年國內市場價:化妝品、保健品用300萬元/公斤，醫藥用800-1000萬元/公斤。2005年國外最新報價為82.50美元/毫克，273.7美元/5毫克。
[0004]目前國內採用的都是用兔肝生產金屬硫蛋白，設備投入大，轉讓費高，而且產量低，難以滿足現在市場對於金屬硫蛋白的需求。
【發明內容】
[0005]本發明克服了現有技術中的不足，提供了一種基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
[0007]基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行:
[0008]步驟1，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，放入小球藻藻種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25 °C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複3-10次，向處於對數生長期的小球藻中加入5-100 μ mol/L鋅離子溶液，培養24-120h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入5-100 μ mo I/L銅離子溶液，再培養3-10天；
[0009]步驟2，培養3-10天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.2-0.6 %，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.05-0.09MPa，膜濃縮溫度為25-30°C，得小球藻濃縮液；
[0010]步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為300-500MPa，破壁時間為l_2h，得到破壁後的混合藻液；
[0011]步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用80-95%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為55-65°C，提取時間為5-7h，提取3-5次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為80-120r/min，離心時間為10_15min，離心2_3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液；
[0012]步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1000-20001./min，離心時間為10-15min，離心3_5次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用5-20mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在50-60°C下乾燥得到藻乾粉；
[0013]步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化1-4次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-40-25 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
[0014]優選的，基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行:
[0015]步驟1，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，放入小球藻藻種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25 °C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複8次，向處於對數生長期的小球藻中加入50 ymol/L鋅離子溶液，培養90h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入70ymol/L銅離子溶液，再培養8天；
[0016]步驟2，培養8天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.4%，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.07MPa，膜濃縮溫度為25°C，得小球藻濃縮液；
[0017]步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為450MPa，破壁時間為1.5h，得到破壁後的混合藻液；
[0018]步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用90%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為60°C，提取時間為6.5h，提取4次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為lOOr/min，離心時間為12min，離心3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液；
[0019]步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1800r/min，離心時間為12min，離心4次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用12mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在56°C下乾燥得到藻乾粉；
[0020]步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化3次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-35 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
[0021 ] 所述步驟I中的培養液的原料為2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的KH2PO4、0.3mg/L 的 Vbi^P 1.0 μ g/L 的 V B12o
[0022]所述小球藻與所述培養液按照體積比為1:1-3的比例進行接種。
[0023]所述步驟I中的鋅離子能夠採用硫酸鋅、氯化鋅、葡萄糖酸鋅中的一種或幾種，銅離子能夠採用硫酸銅、氯化銅、葡萄糖酸銅中的一種或幾種。
[0024]本發明的有益效果為:金屬硫蛋白的來源從傳統主要來源為動物，拓寬到藻類，顯著降低了金屬硫蛋白的生產成本；利用小球藻提取金屬硫蛋白具有突出優點，生長迅速，積累量大，加工容易；並且利用本發明方法提取出金屬硫蛋白後的所得到的副產物藻乾粉仍可用於製備畜牧業的飼料，降低了生產成本；同時，先利用乙醇對小球藻內的葉綠素進行提取，降低了葉綠素對於金屬硫蛋白提取分離過程的影響，使得最終得到的金屬硫蛋白不帶有葉綠素的顏色，提高了金屬硫蛋白的質量；採用自養-異養交替方式培養小球藻，使小球藻的繁殖速率較其他培養方式高30%以上；採用鋅、銅交替脅迫誘導製備金屬硫蛋白，得到金屬硫蛋白的產率高達10g/250kg，純化後可得到更高純度的金屬硫蛋白。
【具體實施方式】
[0025]下面通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
[0026]實施例1
[0027]基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行:
[0028]步驟I，小球藻培養液的原料為2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的Vb12，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，小球藻與培養液按照體積比為1:3的比例進行接種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25°C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複10次，向處於對數生長期的小球藻中加入5 μ mol/L硫酸鋅溶液，培養120h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入5 μ mol/L氯化銅溶液，再培養10天；
[0029]步驟2，培養10天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.6%，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.09MPa，膜濃縮溫度為30°C，得小球藻濃縮液；
[0030]步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為500MPa，破壁時間為2h，得到破壁後的混合藻液；
[0031]步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用95%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為65°C，提取時間為7h，提取5次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為120r/min，離心時間為15min，離心3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液；
[0032]步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為2000r/min，離心時間為15min，離心5次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用20mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在60°C下乾燥得到藻乾粉；
[0033]步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化4次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-25 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
[0034]實施例2
[0035]基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行:
[0036]步驟I，小球藻培養液的原料為2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的V B12，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，小球藻與培養液按照體積比為1:1的比例進行接種，再置於25°c光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25°C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複3次，向處於對數生長期的小球藻中加入100 μ mol/L氯化鋅以及葡萄糖酸鋅混合溶液，培養24h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入100 μ mol/L硫酸銅以及葡萄糖酸銅混合溶液，再培養3天；
[0037]步驟2，培養3天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.2%，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.05MPa，膜濃縮溫度為25°C，得小球藻濃縮液；
[0038]步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為300MPa，破壁時間為lh，得到破壁後的混合藻液；
[0039]步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用80%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為55°C，提取時間為5h，提取3次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為80r/min，離心時間為lOmin，離心2次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液；
[0040]步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1000r/min，離心時間為lOmin，離心3次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用5mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在50°C下乾燥得到藻乾粉；
[0041]步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化I次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-40 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
[0042]實施例3
[0043]基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，按照下述步驟進行:
[0044]步驟I，小球藻培養液的原料為2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、
0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的V B12，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，小球藻與培養液按照體積比為1:2的比例進行接種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25°C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複8次，向處於對數生長期的小球藻中加入50 μ mol/L氯化鋅溶液，培養90h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入70 μ mol/L氯化銅溶液，再培養8天；
[0045]步驟2，培養8天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.4%，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.07MPa，膜濃縮溫度為25°C，得小球藻濃縮液；
[0046]步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為450MPa，破壁時間為1.5h，得到破壁後的混合藻液；
[0047]步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用90%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為60°C，提取時間為6.5h，提取4次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為lOOr/min，離心時間為12min，離心3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液；
[0048]步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1800r/min，離心時間為12min，離心4次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用12mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在56°C下乾燥得到藻乾粉；
[0049]步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化3次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-35 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
[0050]以上對本發明做了示例性的描述，應該說明的是，在不脫離本發明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領域技術人員能夠不花費創造性勞動的等同替換均落入本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，其特徵在於:按照下述步驟進行: 步驟1，將培養液置於反應器內，120°c下滅菌，放入小球藻藻種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25°C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複3-10次，向處於對數生長期的小球藻中加入5-100 ymol/L鋅離子溶液，培養24-120h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入5-100 ymol/L銅離子溶液，再培養3-10天； 步驟2，培養3-10天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.2-0.6%,膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.05-0.09MPa，膜濃縮溫度為25_30°C，得小球藻濃縮液； 步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為300-500MPa，破壁時間為l_2h，得到破壁後的混合藻液； 步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用80-95%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為55-65°C，提取時間為5-7h，提取3-5次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為80-120r/min，離心時間為10_15min，離心2_3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液； 步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1000-20001./min，離心時間為10-15min，離心3_5次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用5-20mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在50-60°C下乾燥得到藻乾粉； 步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化1-4次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-40-25 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
2.根據權利要求1所述的基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，其特徵在於: 步驟1，將培養液置於反應器內，120°C下滅菌，放入小球藻藻種，再置於25°C光照培養箱中，培養12h，然後將反應器置於25°C無光照的培養箱中，培養5h，然後再放入有光照的培養箱中培養12h，如此重複8次，向處於對數生長期的小球藻中加入50 ymol/L鋅離子溶液，培養90h後，再向經過上述處理後的小球藻中加入70 μ mol/L銅離子溶液，再培養8天； 步驟2，培養8天後，將培養液以及其中的小球藻進行微孔濾膜濃縮，濃縮至原培養液體積的0.4%，膜濃縮參數:膜濃縮壓力為0.07MPa，膜濃縮溫度為25°C，得小球藻濃縮液； 步驟3，將步驟2中所得的小球藻濃縮液在常溫下進行壓力破壁，所述常溫壓力破壁的條件:破壁溫度為25°C，破壁壓力為450MPa，破壁時間為1.5h，得到破壁後的混合藻液； 步驟4，將步驟3中得到的破壁後的混合藻液用90%的乙醇溶液進行葉綠素的提取，提取溫度為60°C，提取時間為6.5h，提取4次，提取後的混合液經過離心，離心條件:轉速為lOOr/min，離心時間為12min，離心3次，得到葉綠素提取液以及經過脫色的混合藻液； 步驟5，將步驟4中經過脫色的混合藻液離心，離心條件:離心轉速為1800r/min，離心時間為12min，離心4次，取上清液，採用葡聚糖凝膠對上述上清液進行層析，洗脫液選用12mmol/L的鹽酸提取液，經柱層析之後得到收集液，離心後所得藻泥在56°C下乾燥得到藻乾粉； 步驟6，將上述收集液進行合併，經過真空冷凍乾燥之後，用超純水對其進行溶解，採用脫鹽柱對其進行層析，洗脫液採用超純水，脫鹽純化3次，將所得的洗脫液用超濾膜進行超濾濃縮，濃縮後的濾液在-35 °C下進行乾燥得到金屬硫蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，其特徵在於:所述步驟I中的培養液的原料為2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的KH2P04、0.3mg/L的Vbi和 l.0yg/L 的乂.。
4.根據權利要求1或2所述的基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，其特徵在於:所述小球藻與所述培養液按照體積比為1:1-3的比例進行接種。
5.根據權利要求1或2所述的基於小球藻的金屬硫蛋白製備方法，其特徵在於:所述步驟I中的鋅離子能夠採用硫酸鋅、氯化鋅、葡萄糖酸鋅中的一種或幾種，銅離子能夠採用硫酸銅、氯化銅、葡萄糖酸銅中的一種或幾種。
【文檔編號】C07D487/22GK104480173SQ201410795199
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月18日 優先權日:2014年12月18日
【發明者】季延濱, 李濤 申請人:天科慧洋科技發展（天津）有限公司