新穎的細胞信號多肽和核酸的製作方法

2023-12-10 10:06:42

專利名稱：新穎的細胞信號多肽和核酸的製作方法
背景技術：
促細胞分裂劑活化的蛋白激酶(MAPK)途徑介導各種調節從酵母到哺乳動物的生物體細胞生長和分化以及應激反應的信號(Lewis等《癌症研究進展》7449-139，1998)。這些途徑由激酶級聯組成絲氨酸/蘇氨酸激酶MAPKKK，它磷酸化和活化雙特異性激酶MAPKK，後者進而能夠將磷酸根轉移到第三種酶MAPK的蘇氨酸和酪氨酸上。MAPK隨後磷酸化和活化轉錄因子，其中包括各種底物。在哺乳動物中，原型MAP激酶級聯是由Ras開始的(Howe等《細胞》71335-342，1992)，包括Raf、MEK和ERK(Lewis等《癌症研究進展》7449-139，1998)。在釀酒酵母中，最具特徵的MAP激酶級聯是響應交配信息素的級聯。在該系統中，Ste11是MAPKKK，它活化Ste7，後者是MEK的副本，進而活化兩種功能上多餘的MAPK，即Fus3(Elion等《細胞》60649-664，1990)和KSS1(Courchesne等《細胞》581107-1119，1989)。我們和其他人(Freed等《科學》2651713-1716，1994；Irie等《癌症研究進展》2651716-1719，1994)以前已經指出，由該系統基因失效所致Ste11的喪失在功能上能夠得到活性哺乳動物Raf蛋白及其底物MEK的補充。該雜合MAP激酶途徑與交配信息素的刺激作用沒有聯繫，響應Raf或MEK活化劑，後者具有可在缺少組氨酸的培養基上生長的HIS3基因表達。
附圖的簡要說明

圖1是闡述用於鑑定和克隆SRK的策略的圖解。
圖2顯示編碼人SRK的核苷酸和氨基序列。
圖3A和圖3B顯示使用SRK cDNA所進行的RNA印跡分析。
圖4顯示SRK突變體降低Ras導致轉化灶的能力。
圖5是HAX-1的不同片段圖解。
圖6是顯示在HAX-1複合體中發現SRK-WT和SRK-KA的數據。
圖7顯示HAX-1的胺基酸和核苷酸序列。
發明的詳細說明新穎的核酸和多肽序列已被鑑定，它們編碼存活調節激酶(以下稱之為「SRK」)，這是一類參與細胞信號轉導途徑的蛋白質，例如促細胞分裂劑活化的蛋白激酶途徑。SRK、其片段和其衍生物具有一種或多種下列生物活性，包括但不限於蛋白激酶活性；自磷酸化活性；細胞生長調節活性；細胞存活促進活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK活化或刺激活性；核導向活性；和SRK特異性致免疫活性。
蛋白激酶活性例如指SRK、其片段或其衍生物能夠催化這樣一種反應，其中磷酸基從磷酸供體轉移到磷酸受體胺基酸殘基上，優選地轉移到絲氨酸或蘇氨酸的羥基側鏈上。SRK蛋白激酶活性的底物例如包括自身、MBP和BAD。SRK的蛋白激酶活性類似於MAPKKK的活性，例如Raf(Bonner等《核酸研究》14(2)1009-1015，1986)、Muk(Hirai等《癌基因》12641-650，1996)、TAK1(Irie《科學》1651716-1719，1994)和MLK(Dorow《歐洲生物化學雜誌》213701-710，1993)。蛋白激酶活性能夠用常規方法鑑定，例如公開在Bagrodia等《生物化學雜誌》27027995-27998，1995；Coso等《細胞》811137-1146，1995和下面的實施例中。術語「自磷酸化」指SRK能夠在蛋白激酶反應中兼任催化劑和底物。
SRK也具有對HAX-1(與HS1締合的X-1蛋白)類蛋白質的結合活性。這種活性能夠用任何適當的方式加以測量。例如，可以利用一種體內測定法，其中採用酵母雙雜種篩選，以檢測SRK與HAX-1之間的結合活性。例如參見Braselmann和McCormick《歐洲分子生物學組織雜誌》144839-4848，1995；Chien等《美國國家科學院院報》889578-9582，1991；Fields和Song《自然》340245-246，1989。結合活性也能夠用體外方法檢測。SRK、其片段或其衍生物能夠在有效發生結合的條件下與HAX-1肽(全長HAX-1或其生物學活性片段)結合。SRK或HAX肽能夠在可檢測的水平上加以標記。測定法可以在液相中完成，其中在珠粒上分開結合的和游離的配體，或者根據需要，測定法也可以在固相中完成。固相測定法可以利用免疫螢光等進行。
SRK所具有的另一種功能是編程性細胞死亡抑制活性。編程性細胞死亡中，細胞經歷特徵性形態學改變，其中的細胞及其核皺縮、凝結並頻繁地斷裂。SRK、其片段和其衍生物能夠抑制編程性細胞死亡。「抑制」指SRK降低、減少、縮小、阻斷、抑制等給定種群中在SRK不存在的情況下將經歷編程性細胞死亡的細胞的數量。因此，SRK還具有細胞存活促進活性。
編程性細胞死亡抑制活性能夠用基於細胞的不同測定法加以測量，例如在細胞正常地經歷編程性細胞死亡的條件下將SRK多肽(或其衍生物)對細胞給藥，觀察多肽對編程性細胞死亡的表型作用。可觀察到的編程性細胞死亡表型例如包括DNA斷裂、凝聚染色質結塊、核被膜解體、細胞與核皺縮等。可以採用任何被編程經歷編程性細胞死亡的細胞類型，例如Il-3依賴性細胞，如FL5.12細胞(例如IL-3的撤出導致編程性細胞死亡)，造血細胞，果蠅細胞，和線蟲細胞。另參見下文。編程性細胞死亡抑制活性也可以在已被設計經歷編程性細胞死亡的細胞內加以測量，設計方法例如引入細胞死亡基因，包括可溶性Hax-1(克隆104；參見實施例)、ced-9等。因此，如實施例所述，向細胞引入細胞死亡基因引起編程性細胞死亡；SRK多肽或其衍生物對細胞給藥抑制表型。
SRK、其片段和其衍生物還能夠表現細胞轉化活性。當SRK在致瘤性ras、例如RasV12的存在下被表達時，則顯示這種活性。這種活性例如指當SRK被適當的刺激物活化時，在宿主細胞內發生表型改變，導致其以失控的方式增殖，與在癌細胞內所觀察到的缺陷相似。轉化活性可以通過任何適合的方法加以測量，這些方法測定正常生長控制力的喪失，例如增殖測定法、轉化灶形成測定法等。
SRK還能夠活化MAPKK多肽，即MAPKK刺激活性。這種活性可以是直接的，例如直接作用於MAPKK(例如使其磷酸化)，或者可以是間接的，其中的活化作用是通過作用於一種或多種中間體、後者然後刺激MAPKK的活性而實現的。MAPKK刺激活性例如指SRK及其多肽活化或刺激MAPKK蛋白激酶的活性。MAPKK刺激活性可以體內或體外測量，如實施例所述。被SRK刺激或活化的MAPKK蛋白例如包括MEK和Ste7。在一種類型的測定法中，SRK在細胞內與MAPKK被共同表達，分離MAPKK，然後利用一種適當的底物測定激酶活性，例如，當使用MEK時，底物是ERK；當使用Ste7時，底物是Fus3或KSS1。刺激活性的量可以通過測量來自用與不用SRK轉染的細胞的MAPKK激酶活性加以測定。MAPKK刺激活性也可以用基於細胞的測定法測量。例如，當用SRK轉化時，MAPKKK活性有缺陷的細胞系、例如缺少Raf或Ste11的細胞系的細胞生存能力得到救助。參見下文實施例，供進一步指導。
SRK是細胞信號轉導途徑的一員，該途徑的活性之一是活化基因的轉錄。表達分析可以按常規方法進行。例如，可以設計高密度寡核苷酸碎片陣列，以監測表達。這種碎片可以含有所有的人基因組或人基因組的子集。例如參見Anderson等《Topics in Current Chemistry》194卷117-129頁，1998；Southern《Current Biology》785-88，1996；Marshall和Hodgson《Nature Biotechnology》1627-31，1998。
術語「SRK特異性致免疫活性」指SRK多肽引起對SRK具有選擇性的免疫應答。這種應答可以是細胞的或體液的。因此，選自哺乳動物、例如如圖2所示的人SRK多肽的SRK胺基酸序列對抗體、T-細胞、巨噬細胞、B-細胞、樹突細胞等的刺激作用是特異性致免疫活性。這些應答可以用常規方法測量。例如參見下文，其中SRK特異性抗體是針對C-端肽產生的。
哺乳動物SRK、例如人SRK是具有這樣一種胺基酸序列的哺乳動物多肽，該序列可從天然來源獲得，並且具有一種或多種所述活性。它可以具有圖2所示的序列，該序列具有開始於起始密碼子並結束於終止密碼子的可譯框架。它可以包含這種序列的片段，可以具有上述和下述生物活性。因此它包括天然產生的正常的、突變的、多形的等序列。天然來源例如包括活細胞(例如是從組織或整個生物體得到的)、培養後的細胞系(包括原代和無限增殖化細胞系)、活組織檢查後的組織等。
本發明的人SRK和有關形式被至少三種不同的RNA信息編碼，分別約為7.5Kb、3.8Kb和1.6Kb。圖2顯示被約7.5kb mRNA編碼的SRK的胺基酸與核苷酸序列和約2kb的cDNA克隆(「J42」)。也鑑定了編碼3.8kb mRNA信息的cDNA。這種cDNA約為2.4kb(「J207」)，含有與J42相同的激酶結構域，不過在其羧基末端是有區別的。圖2中的箭頭表示為SRK和J207所共有的序列的末端。
本發明也涉及哺乳動物SRK的片段。片段優選是「在生物學上是活性的」。「在生物學上是活性的」意味著多肽片段在活體系統內具有活性，或者對活體系統的組分具有活性。生物活性包括所述的那些，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；細胞生長調節活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK活化活性；和SRK特異性致免疫活性。片段可以按照任何所需的方法加以製備，包括化學合成、基因工程、裂解產物等。見下。SRK的生物片段包括胺基酸序列已被除去或者在蛋白質的羧基或氨基末端已被修飾的SRK，例如從其原型加工成「成熟」的SRK。
本發明也涉及具有如圖2所示1至455胺基酸的推斷序列的人SRK。455個胺基酸的多肽具有約51千道爾頓的分子量。它包含下列結構域位於約胺基酸23-250的激酶結構域(如下文所討論的，在該區域內的突變影響激酶活性，例如位於胺基酸45、46和133)，位於約胺基酸287-322的亮氨酸拉鏈區域和位於約胺基酸430-455的酸性結構域。
本發明的SRK多肽(例如具有如圖2所示的胺基酸序列)，可以通過可獲得的方法加以分析，以鑑定多肽中的其它結構和/或功能結構域，包括膜跨越區域、疏水性區域。例如，SRK多肽可以通過下面公開的方法加以分析，例如Kyte和Doolittle《分子生物學雜誌》157105，1982；EMBL Protein Predict；Rost和Sander《蛋白質》1955-72，1994。
其它來自哺乳動物和非哺乳動物來源的SRK同系物可以按照各種方法獲得。例如，可以採用與選自人SRK核苷酸序列的寡核苷酸雜交的方法，以從其它種類中選擇同系物，例如Sambrook等《分子克隆》第11章，1989所述。相對SRK而言，這樣的同系物可以具有不同程度的核苷酸和胺基酸序列的同一性和相似性。哺乳動物例如包括齧齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、猴、豬、牛等。非哺乳動物例如包括脊椎動物、無脊椎動物、斑馬魚(zebra fish)、小雞、果蠅、C.elegans、爪蟾屬、酵母(例如S.pombe、釀酒酵母)、蛔蟲、原核生物、植物、擬南芥屬、病毒等。
本發明也涉及SRK特異性胺基酸序列，例如，定義的胺基酸序列，它是在圖2特定人群中、而不是在來自非SRK多肽的其它胺基酸序列中發現的。相關蛋白質之間的比較可用於選擇對SRK呈特異性的序列。特異性胺基酸序列可以用常規方法找到，例如利用BLAST電腦程式組檢索基因/蛋白質資料庫。SRK特異性胺基酸序列可用於製備肽，作為抗原用於產生對其呈特異性的免疫應答。通過這種免疫作用所得抗體可作為哺乳動物SRK蛋白的特異性探針，用於診斷或研究的目的。SRK特異性胺基酸序列例如包括胺基酸AKQNSSKTTSKRRG，如圖2所示。
如上所述，本發明的多肽可以包含SRK的各種胺基酸序列(例如具有如圖2所示的起始和終止密碼子)、成熟胺基酸序列(即，此處SRK多肽是作為前體加以製備的，再將前體加工為成熟多肽，這種肽的加工類似於Ras(例如Gelb《科學》2751750-1751，1997))或其片段。有用的片段例如包括這樣的片段，它們包含任意上述結構域和SRK特異性胺基酸序列或者基本上由這些組成。
可以對SRK多肽的片段加以選擇，使其具有特異性生物活性，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；細胞生長調節活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK活化或刺激活性；轉錄調製活性；SRK特異性致免疫活性等。有用的片段可以用常規方法加以鑑定，通過對所需的活性進行試驗。有用的片段例如包括下列圖2片段1-250、1-23、23-250、251-455、1-286、287-322、1-322、323-455、1-429、430-455等。
這些活性的測量方法描述在下文和實施例中。這些肽也可以如EP496 162所述加以鑑定和製備。有用的片段可以包含例如大約九個鄰接的胺基酸或者基本上由它們組成，優選為圖2的大約10、15、20、30、40個等鄰接的胺基酸。
相對圖2所示胺基酸序列而言，本發明的多肽也可以具有100％或以下的胺基酸序列同一性。為便於以下的討論，序列的同一性是指在所比較序列的對應位置，核苷酸或胺基酸與圖2所示序列相同。相對圖2所示胺基酸序列而言具有小於100％的序列同一性的多肽可以含有來自天然來源序列的各種取代，包括同源的和非同源的胺基酸取代。參見下文同源胺基酸取代的實施例。同一與同源殘基之和除以與SRK多肽進行比較的序列中的殘基總數等於序列相似性百分率。為了計算序列的同一性和相似性，可以將所比較的序列進行對比，按照任何所需的方法、算法、電腦程式等進行計算，例如包括FASTA、BLASTA。相對圖2胺基酸序列而言具有小於100％的胺基酸序列同一性的多肽可以具有大約99％、98％、97％、95％、90％、70％或者低達53％的序列同一性。優選的胺基酸序列同一性為大約87％或以上，例如大約88％、89％。參見下文關於突變或突變蛋白的討論。
本發明也涉及SRK多肽突變蛋白，即胺基酸序列不同於可從天然來源獲得的胺基酸序列的任何多肽(哺乳動物SRK的片段與天然來源的SRK在胺基酸序列上沒有區別)。因此，SRK突變蛋白包含胺基酸的取代、插入和缺失，包括非天然來源的胺基酸。
本發明的SRK胺基酸序列的突變蛋白也可以在同源檢索的基礎上加以製備，檢索針對基因資料庫進行，例如Genbank，EMBL。序列同源性檢索可以採用各種方法，包括BLAST類電腦程式所述算法、Smith-Waterman算法等。通過鑑定和對比在多肽之間是同一和/或同源性的結構域內的胺基酸，然後根據這樣的對比結果修飾胺基酸，可以將突變蛋白引入序列。例如，SRK與Raf激酶共享33％(Bonner等《核酸研究》14(2)1009-1015，1986)、與Muk共享37％(Hirai等《癌基因》12641-650，1996)、與TAK1共享39％(Irie《科學》2651716-1719，1994)、與MLK蛋白共享44％的同一性(Dorow《歐洲生物化學雜誌》213701-710，1993)。這些序列對比揭示彼此相同和不同的胺基酸位置，提供關於胺基酸取代的信息，這種取代預期將減少、降低或消除SRK的生物活性。例如，序列對比揭示保存在兩個或多個結構域之間的相同胺基酸，而胺基酸的除去或取代預期將對其生物活性帶來不利影響。
通過將一種同源胺基酸替換為另一種，可以進行胺基酸的取代。同源胺基酸可以根據側鏈大小和極化程度加以定義，包括小的、非極性的半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小的、極性的絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺；大的、極性的穀氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸、精氨酸；中間極性的酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大的、非極性的苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。同系酸也可以如下分類不帶電的極性R類甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺；酸性胺基酸(帶負電的)天冬氨酸和穀氨酸；鹼性胺基酸(帶正電的)賴氨酸、精氨酸、組氨酸。同源胺基酸也包括下述那些Dayhoff《蛋白質序列和結構圖譜》5，1978和Argos《歐洲分子生物學組織雜誌》8，779-785，1989。
根據本發明的突變蛋白包括這樣的胺基酸序列，其中SRK序列中的殘基被來自上述蛋白質的對應激酶結構域的同源殘基替換。因此，本發明涉及圖2的SRK核苷酸序列，其中所述核酸編碼多肽，並且一個或多個胺基酸位置是取代的或缺失的，或者二者皆是，並且被核酸編碼的多肽具有激酶活性。例如，SRK多肽突變蛋白及其對應的核苷酸編碼序列可以具有如圖2所示的胺基酸序列，但是其中一個或多個位置被同源胺基酸取代，例如有1、5、10、15或20個取代。本發明也涉及突變蛋白多肽和編碼這類多肽的突變蛋白核酸。修飾如何影響所述活性可以按照上述和下述方法加以測量，這些方法是本領域技術人員已知的。
如上所述，胺基酸取代也可以根據與相關蛋白質的相似性加以進行，例如其它MAPKKK蛋白，包括Raf、Ste11、Muk、TAK1、MLK等。例如，在45位和46位的一個或兩個連續的賴氨酸替換為丙氨酸(SRK-K45A或SRK-KA；SRK-45AK46A或SRK-KKAA)，得到具有有缺陷的激酶活性的顯性失活等位基因或顯性幹擾基因。類似地，在胺基酸133位的天冬氨酸取代為丙氨酸(SRK-D133A或SRK-DA)，得到具有有缺陷的激酶活性的顯性失活等位基因或顯性幹擾基因。這種突變蛋白的用途如下所述。也可以按照常規方法選擇其它突變，方法是，對SRK加以修飾或突變，例如通過按照下述方法和實施例測量激酶活性，選擇影響一個或多個活性的那些突變。
哺乳動物SRK多肽、片段或取代的多肽也可以包含各種修飾，其中這樣的修飾包括脂質修飾、甲基化、磷酸化、糖基化、共價修飾(例如胺基酸R-基的共價修飾)、胺基酸取代、胺基酸缺失或胺基酸添加。可以按照各種方法實現對多肽的修飾，包括重組的、合成的、化學的方法等。
本發明多肽(例如人SRK、其片段、其突變體)可以以不同方式使用，例如用在測定法中，作為抗體的免疫原，如下所述，作為生物活性的試劑(例如具有一種或多種與SRK有關的活性)。
編碼SRK的多肽、其衍生物或其片段可以與一種或多種結構域、功能結構域、可檢測的結構域、抗原結構域和/或所需的多肽結合，排列方式不是自然存在的，也就是非自然存在的，例如在人或SRK基因中，是從活生物體基因組製備的基因組片段，活生物體例如動物，優選為哺乳動物，例如人、小鼠，或其細胞系。包含這些特徵的多肽是嵌合或融合多肽。這樣一種嵌合多肽可以按照不同方法加以製備，包括化學的、合成的、準合成的和/或重組的方法。編碼嵌合多肽的嵌合核酸可以在連續的(例如具有多個N-端結構域，以穩定或增強活性)或間斷的可譯框架內含有不同結構域或所需多肽，例如含有內含子、剪接位點、增強子等。嵌合核酸可以按照不同方法加以製備。例如參見美國專利No.5,439,819。結構域或所需多肽可以具有任何所需的性質，包括生物學功能，例如發信號、促進生長、靶向細胞(例如信號序列、導向序列，例如導向內質網或核)等；結構功能，例如疏水性、親水性、跨膜性等；受體-配體功能和/或可檢測的功能，例如與酶、螢光多肽、綠螢光蛋白結合(Chalfie等《科學》263802，1994；Cheng等《天然生物工程》14606，1996；Levy等《天然生物工程》14610，1996)等。另外，在引入宿主細胞時，多肽或其部分可以用作可選擇的標記物。例如，編碼根據本發明的胺基酸序列的核酸可以框架內融合為所需的編碼序列，充當純化、選擇或標記目的的標識。融合區域可以編碼裂解位點，有利於表達、分離、純化等。
按照本發明，根據本發明的多肽可以在表達系統內產生，例如體內、體外、不含細胞、重組體、細胞融合等。對來自該系統的多肽的修飾包括糖基化、胺基酸取代(例如不同的密碼子選擇)、多肽加工，例如消化、裂解、肽鏈內切酶或肽鏈外切酶活性、化學部分(包括脂質和磷酸鹽)的連接等。
按照常用方法，根據本發明的多肽可以從天然來源、轉化的宿主細胞(培養基或細胞)回收，包括洗滌劑提取(例如CHAPS、辛基葡糖苷)、硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水性相互作用色譜、羥磷灰石色譜和凝集素色譜。必要時在完成成熟蛋白質的構型時可以採用蛋白質重摺疊步驟。最後，可以採用高效液相色譜(HPLC)用於純化步驟。SRK多肽也可以按照對其它MAPKKK蛋白所述的方法加以分離，這些方法將是技術人員已知的。
哺乳動物SRK核酸或其片段是具有可從天然來源獲得的核苷酸序列的核酸。見上。因此，它包括自然存在的、正常的、突變的、多形的等位基因等。天然來源例如包括從組織和整個生物體獲得的活細胞、培養的細胞系，包括原代和無限增殖化細胞系。
已經討論過，人SRK表達為多種mRNA。例如，使用來自激酶結構域的cDNA探針進行RNA印跡分析，鑑定了7.5Kb的優勢帶和3.8Kb與1.6Kb的次豐富帶。來自J42克隆3』端的特異性探針鑑定該大的轉錄物為J42 mRNA，而來自J207克隆3』端的探針識別3.8Kb信息。mRNA分布的分析顯示，J42和J207在正常組織中是無所不在地被表達的，不過在骨骼肌和心臟中是最為豐富的。這些克隆在3』端有區別；例如J42含有酸性區域，而J207沒有。使克隆在序列上有分支的區域在圖2中用箭頭表示。因此，從這些區域衍生的探針(既是核酸也是抗體)可用於區分它們，例如在組織切片、樣本等中的印跡上，具有不同的表現。
本發明的核酸序列可以含有從胺基酸1至胺基酸455的完整編碼序列、其簡併序列及其片段。根據本發明的核酸也可以包含與任意上述與下述核苷酸序列100％互補的、例如反義的核苷酸序列。
根據本發明的核酸可以從多種不同來源獲得。可以從DNA或RNA獲得，例如多聚腺苷酸化的mRNA，例如從組織、細胞或整個生物體分離得到。核酸可以直接從DNA或RNA獲得，或者從cDNA文庫中獲得。核酸可以從處於特定發育階段的細胞或組織(例如胚胎或成人心臟或骨骼細胞或組織)中獲得，它們具有所需的遺傳型、表型等。
如上關於SRK多肽所述，包含編碼根據本發明的多肽的核苷酸序列的核酸可以包括僅有的編碼序列；編碼序列和另外的編碼序列(例如編碼前導的、分泌的、靶向的、酶的、螢光的或其它診斷肽的序列)；編碼序列和非編碼序列，例如在5』或3』端未翻譯的序列，或分散在編碼序列中的序列，例如內含子。包含不間斷編碼多肽的核苷酸序列的核酸意味著該核苷酸序列含有SRK的胺基酸編碼序列，沒有非編碼核苷酸中斷或插入該編碼序列，例如不存在內含子。這樣一種核苷酸序列也可以被描述為「連續的」。編碼人或其它哺乳動物SRK等的基因組DNA可以按照常規方法獲得。
根據本發明的核酸也可以包含表達控制序列，可操縱地連接在上述核酸上。措辭「表達控制序列」是指這種核酸序列，它調節被與其可操縱地連接的核酸編碼的多肽的表達。表達可以在mRNA或多肽的水平上加以調節。因此，表達控制序列包括與mRNA有關的元件和與蛋白質有關的元件。這些元件包括啟動子、增強子(病毒的或細胞的)、核糖體結合序列、轉錄終止子等。表達控制序列與核苷酸編碼序列可操縱地連接，此時該表達控制序列處於這樣一種位置，它實現或完成編碼序列的表達。例如，當啟動子可操縱地連接在編碼序列5』上時，編碼序列的表達被啟動子所驅動。相對正常基因而言，表達控制序列可以是異源的或內源的。
根據本發明的核酸可以在核酸雜交的基礎上加以選擇。兩個單鏈核酸製劑雜交在一起的能力是它們的核苷酸序列互補性的量度，例如核苷酸之間的鹼基配對，例如A-T、G-C等。本發明因此也涉及核酸和它們的補體，這些補體與包含圖2所示核苷酸序列的核酸雜交。與後者序列雜交的核苷酸序列將具有互補的核酸鏈，或者在聚合酶(即適當的核酸合成酶)的存在下充當一種序列的模板。本發明包括核酸的兩個鏈，例如有義鏈和反義鏈。
通過選擇雜交條件，可以選擇具有所需的與圖2所示核苷酸序列的核苷酸互補性程度的核酸。能夠與這樣的序列雜交的核酸優選地具有在二者序列之間的例如大約85％、更優選為90％、92％、進而更優選為95％、97％或100％的互補性。本發明特別涉及在嚴格性差或嚴格性強的條件下與圖2所示核苷酸序列雜交的核酸序列。
與SRK序列雜交的核酸可以按不同方式加以選擇。例如，可以按照已知程序，將印跡(即含有核酸的基質)、碎片陣列(chip arrays)和其它包含目的核酸的基質在預雜交溶液(6X SSC、0.5％SDS、100μg/ml變性鮭精DNA、5X Denhardt氏溶液和50％甲醯胺)中、在30EC下培養過夜，然後與可檢測的SRK探針(見下)在雜交溶液(例如6X SSC、0.5％SDS、100μg/ml變性鮭精DNA和50％甲醯胺)中、在42EC下雜交過夜。印跡可以在嚴格性強的條件下洗滌，例如使bp錯配率低於5％(例如在0.1％SSC與0.1％SDS中、在65EC下洗滌30分鐘兩次)，即選擇具有95％或以上序列同一性的序列。嚴格性強的條件的其它非限制性例子包括在65EC下、在含有30mM NaCl與0.5％SDS的含水緩衝液中的最終洗滌。另一個嚴格性強的條件的例子是在7％SDS、0.5M NaPO4，pH 7、1mM EDTA中、在50EC下雜交，例如過夜，然後用1％SDS溶液在42EC下洗滌一次或多次。在上述嚴格性強的條件下，這裡所述的活化SRK和顯性失活SRK序列與圖2所示野生型核酸序列及其寡核苷酸探針雜交。嚴格性強的洗滌可以使錯配率不到5％，而寬鬆或嚴格性差的洗滌條件(例如在0.2％SSC與0.5％SDS中、在37EC下洗滌30分鐘兩次)可使錯配率高達20％。嚴格性差的條件的另一個非限制性例子包括在42EC下、在含有30mM NaCl與0.5％SDS的緩衝液中的最終洗滌。洗滌和雜交也可以按Sambrook等《分子克隆》1989第9章所述方法進行。
如Sambrook等所述，雜交也可以基於探針與其目標之間所形成的雜交體解鏈溫度(Tm)的計算結果。一般地，短寡核苷酸(含有18個核苷酸或以下)從其目標序列解鏈的溫度Tm是由下列方程給出的Tm＝(A與T數)x 2℃+(C與G數)x 4℃。對更長的分子來說，Tm＝81.5+16.6log10[Na+]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是GC鹼基對在探針中的百分率，N是長度。可以在比該溫度低幾度的溫度下進行雜交，以確保探針與目標能夠雜交。進一步降低溫度可以發生錯配。
可以選擇嚴格條件來分離序列和它們的補體，這些補體例如具有在探針(例如SRK的寡核苷酸)與目標核酸(SRK突變蛋白或同系物)之間的至少大約95％、優選為97％的核苷酸互補性。
按照本發明，核酸或多肽可以在圖2所示核苷酸或胺基酸序列中包含一種或多種差異。對核苷酸和/或胺基酸序列的改變或修飾可以通過任何可利用的方法加以實現，包括定向或隨機誘變。
根據本發明的編碼人SRK的核酸可以包含存在於自然存在的SRK基因中的核苷酸，例如自然存在的多形體、正常的或突變的等位基因(核苷酸或胺基酸)、在自然哺乳動物群體中發現的突變，例如人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔。術語「自然存在的」意味著該核酸是可從天然來源獲得的，例如動物組織和細胞、體液、組織培養細胞、法醫樣本。自然存在的突變可以包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基或羧基末端)、取代、倒位或添加。按照本領域技術人員已知的方法，這些基因可以通過核酸雜交加以檢測和分離。本發明的編碼人SRK多肽的核苷酸序列可以含有在自然存在的基因、轉錄物或cDNA中發現的密碼子，例如圖2所示，或者它可以含有編碼相同胺基酸序列的簡併密碼子。例如，可能需要改變序列中的密碼子，以優化用於在所需宿主內表達的序列。
根據本發明的核酸例如可以包含DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或混合物。DNA可以是雙鏈的或單鏈的。包含核酸的核苷酸可以通過各種已知的鍵連接，例如酯、氨基磺酸酯、磺醯胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，這因所需的目的而異，例如為了耐受核酸酶的作用，如RNA酶H，也為了提高體內穩定性等。例如參見美國專利No.5,378,825。
可以對核酸進行各種修飾，例如連接可檢測的標記物(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、改善雜交、檢測或穩定性的部分。按照所需的方法，核酸也可以連接到固體載體上，例如硝基纖維素、磁性或順磁性微球體(例如美國專利No.5,411,863、No.5,543,289所述，例如包含鐵磁性、超磁性、順磁性、超順磁性、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、膠乳固體微球體、聚丙烯醯胺等。例如參見美國專利No.5,470,967、No.5,476,925、No.5,478,893。
本發明在另一方面涉及寡核苷酸或核酸探針。這種寡核苷酸或核酸探針例如可用於檢測、量化或分離試樣中的哺乳動物SRK核酸，或者用於鑑定SRK同系物。在一個優選的實施方式中，核酸例如可用作差示PCR中的寡核苷酸探針，與cDNA文庫、表達文庫等結合。檢測可以是各種不同目的所需要的，包括研究、診斷和法醫鑑定。關於診斷目的，可能需要鑑定樣本中核酸序列的存在或含量，其中該樣本是從組織、細胞、體液等獲得的。在一個優選的方法中，本發明涉及檢測核酸的方法，包括使試樣中的目標核酸與寡核苷酸在有效實現目標與寡核苷酸之間的雜交的條件下接觸；然後檢測雜交。根據本發明的寡核苷酸也可用於合成核酸的擴增，例如PCR(例如Saiki等《科學》24153，1988；美國專利No.4,683,202；《PCR方案方法和應用指導》Innis等編，Academic Press，New York，1990)；差示(例如參見Liang等《核酸研究》213269-3275，1993；美國專利No.5,599,672；WO97/18454)。
檢測可以與其它基因的寡核苷酸結合進行，例如參與信號轉導、生長、癌症、編程性細胞死亡的基因，或者任何上述或下述的基因等。寡核苷酸也可用於試驗突變，例如採用錯配DNA修復技術，如下所述美國專利No.5,683,877；美國專利No.5,656,430；Wu等《美國國家科學院院報》898779-8783，1992。
本發明的寡核苷酸可以包含任何圖2的連續核苷酸序列或其補體。根據本發明的這些寡核苷酸(核酸)可以是任意所需大小的，例如約10-200個核苷酸，12-100個、優選為12-50個、12-25個、14-16個，至少約15個，至少約20個等。寡核苷酸可以具有非自然存在的核苷酸，例如肌苷、AZT、3TC等。相對圖2序列而言，寡核苷酸可以具有100％的同一性或互補性，或者它可以具有錯配或核苷酸取代，例如1、2、3、4或5個取代。按照本發明，寡核苷酸可以構成試劑盒，其中該試劑盒包括所需的緩衝液(例如磷酸鹽、tris等)、檢測組合物等。寡核苷酸可以是被標記的或未標記的，其中放射性或非放射性標記物是本領域已知的。
本發明的另一方面是人SRK獨有的核苷酸序列。SRK獨有的序列指具有明確順序的核苷酸，它存在於SRK中，例如存在於圖2的核苷酸序列中，但是在其它核酸中是罕見的或少見的，尤其是在動物核酸，優選為哺乳動物，例如人、大鼠、小鼠等中罕見的。獨有的核苷酸序列包括編碼胺基酸AKQNSSKTTSKRRG的序列或其補體。該序列可作為探針，用於任何本文或參考文獻所述的方法。有義和反義核苷酸序列都包括在內。根據本發明的獨特核酸可以按照常規方法測定。包含這樣一種獨特序列的核酸可用作雜交探針，用於鑑定包含核酸混合物的樣本中例如人或小鼠SRK的存在，例如利用RNA印跡法。雜交可以在嚴格性強的條件(見上)下進行，以選擇相對探針而言具有至少95％同一性(即互補性)的核酸(和它們的可以含有編碼序列的補體)，不過也可以採用不太嚴格的條件。獨特的SRK核苷酸序列也可以在其5』或3』端被框架內融合為本專利通篇所提到的各種核苷酸序列，包括用於編碼SRK的其它部分、酶、GFP等的序列、表達控制序列等。
已經討論過，雜交可以在不同條件下進行，這取決於所需的選擇性，例如Sambrook等《分子克隆》1989所述。例如，為了特異性地檢測人或小鼠SRK，寡核苷酸可以在僅與目標核酸雜交的條件下與其雜交，例如其中的寡核苷酸與目標是100％互補的。如果需要選擇具有低於100％的核苷酸互補性的目標核酸，則可以採用不同的條件，互補性例如至少約為99％、97％、95％、90％、70％、67％。
也可以從根據本發明的核酸製備反義核酸，優選從反義於圖2的編碼序列。反義核酸可以按各種方式加以使用，例如調節或調製SRK的表達，例如抑制之，檢測它的表達或用於原位雜交。這些寡核苷酸可以類似於美國專利No.5,576,208所述方法加以使用。出於調節或調製SRK表達的目的，反義核苷酸可以可操縱地連接在表達控制序列上。
根據本發明的核酸可以按照任何所需的方法加以標記。核酸可以用放射性示蹤劑加以標記，例如32P、35S、125I、3H或14C，以及其它一些常用的示蹤劑。放射性標記可以按照任意方法進行，例如使用放射標記的核苷酸、多核苷酸激酶(用或不用磷酸酶進行脫磷酸化作用)或連接酶(取決於所要標記的末端)在3』或5』端進行末端標記。也可以採用非放射性標記，使本發明的核酸與具有免疫學性質的殘基(抗原、半抗原)、對某些試劑具有特殊親和性的殘基(配體)、具有能夠完成可檢測的酶反應的殘基(酶或輔酶、酶底物或其它參與酶反應的物質)或具有特有的物理性質的殘基(例如螢光，或者在所需波長下發射或吸收光)等結合。
包括寡核苷酸、反義核酸等在內的根據本發明的核酸可用於檢測全器官、組織、細胞等內的SRK表達，檢測採用不同的技術，包括RNA印跡、PCR、原位雜交等。這些核酸特別可用於檢測紊亂的SRK表達，例如細胞特異性和/或亞細胞改變。可以單獨或與其它基因產物結合測定SRK的水平，尤其是心、骨骼和細胞死亡特異性基因產物，或其它參與細胞信號和調節的基因產物。根據本發明的核酸可以在各種不同的系統內被表達，體外的和體內的，因所需目的而異。例如，核酸可以插入到表達載體中、引入到所需的宿主中和在有效實現被核酸編碼的多肽的表達的條件下培養。有效條件包括任何適合於宿主細胞產生多肽的培養條件，包括有效的溫度、pH、培養基、向培養宿主細胞的培養基中加入的添加劑(例如擴增或誘導表達的添加劑，例如丁酸鹽，如果編碼核酸鄰近dhfr基因，則為氨甲蝶呤)、環己醯亞胺、細胞密度、培養皿等。核酸可以通過任何有效的方法引入到細胞內，例如包括裸露DNA、磷酸鈣沉澱、電穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介導的轉染、與脂質體融合、與增強細胞攝取的試劑締合、病毒轉染。引入本發明核酸的細胞是轉化的宿主細胞。核酸可以在染色體外，或者整合在宿主細胞染色體內。它可以是穩定的或瞬變的。選擇與宿主細胞具有相容性的表達載體。宿主細胞包括哺乳動物細胞(例如COS、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、293、PAE、人、人成纖維細胞、人初生腫瘤細胞、睪丸細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9(S.frugipeda)和果蠅)、細菌(例如大腸埃希氏菌、鏈球菌、芽孢桿菌)、酵母(例如酵母屬、釀酒酵母(例如cdc突變體cdc25、細胞周期與分裂突變體，如ATCC Nos.42563、46572、46573、44822、44823、46590、46605、42414、44824、42029、448258、44826、42413、200626、28199、200238、74155、44827、74154、74099、201204、48894、42564、201487、48893、28199、38598、201391、201392)、YRG2)、真菌細胞、植物細胞、胚胎幹細胞(例如哺乳動物的，如小鼠或人)、成纖維細胞、肌細胞、心細胞、T-細胞(輔助細胞、CD4、CD8)、B-細胞、巨噬細胞、造血細胞、淋巴細胞、Th1、Th2等。
在選擇表達控制序列時類似地出於宿主相容性和所需的目的，例如複製數量高、含量高、誘導、擴增、控制表達。其它可以採用的序列包括例如來自SV40、CMV、RSV的增強子、誘導啟動子、細胞類型的特殊元件、或允許選擇性或特異性細胞表達的序列。可用於驅動其表達的啟動子例如包括內源性啟動子、細胞信號轉導途徑中其它基因的啟動子、用於細菌宿主的MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7啟動子、或α因子、醇氧化酶或用於酵母的PGH啟動子。
另一種有關基因可以引入到相同的宿主中，例如出於調製SRK功能的目的。這樣的基因可以是正常的基因，或變體，例如突變體、嵌合體、多形體等。這樣的基因例如包括相同或有關信號途徑的成員，例如Ras族、RasV12、Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich症候群蛋白、FTases、STEl4、p53、Rb、Mtase、GTPases亞單位、Dbl、lbc、Ost、Lsc、STATS、Raf、src、Jun、fos、elk、MEK、Ste11、Ste7等。
本發明的核酸或多肽在核酸或蛋白質電泳、色譜等中可用作大小標記物。明確限制的片段可以這樣測定，掃描序列的限制位點、計算大小、進行相應的限制消化。如圖2所示的SRK cDNA在核酸電泳中可用作分子量標記物。
本發明在另一方面涉及有SRK基因參與的生物途徑的調節，確切地說，該途徑是編程性細胞死亡(例如涉及各種細胞類型的維持和存活，包括免疫、骨骼和心細胞)、細胞發信號、信號轉導、配體活化的應答、病理學狀態，例如癌症、心肺疾病、自體免疫疾病(多發性硬化、狼瘡、類風溼性關節炎等)。例如，已經觀察到抑制性T細胞的缺失或編程性細胞死亡可以介導耐受性。例如參見Chen等《自然》376177-180，1995。因此，SRK的編程性細胞死亡抑制活性或細胞存活促進活性的抑制劑可用於治療耐受性已被破壞的自體免疫疾病。一般來說，本發明涉及調節生物學反應的方法，在該生物學反應中SRK或其同系物參與了引起最終細胞反應的生物化學途徑，例如作為參與者。例如，本發明在一方面涉及調製有SRK參與的信號轉導的方法。由於這種信號轉導能夠引起各種生物學反應，包括某些基因的轉錄活化，因此本發明涉及通過調製SRK活性來控制這些基因的表達的方法。按照本發明，可以採用任意例如描述在美國專利Nos.5,767,075、5,753,446、5,728,536、5,667,314和5,459,036中的方法，例如使用SRK、其生物活性片段或其同系物。被SRK介導的信號轉導可以通過各種試劑的給藥加以調製，包括抗SRK抗體、顯性失活SRK基因(參見實施例)、其多肽模擬物、反義物等。
本發明涉及檢測SRK多肽或其生物活性多肽片段中蛋白激酶活性的方法。SRK多肽的蛋白激酶活性的檢測可以採用任意適合的方式完成，包括體外的、體內的，或它們的組合。例如，激酶測定可以如Bagrodia等《生物化學雜誌》27027995-27998，1995或Coso等《細胞》811137-1146，1995所述方法進行。通常，檢測SRK多肽中激酶活性的方法包括使人SRK多肽或其生物活性多肽片段與底物在對所述SRK多肽磷酸化所述底物有效的條件下反應；然後檢測所述底物的所述磷酸化作用。有效的條件例如包括適當的底物、32P-ATP、pH、緩衝液、輔因子等。關於SRK激酶測定，底物例如可以是MBP，它被SRK直接磷酸化；SRK或其片段；MAPKK，例如MEK；BAD。檢測可以採用各種方式實現，包括凝膠色譜、液相色譜、與放射自顯影法結合，例如在使用放射性ATP的情況下。上面已經討論過，激酶活性例如意味SRK將磷酸基從磷酸供體(例如ATP)轉移到磷酸受體(例如MBP)的能力。
本發明也涉及鑑定SRK激酶活性底物的方法。SRK可以與供試底物在有效發生磷酸化作用的條件下接觸，接觸是體內的或體外的。經過適當的時間，可以分離底物，探查磷酸殘基的存在。如上所述，檢測磷酸化作用的優選方法是採用放射性ATP。不過，也可以採用任何適合的檢測方案。參見下列關於進一步指導的實施例。
本發明也涉及鑑定調製人SRK多肽或其生物活性多肽片段的MAPKK刺激活性的試劑的方法，包括將供試試劑對細胞給藥，該細胞表達(1)人SRK多肽或其生物活性多肽片段，和(2)MAPKK多肽，是在對所述SRK多肽刺激所述MAPKK多肽的蛋白激酶活性有效的條件下進行的；檢測所述蛋白激酶活性；通過比較在有和沒有供試試劑的存在下的激酶活性量，鑑定供試試劑是否調製所述SRK多肽的所述刺激活性。已經解釋過，MAPKK刺激性例如意味SRK本身活化MAPKK激酶活性的能力。這種刺激作用可以是直接的或間接的，例如SRK刺激一種因子，該因子依次刺激MAPKK。該刺激作用對MAP激酶級聯來說是相對特異性的；JNK1很少被SRK所刺激。
一般地，術語「有效的條件」例如意味達到所需效果的環境。這樣一種環境例如包括緩衝劑、氧化劑、還原劑、pH、輔因子、溫度、離子濃度、所用細胞的適合的細胞壽命和/或階段(例如細胞周期的特定部分，或者在特定的發育階段，其間特定的基因被表達)、培養條件(包括底物、氧、二氧化碳等)。
術語「調製」意味著任何所述活性例如被增加、增強、增加、激動(充當激動劑)、促進、降低、減少、抑制、阻斷或拮抗(充當拮抗劑)。調製可以增加活性超過基線值的1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。調製也可以降低其活性至基線值以下。
本文所用的術語「給藥」例如意味任意適合的釋放技術，該技術對放置該試劑在能夠發揮作用的位置來說是適合的。例如，給藥可以意味使細胞或宿主以有效的方式與有關試劑接觸，該試劑從而能夠調製有關活性。因此試劑可以這樣給藥以脂質體的方式、作為核酸、與聚合物結合、以包封試劑的形式、在適合的載體內等。
SRK多肽能夠刺激各種MAPKK激酶，包括MEK和Ste7。其它能夠被SRK刺激的MAPKK激酶可以用常規方法鑑定，例如實施例所述方法。
上述方法中，SRK和MAPKK多肽在細胞內被表達。本文所用的術語「表達」意味著細胞適量產生多肽，其中SRK對MAPKK的刺激活性是可以被調製的。可以使用任意適合的細胞系，包括正常產生蛋白質的細胞系、已被誘導產生蛋白質的細胞系、已經基因工程化處理而產生SRK和/或MAPKK的細胞系等。在優選的實施方式中，SRK多肽和MAPKK多肽被引入細胞系的核酸編碼。核酸可以包含表達控制序列，包括啟動子(例如誘導型和組成型啟動子)、增強子、多聚腺苷酸化信號、剪接序列和其它實現表達所必要的或增強表達的元件。各種細胞系都適合作為宿主，包括COS細胞(用於瞬時表達)、人293細胞、酵母細胞等。另見上文關於其它表達方法。
檢測蛋白激酶活性可以用常規方法實現。在優選的實施方式中，上述本發明方法進一步包括這些步驟，例如溶解包含所述被表達的SRK多肽和MAPKK多肽的所述細胞；分離所述MAPKK；檢測所述分離的MAPKK中的激酶活性。該方法中，細胞的溶解或破碎可以在SRK多肽有機會刺激MAPKK多肽之後進行。溶解可以用常規方法實現，例如洗滌劑、超聲、勻化等處理。供試試劑是否調製刺激活性可以通過分離MAPKK和試驗其激酶活性加以測定。MAPKK可以按常規方式加以分離，例如色譜、抗體、結合配體等。抗體可以是針對MAPKK本身製備的，或者是針對被表達的MAPKK(它已經連接有表位，優選為多肽表位)；關聯抗體然後可用於捕獲MAPKK。更優選的實施方式包括使所述胞溶物與抗表位抗體接觸，接觸是在對所述抗體與所述表位結合形成複合體有效的條件下進行的；然後測定該複合體的激酶活性。核酸可以包含編碼MAPKK肽的序列，該肽與編碼任意適合表位的序列是框架內融合的，包括例如KT3、Glu、myc或血凝素。這些表位是本領域所熟知的。抗體可以連接於任何所需的底物，包括固體載體，例如96孔板、硝基纖維素、磁性或順磁性微球體(例如美國專利No.5,411,863、5,543,289所述；例如包含鐵磁性、超磁性、順磁性、超順磁性、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、膠乳固體微球體、聚丙烯醯胺等。
在本文所述的這種和其它方法中，可以在有和沒有供試試劑的存在下測量活性。目的是確定基線活性，例如作為對照，以測定供試試劑是否有效。對照或基線值可以在試驗試劑作用的同時、之前、之後、順序地等獲得。術語「比較」例如意味測定試劑是否影響所需的活性。一般地，這種「比較」是在供試試劑存在和供試試劑不存在時獲得活性數值而進行的；不過也可以採用其它適合的方法。為了測定供試試劑是否對活性(例如編程性細胞死亡、激酶、MAPKK刺激活性)有影響，一般可以在有或沒有試劑的存在下觀察細胞表型(例如編程性細胞死亡、轉化)或活性。觀察不必在同時、順序地或者甚至在同一天內進行。例如，一旦建立有活性或表型發生的試驗條件，在沒有化合物的存在下不必再次重複該條件。這對所有上述和下述方法來說都是如此。
本發明也涉及與SRK多肽在調節細胞轉化中的作用有關的方法。已經討論過，細胞轉化例如發生在正常靜止細胞被刺激增殖的時候。細胞轉化可以通過任意適合的方法加以測量，包括轉化灶形成(參見實施例，其中檢查塑性或其它底物上細胞轉化灶的數量和/或大小)、軟瓊脂中的生長、細胞周期S-相的細胞比例等。這些方法是本領域已知的。
在本發明的優選實施方式中，鑑定調製被Ras和SRK介導的細胞轉化的試劑的方法可以通過利用對轉化敏感的細胞繫結合缺少激酶活性的SRK多肽(例如SRK-KA、SRK-KKAA、SRK-DA和其它顯性失活作用的SRK多肽)加以實現。在優選的實施方式中，使用當活化Ras基因(例如RasV12，例如Schafer等《分子細胞生物學》5(12)3617-3620，1985；或RasL61)引入其中時變為轉化的細胞系，例如使用含有其可操縱地連接於適當啟動子的編碼序列的核酸。見上關於表達元件和方法。轉化可以按上文討論的方法加以測量。適合的細胞系例如包括NIH3T3、COS、BHK、CHO、人293等。缺少激酶活性的SRK多肽的、作為核酸以及在適當啟動子等的控制下的表達也引入細胞內。它在這類細胞內的表達抑制活化Ras的轉化灶形成活性，例如減少、抑制、幹擾通過轉化灶形成作用測量到的活化Ras的轉化活性。該方法也可以這樣進行，通過鑑定細胞在軟瓊脂中的生長能力，測定轉化作用。上述方法可以鑑定各種類型的試劑，包括直接修飾SRK的那些，例如通過引起構象改變，賦予缺少激酶的突變蛋白以激酶活性。試劑也可以這樣補充SRK的缺陷充當SRK模擬物、作用於Ras途徑中SRK的下遊底物(例如刺激MAPKK)、引起內源性SRK基因或SRK替代物轉錄等。
在鑑定調製由Ras和SRK介導的細胞轉化作用的試劑的有關方法中，使用表達活化Ras的細胞系；不過，不採用缺少激酶活性的SRK。這種方法包括將供試試劑對表達活化Ras的細胞給藥，例如RasV12多肽，給藥是在活化Ras有效引起轉化的條件下，例如是在轉化灶形成測定法或軟瓊脂生長測定法中所檢測到的；通過在有或沒有所述供試化合物的存在下比較轉化細胞的數量，鑑定供試試劑是否調製活化Ras轉化活性；測定所述供試化合物是否調製人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的活性。因此在本發明的這種實施方式中，一旦鑑定了幹擾Ras轉化的試劑，則將該試劑對SRK進行試驗，以測定它是否調製SRK的活性，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；細胞轉化活性；細胞生長調節活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK活化活性；轉錄調製活性等。這些活性可以按照上文討論的方法加以測量。
本發明也涉及SRK的存活調節活性，例如在預防編程性細胞死亡中。編程性細胞死亡的預防作用可用於治療自體免疫疾病等。本發明也涉及鑑定調製SRK存活調節活性的試劑的方法，例如它在抑制編程性細胞死亡中的活性。這種活性可以以任何適當的方式加以測量。
正如實施例所確立的，可溶性HAX-1產生細胞內的編程性細胞死亡，例如當在哺乳動物細胞內被表達時，例如COS細胞。SRK的表達逆轉這種作用。因此在本發明的一種實施方式中，該方法包括將供試試劑對表達可溶性HAX-1多肽和人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的細胞給藥，其中所述可溶性HAX-1多肽導致所述細胞內的編程性細胞死亡；在有和沒有所述供試化合物的存在下檢測所述細胞內的編程性細胞死亡。實施例中使用的是HAX-1克隆104，不過可以採用任何其它片段，只要它導致編程性細胞死亡即可。其它有用的HAX-1片段可以按照常規方法加以測定，例如遵循下列實施例，其中HAX-1核酸在細胞內被表達，使用FACS分類的DAPI檢測編程性細胞死亡。可以將可溶性HAX-1、HAX-1多肽(或其它編程性細胞死亡誘導劑，包括基因和蛋白質)、SRK和SRK片段以任何適當的方式對細胞給藥，只要HAX-1有效導致編程性細胞死亡即可。可以使用任何所述的釋放手段，包括轉染(磷酸鈣、電穿孔、脂質體、DEAE等)或其它引入編碼所需多肽或等價物的核酸的手段；直接將多肽引入細胞內(例如使其與配體綴合，細胞與之結合併使之內在化，通過胞飲作用等)。可以同時或按順序將HAX-1和SRK對細胞給藥。例如，細胞可以用編碼序列共轉染。核酸序列如上文和下文的討論，可以可操縱地連接於表達控制序列。使用適當的啟動子可以誘發表達，或者表達可以是組成型的。這些和其它適當條件可以按常規方法加以測定，例如遵循下列實施例，測定誘導編程性細胞死亡的有效條件和編程性細胞死亡被SRK抑制的有效條件。然後可以將試劑以任何適當的方式對表達HAX-1和SRK的細胞給藥。觀察可以在任何時間進行，包括連續觀察或按預定間隔觀察。編程性細胞死亡可以按照任何已知的方法加以檢測，包括目測觀察、用DAPI或其它染色體染劑染色並尋找DNA斷裂、碘化丙錠染色和FACs(例如參見Mohr等《美國國家科學院院報》955045-5050，1988；下列實施例)。如同其它方法那樣，可以鑑定調製SRK活性的試劑，例如抑制、增強等。
因此，本發明在另一方面涉及胞質形式的HAX-1多肽、優選為哺乳動物HAX-1、更優選為人HAX-1。參見Suzuki等《免疫學雜誌》158(6)2737-2744，1997，關於與膜結合的人HAX-1。如下實施例7所示，當在哺乳動物細胞系、例如COS細胞內被表達時，Hax-1的胞質形式可以導致編程性細胞死亡。這種導致編程性細胞死亡的作用、即編程性細胞死亡活性可以在各種方法中是有用的，例如包括治療腫瘤(例如通過導致細胞死亡)、治療自體免疫疾病、在測定法中鑑定調製編程性細胞死亡的試劑(例如參見實施例7)等。術語「胞質性」意味著多肽不是與膜結合的，也不是與膜締合的，而是存在於細胞的細胞質內。
實施例7中使用了胞質性HAX-1的一個例子。這種特定的胞質形式的HAX-1含有HAX-1的胺基酸104-279，如圖7所示。其它胞質性HAX-1形式可以按常規方法加以測定，例如製備嵌套缺失組、將克隆轉染到細胞系內、定位從克隆產生的多肽。定位作用可以按常規方法完成，例如使用如實施例所述的表位標記、使用抗HAX-1選定部分的抗體、使用與HAX-1結合併包含可檢測標記的分子。其它可溶形式的HAX-1包括HAX-1的大約胺基酸104-279，即其中來自HAX-1或另一種多肽的1、2、5、10個胺基酸包括在它的N-或C-端。胞質性HAX-1可以在上述和下述各種細胞系內被表達，類似於SRK的情況(例如與表達控制操縱性連鎖等)。包含胺基酸104-279的人胞質HAX-1不包括圖7所示全長序列，這是因為這種全長序列不是可溶性的，而是與膜結合的。人胞質HAX-1可以基本上由胺基酸104-107組成，並且可以進一步包含多肽表位(例如S-肽、myc等)。這樣一種多肽表位不影響胞質HAX-1的活性，但是採用抗多肽表位抗體，可以使其定位在免疫沉澱等的細胞內。
上述方法也可以這樣進行，在發生編程性細胞死亡的條件下，將供試試劑對細胞系給藥。在下列實施例中，將SRK對細胞系給藥，細胞系依存活的細胞分裂素而定，例如需要IL-3的FL5.12細胞。撤去IL-3大約18小時導致編程性細胞死亡。這樣一種方案是發生編程性細胞死亡的條件的一個例子。還可以採用其它細胞系，例如Jurkat細胞，並使用如Zhou等《美國國家科學院院報》956785-6790，1998所述條件；巨噬細胞，並使用如Mohr等《美國國家科學院院報》955045-5050，1998所述的氧化氮條件；各種造血細胞和它們的促進存活的關聯CSF(例如粒細胞/巨噬細胞和GM-CSF、G-CSF和M-CSF)。例如參見Alberts等《細胞分子生物學》第3版1994，1169-1175頁。當將SRK對這些細胞給藥時，可以抑制編程性細胞死亡。如同其它方法那樣，可以鑑定調製這種活性的試劑。SRK的抑制作用可以是特別有用的，這是在需要編程性細胞死亡的情況下，例如在自體免疫疾病中。
另一種可以調製SRK功能的方式是調節參與其表達的途徑，例如調製它的轉錄(誘導之)、mRNA穩定性、翻譯、翻譯後修飾、加工(例如在內部裂解位點裂解)等。表達可以利用不同的試劑加以調節，例如反義核酸、核酶、aptamer、合成化合物或自然存在的化合物。因此，本發明也涉及鑑定誘導細胞內SRK表達的試劑的方法。這種試劑可以按上述方式加以鑑定，即使用註定發生編程性細胞死亡(按正常程序或作為人工條件的結果)的細胞，但是不引入SRK。因此細胞可以培養在發生編程性細胞死亡的條件下，但是不引入SRK。該方法可以進一步包括將抑制編程性細胞死亡的試劑給藥；檢測SRK的表達。表達可以利用SRK抗體、SRK核探針等加以檢測。
本發明也涉及鑑定其轉錄被SRK調製的基因的方法。例如，可以將活化SRK引入到細胞內，可以在有和沒有SRK的存在下分析它們的表達/轉錄模式。表達分析可以按常規方法進行。例如，可以設計高密度寡核苷酸碎片陣列，以監測表達。這種碎片可以含有所有的人基因組或人基因組的子集。例如參見Anderson等《Topics in CurrentChemistry》194117-129，1998；Southern《Current Biology》785-88，1996；Marshall和Hodgson《Nature Biotechnology》1627-31，1998。
本發明也涉及鑑定調製SRK的天然配體和信號的方法。例如，可以使表達SRK的細胞與各種細胞產物接觸，然後測定有SRK參與的信號途徑的活化作用。在一種實施方式中，異源SRK在細胞內被表達；使該細胞與已經用cDNA文庫轉化的細胞或其產物接觸。SRK的活化作用按本文所述的常規方法加以測量(例如通過激酶的活性等)。如果轉化的細胞或其產物引起SRK的活化，那麼分離並鑑定在該轉化細胞內表達的cDNA。
在任意上述測定法中鑑定的化合物可用於調製細胞、組織、完整生物體、原位、體外(試管、固體載體等)、體內或任何所需環境內的SRK活性。一般來說，具有這樣一種體外活性的化合物也將可用於體內調製與SRK有關的生物途徑，例如細胞周期紊亂、自體免疫疾病、編程性細胞死亡、有絲分裂發生、分化、酵母感染(例如在調製酵母SRK同系物時)、生育疾病、心臟病、癌症、轉移、腫瘤發生、自體免疫疾病、血液疾病等。這些試劑可以是激動劑或SRK模擬物、或拮抗劑，依所需作用而定。
在治療疾病時，化合物或混合物可以配製成藥物組合物，其中包含1藥學上可接受的載體和其它賦形劑，這對技術人員來說都是顯而易見的。例如參見《Remington氏藥物科學》第18版，Mack PublishingCompany，1990。這樣的組合物可以另外含有有效量的其它化合物。
本發明也涉及特異性識別SRK的抗體。SRK特異性抗體意味著該抗體識別包括SRK或包括在SRK內的明確的胺基酸序列，例如圖2的人序列。因此，特異性抗體一般將以高於與不同表位的親和性與胺基酸序列、即圖2中的表位結合，其檢測和/或測量方法例如免疫印跡測定法或其它常規的免疫測定法。因此，人SRK表位特異性抗體可用於檢測樣本中表位的存在，例如含有人SRK基因產物的組織樣本，以區分它與不存在表位的樣本。這種抗體是有用的，如Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Research Product Catalog所述，可以相應地配製成例如100mg/ml。可以按照任何所需的方法製備抗體，例如多克隆的、單克隆的、重組的、嵌合的、人源化的。另參見篩選重組免疫球蛋白文庫(Orlandi等《美國國家科學院院報》863833-3837，1989；Huse等《科學》2561275-1281，1989)；淋巴細胞群的體外刺激作用；Winter和Milstein 《自然》349293-299，1991。例如，關於單克隆抗體的產生，可以將根據圖2的多肽對小鼠、山羊或兔皮下和/或腹膜內給藥，加入或不加入佐劑，給藥量有效引起免疫應答。抗體也可以是單鏈的或FAb片段。抗體可以是IgG、亞型、IgG2a、IgG1等。抗體和免疫應答也可以通過將裸露的DNA給藥而產生。例如參見美國專利Nos.5,703,055、5,589,466、5,580,859。
用於誘導抗體的SRK或其片段不必具有生物活性；不過，它們必須具有致免疫活性，單獨的或者與載體結合。用於誘導SRK特異性抗體的肽可能具有由至少五個胺基酸組成的胺基酸序列，優選為至少10個胺基酸。SRK胺基酸的短段、例如五個胺基酸可與另一種蛋白質、例如匙孔血藍蛋白或另一種有用的載體的那些融合，該嵌合分子用於抗體的產生。
所述若干不同的方法可用於製備SRK特異性抗體。例如，在一種方法中，從純化SRK(例如通過反相HPLC分離純化)獲得高達75mg的變性SRK。利用標準方案，這種變性蛋白可用於致小鼠或兔免疫；對小鼠的免疫來說大約100微克是足夠的，而致兔免疫可能需要高達1mg。關於鑑定小鼠雜交瘤，變性蛋白可以被放射性碘標記，用於篩選產生抗體的潛在鼠B-細胞雜交瘤。這種程序僅需要少量的蛋白質，例如20mg就足以標記和篩選幾千種克隆。
在另一種方法中，分析從cDNA推導的SRK胺基酸序列，以測定高致免疫性區域。合成包含這些區域的多肽，用在適當的免疫方案中，以產生抗體。Ausubel FM等描述了用以選擇適當表位的分析法(1989，《Current Protocols in Molecular Biology》第2卷John WileySons)。最適合免疫的胺基酸序列通常在多肽的C-端、N-端和中間的親水性區域，當蛋白質處於其天然構象時，這些區域可能暴露於外部環境中。通常，利用fmoc化學，採用APPlied Biosystems 431A型肽合成儀合成所選擇的肽，長度約為15個殘基，再通過與M-馬來醯亞氨基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS參見Ausubel FM等，出處同上)的反應偶聯到匙孔血藍蛋白(KLH，Sigma)上。如果必要的話，可以在肽的N-端引入半胱氨酸，以便與KLH偶聯。用含有肽-KLH複合體的完全弗氏佐劑使兔獲得免疫。試驗所得抗血清的抗肽活性，方法是使肽與塑料結合，用1％BSA封閉，與抗血清反應，洗滌，與(放射性或螢光)標記的、親和性純化的、特異性山羊抗兔IgG反應。
也可以製備雜交瘤，利用標準技術篩選。通過用標記的SRK篩選，檢測所針對的雜交瘤，以鑑定產生具有所需特異性的單克隆抗體的融合物。在典型的方案中，將平皿(FAST，Becton-Dickinson，Palo Alto，Calif)的孔塗以10mg/ml親和性純化的、特異性兔抗小鼠(或適當的抗Ig種)抗體。將塗後的孔用1％BSA封閉，洗滌，與雜交瘤上清液接觸。培養後，使孔與1mg/ml標記的SRK接觸。產生抗體的克隆將與一定量標記的SRK結合，後者在背景上是可檢測的。擴大這些克隆，按有限的稀釋比(1個細胞/3個孔)進行2個周期的克隆。將克隆後的雜交瘤注射到原來的小鼠內，產生腹水，通過蛋白質A親和色譜法從小鼠腹水純化單克隆抗體。親和性為至少108M、優選為109至1010或更強的單克隆抗體通常按照標準程序加以製備，如Harlow和Land(1988)《抗體實驗室手冊》Cold Spring Harbor Laboratory或Goding(1986)《單克隆抗體原理和實踐》第2版Academic Press N.Y.所述。
可用於產生抗體的序列包括AKQNSSKTTSKRRG。尤其有用的序列包括圖2箭頭後所指示的那些。抗這些序列的抗體可用於區分不同的SRK轉錄物。見上。
特定的SRK抗體可用於病理學狀態和慢性或急性疾病的診斷，這些疾病以SRK的量或分布差異為特徵。SRK的診斷試驗包括採用抗體和標記檢測人(或小鼠等，如果使用小鼠等的話)體液、組織或組織提取物中SRK的方法。
本發明的多肽和抗體在使用時可以進行或不進行修飾。經常，多肽和抗體將通過它們以共價或非共價方式與提供可檢測的信號的物質連接而被標記。已知有多種標記和綴合技術，廣泛見諸科學和專利文獻。適合的標記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光劑、化學發光劑、磁性粒子等。涉及這些標記用途的專利包括美國專利Nos.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。而且，還可以產生重組免疫球蛋白，如美國專利No.4,816,567所示，引用在此作為參考文獻。
本領域已知各種用於測量可溶性或與膜結合的SRK的方案，它們使用SRK特異性單克隆或多克隆抗體。例子包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)和螢光激活細胞分類術(FACS)。優選的是雙位點單克隆類免疫測定法，使用對EC上兩個非幹擾性表位具有反應性的單克隆抗體，但是也可以採用競爭性結合測定法。這些測定法尤其描述在Maddox，Del.等(1983)《實驗醫學雜誌》1581211。
抗體和其它與SRK結合的配體可以按各種方式使用，包括作為治療、診斷和商業研究的工具，例如量化動物、組織、細胞等中的SRK多肽水平，鑑定細胞定位作用和/或其分布，純化它或包含其一部分的多肽，調製它的功能，用在蛋白質印跡、ELIZA、免疫沉澱、RIA等中。本發明涉及這樣的測定法、進行這些方法的組合物和試劑盒等。利用這些和其它方法，根據本發明的抗體可用於檢測各種樣本中的SRK多肽或其片段，樣本包括組織、細胞、體液、血液、尿、腦脊液。本發明的方法包括a)在本領域已知有效實現結合的條件下，接觸與圖2肽結合的配體，和b)檢測配體與肽之間的特異性結合。特異性結合意味著配體連接在明確的胺基酸序列上，例如包括圖2胺基酸序列或其衍生物或包括在其中。
使用SRK特異性抗體，天然或重組SRK可以按免疫親和色譜法加以純化。一般來說，通過將抗SRK抗體與活化色譜樹脂共價偶聯，構造免疫親和柱。
多克隆免疫球蛋白是從免疫血清中製備的，方法是用硫酸銨沉澱，或在固定化蛋白質A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)上純化。同樣，單克隆抗體是從小鼠腹水中製備的，也是通過硫酸銨沉澱或固定化蛋白質A色譜。部分純化的Ig共價連接到色譜樹脂上，例如CnBr活化的Sepharose(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)。將抗體與樹脂偶聯，將樹脂封閉，按照廠商說明洗滌衍生樹脂。
在SRK的純化中採用免疫親和柱，通過製備含有SRK的細胞部分進行純化。這種製備可以是將通過加入洗滌劑進行差示離心所獲得的全細胞或亞細胞部分進行增溶，或者是本領域熟知的其它方法得到的。或者，含有信號序列的可溶性SRK可以以有用的量分泌到細胞在其中生長的培養基中。
使含有SRK的可溶性製劑通過免疫親和柱，柱子例如在這樣的條件下洗滌，例如在洗滌劑存在下的高離子強度緩衝液，以便SRK的優先吸收。然後，柱子在破壞抗體/SRK結合的條件(例如pH 2-3的緩衝液，或高濃度離液劑，例如尿素或硫氰酸根離子)下洗脫，收集SRK。
另外，與根據本發明的SRK多肽或其衍生物結合的配體例如可以利用合成肽文庫或aptamer加以製備(例如Pitrung等，美國專利No.5,143,854；Geysen等《免疫學方法雜誌》102259-274，1987；Scott等《科學》249386，1990；Blackwell等《科學》2501104，1990；Tuerk等《科學》249505，1990)。
抗體或其衍生物也可用於抑制SRK或其片段的表達。SRK多肽水平可以單獨或結合其它基因產物加以測定。確切地說，可以將SRK多肽的量(例如其表達水平)與相同或不同樣本中其它多肽、例如肌動蛋白的量進行比較(例如作為比例)。一般來說，按照任何所需的方法，SRK特異性試劑可用在診斷和/或法醫研究中，例如美國專利Nos.5,397,712、5,434,050、5,429,947。
本發明也涉及SRK多肽，它是按照所需方法製備的，例如公開在美國專利No.5,434,050中的方法。標記後的多肽例如可用在結合測定法中，例如用於在體外、體內、原位系統等中鑑定與SRK結合或連接的物質、跟蹤SRK在細胞內的運動等。
根據本發明的核酸、多肽、抗體、SRK、配體等可以被分離。術語「分離」意味著物質處於其原始環境中或自然形式中不能存在的形式中，例如更濃縮、更純淨、從組分中分離等。分離後的核酸例如包括具有從活動物染色體DNA分離的SRK序列的核酸，例如作為完整的基因、轉錄物或cDNA。這種核酸可以是載體的一部分，或者可以插入到染色體內(通過特異性基因靶向或隨機整合在除正常位置以外的位置)，並且也仍是分離的形式，即不是在其自然環境中的形式。本發明的核酸或多肽也可以是基本上純淨的。基本上純淨意味著核酸或多肽是分離的，基本上不含其它核酸或多肽，也就是說核酸或多肽是主要的活性成分。
本發明也涉及包含SRK的轉基因動物，例如非人哺乳動物，例如小鼠。轉基因動物可以按照已知方法製備，例如包括將重組基因原核注射到1-細胞胚胎的原核內、向胚胎幹細胞內摻入人工酵母染色體、基因靶向方法、胚胎幹細胞方法學。例如參見美國專利Nos.4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon等《美國國家科學院院報》777380-7384，1980；Palmiter等《細胞》41343-345，1985；Palmiter等《Ann.Rev.Genet.》20465-499，1986；Askew等《分子細胞生物學》134115-4124，1993；Games等《自然》373523-527，1995；Valancius和Smithies《分子細胞生物學》111402-1408，1991；Stacey等《分子細胞生物學》141009-1016，1994；Hasty等《自然》350243-246，1995；Rubinstein等《核酸研究》212613-2617，1993。可以將根據本發明的核酸引入任何非人哺乳動物，包括小鼠(Hogan等《利用小鼠胚胎實驗室手冊》ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1986)、豬(Hammer等《自然》315343-345，1985)、綿羊(Hammer等《自然》315343-345，1985)、牛、大鼠或靈長類。例如也參見Church，1987《生物技術趨勢》513-19；Clark等《生物技術趨勢》520-24，1987)；和DePamphilis等《生物技術》6662-680，1988。另外，定製的轉基因大鼠和小鼠是商業上可得到的。這些轉基因動物是有用的動物模型，可用於試驗SRK的功能、作為蛇的飼料、作為檢測菌株起源的遺傳標記(即其中SRK或其片段已被插入)等。這些轉基因動物可以進一步包含其它轉基因。轉基因動物(例如SRK失效)可以按照美國專利申請Nos.08/866,058和09/000,846加以製備和使用。含有SRK突變體(例如顯性幹擾性SRK)或SRK失效的轉基因動物可以結合其它基因突變，例如涉及相同或相似信號途徑的基因失效或突變。這樣的基因包括Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich症候群蛋白、FTases、STE14、p53、Rb、Mtase、GTP酶亞單位、Dbl、1bc、Ost、Lsc、Ste7，優選為Ste11、Fus3、KSS1、Ras、活化Ras突變蛋白、Raf、MEK等，以及上文、下文或本文引用的參考文獻中提到的任何基因等。動物可以是純合的或雜合的，依所需用途和表型而定。
一般地，本發明的核酸、多肽、抗體等可以如美國專利Nos.5,501,969、5,506,133、5,441,870和WO 90/00607、WO 91/15582所述加以製備和使用。
關於核酸的其它方面，請參考分子生物學的標準教科書。例如參見Davis等《分子生物學中的基本方法》Elsevir Sciences Publishing，Inc.，New York，1986；Hames等《核酸雜交》IL Press，1985；Sambrook等《分子克隆》CSH Press，1989；Howe《基因克隆和操作法》Cambridge University Press，1995。
實施例實施例1SRK的克隆為了鑑定新穎的影響MAP激酶途徑的信號轉導分子，我們採用一種酵母系統，其中表達哺乳動物Raf和MEK蛋白，以補充酵母Ste11蛋白(Freed等《科學》2651713-1716，1994)。表達Raf和MEK的菌株SY1984(SY1984 R-L M-T)響應於Raf的活化，藉助酵母MAP激酶Kss1和Fus3發信號而實現活化。後者激酶的活化誘導HIS3基因從FUS1啟動子轉錄，引起在沒有外源性組氨酸的存在下的生長(圖1)。將細胞用從Jurkat細胞製備的人cDNA文庫轉化，分離在沒有組氨酸的存在下生長的菌落。分離每個菌落的cDNA，再對四種不同的菌株進行試驗原來用於篩選的菌株(SY1984 R-L M-T)、缺少Raf的菌株(SY1984 M-T)、缺少MEK的菌株(SY1984 R-L)和無Ste7菌株(SY1943-L21)，以鑑定它們的功能靶特徵。
篩選得到若干活化Raf、MEK或酵母MEK、Ste7的基因。分離不同的Ras和14-3-3克隆作為Raf活化劑，它們在沒有組氨酸的存在下且僅當存在Raf時刺激生長。在MEK活化劑中，獲得涵蓋這些基因的激酶結構域的MEKK1和MEKK2部分克隆。另外，分離到兩種新穎的基因，是Ste7的活化劑。它們允許SY1984菌株(具有野生型STE7)在缺少組氨酸的培養基上生長，但是不允許SY1493-L21菌株(STE7缺失)生長。這些克隆J42和J207編碼相同的激酶結構域，在3』序列中有分支(圖2)，提示了它們可能代表相同基因的剪接變體。這些基因的激酶結構域與Raf激酶共享33％(Bonner等《核酸研究》141009-1015，1986)、與Muk共享37％(Hirai等《癌基因》12641-650，1996)、與TAK1共享39％(Irie《癌症研究進展》2651716-1719，1994)、與MLK蛋白共享44％的同一性(Dorow《歐洲生物化學雜誌》213701-710，1993)，所述均為MAPKKK家族的成員。與MLK蛋白相似，J42激酶結構域後接亮氨酸拉鏈區，它也存在於J207克隆中。J42基因具有獨特的3』區，它編碼強酸性結構域。分離的J42 cDNA具有編碼51KDa計算MW蛋白質的能力。
使用來自激酶結構域的cDNA探針進行RNA印跡分析，鑑定了7.5kb的優勢帶和3.8kb與1.6kb的次豐富帶。來自J42 3』端的特異性探針鑑定該大的轉錄物為J42 mRNA，而來自J207 3』端的探針識別3.8kb信息(圖3A)。mRNA分布的分析顯示，J42和J207在正常組織中是無所不在地被表達的，不過在骨骼肌和心臟中是最為豐富的(圖3B)。因為J42特異性信息在三種形式RNA中是最主要的，我們主要對J42克隆進行下列研究。我們將J42基因稱為「存活調節激酶」或「SRK」。
其它克隆可以按常規方法從cDNA文庫中加以分離，例如富集更大轉錄物、例如大於5kb的轉錄物的文庫。由於7.5kb SRK轉錄物在心臟和骨骼肌中是豐富的，文庫可以按常規方法從分離自這些組織的mRNA加以製備。mRNA可以富集更長的轉錄物，方法是在凝膠上走mRNA，切除含有7.5kb轉錄物的凝膠區域，從大小富集的mRNA製備cDNA。一旦準備好文庫，可以按常規方法進行篩選，例如使用標記的激酶結構域、標記的J42等。也可以通過聚合酶鏈反應進行篩選。
實施例2重組SRK具有體內和體外激酶活性為了試驗這種新穎的激酶是否影響哺乳動物細胞內的MEK活性，我們將COS細胞用SRK-KT3標記構建物和Glu-標記的MEK質粒進行共轉染。隨後，重組MEK用抗Glu抗體進行免疫沉澱，並在重組ERK的存在下進行體外激酶反應。當與SRK共表達時，經過免疫沉澱的MEK能夠體外磷酸化MAP激酶，說明它被體內活化。不過，當SRK從COS細胞中被免疫沉澱出來並與重組無激酶活性MEK(MEK-B)進行體外反應時，它不能磷酸化和活化MEK，儘管對於MBP具有非常強的活性。相反，重組MEK被MEKK1相當充分地磷酸化和活化。另外，SRK也顯示強烈的自磷酸化作用。該結果提示，SRK對MEK的體內活化作用是間接的。與這種假設一致的是，當在細胞內共表達時，SRK對ERK2產生弱的活化作用。SRK也僅微弱地刺激JNK1。這些觀察結果以及序列同源性和對酵母系統所作的研究都支持了這樣的假設SRK可能代表新穎的MAP激酶途徑中的一員。
實施例3抗SRK特異性抗體鑑定51KDa蛋白質是細胞內內源性SRK的主要形式為了測定內源性SRK蛋白的大小，我們引起兔抗肽抗體，這種肽是從SRK獨有的羧基末端序列衍生的(圖2)。將抗血清在肽親和柱上純化，所得抗體4-1-1用在對COS和293細胞溶胞產物所進行的蛋白質印跡分析中。250KDa帶與7.5Kb SRK轉錄物的編碼潛力是一致的。不過，在細胞溶胞產物中始終觀察到更佔優勢的表觀分子量約為51KDa的帶。即使當細胞在高濃度蛋白酶抑制劑的存在下或在SDS的存在下溶解時也檢測到這條帶。較小形式的大小非常接近於從我們在原來的篩選中所鑑定的cDNA表達的重組SRK蛋白。重組蛋白的緩慢移動性可能是由KT3標記所導致的，加入該標記用於鑑定。隨後的試驗使用了針對重組SRK產生的抗體，確認了~51kDa內源性蛋白質具有組成型激酶活性。另外，內源性51kDa SRK和重組蛋白質的有限蛋白水解作用都產生相似模式的肽片段。
實施例4SRK的激酶缺陷型突變體具有顯性幹擾性質大多數激酶在活性位點都具有保守的賴氨酸，這對激酶活性來說是必需的。SRK在這個區域具有兩個連續的賴氨酸，在45位和46位。我們將這些位點之一或者兩者都突變為丙氨酸，以及133位的天冬氨酸，後者在cdc2菌肉中表現為顯性失活。分別產生SRK-K45A(SRK-KA)、SRK-K45AK46A(SRK-KKAA)和SRK-D133A(SRK-DA)。為了試驗這些突變是否使激酶失活，我們將各種突變的蛋白質表達在酵母以及COS細胞中。這些突變體沒有一個能夠支持酵母菌株SY1984在缺少組氨酸的培養基上生長。同樣，利用在COS細胞內表達的這些蛋白質既沒有觀察到自磷酸化作用，也沒有觀察到MBP磷酸化作用(數據沒有顯示出來)。為了試驗無激酶活性的SRK突變體是否表現為顯性失活突變體，我們將它們在酵母內與野生型J207共表達，後者在該系統內具有相同的表型，並確定SRK突變體是否幹擾J207向Ste7發信號的能力。這些蛋白質的共表達不影響在組氨酸存在下(+His)的細胞生長，說明缺乏對細胞的非特異性毒性。不過，當在沒有組氨酸的存在(-His)下使突變體在複製平皿上表達以試驗MAP激酶途徑的活化作用時，觀察到菌落數量較少(10-20％)。當野生型SRK被表達時，在兩種培養基上沒有觀察到菌落數量差異。這些結果說明，無激酶活性的SRK突變體非生產性地與Ste7結合，在酵母中以顯性失活方式發揮作用。
實施例5SRK-KA降低Ras的轉化潛力，抑制293細胞在軟瓊脂中和在塑料上的生長為了鑑定SRK的功能，我們在轉化灶形成測定法中測定了它的激酶活性是否是致癌基因RasV12轉化NIH3T3細胞所必需的。為此，我們將RasV12以及無激酶活性的SRK構建物一起共表達，後者可能在哺乳動物細胞以及酵母中充當顯性幹擾突變體。圖4顯示SRK突變體減少Ras引起轉化灶的能力，這與顯性失活MEK和RacN17的情況一樣。為了將這種觀察結果延伸到人細胞系，我們創建了穩定的人胚胎腎293細胞系，它們表達蛻皮素可誘導的SRK-KA構建物。用muristerone A誘導後，在不同的克隆中觀察到不同水平的SRK-KA表達。SRK-KA在這些細胞內的誘導作用以劑量依賴性方式影響它們的生長。高表達克隆的生長比低表達克隆受到更多影響，也就是說在表達更大量SRK-KA的克隆中觀察到比表達更低量的克隆更多的生長抑制作用。有趣的是，即使在非誘導性條件下，也在一些克隆中觀察到對細胞生長的一定影響。這種影響與這些克隆中沒有muristerone A存在的背景表達水平有相互關係。有趣的是，一種顯示最緊密表達模式的克隆在其生長性質上不能區別於沒有誘導作用存在的對照細胞。不過，這種克隆在SRK-KA表達的誘導作用之後受到嚴重影響。我們隨後試驗這些克隆在軟瓊脂中生長的能力，這是一種與轉化表型有關的性質。我們發現，SRK-KA表達對軟瓊脂中的菌落形成具有顯著影響，這種影響的程度也與突變SRK蛋白的表達水平有相互關係。綜上，這些觀察結果提示，SRK在生長調節和轉化中具有重要的功能，用顯性失活突變體阻斷它的信號途徑則幹擾細胞轉化。
實施例6SRK激酶與HAX-1結合為了描繪SRK激酶的下遊途徑，我們用SRK-WT或SRK-KKAA進行了酵母雙雜交篩選。在兩者情況下，僅使用激酶和亮氨酸拉鏈結構域作為誘餌，因為SRK的C-端結構域是強酸性的，它主動誘導反式激活作用(數據沒有顯示出來)。將攜帶一種或另一種誘餌的YRG2菌株用從U937細胞衍生的cDNA文庫轉化。總計9.3×106個轉化體，其中2.6×106個為SRK-WT，6.7×106個為SRK-KKAA，分析發現318個克隆在-His上的生長為陽性。由於YRG2菌株不產生-半乳糖苷酶表型，候選物在YGH1菌株中重新試驗藍色。用SRK-WT和SRK-KKAA獲得相似的克隆。總計18個陽性克隆，其中5個編碼不同的HAX-1基因片段。該基因編碼與Bcl-2類蛋白共享一定同源性的蛋白質，定位於線粒體(Suzuki等《免疫學雜誌》1582736-2744，1997)。圖5顯示克隆和它們的-gal表型。有趣的是，用缺少蛋白質N-端一半的克隆104觀察到最強烈的相互作用，說明Hax-1的C-端區域對與SRK結合來說是足夠的。與SRK的相互作用是特異性的，因為用Gal-4 DNA結合結構域或其它三種誘餌Bcl2、p53或BCR-PH則觀察到沒有相互作用。為了確認哺乳動物細胞中的相互作用，將SRK激酶在COS細胞內與重組S-標記的Hax-1共表達。圖6顯示在S-Hax-1複合體中發現了SRK-WT和SRK-KA。還發現被克隆104編碼的短型Hax-1可用兩種形式的SRK共沉澱。
免疫螢光研究確認，全長Hax-1(克隆102)主要定位於線粒體，前人有所報導(Suzuki等《免疫學雜誌》1582736-2744，1997)。有趣的是，有相當一部分重組SRK共定位於該相同的細胞器。這種定位作用在固定之前的細胞的透化作用之後是明顯的，使重組SRK的胞質可溶性部分從細胞內漏出，揭示了該部分通過Hax-1固定於線粒體。除了線粒體定位作用以外，還在核內檢測到了SRK。
實施例7Hax-1的可溶形式導致編程性細胞死亡當Hax-1的C-端一半(克隆104、Hax-104)在COS細胞內被表達時，它不定位於線粒體，儘管在蛋白質的C-端存在公認的疏水性跨膜結構域。用與重組Hax-1上的S-肽標記特異性結合的S-蛋白所進行的亞細胞螢光定位作用顯示，這種截短的蛋白是胞質的。固定之前的細胞透化作用引起重組Hax-104的全體喪失。DAPI染色說明Hax-104表達導致染色體縮合，這是經歷編程性細胞死亡的細胞的典型特徵。用全長Hax-1蛋白沒有觀察到這種表型，提示它在編程性細胞死亡的抑制中發揮作用(Suzuki等《免疫學雜誌》1582736-2744，1997)。截短的Hax-1的毒性提示這種片段能夠充當顯性失活突變體。這種部分蛋白可以結合在不適當的位置，隔離必需因子，引起細胞死亡。有趣的是，這種作用被SRK共表達所抑制，說明SRK可以在編程性細胞死亡的調節中發揮作用。
實施例8SRK-激酶抑制IL-3-依賴性細胞的編程性細胞死亡為了探究SRK是否可以抑制其它系統中的細胞死亡，我們選擇FL5.12細胞進行研究，這種細胞為了存活而對IL-3的依賴性特徵已被廣泛地描述過(McCubrey等《癌基因研究》497-109，1989)。將細胞用SRK或Bcl2瞬時轉染，再使其恢復24小時。隨後，撤去IL-3達18小時，對細胞進行加工用於FACS分析。SRK表達減少了細胞的sub-G1群，這代表細胞經歷DNA斷裂，而後者是編程性細胞死亡的結果。這種減少作用類似於在相同實驗中用Bcl2所觀察到的結果。因此，在這種系統中SRK也充當編程性細胞死亡的抑制劑。
實施例9J42體外磷酸化BAD磷酸化作用使原編程性細胞死亡蛋白BAD體內失去活性，磷酸化作用發生在兩個位點Ser1112和Ser136，這促進這種蛋白質與14-3-3蛋白的結合，並防止它與存活蛋白Bcl-X發生相互作用。已經顯示PKB負責磷酸化Ser136，不過，還沒有鑑定出體內磷酸化Ser112的激酶。既然J42是絲氨酸/蘇氨酸激酶，並且我們指出它涉及編程性細胞死亡的抑制作用，因此我們試驗它是否能夠磷酸化BAD。我們首先試驗了BAD的體外磷酸化作用。我們把從被杆狀病毒感染的細胞製備的重組J42，與重組GAST-BAD培養，進行激酶反應。J42對BAD的活性非常高。磷酸-BAD(Ser 112)特異性抗體鑑定Ser112是被J42磷酸化的位點之一。有趣的是，Ser136不受J42的影響，但是被PKB磷酸化。
實施例10J42對S112-BAD的體內磷酸化作用為了檢查J42是否能夠體內磷酸化BAD的S112，將COS細胞用J42和不再導致編程性細胞死亡的BAD突變形式瞬時轉染。然後利用磷酸-112抗-BAD抗體，通過細胞溶胞產物的蛋白質印跡觀察BAD位點112的磷酸化作用。Wt-J42能夠增加磷酸-BAD水平超過背景水平，而J42-KA減少該水平。因此，J42能夠體內磷酸化BAD的S112。
實施例11質粒和cDNA文庫的構建通過在BstX1與Not1之間插入新穎的多接頭(Sal1、Sac1、AatII和Xho1)，從pAB23-BXN衍生含有URA3可選擇性標記物的2μm級質粒pAB23BXN2(Schild等《美國國家科學院院報》872916-2920，1990)，用作文庫載體。在5μg Poly(A+)RNA上進行cDNA合成，這種RNA是利用Invitrogen Fast跟蹤試劑盒從2×108個Jurkatt細胞中分離的。第一鏈用來自ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene)的接頭-引物來引發，它含有Xho1位點。這種3』克隆位點的保護作用保證最終cDNA的單向克隆化。5』克隆位點是由BstX1銜接體的連接作用所提供的。將cDNA文庫按大小分級，收集含有500bp以上插入片段的部分，與所製備的載體連接。大腸埃希氏菌DH10β(GIBCO-BRL)的轉化得到總計大約1×106個轉化體，載體的再連接作用代表其3％背景。
來自用在2-雜交篩選中的U937細胞的人cDNA文庫是來自AliciaEguinoa(The Babraham Institute，Cambridge)的慷慨禮物。在pAD-GAL4質粒(Stratagene)中的Eco R1與Xho1位點之間構建該文庫。使用質粒pDB-GAL4-SRK-WT-C和pDB-GAL4-SRK-KA-C作為誘餌。利用來自Stratagene的定點誘變試劑盒QuickChangeTM生成無SRK-激酶活性的突變體。使用下列引物將K45、K46和D133轉變為A對於SRK-KA使用GAGGTGGCTGTCGCGAAGCTCCTCA，對SRK-KKAA使用GGTGGCTGTAGCAGCGCTCCTCAAA，對SRK-DA使用GTGATTCACAGGGCCCTCAAGTCAAG。按照廠商的提示進行誘變。含有RacN17、DN-MEK和RasV12的質粒EXV及其衍生物是從Marc Symons(OnyxPharmaceuticals)獲得的。pBS-SRK-KT3是這樣構建的，在PCR反應中，利用下列3』端低聚體，在SRK的最後一個密碼子之後插入KT3標記GGATCCAACACCACCACCAGAACCAGAAACATGAGCGGCCGC。
含有SV40啟動子的pCDB載體是從George Martin(OnyxPharmaceuticals)獲得的，用於生成pCDB-SRK-WT、pCDB-SRK-KA和pCDB-SRK-KKAA，方法是亞克隆來自pBS構建物的Sal1(填補)-Not1片段。Hax-1克隆102和104分別代表全長的和N-端截短的基因。將它們從文庫質粒亞克隆到pT7 Blue-2載體(Novagen)中，後者提供N-端的S-標記，然後作為Nco 1-填補-Hinc II片段重新克隆到pCDB的填補Eco R1位點。
利用含有KT3-標記的突變SRK編碼序列的pBS-SRK-KA的HindIII-Not1片段構建pIND-SRK-KA，將其連接到用相同酶消化的pIND(Invitrogen)載體上。
實施例12酵母菌株和技術SY1984菌株(MAT ste11 pep4 his3 FUS1HIS3 leu2 ura3 trp1can1)(Freed等《科學》2651713-1716，1994)用於生成其衍生物SY1984 R-L、SY1984 M-T和SY1984 R-L M-T，方法是將RAF(R)和MEK(M)基因分別整合在LEU2(L)和TRP1(T)基因座上。SY1493-L21菌株(MAT ste11 pep4 his3 FUS1∷HIS3 leu2 ura3trp1 can1 ste7∷LEU2)是從Kunihiro Matsumoto(NagoyaUniversity，Japan)獲得的。YRG2菌株(Stratagene)和YGH1(Hannon等《基因進展》72378-2391，1993)用於2-雜交篩選。
使用標準酵母培養基(Rose等，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)和遺傳技術(Sherman等，ColdSpring Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982)。
實施例13RNA和蛋白質分析利用Invitrogen Fast跟蹤試劑盒從HT1080細胞製備Poly(A+)RNA。從Clontech購買人多組織RNA印跡I和II，與上述SRK激酶結構域雜交。將哺乳動物細胞溶解在溶胞緩衝液中，後者含有20mMtris-HCl pH8.0、137mM NaCl、1mM EGTA、1％Triton x-100、10％甘油、1.5mM MgCl2，在使用前補充1mM原釩酸鈉、50mM NaF、1mMPefabloc、20μM亮抑酶肽和10μg/ml抑酶肽。將細胞在4℃下溶解20分鐘，在4℃下使碎屑在14Krpm下自旋。通常，將500μg蛋白質用適當的抗體進行免疫沉澱，該抗體與蛋白質G瓊脂糖珠粒偶聯(KT3抗體)或者與蛋白質A珠粒一起，在4℃下免疫沉澱2小時。將免疫複合物用溶胞緩衝液洗滌三次，將蛋白質在Laemmli樣本緩衝液中洗脫，在95℃下加熱5分鐘。對樣本進行加工，用於蛋白質印跡分析或激酶反應，後者是在30mM Tris-HCl pH8.0、20mM MgCl2、1mM EDTA、75mM NaCl、1mM DTT、1mM原釩酸鈉、10μM冷ATP、5微居裡[-32P]ATP和適當底物的存在下。
免疫螢光是這樣進行的，將細胞在4％甲醛中固定15分鐘，然後用PBS、0.1％Triton x-100洗滌三次，使細胞透化，用含有5％奶粉和0.1％吐溫的blotto溶液封閉45分鐘。必要時，在固定前進行30秒鐘的細胞透化作用。
按下列稀釋比使用抗體SRK 4-1-1抗體為1∶200，S-FITC蛋白稀釋為1∶2000。培養45分鐘。用axiovert 100顯微鏡(Zeiss)觀察細胞，並利用40x(0.75NA)neofluar物鏡或100x(1.3NA)平面neofluar物鏡，用冷卻的CCD照相機捕獲圖象。
實施例14細胞轉染如下利用電穿孔進行COS細胞的瞬時轉染。4×106個細胞經受胰蛋白酶消化作用，用HeBs緩衝液洗滌兩次，該緩衝液含有20mM HepespH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4和6mM葡萄糖。將細胞再懸浮在HeBs中，最終體積為260μl，該HeBs含有10μg(1μg/ml)供試DNA和100μg鮭睪丸載體DNA。在Biorad儀器中進行電穿孔，電壓為250伏，電容為125μF。使細胞在比色杯中恢復10分鐘，放置在10cm平皿內，72小時後收穫。從Invitrogen購買穩定表達蛻皮激素受體的EcR-293細胞，採用Qiagen的SuperFect技術，用SRK-KA或載體質粒穩定地轉染該細胞。在300μg/ml G418和400μg/Zeocin(Invitrogen)的存在下進行轉染細胞的選擇。
實施例15轉化灶形成測定法、SRB和軟瓊脂生長轉化灶形成測定法如前人所述進行(Qiu等《自然》374457-459，1995)。簡單地說，使用磷酸鈣法，將NIH3T3細胞用不同DNA轉染，14天後計數轉化灶。SRB測定法如前人所述進行(Skehan等《國家癌症研究院雜誌》821107-1112，1990)。簡單地說，將細胞按104個細胞/孔接種在96孔微量滴定板中。為了實現再現性，每種細胞系試驗七個孔，每個時間點、即0或4天試驗兩個板。附著幾小時後，改變培養基，開始進行處理。在該0時間點，固定平板以提供用於數據歸一化的內部對照。四天後，將細胞用50％三氯乙酸溶液固定。將平板在4℃下培養60分鐘，然後在室溫(RT)下用0.2％SRB的1％乙酸溶液染色30分鐘，風乾。在低速搖動器上，將所結合的染料在200μl 10mM未緩衝的Tris鹼中溶解5分鐘，在ELISA平板讀數器中、在515nm下讀取OD值。
軟瓊脂生長如前人所述進行(Qiu等《自然》374457-459，1995)。
實施例16FL5.12細胞的編程性細胞死亡測定法將FL5.12細胞培養至最大密度為5×105個細胞/ml，培養基為RPMI 1640、10％FCS、10％WEHI IL-3上清液、2.0mM L-穀氨醯胺、1.0mM丙酮酸鈉、100u/ml青黴素和10μg/ml鏈黴素。
在室溫下，在1.5ml eppendorf試管內，使DEAE葡聚糖與所有轉染的DNA結合，二者比例為1.0μg DEAE葡聚糖/10μg DNA。離心收穫FL5.12細胞，用冷的電穿孔培養基洗滌兩次；該培養基為RPMI1640、20％FCS、2.0mM L-穀氨醯胺、1.0mM丙酮酸鈉、100u/ml青黴素和10μg/ml鏈黴素，再按4×107個細胞/ml的密度懸浮。將500μl細胞懸液轉移到含有DNA/DEAE葡聚糖複合物的eppendorf試管內。將細胞懸液在冰上培養15分鐘，並進行間歇的混合(反轉)，再轉移到預冷卻的0.4cm Bio-Rad電穿孔比色杯內。使細胞在Bio-RadGene-pulsor電穿孔儀中進行電穿孔，電壓為250-350V，電容為960μF，在冰上培養10分鐘。從比色杯內收集細胞，用吸移管小心地除去游離的基因組DNA。將細胞用預溫熱至37℃的培養基稀釋至5.0ml，在15ml圓錐形離心試管內小心地覆蓋在5.0ml預溫熱的Ficoll-paque上。在22℃下，在裝有GS-3.8轉子的Beckman GS-6R離心機中離心分離存活的細胞中的電瀕死細胞，在3000xg下離心20分鐘。小心地收集梯度界面上的細胞，用培養基洗滌2次。將細胞再懸浮在10ml培養基中，使其在37℃、5％CO2下恢復24小時。
24小時恢復期後，將細胞用PBS、1.0％FCS洗滌3次，再懸浮在RPMI 1640、1.0％FCS、2.0mM L-穀氨醯胺、1.0mM丙酮酸鈉、100u/ml青黴素、10μg/ml鏈黴素和+/-IL-3中。將細胞在標準環境條件下另外培養18-36小時。
將細胞在冷的PBS、1.0％FCS中洗滌2次，再懸浮在500μl不含鈣或鎂的PBS中。然後將細胞用5.0ml冰冷卻的85％乙醇固定，在冰上避光培養20分鐘。固定後，將細胞在冰冷卻的、不合Ca和Mg的PBS中洗滌2次，再懸浮在1.0ml碘化丙錠溶液中10μg/ml碘化丙錠、25μg/ml RNA酶A、1.0％FCS在不含Ca和Mg的PBS中的溶液，在37℃下避光培養30分鐘。將細胞轉移到帶濾帽的4.0ml聚碳酸酯試管內，在Becton-Dickenson FACScalibur掃描儀上進行FACS分析。
討論在這項研究中，我們描述了新穎的人絲氨酸/蘇氨酸激酶SRK的鑑定方法，SRK在釀酒酵母中能夠活化Ste7，後者是介導交配信息素應答的酵母MEK同系物。SRK蛋白與MAPKKK類蛋白質在激酶結構域上共享顯著的同源性，後者蛋白質已知活化MEK。功能鑑定和序列相似性提示SRK是MAPKKK家族的新成員，可能涉及另一種信號途徑。
比較所分離的SRK cDNA與其mRNA的長度，分別為2kb和7.5kb，說明這是一種部分cDNA。我們對若干cDNA文庫進行了廣泛篩選，以分離全長基因，但是我們所分離到的最長克隆與原始分離到的cDNA開始於同一點。不過有趣的是，細胞內所檢測到的SRK的主要形式的分子量非常接近於被所分離的cDNA克隆編碼的蛋白質。
SRK活性位點的突變幹擾其在酵母系統中的活性。因此我們使用這些突變蛋白研究SRK在細胞增殖控制中的作用。轉化灶形成測定法說明突變後的SRK能夠幹擾Ras介導的轉化作用，說明其功能是致癌基因Ras發揮全部轉化能力所必需的。另外，顯性失活SRK的可誘導構建物對293細胞在軟瓊脂中生長的能力具有顯著影響。這種表型與對細胞生長的影響密切相關，這是用SRB測定法檢測到的，並且與顯微鏡觀察結果是一致的，顯示培養物中的生存能力喪失。同時，這些發現說明了SRK在維持轉化表型中的作用。人們關於SRK調節轉化作用的分子機理的一定認識來自其結合配偶體之一是Hax-1蛋白這一發現。Hax-1經鑑定是HS1-相互作用分子，與Bcl2家族共享一定同源性。Bcl2家族代表一大類抗編程性細胞死亡因子以及原編程性細胞死亡因子(Chao等《免疫學年鑑》16395-419，1998，1998)。它們主要以共享的同源性結構域為特徵，這些結構域包括保守區域，稱為BH(Bcl同源性)1、BH2、BH3和BH4。Hax-1具有BH1和BH2區域，但是缺少BH3同源性(Suzuki等《免疫學雜誌》1582736-2744，1997)，其意義是不清楚的。HS1是造血的特異性蛋白質，它轉導淋巴樣細胞內克隆擴充和缺失的信號(Taniuchi等《歐洲分子生物學組織雜誌》143664-3678，1995)，並已涉及編程性細胞死亡的誘導作用(Fukuda等《美國國家科學院院報》927302-7306，1995)。作為HS1的結合配偶體，提示Hax-1在介導細胞存活功能中發揮作用(Suzuki等《免疫學雜誌》1582736-2744，1997)。我們指出，不再膜定位的Hax-1的截短突變形式導致編程性細胞死亡，而且SRK能夠抑制這種表型。另外，SRK抑制由除去FL5.12細胞中的IL-3誘導的細胞死亡。
最近日益明顯的是，癌基因除了解除調節生長以外還誘導細胞死亡(Evan等《細胞》69119-128，1992；Shi等《科學》257212-214，1992)。攜帶癌基因突變的細胞內編程性細胞死亡的抑制作用因此是發展為轉化表型的先決條件。這種抑制作用可以是由原編程性細胞死亡因子、如Bax的喪失引起的(Rampino等《科學》275967-969，1997)，或者是由存活因子或其受體、例如IGF-1和IGF-1R的過度產生引起的(Yee等《癌症治療研究》5393-106，1991；Cullen等《癌症研究》9443-454，1991)。涉及編程性細胞死亡抑制的磷酸化作用已被描述為Bcl-2活性(Ito等，1997；May等，1994)以及BAD活性(Zha等，1996)的調節作用。
Hax-1和SRK的共定位作用象徵這樣一種模型，其中與Hax-1結合的SRK使這種激酶適當地定位，以磷酸化原編程性細胞死亡蛋白，例如淋巴細胞中的HS1或其它細胞類型中的副本。這種修飾作用能夠防止原編程性細胞死亡蛋白與Hax-1結合，並減少它們的毒性作用。我們的發現說明，SRK活性的抑制作用能夠引起轉化細胞經歷編程性細胞死亡，因此，SRK代表一種有用的靶子，用於癌症的治療介入。
勿庸贅言，相信本領域技術人員藉助前面的說明，能夠最充分地利用本發明。前述優選的具體實施方式
因此被解釋為僅供舉例說明，無論如何也不限制其餘任何公開內容。上文引用的和附圖中的全部申請、專利和文獻的完整公開內容全文引用在此作為參考文獻。
權利要求
1.分離的人SRK多肽或其生物學活性多肽片段。
2.權利要求1的分離的SRK多肽，其中所述多肽具有蛋白激酶活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特異性致免疫活性；
3.權利要求1的分離的人SRK多肽，包含圖2所示的胺基酸1至胺基酸455。
4.權利要求1的分離的人SRK多肽，包含圖2所示的胺基酸1至胺基酸455，並具有圖2所示的DNA序列。
5.權利要求1的人SRK的分離的生物學活性片段，其中所述片段包含胺基酸1-250、23-250、287-322和430-455。
6.權利要求1的人SRK的分離的生物學活性片段，其中所述片段基本上由圖2所示的胺基酸1-455組成。
7.權利要求1的分離的人SRK多肽，與圖2胺基酸序列具有95％的序列同一性。
8.分離的SRK或其生物學活性片段，它是被一種核酸序列的補體編碼的，該序列在嚴格性強的條件下與圖2所示的DNA序列雜交，並且與所述DNA序列具有至少95％的序列同一性。
9.權利要求8的分離的SRK或其生物學活性片段，它是從天然來源獲得的。
10.權利要求8的分離的SRK，具有圖2的胺基酸序列，但是胺基酸45位賴氨酸被丙氨酸代替；胺基酸45位賴氨酸被丙氨酸代替並且胺基酸46位賴氨酸被丙氨酸代替；或者胺基酸133位天冬氨酸被丙氨酸代替。
11.權利要求8的分離的SRK或其生物學活性片段，它具有蛋白激酶活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特異性致免疫活性。
12.分離的核酸，包含編碼全長人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的核苷酸序列。
13.權利要求12的分離的核酸，其中所述被編碼的多肽具有蛋白激酶活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特異性致免疫活性。
14.權利要求12的分離的核酸，其中所述核酸是被7.5kb、3.8kb或1.6kb的mRNA所編碼的。
15.權利要求12的分離的核酸，其中該核苷酸序列編碼圖2所示的胺基酸1至胺基酸455。
16.權利要求12的分離的核酸，具有圖2所示的核苷酸序列。
17.權利要求12的分離的核酸，其中該核苷酸序列可操縱地連接於表達控制序列上。
18.權利要求12的分離的核酸，其中該核酸不間斷地編碼所述多肽。
19.權利要求12的分離的核酸，其中該核酸進一步包含可檢測的標記。
20.在轉化的宿主細胞內表達被核酸編碼的人SRK多肽的方法，包括在有效表達該多肽的條件下，培養含有權利要求11的核酸的轉化的宿主細胞。
21.權利要求20的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
22.權利要求20的方法，其中所述宿主細胞是酵母。
23.權利要求20的方法，進一步包括分離所述人SRK。
24.用權利要求20的方法生產的分離的人SRK多肽。
25.含有權利要求12的核酸的轉化的宿主細胞。
26.包含權利要求12的核酸的載體。
27.分離的核酸，它在嚴格性強的條件下與圖2所示的核酸序列或其補體雜交，並且與所述核酸序列或其補體具有至少95％的序列同一性。
28.權利要求27的分離的核酸，該序列編碼蛋白激酶活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特異性致免疫活性。
29.分離的核酸，基本上由選自圖2所示核苷酸序列的、12-100個鹼基對的任意連續序列或其補體組成。
30.權利要求29的分離的核酸序列，進一步包含可檢測的標記。
31.權利要求29的分離的核酸，在所述序列中具有至少一個但是不超過五個核苷酸取代，該核酸在嚴格性強的條件下與它或其補體雜交。
32.檢測人SRK多肽或其生物學活性多肽片段中蛋白激酶活性的方法，包括使人SRK多肽或其生物學活性多肽片段與底物在有效使所述SRK多肽磷酸化所述底物的條件下反應；和檢測所述底物的所述磷酸化作用。
33.權利要求32的方法，其中所述底物是MBP。
34.鑑定調製人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的MAPKK刺激活性的試劑的方法，包括將供試試劑對表達(1)人SRK多肽或其生物學活性多肽片段和(2)MAPKK多肽的細胞給藥，給藥在有效使所述SRK多肽刺激所述MAPKK多肽的蛋白激酶活性的條件下進行；檢測所述蛋白激酶活性；和通過比較在有和沒有該供試試劑的存在下的激酶活性的量，鑑定該供試試劑是否調製所述SRK多肽的所述刺激活性。
35.權利要求34的方法，其中所述給藥是對已經引入和表達編碼所述SRK多肽和所述MAPKK多肽的核酸的細胞而進行的。
36.權利要求35的方法，其中所述MAPKK多肽進一步包含多肽表位。
37.權利要求36的方法，進一步包括溶解所述包含所述被表達的SRK多肽和MAPKK多肽的細胞；使所述溶胞產物與抗多肽表位抗體在有效使所述抗體與所述表位結合形成複合體的條件下接觸；分離所述複合體；和檢測所述分離的複合體中的激酶活性。
38.權利要求37的方法，其中所述MAPKK多肽是MEK，所述多肽表位是myc、KT3、Glu或與所述MEK多肽框內融合的血凝素多肽序列。
39.鑑定調製由Ras和SRK介導的細胞轉化的試劑的方法，包括將供試試劑對表達RasV12多肽和缺少激酶活性的SRK多肽或其生物學活性片段的細胞在有效使所述RasV12導致所述細胞形成轉化灶的條件下給藥，其中所述RasV12多肽具有轉化灶形成活性，所述SRK多肽抑制所述RasV12的轉化灶形成活性；檢測由所述細胞形成的轉化灶；和通過比較在有或沒有所述供試化合物的存在下的轉化灶數量和大小，鑑定該供試試劑是否調製所述SRK多肽抑制所述RasV12的轉化灶形成活性的能力；和
40.權利要求39的方法，其中所述細胞是小鼠NIH3T3細胞或人293細胞。
41.權利要求39的方法，其中所述給藥是對已經引入和表達編碼所述RasV12和所述SRK多肽的核酸的細胞而進行的。
42.權利要求39的方法，其中所述轉化活性是在軟瓊脂中測定的。
43.權利要求39的方法，其中所述缺少激酶活性的SRK多肽是SRK-KA。
44.鑑定調製由Ras和SRK介導的細胞轉化的試劑的方法，包括將供試試劑對表達RasV12多肽的細胞在有效使所述RasV12導致所述細胞形成轉化灶的條件下給藥，其中所述RasV12多肽具有轉化灶形成活性；檢測由所述細胞形成的轉化灶；通過比較在有或沒有所述供試化合物的存在下的轉化灶數量和大小，鑑定該供試試劑是否調製所述RasV12的轉化灶形成活性；和測定所述供試化合物是否調製人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的蛋白激酶活性，其中所述活性是蛋白激酶活性；自磷酸化活性；細胞轉化活性；細胞生長調節活性；HAX-1結合活性；編程性細胞死亡抑制活性；或MAPKK刺激活性。
45.權利要求44的方法，其中所述檢測激酶活性包括使人SRK多肽或其生物學活性多肽片段與底物在有效使所述SRK多肽磷酸化所述底物的條件下反應；和檢測所述底物的所述磷酸化作用。
46.權利要求45的方法，其中所述底物是MBP。
47.鑑定調製人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的編程性細胞死亡抑制活性的試劑的方法，包括將供試試劑對表達可溶性HAX-1多肽和人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的細胞給藥，其中所述可溶性HAX-1多肽導致所述細胞內的編程性細胞死亡；在有和沒有所述供試化合物的存在下，檢測所述細胞內的編程性細胞死亡。
48.權利要求47的方法，其中所述檢測編程性細胞死亡包括利用DNA染色劑檢測染色體縮合。
49.鑑定調製人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的編程性細胞死亡抑制活性的試劑的方法，包括將供試試劑對已經引入編碼人SRK多肽或其生物學活性多肽片段的基因的細胞或其後代細胞給藥；在發生編程性細胞死亡的條件下培養所述細胞；和在有和沒有所述供試化合物的存在下，檢測所述細胞內的編程性細胞死亡。
50.權利要求49的方法，其中所述檢測編程性細胞死亡包括利用DNA染色劑檢測染色體縮合。
51.分離的抗體，它對人SRK多肽序列是特異性的。
52.權利要求51的分離的抗體，它與選自圖2的胺基酸序列結合。
53.權利要求49的分離的抗體，其中所述多肽序列包含AKQNSSKTTSKRRG。
54.具有編程性細胞死亡活性的人胞質HAX-1。
55.權利要求54的人胞質HAX-1，包含圖7所示的胺基酸104-279。
56.權利要求54的人胞質HAX-1，包含圖7所示的、編碼胺基酸104-279的核苷酸序列。
57.權利要求54的人胞質HAX-1，基本上由圖7所示的胺基酸104-279組成。
58.權利要求57的人胞質HAX-1，進一步包含與所述HAX-1多肽框內融合的多肽表位。
59.具有編程性細胞死亡活性的人胞質HAX-1，它被一種核酸序列的補體所編碼，該序列在嚴格性強的條件下與圖7所示DNA序列雜交，並且與所述DNA序列具有至少95％的序列同一性。
60.分離的核酸，包含編碼人胞質HAX-1的核苷酸序列。
61.權利要求60的分離的核酸，其中該核苷酸序列可操縱地連接於表達控制序列上。
62.權利要求1的分離的人SRK，進一步包含具有編程性細胞死亡活性的人胞質HAX-1。
63.權利要求1的分離的人SRK，進一步包含人胞質HAX-1，後者包含圖7所示的胺基酸104-279。
全文摘要
本發明涉及分離的SRK多肽、其生物學活性多肽片段和編碼它的核酸。這種多肽在調節細胞發信號和信號轉導途徑中具有多種活性,例如包括蛋白激酶活性;自磷酸化活性;細胞存活促進活性;HAX－1結合活性;編程性細胞死亡抑制活性;MAPKK刺激活性;轉錄調製活性;和SRK特異性致免疫活性。本發明涉及SRK或其同系物的所有方面,包括調製劑、活化劑、配體等的測定法。本發明也涉及胞質或可溶性HAX－1,當在細胞內被表達時,它引起編程性細胞死亡。
文檔編號A61P21/00GK1334875SQ99814235
公開日2002年2月6日 申請日期1999年9月20日 優先權日1998年10月13日
發明者R·魯吉耶利, M·卡洛, P·迪亞茲 申請人:昂尼克斯藥物公司