乳清蛋白水解物的製作方法

2023-06-12 18:33:46 1

專利名稱：：乳清蛋白水解物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種使用微生物內肽酶來生成乳清蛋白水解物的方法。
背景技術：
：蛋白質補充物(諸如乳清蛋白粉末)普遍被健身者和其它運動員用於加速肌肉發育和幫助恢復。同樣地，此類蛋白質補充物對於臨床營養是有用的。一般而言，預先消化的、經過部分水解的乳清蛋白比未水解的蛋白質更容易吸收，這便是為何蛋白質水解物被認為具有營養益處。但是未水解的乳清蛋白在味道方面清淡略有奶味(mildandslightlymilky)，而經過水解的乳清蛋白趨於嘗起來完全不同，通常在某種程度上是不受多數人歡迎的。因此，在此類水解物使用在例如飲料中時，該味道不得不通過例如添加人造香料來掩至ΓΤΠο使用特定內肽酶來水解蛋白質是本領域已知的，參見例如W097/43910。對β-乳球蛋白(其是乳清蛋白中所存在的蛋白質之一)的水解已經在Madsen等(1997)，Int.DairyJournal，7，399-409頁中進行了研究。還有，用不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的表位記載於FoodProteinsandTheirApplications;Ed.S.Damodaran禾口A.Paraf;MarcelDekker，NewYork,1997；443-472頁。發明概述本發明人令人驚訝地發現了一種用於生成乳清蛋白水解物的方法，其中用針對精氨酸和賴氨酸具有特異性的微生物內肽酶對所述乳清蛋白進行處理，接著使所述內肽酶失活，這產生具有可口味道的水解物。所述水解物可能甚至具有比未水解的乳清蛋白更好的味道。此外，通過本發明方法所獲得的乳清蛋白水解物是穩定的，而且與用其它內肽酶獲得的水解物相比在熱處理時具有降低的膠化趨勢。因此，本發明涉及一種用於生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側進行特異性切割的微生物內肽酶的作用；並c)使所述內肽酶失活。本發明還涉及通過上文方法所獲得的乳清蛋白水解物在臨床營養或能量飲料(energydrink)或運雲力飲料(sportsdrink)中的用途。發明詳述如上文所提及的，本發明涉及一種用於生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側進行特異性切割的微生物內肽酶的作用；c)使所述內肽酶失活。要在本發明方法中使用的乳清蛋白要理解為可從乳清獲得的蛋白質，諸如自乳清分離的蛋白質。乳清可定義為在乳因酸和/或粗製凝乳酶(rennet)凝結時分開的液體部分。如此，乳清可以是來自乾酪生產或來自酪蛋白生產的副產物。在本發明語境中的乳可以源自任何哺乳動物，諸如牛(cow)、山羊、綿羊、驢、駱駝、camelid、犛牛、或水牛。在一個優選的方面，所述乳是牛奶。要在本發明方法中使用的乳清蛋白包含乳球蛋白和α-乳清蛋白。它還可以包含可從乳清獲得的其它蛋白質，諸如血清清蛋白。步驟a)的水性組合物還可以包含不可從乳清獲得的其它蛋白質。在一個優選的方面，步驟a)的水性組合物包含佔總乾物質至少15%，諸如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%的β-乳球蛋白。在另一個優選的方面，步驟a)的水性組合物包含佔總乾物質至少5%，諸如至少10%、至少15%或至少20%的α-乳清蛋白。另一方面，步驟a)的水性組合物包含佔總乾物質至少1%、諸如至少2%、至少3%、至少4%或至少5%的血清清蛋白。在另一個優選的方面，步驟a)的水性組合物包含佔總蛋白質至少15%(w/w(重量/重量))，諸如至少20%(w/w)、至少25%(w/w)、至少30%(w/w)、至少35%(w/w)、至少40%(w/w)、至少45%(w/w)、至少50%(w/w)、至少55%(w/w)或至少60%(w/w)的β-乳球蛋白。在另一個優選的方面，步驟a)的水性組合物包含佔總蛋白質至少5%(w/w)，諸如至少10%(w/w)、至少15%(w/w)或至少20%(w/w)的α-乳清蛋白。另一方面，步驟a)的水性組合物包含佔總蛋白質至少(w/w)，諸如至少2%(w/w)、至少3%(w/w),至少4%(w/w)或至少5%(w/w)的血清清蛋白。優選地，乳清蛋白已經從乳清中分離出來，且乳球蛋白和α-乳清蛋白之間的比率大體上與從中分離乳清蛋白的乳清中的相同。在一個優選的實施方案中，該方法中所使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白濃縮物，其具有約29%至小於約90%(以無水物為基礎)的蛋白質含量。乳清蛋白濃縮物含有低水平的脂肪和膽固醇，但是一般具有較高水平的乳糖形式的碳水化合物。在另一個實施方案中，乳清蛋白可以是乳清蛋白分離物。一般而言，乳清蛋白分離物具有至少約90%乳清蛋白(以無水物為基礎)的蛋白質含量。一般而言，此類分離物已經進行了加工以除去脂肪和乳糖。要在本發明方法中使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白濃縮物和乳清蛋白分離物的混合物。乳清蛋白可以包含完整的乳清蛋白或其可以包含經過部分水解的乳清蛋白。在本發明的方法中，乳清蛋白材料通常混合或分散在水中以形成包含約至約20%蛋白質(按重量計)的漿料。在一個實施方案中，所述漿料可以包含約至約5%蛋白質(按重量計)。在另一個實施方案中，所述漿料可以包含約6%至約10%蛋白質(按重量計)。在一個進一步的實施方案中，所述漿料可以包含約11%至約15%蛋白質(按重量計)。在又一個實施方案中，所述漿料可以包含約16%至約20%蛋白質(按重量計)。在蛋白質材料在水中分散後，可以對蛋白質漿料的ρΗ和溫度進行調節以優化水解反應，具體地，以確保水解反應中所使用的內肽酶幾乎以其最佳活性水平起作用。可以依照本領域普遍知道的方法對蛋白質漿料的PH進行調節和監測。可以對蛋白質漿料的PH進行調節，並維持在約5.0至約10.0。在一個實施方案中，可以對蛋白質漿料的ρΗ進行調節，並維持在約6.5至約8.0。在一個優選的實施方案中，可以對蛋白質漿料的ρΗ進行調節，並維持在約7.5。優選地，依照本領域中已知的方法在水解反應過程中對蛋白質漿料的溫度進行調節，並維持在約40°C至約70°C。在一個優選的實施方案中，可以在水解反應過程中對蛋白質漿料的溫度進行調節，並維持在約40°C至約60°C。一般而言，高於此範圍的溫度可能使內肽酶失活，而低於或高於此範圍的溫度趨於減緩內肽酶的活性。一般地，通過將內肽酶添加至蛋白質材料的漿料來啟動水解反應。要在本發明方法中使用的內肽酶在精氨酸殘基或賴氨酸殘基中任一的羧基端一側進行特異性切割。「特異性切割」意指內肽酶具有的在精氨酸或賴氨酸中任一的羧基端一側進行切割的特異性高於在任何其它胺基酸的羧基端一側進行切割的特異性。在一個實施方案中，所述內肽酶在精氨酸的羧基端一側進行特異性切割，意味著所述內肽酶具有的在精氨酸的羧基端一側進行切割的特異性高於在任何其它胺基酸的羧基端一側進行切割的特異性。通常，內肽酶在pH約6.0至約11.0，優選地，pH約8至約10，且在約40°C至約70°C的溫度，優選地，在約45°C至約60°C或約45°C至約55°C的溫度具有最佳的蛋白水解活性。要在本發明方法中使用的內肽酶是微生物來源的。微生物酶(而不是動物或植物酶)的使用是有利的，有利之處在於微生物酶展現出廣譜的特徵(最適pH、溫度等)，而且可以相對大量地一致地獲得。優選地，所述內肽酶是微生物來源的胰蛋白酶樣內肽酶。在本發明的語境中，胰蛋白酶樣內肽酶是具有與胰蛋白酶的特異性類似的特異性的內肽酶，例如具有大於100的胰蛋白酶比率(Trypsinratio)的內肽酶，其中所述胰蛋白酶比率根據該酶在Arg或Lys後切割時的活性(取較大者)除以該酶在任何其它胺基酸之後切割時的活性來測定。應當在如下pH值進行用以測定胰蛋白酶比率的此類活性測量，內肽酶在所述pH值的活性至少是內肽酶在其最適PH的活性的一半。可以如本申請的實施例3中所描述的那樣測定胰蛋白酶比率。在一個實施方案中，所述內肽酶是細菌內肽酶。在另一個實施方案中，所述內肽酶是真菌內肽酶。在一個優選的實施方案中，所述內肽酶來自鐮孢屬(Fusarium)菌株，優選地，來自尖鐮孢(Fusariumoxysporum)，例如具有如本申請的SEQIDNO:2所示的胺基酸序列(SWISSPROTNo.P35049)。先前已經描述了來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣內肽酶，其具有如SEQIDNO:2的胺基酸25-248所示的胺基酸序列(US5,288，627；US5,693，520)。在一個實施方案中，所述內肽酶是來自水解無色桿菌(Achromobacterlyticus)的胰蛋白酶樣內肽酶，例如具有如本申請的SEQIDN0:4所示的胺基酸序列(UNIPR0TP15636)。在另一個實施方案中，所述內肽酶是來自腐皮鐮孢(Fusariumsolani)的胰蛋白酶樣內肽酶，例如具有如本申請的SEQIDN0:6所示的胺基酸序列(GENESEQP:ADZ80577)的AP977S。在另一個實施方案中，所述內肽酶是來自腐皮鐮孢相似種(Fusariumcf.solani)的胰蛋白酶樣內肽酶，例如具有如本申請的SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的AP971。在本發明的一個實施方案中，所述內肽酶選自下組i)多肽，其具有與如下的(A)或(B)至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的胺基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段；ii)多肽，其由與SEQIDNO1、3、5或7中任一至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的多核苷酸編碼；iii)多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸的補體在至少低嚴格性條件，優選至少中等嚴格性、至少高嚴格性或至少極高的嚴格性條件下，與SEQIDN0:l、3、5或7中任一雜交；和iv)多肽，其具有通過在如下的㈧或⑶中取代、缺失、和/或插入一個或幾個胺基酸而修飾的胺基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或(B)這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段。胺基酸序列中具有蛋白酶活性的片段可以是活性酶的胺基酸序列，例如在加工後，諸如在切除任何信號肽和/或前肽後。優選的片段是SEQIDNO:2的胺基酸25-248、SEQIDNO4的胺基酸21-653、SEQIDNO6的胺基酸26-251、或SEQIDNO8的胺基酸18-250。在本發明的一個優選實施方案中，所述內肽酶具有這樣的胺基酸序列，其與SEQIDNO2的胺基酸25-248至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同。極低的至極高的嚴格性條件定義為於42°C在5XSSPE、0.S^SDSJOOyg/ml經過剪切的且變性的鮭精DNA、和或是用於極低的和低的嚴格性的25%甲醯胺、或是用於中等的和中_高的嚴格性的35%甲醯胺、或是用於高的和極高的嚴格性的50%甲醯胺中遵循標準的Southern印跡規程進行最佳12至24小時的預雜交和雜交。最後，使用2XSSC、0.2%SDS，優選至少在45°C(極低的嚴格性)、更優選至少在50°C(低的嚴格性)，更優選至少在550C(中等嚴格性)，更優選至少在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴格性)，和最優選至少在70°C(極高的嚴格性)清洗載體材料3次，每次15分鐘。在一個具體的實施方案中，使用0.2X33(、0.2%303，優選至少在451(極低的嚴格性)、更優選至少在50°C(低的嚴格性)，更優選至少在55°C(中等嚴格性)，更優選至少在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴格性)，和最優選至少在70°C(極高的嚴格性)進行清洗。在另一個具體的實施方案中，使用0.IX33(、0.2%303，優選至少在451(極低的嚴格性)、更優選至少在50°C(低的嚴格性)，更優選至少在55°C(中等嚴格性)，更優選至少在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴格性)，和最優選至少在70°C(極高的嚴格性)進行清洗。就本發明而言，可以通過使用來自EMBOSS軟體包(Rice，P.，Longden,I.andBleasby,Α.(2000)EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.TrendsinGenetics16，(6)276-277頁；http://emboss,org)第2.8.0版的Needle程序來確定兩個胺基酸序列的比對。Needle程序執行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所記載的全局比對算法。所使用的取代矩陣是BL0SUM62，缺口產生罰分是10，而缺口延伸罰分是0.5。兩個胺基酸序列之間的同一性程度以兩個序列比對中的精確匹配的數目除以兩個序列中最短序列的長度來計算。結果以百分比同一性表示。精確匹配在兩個序列在重疊的同一位置中具有相同胺基酸殘基時發生。序列的長度是該序列中胺基酸殘基的數目(例如SEQIDNO2的長度是248個胺基酸)。通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726_730)使用LASERGENEMEGALIGN軟體(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)用同一性表和以下多重比對參數來測定兩個核苷酸序列之間的同一性程度缺口罰分為10，且缺口長度罰分為10。成對比對參數是Ktuple=3、缺口罰分=3、和窗口=20。核苷酸序列之間的同一性程度以兩個序列的比對中的精確匹配的數目除以兩個序列中最短序列的長度來計算。結果以百分比同一性表示。精確匹配在兩個序列在重疊的同一位置中具有相同核苷酸時發生。序列的長度是該序列中核苷酸的數目(例如SEQIDNO1的長度是744個核苷酸)。優選地，本發明的方法中所使用的微生物內肽酶量是每kg乳清蛋白約0.01至約500AU(如下文所定義的)，優選每kg乳清蛋白約0.1至約100AU，更優選每kg乳清蛋白約0.5至約50AU。一個安森單位(AnsonUnit,AU)定義為在標準條件(即25°C，pH7.5和10分鐘反應時間)下以如下的起始速率消化血紅蛋白的酶量，所述起始速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產物的量給出與一毫當量的酪氨酸相同的用酚試劑顯現的顏色。根據蛋白質材料的來源、想要的水解程度、和水解反應的持續時間，向蛋白質材料所添加的內肽酶量可以且會有所變化。內肽酶量可以在每kg蛋白質材料約Img酶蛋白至約5000mg酶蛋白的範圍。在另一個實施方案中，所述量可以在每kg蛋白質材料IOmg酶蛋白至約2000mg酶蛋白的範圍。在又一個實施方案中，所述量可以在每kg蛋白質材料約50mg的酶蛋白至約IOOOmg的酶蛋白的範圍。如技術人員可領會的，水解反應的持續時間可以且會有所變化。一般而言，水解反應的持續時間可以在少許幾分鐘至許多個小時的範圍，諸如約30分鐘至約48小時。優選地，用微生物內肽酶進行的處理導致這樣乳清蛋白水解物，其具有約0.至約20%，更優選約0.5%至約10%或約0.5%至約8%，甚至更優選約1%至約5%的水解程度(DH)。水解程度(DH)表示通過該方法所獲得的蛋白質水解的程度。在本發明的語境中，水解程度(DH)定義如下DH=(所切割的肽鍵數/肽鍵總數)χ100%技術人員會知道如何測量DH。在本發明方法的步驟C)中，使內肽酶失活。可以通過本領域中已知的任何方法來實施這種失活，例如通過加熱至至少70°C，諸如至至少75°C或至少80°C。通過本發明方法所獲得的乳清蛋白水解物可以在食品中(例如在飲料中)使用。此類食品的非限制性例子包括運動飲料或能量飲料。通過本發明方法所獲得的乳清蛋白水解物還可以在臨床營養中使用，例如在醫院中使用。實施例實施例1使用5種不同的蛋白水解酶來水解來自AriaFoods,Denmark的乳清蛋白濃縮物(Lacprodan80)(包含佔總乾物質約80%的蛋白質)。酶和劑量是來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶，劑量為500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%0Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，劑量為原料的0·2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，劑量為原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%。添加酶之前將乳清蛋白濃縮物與水(19)混合。水解在燒杯中於50°C發生，所述燒杯安裝有鹼(0.INNaOH)添加劑量系統以將pH保持在PH7.5不變，直至水解程度(DH)=4%。將樣品加熱至85°C以使酶失活，並在感覺小組中測試。使用三個一組測試(triangletest)來比較用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶所獲得水解物與用其它4種酶所獲得的每一種水解物。6位小組成員各接受3個編碼的樣品。他們被告知樣品中的兩個是相同的而一個是不同的。要求各位小組成員鑑別出單獨的樣品。下表中「正確答案」的數目指明能夠鑑別出單獨樣品的小組成員數。各位小組成員還被要求選出每項三個一組測試中苦味最小的樣品。用Alcalase、Neutrase和Protamex製備的樣品在巴斯德消毒法過程中均具有明顯的凝膠化趨勢。用PTN和微生物胰蛋白酶樣蛋白酶製備的樣品保持同質。在味覺評估之前將樣品稀釋至3%蛋白質含量。下文顯示了來自三個一組味覺評估的結果。MTP是來自尖鐮孢的實驗用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶。該評估中包括6位小組成員。如果給出至少5個正確答案(第2列)，那麼認為樣品之間的差異是顯著的。第3列和第4列是(在第2列具有正確答案的小組成員中)發現任一樣品具有較小苦味的小組成員的數目__正確答案__苦亨較小_試驗1,PTN5__PTN__MTP______23.試驗2,Alcalase4Alcalase__MTP_______2試驗3,Neutrase2Neutrase__MTP--__1__試驗4,Protamex3Protamex__MTP__2_1_該結果顯示了MTP和PTN生成的樣品之間有顯著性差異，其中因為MTP生成的樣品沒有PTN生成的樣品苦，所以選擇MTP生成的樣品。MTP生成的樣品和用沒有Lys和Arg特異性的酶(Alcalase，Neutrase,Protamex)生成的任何樣品之間沒有顯示顯著性差異。實施例2使用5種不同的蛋白水解酶來水解來自L印rinoFoodS，US的乳清蛋白濃縮物(包含佔總乾物質約80%的蛋白質)。酶和劑量是來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶，劑量為500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，劑量0.5%的原料。Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，劑量為原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%。添加酶之前將乳清蛋白濃縮物與水(19)混合。水解在燒杯中於50°C發生，所述燒杯安裝有鹼(0.INNaOH)添加劑量系統以將pH保持在PH7.5不變，直至水解程度(DH)=4%。將樣品加熱至85°C以使酶失活，並在感覺小組中測試。使用三個一組測試來比較用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶所獲得水解物與用其它4種酶所獲得的每一種水解物。7位小組成員各接受3個編碼的樣品。他們被告知樣品中的兩個是相同的而一個是不同的。要求各位小組成員鑑別出單獨的樣品。下表中「正確答案」的數目指明能夠鑑別出單獨的樣品的小組成員數。各位小組成員還被要求選出每項三個一組測試中苦味最小的樣品。所有樣品在巴斯德消毒法期間/之後均保持同質。在味覺評估之前將樣品稀釋至3%蛋白質含量。下文顯示了來自三個一組味覺評估的結果。MTP是來自尖鐮孢的實驗用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶。該評估中包括7位小組成員。如果給出至少5個正確答案(第2列)，那麼認為樣品之間的差異是顯著的。第3列和第4列是(在第2列具有正確答案的小組成員中)發現任一樣品具有較小的苦味的小組成員數tableseeoriginaldocumentpage9該結果顯示了用MTP生成的樣品和用Alcalase或PTN生成的樣品之間有顯著性差異，其中因為MTP生成的樣品沒有Alcalase和PTN生成的兩種樣品苦，所以選擇MTP生成的樣品。實施例3胰蛋白酶比率的定義、測量和計算Mfi為了進行可測量的測定法以測定胰蛋白酶樣內肽酶活性，我們使用了10種具有通式Suc-AAPX-pNA的不同顯色底物，在所述通式Suc-AAPX-pNA中X是20種天然胺基酸殘基之一的單字母縮寫。該內肽酶會在X的羧基端一側進行切割，並釋放可以被測量的黃色(對硝基苯胺)。我們使用了可從Bachem獲得的這10種不同Suc-AAPX-pNA底物(X=A、R、D、E、I、L、K、M、F和V)以進行我們所稱的胰蛋白酶比率的測量和計算。胰蛋白酶樣內肽酶在本發明的語境中可定義為具有大於100的胰蛋白酶比率的內肽酶。胰蛋白酶比率以對Suc-AAPR-pNA或Suc_AAPK-pNA的最大活性除以對8種其它Suc-AAPX-pNA底物之任一種的最大活性來計算胰蛋白酶比率=對Suc-AAP(R/K)-pNA的最大活性/對Suc-AAP(非R/K)-pNA的最大活性應當在如下pH值進行活性測量，其中在所述PH值的活性至少是在最適pH的活性的一半。材料和方法Suc-AAPX-pNA測定法底物Suc-AAPA-pNA(BachemL-1775)Suc-AAPR-pNA(BachemL-1720)Suc-AAPD-pNA(BachemL-1835)Suc-AAPE-pNA(BachemL-1710)Suc-AAPI-pNA(BachemL—1790)Suc-AAPL-pNA(BachemL-1390)Suc-AAPK-pNA(BachemL-1725)Suc-AAPM-pNA(BachemL—1395)Suc-AAPF-pNA(BachemL-1400)Suc-AAPV-pNA(BachemL-1770)溫度室溫(25°C)測定緩衝液100mM琥珀酸、IOOmMHEPESUOOmMCHESUOOmMCABSUmMCaCl2,150mMKCUO.01%TritonX-100，pH9.0。測定法將20ul(微升)肽酶稀釋物(在0.01%TritonX-100中稀釋)置於微量滴定板的孔中。通過添加200ulpNA底物(50mg在1.0mlDMSO中溶解，並用測定緩衝液進一步稀釋90x)來開始該測定法。監測OD4tl5的起始增加，作為對肽酶活性的測量。若在4分鐘測量時間中沒有實現線性(或接近線性)的曲線，則進一步稀釋肽酶，並重複該測定法。肽酶Alcalase(NovozymesA/S,Denmark)水解無色桿菌賴氨醯_內肽酶(SEQIDNO4)來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶豬胰蛋白酶(NovozymesA/S,Denmark)通過層析將所有的酶純化至高純度。在經考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上針對每種肽酶僅看到一條條帶。肽酶的特徵Alcalase對Suc—AAPF—pNA的pH最佳=pH9。水解無色桿菌蛋白酶對Suc-AAPK-pNA的pH最佳=pH10。鐮孢屬胰蛋白酶樣蛋白酶對Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。豬胰蛋白酶對Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。MM肽酶在pH9對Suc-AAPX-pNA底物的特異性和胰蛋白酶比率的計算在pH9實施特異性實驗。如在材料和方法段落中所看到的，3種測試的肽酶具有ρΗΛβ>pH9。然而，對於這3種肽酶，在pH9的活性大於在活性的一半。在下表中顯示了該結果tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13可以看出，依照我們的定義，水解無色桿菌蛋白酶、鐮孢屬胰蛋白酶樣蛋白酶和豬胰蛋白酶是胰蛋白酶樣內肽酶。而Alcalase不是胰蛋白酶樣內肽酶。權利要求一種用於生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α-乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側進行特異性切割的微生物內肽酶的作用；c)使所述內肽酶失活。2.權利要求1的方法，其中所述微生物內肽酶是真菌內肽酶。3.權利要求2的方法，其中所述真菌內肽酶源自鐮孢屬菌株。4.權利要求3的方法，其中所述真菌內肽酶源自尖鐮孢菌株。5.上述權利要求任一項的方法，其中所述內肽酶在PH約8至約10具有最佳的蛋白水解活性。6.上述權利要求任一項的方法，其中所述內肽酶在約45°C至約60°C的溫度具有最佳的蛋白水解活性。7.上述權利要求任一項的方法，其中所述內肽酶選自下組i)多肽，其具有與(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段至少60%相同的胺基酸序列；ii)多肽，其由與SEQIDNO:1、3、5或7中任一至少60%相同的多核苷酸編碼；iii)多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸的補體在低嚴格性條件下與SEQIDNO:1、3、5或7中任一雜交；和iv)多肽，其具有通過在(A)SEQIDN0:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段中取代、缺失、和/或插入一個或幾個胺基酸而修飾的胺基酸序列。8.上述權利要求任一項的方法，其中所述內肽酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸25-248至少60%相同的胺基酸序列。9.上述權利要求任一項的方法，其中所述乳清蛋白是乳清蛋白濃縮物或乳清蛋白分離物。10.上述權利要求任一項的方法，其中所述乳清蛋白的水溶液包含佔總乾物質至少5%的α-乳清蛋白。11.上述權利要求任一項的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有約0.至約20%的水解程度。12.權利要求11的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有約0.5%至約8%的水解程度。13.上述權利要求任一項的方法，其中步驟c)包括加熱至至少70°C。14.上述權利要求任一項的方法，其中所述內肽酶以每kg乳清蛋白0.Ol-IOg酶蛋白的濃度添加。15.通過上述權利要求任一項的方法所獲得的乳清蛋白水解物在臨床營養中的用途。16.通過權利要求1-14任一項的方法所獲得的乳清蛋白水解物在運動飲料中的用途。全文摘要本發明涉及一種使用在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側特異性切割的微生物內肽酶來生成乳清蛋白水解物的方法。本發明還涉及此乳清蛋白水解物在運動飲料或臨床營養中的用途。文檔編號A23J3/34GK101801209SQ200880012256公開日2010年8月11日申請日期2008年4月16日優先權日2007年4月16日發明者吉特·B·林雷夫,珀·M·尼爾森申請人:諾維信公司