在作物中大規模誘變的方法

2023-12-10 04:42:31 4

專利名稱：在作物中大規模誘變的方法
技術領域：
本發明屬於植物遺傳學領域，並涉及在作物中進行誘變、基因鑑定和基因功能分析的改進方法。所述方法可用於所有植物種中，本文以番茄為例披露了其用途。
背景技術：
估計高等植物的基因組合有30，000—50，000個基因。僅僅闡明了幾百個植物基因的功能。為了證實基因功能，通常需要分離新的基因，並對這些新分離的基因進行誘變。通過生物技術進行的作物改良取決於新分離基因的詳細表徵。
在過去十年中，擬南芥屬模型系統對植物分子生物學領域的顯著進步作出了很大貢獻。擬南芥屬被成功利用的主要原因是其體形小，生命周期短，以及具有較小的基因組(Leutwiler等，1984)。另外，擬南芥屬可以用外源DNA方便地進行轉化(Bechtold等，1993)。以上特徵有利於通過選擇控制感興趣的性狀的各種基因的大量的突變型，對在擬南芥屬中表達的所有性狀進行遺傳學剖分。業已證實通過甲基磺酸乙酯(EMS)、快速中子轟擊、T—DNA插入、和轉座子標記進行的植物群體誘變，作為剖析植物發育的遺傳學控制和基因組性狀的手段對於植物生物學家來說具有很高價值(Koncz等，1992)。儘管用擬南芥屬作為模型進行遺傳學分析具有很多優點，但它不是作物，並且，在該物種上所獲得的知識並不是總能應用於其它農業上重要的作物種。例如，擬南芥屬具有莢果型果實，因此，它是十字花科成員果實發育的良好模式物種，但不適用於生長肉質、漿果型果實的植物。
另一方面，番茄(Lycopersicon esculentum)是產生肉質、漿果型果實的作物種的良好模型。番茄在遺傳學上是眾所周知的。番茄具有較小的二倍體基因組(n=12，C=1pg)，它含有數百個作圖的性狀和分子標記(Tanskley，1993)。可以用外源DNA轉化番茄(McCormick等，1986)。而且，它還是新鮮蔬菜市場以及糧食加工行業中的最重要的作物(Hille等，1989；Rick和Yoder，1988)。
在番茄遺傳學領域取得進一步進展的主要障礙是缺少基因鑑定所必須的大量的突變群體。番茄的有用的突變群體應當使每一個番茄基因包括至少一個突變型等位基因，這樣的群體有可能在這種作物中實現飽和誘變。儘管存在用於生產突變型番茄植物的技術，但由於時間和空間的限制目前尚不能將這種技術以足夠大的規模使用，以便獲得其基因組被突變飽和的群體。這些限制還制約了在其它農業作物上的研究。
通過使用諸如EMS的DNA破壞劑(Hildering和Verkerk，1965；Schoenmakers等，1991；Wisman等，1991)、X—射線(Hildering和Verkerk，1965)或快速中子(Verkerk，1971)業已產生了突變型番茄植物，但與在擬南芥屬上所做的努力相比，這些成果還是很有限的。業已披露了由番茄遺傳學資源中心出售的數百個突變型番茄品系，但尚沒有可供在新基因中選擇突變的源於大的M1植物群體的誘變的M2種子的資源。
通過T—DNA標記進行的插入誘變不適用於番茄，因為轉化方法仍然很煩瑣。另一方面，轉座子標記是在番茄和其它農業種上進行誘變和基因鑑定的有希望的途徑。業已證實Ac／Ds轉座因子家族能在番茄中起作用(Yoder等，1988)，並且業已披露了在該物種中Ac／Ds轉座的方式(Carroll等，1995；Osborne等，1991；Lommens等，1992；Yoder等，1988)。業已生產出了含有Ds因子的番茄品系，該因子被作圖於番茄基因組上(Knapp等，1994；Thomas等，1994)。這些品系有可能利用在附近位點的Ac／Ds的優勢插入(Dooner和Belachew，1989；Jones等，1990)。將Ac／Ds標記系統用於標記並分離若干基因，如cf9，一個決定芽枝黴屬抗性的基因座(Jones等，1994)；dwarf，編碼細胞色素p450同系物的基因(Bishop等，1996)；和控制葉綠體發育的dcl(Keddie等，1996)。
反向遺傳學是確定分離的基因的功能的有效方法(Benson等，1995)。例如，在玉米中，通過選擇包括48，000個隨機誘變植物的大型植物群體可以鑑定在感興趣的基因上的突變。原則上講，在所述突變群體中的每一個植物都含有由插入轉座因子所導致的不同突變。通過聚合酶鏈式反應(PCR)分析鑑定在感興趣的基因上含有轉座因子插入的植物。將具有相當於轉座子的核苷酸序列的第一種引物和具有相當於感興趣的基因的核苷酸序列的第二引物與從推測的突變體中分離的DNA一起用於PCR反應。原則上講，只有轉座子插入感興趣的基因上才能產生PCR產物。分析含有在PCR反應中產生PCR產物的DNA的突變型植物，確定該突變對植物生長和發育的影響，並因此確定感興趣的基因的功能。
不過，在大多數作物種上不能採用反向遺傳學，因為它需要投入很多的時間和精力，並需要大量的田間設施以便產生並容納數以萬計的T—DNA或轉座子標記的植物，這些植物必須生長到成熟，以便檢測感興趣的突變型。因此，需要另一種方法來在大多數作物種上實現反向遺傳學。類似地，需要一種實用方法來選擇用總DNA結構轉化過的大型作物群體，該方法可以檢測控制基因表達的DNA因子，如啟動子或增強子。
發明概述本發明的一個目的是提供用小型化作物進行突變型鑑定和表徵的改進方法。
本發明的另一個目的是提供表徵克隆的核苷酸序列的改進方法。
本發明的再一個目的是提供克隆核苷酸序列的改進方法。
上述目的以及其它目的是通過提供一種選擇具有理想性狀的突變型小型植物的方法而實現的，該方法包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業栽培品種相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；(b)通過用突變誘導劑處理所述小型植物在所述小型植物群體中產生突變型小型植物，以便產生突變型植物群體；和(c)在所述誘變的小型植物群體中選擇具有所述理想性狀的突變型小型植物。
在本文所披露的本發明的所有方面和實施方案中，可以通過天然或誘發突變，通過遺傳工程，或通過用植物生長因子處理產生小型植物的群體。可用於本發明的小型植物的例子包括，但不限於小型番茄品種，如『Micro—Tom』和『Micro—Peach』。上述步驟(b)中所使用的突變誘導劑可以是化學誘變劑，如甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)，甲基—N—亞硝基脲(MNU)和博來黴素。另外，所述突變誘導劑可以是射線，如UV、γ—射線、X—射線、和快速中子。最後，所述突變誘導劑還可以是可動DNA序列，該序列是T—DNA或選自下列一組的轉座因子自主性轉座子、非自主性轉座子、和自主性轉座子／非自主性轉座子系統，如(但不局限於)玉米Ac／Ds轉座因子。所述同一物種的商業植物是用於生產糧食、纖維或花卉的植物，包括，但不限於產生漿果型果實的植物，如番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘類果實和蘋果，或茄科的植物，如馬鈴薯。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種突變型小型群體，其中，所述群體的小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；和(ⅳ)具有用一種製劑誘導的突變，該製劑是化學誘變劑、射線、或可動DNA序列。
本發明的另一種實施方案提供了一種用於鑑定含有插入感興趣的基因上的可動DNA序列的小型植物的方法，包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；(b)通過用可動DNA序列處理所述植物，在所述小型植物群體中產生突變型植物；(c)通過PCR篩選從所述突變型植物中提取的DNA，使用具有相當於所述可動DNA序列的核苷酸序列的第一引物和具有相當於所述感興趣的基因的核苷酸序列的第二引物；和(d)鑑定包括能在有所述第一和第二引物的條件下產生PCR產物的DNA的小型植物。
本發明的另一種實施方案提供了一種生產小型植物的突變型群體的方法，包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；和
(b)通過用一種突變誘導劑處理所述小型植物在所述小型植物群體中產生所述突變植物。
當步驟(b)中的所述突變誘導劑是T—DNA時，用農桿菌屬感染所述小型植物，由此產生多個轉化體，其中，每一個轉化體包括插在不同基因組位點上的T—DNA。當步驟(b)中的突變誘導劑是轉座子時，所述突變型小型植物群體是從含有一種活性轉座系統的小型植物的後代獲得的。所述活性轉座系統可以是植物天然具備的轉座子或通過本領域技術人員熟知的遺傳工程技術導入植物中的轉座子，如自主性轉座子，或通過讓含有非自主轉座子的植物與轉座酶源或含有自主性轉座子的植物雜交獲得的轉座因子。例如，所述轉座因子是玉米Ac／Ds轉座子系統。
本發明的另一種實施方案提供了鑑定控制植物基因表達的核苷酸序列的方法，包括下列步驟(a)用一種DNA結構轉化一種作物的小型植物，以便產生一個隨機誘變植物的群體，其中，所述DNA結構包括一個編碼選擇標記的基因序列，該基因缺少啟動子或者含有一個最小啟動子，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交產生隨機誘變植物群體；(b)在所述植物群體中鑑定由所述DNA結構轉化的並能表達所述選擇標記的小型植物；和(c)克隆所述核苷酸序列，該序列可操作地連接於從在步驟(b)中鑑定的所述轉化小型植物中提取的總DNA的編碼所述選擇標記的基因上。
所述選擇標記可以是GUS或螢光素酶，所述可動DNA序列可以是T—DNA或轉座因子，而所述控制所述植物基因表達的核苷酸序列可以是啟動子或增強子。
在本發明的又一種實施方案中，本發明提供了生產具有理想性狀的突變型群體的方法，該方法包括以下步驟(a)讓按照本發明選擇方法選擇的具有所述理想性狀的突變型小型植物與同一物種的商業植物雜交；和
(b)選擇與所述商業親本植物相似並表達所述理想性狀的後代。
根據該實施方案，本發明還包括通過上述方法獲得的商業植物的突變型群體。
附圖的簡要說明


圖1表示『Micro—Tom』對不同生長條件的反應。
圖2表示『Micro—Tom』野生型和突變表型。
圖3表示轉入『Micro—Tom』中的結構的示意圖。
圖4表示選擇含有用於轉座選擇的標記的植物的結果。
圖5表示chlorosulfuron抗性(Chl)和潮黴素抗性(Hygr)植物的Southern印跡的結果。
圖6表示質粒Ds—螢光素酶(Ds／LUC)的示意圖。
圖7表示Ds—螢光素酶(Ds／LUC)插入在各種植物器官中表達的基因中的結果。
發明詳述本發明可以快速和大規模生產並有效選擇誘變植物。這一目的是通過使用一種小型化作物實現的，這種作物能夠與同一物種的商業栽培品種雜交。在所述小型植物中誘發突變，然後在突變型小型植物群體中鑑定突變體，該群體能以高密度有效生長到成熟。
用諸如番茄的大多數作物種進行反向遺傳學的主要障礙是需要大量時間、精力和空間來生產並處理非常龐大的突變植物群體。例如，本發明能夠快速、大規模生產並有效選擇轉座子誘變的植物，而這一點用現有的生產技術是無法做到的。據估計，為了生產對諸如番茄的大多數農業上感興趣的物種進行反向遺傳學的代表性植物群體，需要100，000個不同轉座子誘變的植物。在作物中生產這樣一種突變體文庫，按照本發明可以通過採用一種小型植物來實現。本發明通過在生長在可控制的種植面積上的大的植物群體中鑑定具有插入感興趣的靶基因的轉座子的品系使幾乎所有需要的基因失活。插入靶基因的轉座子的鑑定是通過PCR篩選攜帶轉座子的植物庫而進行的，使用具有相當於所述靶基因的核苷酸序列的一種引物和具有相當於轉座子的核苷酸序列的第二引物。只有從具有插入所述感興趣的基因的轉座子的植物突變體中提取的DNA物質才能夠產生PCR產物。
本發明的方法適用於農業上感興趣的任何植物，包括用於生產糧食、纖維或花卉的植物。所述農業作物包括，但不限於產生漿果型果實的植物，如番茄、葡萄、柑橘類果實、李子、蘋果、茄子；茄科的植物，例如馬鈴薯；和玉米以及花卉和果樹。
本發明的方法還有利於鑑定具有商業價值的基因，分離新基因，用傳統育種方法導入新的基因，以及分離組織特異性啟動子和增強子。具有商業價值的基因包括影響果實成熟的基因，和提高植物產量和／或品質的基因。新的基因很可能是分離的目標，包括與果實的糖份含量、礦物質攝取等相關的基因。可以通過使用在轉座子中操作的「基因捕獲」方法分離組織特異性啟動子。
幾乎所有理想基因的失活是通過將諸如轉座因子的可動DNA序列插入植物基因組，在所述小型植物中進行隨機誘變，並鑑定具有插入所述靶基因的轉座子的植物而實現的。感興趣的插入突變型的鑑定是通過PCR選擇攜帶轉座子的植物庫而完成的，使用具有相當於所述靶基因的核苷酸序列的一種引物，和相當於轉座子的第二種引物。所述小型化作物群體還可用於植物啟動子的有效選擇和鑑定。
用於本說明書的術語定義如下小型植物，栽培品種或作物的整體大小或生物量與相應植物、栽培品種或植物的野生型作物相比明顯降低。所述小型植物、栽培品種或作物可以相應野生型植物不可能達到的種植密度生長到成熟，並產生有生活力的繁殖器官，如果實、種子、塊莖等。例如，小型植物、栽培品種或作物可以比用於相同物種的商業植物的標準生長條件至少高1倍，優選5倍、10倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍或更高的種植密度生長到成熟。可以高的密度生長野生型植物，但只能生長到幼苗或幼小植株階段，不能產生果實、種子或塊莖。相反，本發明的小型作物可以高的種植密度生長到成熟，具有成熟果實、種子、塊莖等的發育。
轉座子—能夠移動或「跳動」到基因組的不同位點的天然DNA序列。通過插入基因並導致基因破壞，轉座子可以在該基因中引起突變。業已在細菌、果蠅、酵母、線蟲、植物和哺乳動物中發現了轉座子。
轉座因子—相當於轉座子。
轉座酶—由自主性轉座子表達的蛋白，它結合在轉座子的末端區，它能引起轉座子切除並轉座到該基因組的另一個位點。
自主性轉座子—一種編碼轉座酶並具有由該轉座酶識別以表現其催化活性的末端區的因子，因此能夠自主性轉座。由自主性轉座子引起的突變是不穩定的。自主性轉座子的例子有玉米的Ac(激活物)轉座子。
非自主性轉座子—一種含有被轉座酶識別的末端區，但不編碼這種酶的因子，因此，為了切除並轉座到該基因組的另一個位點需要反式添加的轉座酶。非自主性轉座子的例子有玉米的Ds(解離)轉座子，該轉座子可以與自主性，例如，Ac轉座子一起使用。
所述作物的小型栽培品種可以由天然或誘導的突變形成，通過遺傳工程或通過用植物生長因子處理感興趣的作物。矮化突變型在植物王國中是普遍存在的，並且業已在大量物種中發現。
最重要的一類矮化基因是小麥的rht(降低高度)基因(Gale和Youssefian，1985)。所述基因主要是決定綠色進化。矮化栽培品種的較短的莖杆可以「負荷」每個植株的較高的產量(較重的果穗)，並能使得該植物以高於高的栽培品種可能達到的密度生長，從而導致世界範圍內的小麥產量提高。野生型小麥的高度大約為120—140釐米；一個矮化基因的存在可將其降低到90—100釐米，兩個矮化基因的存在可將其降低到40—60釐米。目前，標準的小麥栽培品種包括一個或兩個矮化基因。在這些植物中，降低的高度與其它植物器官(例如葉或果穗)的小型化無關，因此，不能用於大規模誘變。不過，極端矮化的小麥植物可用於在該物種上進行大規模誘變。
類似地，業已在玉米和稻的其它禾本科植物上；在諸如豌豆的豆科植物上；在諸如辣椒、茄子和番茄的蔬菜上；在諸如玫瑰的觀賞植物上；和在諸如橙子和其它柑橘類的樹木上發現了矮化基因，這些基因的作用模式不同。在最新的綜述中披露了矮化植物的若干例子，其決定基因，及其作用模式(Hedden和Kamiya，1997)。例如，某些矮化植物在合成一種植物激素(例如赤黴素)方面是有缺陷的，而其它矮化植株能合成赤黴素但對它不敏感(例如，GAI=赤黴素不敏感突變型)。不過，對於大多數矮化植物來說，其作用模式尚不清楚。所述矮化植物，或可以操作並明顯減小植物大小的克隆基因，可被本發明用於在任何作物中進行大規模誘變。
存在在多種作物中分離並表徵矮化植物的通用方法。可以用能影響總體大小的分離基因轉化植物。例如，可以用從擬南芥屬中分離的無花瓣基因改變被轉化的楊樹的大小。可以用傳統育種方法構建小型作物。對於栽培品種『Micro—Tom』來說，被稱為miniature和dwarf的兩個主要基因決定其小型表型。
矮化或小型栽培品種植物的種植密度至少比標準大田條件高10倍，因為小型植物的體型明顯減小，這有利於在小的土地面積上分析大的植物群體。如在下面的實施例部分所述，對於番茄小型栽培品種『Micro—Tom』來說，其植物種植密度比商業栽培品種在標準大田條件下所能達到的密度高大約200倍。新的突變型包括在小型栽培品種中獲得的插入突變型，可以通過與所述作物進行標準雜交，並分離小型化基因或轉基因將其轉移到商業背景中。
任何誘變技術均可用於獲得本發明的小型栽培品種，這些技術包括，但不限於化學處理、輻射、或用本領域技術人員所熟知的技術用源於宿主植物或異源的T—DNA或轉座子進行DNA插入。通過篩選大的植物群體，可以獲得導致矮化的插入失活。生產小型栽培品種的化學處理可以通過已知技術進行，使用諸如甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)，甲基—N—亞硝基脲(MNU)，和博來黴素等的誘變劑。還可以用已知技術通過用UV—射線，X—射線和快速中子輻射實現(例如，參見Poehlman，1987或Malmbery，1993)。
可以用可動DNA序列進行基因的插入失活。所述可動DNA序列可以是T—DNA或轉座子。
可以通過已知方法用農桿菌屬進行T—DNA誘變(Hoekema等，1983；US5，149，645)。轉座子插入誘變可以用眾所周知的方法進行(Fedoroff等，1984；US4，732，856和US5，013，658)。所述轉座因子可以是自主性轉座子、非自主性轉座子、或自主性轉座子／非自主性轉座子系統，例如，玉米Ac／Ds轉座子系統。
篩選大的植物群體，優選至少數千個植物的群體中的突變型。突變型的鑑定可以用肉眼完成，例如，鑑定小型選擇。還可以用其它方法鑑定其它類型的突變型；例如，通過植物生物學領域中已知的技術分析特殊性狀，這些性狀包括，但不限於對激素的反應、對礦物質的反應、對病原體的反應、和對除草劑的反應等。
在特定基因上鑑定插入現象是通過包括PCR篩選的方法進行的，使用相當於轉座子或T—DNA的核苷酸序列的第一引物和相當於感興趣的基因的核苷酸序列的第二引物。感興趣的基因可以是分離的基因，業已測定了其部分或全部序列。另外，感興趣的基因可以是一種表達序列標記(EST)。PCR方法是本領域中眾所周知的。有關PCR的一般性描述參見Delidow等，1993。Rychlick等(1993)披露了適用於PCR方法的寡核苷酸引物序列的設計。Allen等(1993)披露了檢測PCR產物的方法。
鑑定有關植物，從該植物中分離的DNA與所述第一和第二引物能產生PCR產物。對該植物進行分析，以確定轉座子插入對該植物表型的影響。
可將本發明的方法用於鑑定和表徵任何感興趣的基因，包括發育和抗病基因。為了設計進行PCR分析的引物，需要感興趣的基因的足夠的核苷酸序列。一旦鑑定了特定感興趣的基因，可以用植物育種領域中眾所周知的技術將其轉移到合適的商業背景中(例如，參見Poehlman，JM，大田作物育種，紐約1987)。所使用的具體方法取決於有關作物。
本發明被用於在番茄作物中建立一個突變型文庫。該文庫大大加強了番茄遺傳學的研究和分離重要基因的能力。該突變型番茄文庫是以被稱為『Micro—Tom』(小型番茄)的小型—矮化—有限番茄栽培品種為基礎建立的，該品種最初是為了家庭種植目的而育成的(Scott和Harbaugh，1989)。該栽培品種特別適用於本發明，因為它能夠以高達每平方米1357個植株的高密度種植，並且能在以如此高的密度種植時結果。另外，該栽培品種具有短的生活周期，從播種日開始在70—90天內就能產生成熟的果實，這有利於每年選擇4代。這使得它成為選擇大型誘變植物群體的有效系統，並使得能夠在番茄中進行飽和誘變。
另外，還可以對該栽培品種進行方便而有效的轉化。用農桿菌屬介導的子葉轉化可以獲得高達80％的轉化頻率，並且，從接種子葉開始，到收穫轉基因果實僅需要大約100天。另外，該栽培品種與標準番茄栽培品種僅有兩個主要基因的差別。由於這兩個控制『Micro—Tom』體形的基因是隱性的，可以在標準背景中用F1代分析顯性性狀。需要一代以上以便將隱性基因轉移到標準類型中。因此，可以在『Micro—Tom』遺傳背景中方便地研究任何突變或轉基因，並且如果必要，還可以用本領域技術人員所熟知的傳統育種技術將其轉移到標準背景中。
我們還證實，Ac／Ds轉座子標記系統可用於被稱為『Micro—Peach』的另一種小型番茄栽培品種中。『Micro—Peach』在體形上與『Micro—Tom』類似。不過，『Micro—Peach』具有桃色果實，而『Micro—Tom』具有紅色果實。Ac／Ds轉座子在『Micro—Peach』系統中非常活躍，可以進行大規模誘變和反向遺傳學。
為了評價『Micro—Tom』作為誘變和反向遺傳學的模型系統的價值，對該栽培品種的生長條件和轉化條件進行優化。然後，篩選由9，000個M1個體得到的20，000EMS誘變的M2植物。發現了具有改變了的顏色或改變了的葉片性狀、花和果實的突變型。將Ac／Ds轉座因子增強子捕獲系統(Fedoroff和Smith，1993)和基因捕獲系統(Sunadaresan等，1995)導入『Micro—Tom』，並測定其活性。因此，使用『Micro—Tom』栽培品種可以實現在番茄中進行飽和誘變的目的，或進行任何基因的標記或插入失活。本發明的方法可用於對感興趣的植物種進行任何小型選擇，以便快速並有效地鑑定基因。
源於EMS—誘變『Micro—Tom』的包括14，000個體的M2植物群體可以生長在100平方米的空間內，通過這一觀察結果可以了解本發明的優點。另外，僅需要一個人短短6個月的工作(M1在春季種植，而M2在同一年的夏季種植)，就能產生該群體。回收到了大量的突變型，儘管所採用的EMS誘變是相對溫和的，這一點由出現的白化植株低於1％這一事實所證實。很有可能在所得到的M2群體中存在很多其它的突變型基因，這與由其它研究者報導的僅能獲得有限的數百個番茄突變型相比是有利的。
所有M2家族都源於單個的M1植株，並表現出以3∶1(顯性∶隱性)的比例分離的突變表型。這表明，在本文所使用的實驗條件下，在『Micro—Tom』中，配子是源於在誘變時存在於成熟種子的胚胎中的單細胞。上述結果與以前的報導吻合(Hildering和Verkerk，1965；Verkerk，1971)，有1—3個細胞在突變的番茄植物中產生孢母細胞。
儘管以前業已在番茄中披露了轉座子標記系統(Carroll等，1995；Knapp等，1994；Rommens等，1992；Yoder等，1988)，但在現有文獻中尚未報導該植物的增強子和基因標記系統。不過，同樣根據本發明，將兩種選擇不連鎖的轉座的系統導入番茄一種系統基於NAM敏感性和卡那黴素抗性(Sundaresan等，1995)，第二個系統基於切除—插入選擇(Fedoroff和Smith，1993)，該系統具有有效檢測包含在Ds中的潮黴素抗性的優點。另外，使用對chlorosulfuron的抗性作為切除標記，並結合『Micro—Tom』其它農藝特徵，可以從大型推測的突變群體中篩選增強子和啟動子，並用於基因分離。另外，最近披露的在番茄體細胞組織中進行位點選擇插入的方法(Cooley等，1996)也可應用於『Micro—Tom』，進行穩定的胚轉座過程。在這一方面，業已證實Ac／Ds系統能在『Micro—Tom』起作用，並且還可以通過基因剔除或插入失活進行反向遺傳學。
因此，通過本發明，可將『Micro—Tom』用於開發一種在植物中進行遺傳學研究的模型系統。它加快了轉基因植物的鑑定，並有利於分離突變型、啟動子和基因。『Micro—Tom』可以用作能產生漿果型果實的其它商業上重要的作物(例如，柑橘、葡萄等)的通用模型系統。在『Micro—Tom』中所發現的果實基因、啟動子、和突變型都有利於研究其它在植物學上相似果實的遺傳學、生理學和代謝。類似地，『Micro—Tom』可以用作植物發育突變和基因以及其它重要農藝基因座的通用模型系統。能有效用於小型番茄栽培品種『Micro—Tom』的基因鑑定和分析方法能方便地應用於其它植物的其它矮化突變型，包括農業上重要的作物種。
提供下列實施例是為了說明目的，而不構成對權利要求書的限定。本領域普通技術人員可以對所披露的實施例進行各種改進，而這些改進應該包括在本發明的範圍內。本說明書中所提到的所有文獻和專利申請代表了本發明所屬領域技術人員的水平。所有文獻和專利申請在本文中以相同程度收作參考文獻，就如同每一件文獻或專利申請被特別和單獨指明以其整體形式收作參考文獻一樣。
實施例例1．生長習性和遺傳組成(a)方法將『Micro—Tom』植物種子播種到苗圃用託盤或花盆中，並生長到果實成熟。為了進行種植密度試驗，每一種處理相當於生長在不同的根體積中。為此目的，將植物種植在13、33、90或200毫升的商業化苗圃用分隔過的託盤或容積為465毫升的花盆中。每一種處理有兩個重複，每一個重複包括84(13毫升處理)、72(33毫升)、63(90毫升)、50(200毫升)和15(465毫升)個植株，將其用於每一種性狀的分析。
(b)結果在各種大小的根系容積的苗圃用託盤中讓『Micro—Tom』植物從種子生長到果實成熟，以便測定密度對植物生長以及對果實和種子成熟的影響。每平方米100—1357個植株的密度等於試驗的根體積為465—13毫升。在
圖1中示出了『Micro—Tom』對不同生長條件的反應。檢驗過的生長性狀在每一個方框中標出，在括號中給出了有關值的範圍(最小—最大)。每一個性狀以該性狀的最大值的百分比形式給出，將其表示為根體積(底部刻度)或植物密度(上部刻度)的函數。測定了以下性狀到開花的天數(從播種到開花的平均天數)；到成熟的天數(從播種到果實顏色改變的平均天數)；植株高度(從土壤表面到第一花序的高度(釐米))；葉片數(主莖上的葉片數)；植物產量(每個植株的總的果實重量(克))；果實數量(每個植株的果實數量)；果實重量(果實的平均重量(克))；和種子數量(每個植株的平均種子數量)。誤差線條太小以至於不能表示。
某些性狀幾乎不受種植密度影響。例如，從種子播種到開花的天數為30天—40天，而從種子播種到果實成熟的天數為75—82天。當在相同條件下種植對照標準鑑定的番茄栽培品種(cv．UC82)時，在高密度(412—1357植株／米2)下它不能結實，而且在較低密度(100—226植株／米2)下僅有某些植株形成果實，其它性狀，如每個植株的植物產量、果實數量或種子數量，與種植密度的改變呈線性反應，在該試驗中所獲得的最小和最大值之間存在10倍以上的差別。平均果實重量和植株高度的性狀表現出對密度有較弱的反應，在最小和最大值之間存在2倍的差別。
在圖2A和2B中示出了生長在各種密度水平下的成熟植物。圖2A表示以13毫升(上左)、33毫升(上右)、90毫升(下左)、和200毫升(下右)的根體積種植的『Micro—Tom』植物。圖2B表示以90毫升容積種植的野生型『Micro—Tom』成熟植物，具有一個尺度線條。所述植物高5—6釐米(不包括根)，果實的直徑為1．5—2釐米。以226植株／米2的密度將『Micro—Tom』植物種植在苗圃中。注意到在『Micro—Tom』中，所有植物器官的體積都呈比例地變小了(只有種子除外，種子的大小接近正常大小)。這與其它番茄矮化突變型相反，所述矮化突變型具有緊湊的外觀，並且與其整體植株體形相比，具有大的葉片。
以上結果表明，矮化栽培品種『Micro—Tom』通常能以高達1357植株／米2的密度種植，以便用於本發明。
讓『Micro—Tom』與鑑定的栽培品種UC82和未鑑定的栽培品種VF86雜交。兩種雜交的F1植株在高度方面與「高的」親本非常相似，表明控制『Micro—Tom』表型的基因是隱性的。在來自與UC82雜交的F2後代中，存在多種生長習性表型。在分析過的176個F2植株中有6個明確不具備『Micro—Tom』表型，表明該表型是由2個主要隱性基因控制的，並可能具有額外的修飾基因的作用。根據『Micro—Tom』的譜系(Scott和Harbaugh，1989)，似乎dwarf和miniature是與『Micro—Tom』表型有關的兩個基因。
以上結果表明，矮化栽培品種『Micro—Tom』能夠方便地與番茄的商業栽培品種雜交。
例2．EMS誘變(a)方法為了進行EMS試驗，按照例1所述生長植物，所不同的是，這些植物生長在以色列Rehovot的魏茨曼科學研究所的防昆蟲網狀室中，而不是生長在溫室中。
對15，000粒『Micro—Tom』種子進行EMS—誘變。對所述種子進行誘變處理，由誘變的種子萌發的植株被稱為M1代。將所述種子放在培養皿中的溼的Whatman紙上吸水9小時，轉移到裝有150毫升未緩衝過的0．7％EMS(Sigma)溶液的三角瓶中，並在室溫(22℃下)輕緩振蕩培養16小時過夜。對誘變過的種子進行徹底清洗，吹風乾燥，並在當天播種到育苗託盤中。與對照組相比，誘變過的幼苗其生長推遲，並且其發芽百分比降低大約25％。大約10％的M1植物是不育的。從9000個M1植株上收穫M2種子。從70個M1植株中，分別從每一個植株上單獨收穫M2種子，並且將每一個M1植株的10—20個M2植物種植在後代行中。其餘的M2種子是統一收穫的，合併來自每一個M1植株的一個果實。播種來自統一收穫的大約20，000粒M2種子，並產生14，000個形成果實的M2植物。統一收穫M3種子。
(b)結果在M1群體(處理的一代)中，大約1％的植物出現葉綠素花斑。
在M2群體中，總共在苗圃用託盤中生長14，000個植株，並選擇突變表型，如圖2C所示。圖2D—H表示具有突變表型的EMS產生的M2植物。在該群體中發現了111個葉綠素突變體，包括白化、黃色(葉黃素樣)和淺綠色葉片；圖2G表示具有葉綠素突變表型(黃色葉片)的M2植物。還觀察到了具有改變了的葉片形狀，花(花瓣)和果實顏色的植株。與野生型圓形果實相比，有6個植物的所有果實都表現出改變了的果實形狀，包括諸如柿子形狀(圖2D)和梨形(圖2E)的表型。具有長橢圓形果實的植物同樣具有長而且窄的葉片(圖2F)。
還選擇了源於單個M1植物的70個M2家族的突變。在5個家族中，觀察到了總是以3∶1比例分離的突變表型。所述家族之一的葉片花青苷(紫色)著色是分離的；該家族如圖2H所示，源於單一的M2植物，其花青苷以3∶1的比例分離。
例3．『Micro—Tom』中的轉座子標記和增強子捕獲(a)方法按所述方法用下列結構轉化『Micro—Tom』植物；然後按照例1所述在溫室中生長所述轉基因植物。
(1)結構用於增強子捕獲的結構Bam35S—Ac和Ds378—GUS(Fedoroff和Smith，1993)獲自Nina Fedoroff。分別被用於基因捕獲和增強子捕獲(Sundaresan等，1995)的結構DsG和DsE(Sundaresan等，1995)獲自Venkatesan Sundaresan。所述結構如圖3所示，並說明如下。類似於2Ac的序列用灰色表示，其末端反向重複用灰色箭頭表示。結構的兩側是其相應的T—DNA的右臂(RB)和左臂(LB)。將β—葡糖醛酸酶基因(GUS)融合到Ds378—GUS的Ac弱啟動子上，融合到DsE上的35S的最小—1至—46啟動子區(黑色方框)上，或融合到擬南芥屬的內含子上，隨後是位於DsG上的三個受體剪接位點(黑色方框)(Sundaresan等，1995)。卡那黴素的抗性(Kanr)或潮黴素抗性(Hygr)分別是由新黴素磷酸轉移酶或氨基環醇磷酸轉移酶基因產生的。對萘乙醯胺(NAM5)的敏感性是由吲哚乙酸水解酶基因產生的。
Ds移動性是通過讓含Ds的植物(DsG、DsE和Ds378—GUS)與用Bam35S—Ac轉化過的產生轉座酶的植物雜交而獲得的。在該結構中，轉座酶是在與Ac因子融合的35S啟動子的控制下產生的。Ac因子的5』末端區一直到單一BamHI位點業已缺失。在從含有Ds378—GUS的結構中切除Ds因子時，獲得了chlorosulfuron抗性(Chlr)，並激活了來自含有GUS的結構的突變的乙醯乳酸合酶基因，還激活了源於擬南芥屬的突變的乙醯乳酸合酶基因(Fedoroff和Smith，1993)。在Bam35S—Ac和Ds378—GUS雜交的F1中切除Ds378—GUS時，獲得了切除足跡(Ex1和Ex2)，並用引物pr1和pr2進行擴增。Ds378—GUS的旁側序列在Ex1和Ex2上面示出。在下面劃線的序列表示在產生Ds378—GUS的原始wx—m7玉米等位基因上的宿主重複旁側Ac插入位點。
(2)轉化通過以下優化方法用結構Ds378—GUS、Bam35S—Ac、DsE和DsG轉化『Micro—Tom』。在25℃下，在低光照條件下，讓補充了0．2微克／毫升2，4—D的含有KCMS培養基的平板(Fillati等，1987)和菸草飼養細胞層(Horsch等，1985)培養24小時。在靠近葉柄處和葉尖處切割7日齡幼苗的子葉，放在平板上，並在25℃下在低光照條件下預培養24小時。用於共培養的農桿菌屬菌株LBA4404的濃度為5×107—9×107cfu／ml，相當於OD為0．4—0．5。共培養是在和預培養相同的條件下進行的，並持續48小時。然後將所述子葉轉移到含有100微克／毫升卡那黴素和400微克／毫升羧卞青黴素的2Z培養基(Fillati等，1987)上，培養3—4周，然後再轉移到含有200微克／毫升羧卞青黴素的1Z培養基上培養2—3周，然後從所述子葉上切除芽，並轉移到補充了2微克／毫升IBA，50微克／毫升卡那黴素，和100微克／毫升羧卞青黴素的生根培養基(MSSV)上(Fillati等，1987)。小植株在1—3周之後長出根，然後將其轉移到溫室中。
(3)選擇標記和GUS報導基因。除了用於所述捕獲系統的轉化和GUS報導基因所需要的卡那黴素選擇之外，將多種標記用於選擇轉座現象(Fedoroff和Smith，1993；Sundaresan等，1995)。為此，讓消毒過的種子萌發並生長在補充了下列化合物之一或其組合的含有0．8％瓊脂的Nitsh培養基上20微克／毫升潮黴素(Calbiochem)；0．25微克／毫升萘乙醯胺(NAM，Sigma)；和100p．p．b．或2p．m．chlorosulfuron(杜邦)。按照Jefferson(1987)的方法進行GUS染色，按照Beeckman和Engler(1994)的方法進行組織清理。
(4)DNA分析。用Dellaporta方法(Dellaporta等，1983)從幼小葉片中提取DNA，增加一次苯酚氯仿萃取。按照生產商推薦的條件，用Promega Taq聚合酶與2．5mM氯化鎂和200μM dNTPs在MJ熱循環儀中進行PCR反應。使用了下列方案在94℃下進行2分鐘變性，在94℃下1分鐘，在55℃下40分鐘，在72℃1分鐘，反應30輪次，最後一步是在72℃下5分鐘。用於擴增Ds切除產物的引物是pr2，5』GGATAGTGGGATTGTGCGTC3』，該引物互補於35S啟動子的序列，和pr1，5』GGATGATTTGTTGGGGTTTA3』，該引物互補於ALS基因的序列(圖3)。從瓊脂糖凝膠中提取預期大小的切除產物(大約322bp)的帶，並按照生產商的說明用GenClean純化DNA。將所述PCR產物克隆到pGEM—T載體(Promega)上，並用T7或SP6引物測序。為了進行Southern分析，用HindⅢ消化2微克基因組DNA，在0．8％的瓊脂糖凝膠上分離，並轉移到從MSI購買的硝酸纖維素膜上。按照生產商的說明進行雜交。通過PCR擴增1kb的內部GUS片段，通過隨機引物法進行放射性標記(Feinberg和Vogelstein，1983)，並用作Ds檢測的探針。
(b)結果按所述方法將結構Ds378—GUS、Bam35S—Ac、DsE、和DsG轉入『Micro—Tom』中。
所述結構含有能賦予對卡那黴素的抗性的NPTⅡ基因。可將NPTⅡ用作轉化標記，檢測T—DNA的存在，並使Ds因子相對其Ds378—GUS上的供體位點作圖，或選擇DsE和DsG的不連鎖的轉座現象。該基因的一個優點是，它可以在整個番茄植物中用作非破壞性的報導基因。按以前披露的方法(Weide等，1989)連續3天用300微克／毫升卡那黴素在大多數發育階段噴灑『Micro—Tom』植株，能夠鑑定卡那黴素敏感植株而不破壞該植株。如圖4所示，在所述植物中，靠近苗端的幼小葉片在噴灑後不久變白。圖4A表示用300微克／升卡那黴素進行3天噴灑處理(每天1次)之後的3周齡『Micro—Tom』植物。比較用Bam35—Ac轉化過的卡那黴素抗性植物(上圖)和同齡的野生型敏感植物(下圖)。在敏感植物的苗端上形成白色葉片。這些葉片最終死亡，但隨後出現的葉片是綠色的，並且植株能存活。
如圖4B所示，潮黴素抗性基因表示Ds378—GUS的存在。用Ds378—GUS轉化過的植物能抗20微克／毫升潮黴素(圖4B，左)，而野生型『Micro—Tom』是敏感型的(圖4B，下右)。
吲哚乙酸水解酶(iaaH)基因能產生對NAM的敏感性。敏感型植物在根基部位形成愈傷組織樣組織，並在發芽後大約3周死亡，如圖4C所示。用Bam35S—Ac轉化過的植物對0．25微克／毫升萘乙醯胺敏感(圖4C，左)，而野生型是抗性的(圖4C，右)。可將NAM敏感性用作負選擇標記，對Bam35S—Ac進行選擇，從而穩定新的插入和／或對DsE和DsG上的供體位點進行選擇。
ALS基因能在攜帶未剪切的Ds因子的植物中產生對100ppbchlorosulfuron低的抗性，並能在Ds被切除的植物中產生對2ppmchlorosulfuron的抗性，如圖4D所示。生長在100ppb chlorosulfuron上的野生型植物是敏感的(圖4D，左)，而用Ds378—GUS轉化過的植物具有低的抗性(圖4D，中)。
選擇用於轉座選擇的標記的結果如圖4所示，對F1(Ds×轉座酶)植物進行X—Gluc染色，出現了蘭色扇形區(圖4E—F)。通過10日齡F1幼苗根中的蘭色，證實無啟動子GUS報導基因在DsG中是激活的。對開花後2周的、直徑為1釐米大的幼小果實進行染色，檢測GUS活性(圖4F)。在諸如野生型或Bam35S—Ac的親本的負對照植物中未獲得GUS活性(圖4F，上)。GUS在某些F1果實中是有活性的(圖4F，下)。
因此，以前所披露的擬南芥屬的選擇特徵(Fedoroff和Smith，1993；Sundaresan等，1995)同樣適用於『Micro—Tom』，因此，可被用於轉座子標記系統。以前業已披露並比較了產生不連鎖的並且穩定的Ds轉座的方法，以及用於選擇切除和再插入的方法，其中，通常都能獲得連鎖的轉座現象(Sundaresan，1996)。
使用Ds378—GUS和Bam35S—Ac結構獲得了該剪切／再插入系統的新的特徵，因為其具有鑑定和恢復卡那黴素敏感植物的能力(圖4A)。讓攜帶Ds378—GUS的親本與攜帶Bam35S—Ac的親本雜交，選擇F2植物對潮黴素的抗性和對卡那黴素的敏感性，可以選擇不連鎖的、穩定的轉座現象，如圖4D所示。發生了胚Ds切除現象的F2植物(Bam35S—Ac×Ds378—GUS)能充分地抗chlorosulfuron(圖4D，右)，這一特徵使得由Fedoroff和Smith(1993)開發的系統適用於番茄。所述雙重系統適用於選擇連鎖的和不連鎖的轉座。
該系統在番茄中的使用首先包括選擇Hygr和Kans植物，由此可以鑑定不連鎖的、穩定的轉座現象。對於這一類植物來說，NAM選擇是不必要的，而且不使用chlorosulfuron，因為含有空的供體位點的T—DNA發生了分離。其次，在Hygr和Kanr植物中選擇抗chlorosulfuron的植物，能夠鑑定連鎖的轉座現象。這一類植物多有所述現象，因為Ac具有自然轉座的傾向，並且因為消除了某些上述不連鎖的轉座現象(Hygr，Kans和Chls植物)。
通過對Ds切除足跡進行測序，在分別用Ds378—GUS和Bam35S—Ac轉化過的轉基因植物之間雜交所產生的F1植物中證實了導入「Micro—Tom」的Ac／Ds系統的活性。在圖3中Ds378—GUS結構下面示出的所述足跡，是預期的典型的Ac／Ds足跡。在分析過的4個克隆中，3個具有相同的足跡(GC反向)，如Ac在玉米的wx—m7等位基因，或在擬南芥屬(C．Weil，個人通訊)和菸草(Gorbunova和Levy，1997；Shalev和Levy，1997)中產生的。以上結果表明，優勢足跡的形成是不依賴於物種的，如Scott等以前所披露的(1996)。另外，在F1植物中的GUS染色特徵出現在DsG X Bam35S—Ac的根部(圖4E)，在葉片中(未示出)或在Ds378—GUS X Bam35S—Ac幼小果實中(圖4F)，表明Ds在植物發育過程中整合到有關基因或附近基因中。在缺少Ac啟動子的Ds378—GUS親本中，僅在幼小果實的不成熟的種子中檢測到微弱的GUS活性。
最後，在chlorosulfuron和潮黴素抗性F2植物的Southern印跡分析中證實了轉座，所述F2植物是Ds378—GUS X Bam35S—Ac雜交的後代，如圖5所示。基因組DNA提取自Ds378—GUS結構純合的轉基因植物(泳道a)；Bam35S—GUS結構純合的轉基因植物(泳道b)；以上兩種植物雜交的F1植物(泳道C)；以及所得到的抗2ppm chlorosulfuron和抗潮黴素的F2植物(泳道D—L)。用HindⅢ消化DNA，並在0．8％的瓊脂糖凝膠上電泳，轉移到尼龍膜上，並與內部1kb GUS探針雜交。箭頭指向來自Bam35S—GUS親本的8kb帶。
處理源於含有Ds親本Ds378—GUS的DNA，用HindⅢ消化能斷開Ds的5』末端和GUS基因的5』末端之間的結合，但不能斷開T—DNA的左臂(圖3)。GUS探針存在於Ds中，揭示了一個Ds親本的單一8kb帶(泳道a)，表明單一的T—DNA拷貝插入該基因組中。正如所預料的，未獲得與轉座酶親本的雜交(泳道b)。F2植物表現出可變的雜交方式(圖5，泳道d—1)，表明在新的位點上發生了因子切除和再插入。對來自Ds378—GUS和Bam35S—Ac雜交的F2植物進行分析表明，在進行chlorosulfuron抗性試驗的22個植物中有11個抗潮黴素，這一點通過在含有潮黴素的培養基上培養時旺盛的根系發育所證實。這使得切除Ac的丟失百分比大約為50％，這一結果類似於以前在玉米(Dooner和Belachew，1989；Greenblatt，1984；McClintock，1956)，菸草(Jones等，1990)，和擬南芥屬(Altmann等，1992)上所報導的結果。
例4．小型作物栽培品種的反向遺傳學選擇小型番茄栽培品種『Micro—Tom』來生產含有轉座子的植物群體。通過在例3中所述的轉化方法將圖3所示質粒Bam35S—Ac轉化到『Micro—Tom』中。讓轉化體自交，產生第一親本植物(品系R2—1—1)，該品系的質粒Bam35S—Ac是純合的，並表達轉座酶活性。按例3所述方法將圖3所示質粒Ds378—GUS和圖6所示Ds—LUC轉入『Micro—Tom』中。讓轉化體自交，產生一系列在T—DNA上含有供體Ds的植物。讓轉座酶和Ds植物雜交，產生F1種子。讓F1植物生長而不進行選擇，自交產生F2種子。按例3所述方法通過讓F2幼苗生長在含有chlorosulfuron、潮黴素和NAM的瓊脂培養基上篩選F2種子的穩定轉座現象。種植相當於獨立轉座現象的F2植物，並篩選顯性突變。讓F2植物自交，並得到F3家族，每一個家族包括源於單一F2植物的12個F3植物，篩選F3家族的隱性突變。
鑑定了含有插入已知核苷酸序列(靶序列)上的Ds的突變型小型植物。從F2植物的葉片中提取DNA。對所述DNA樣品進行PCR，用相當於轉座子Ds的核苷酸序列的第一引物和相當於所述靶核苷酸序列的核苷酸序列的第二引物進行選擇。鑑定並分析了用所述第一和第二引物能產生PCR產物的植物，以便確定轉座子插入感興趣的核苷酸序列對植物表型的影響。
例5．Ds—螢光素酶被命名為Ds—螢光素酶的用於基因捕獲的DNA結構如圖6所示。類似於Ac的序列用灰色表示，其末端反向重複用灰色箭頭表示。該結構的旁側是相應的T—DNA的右臂(RB)和左臂(LB)。螢光素酶基因(LUC)融合到Ac的左側末端，從1到252號核苷酸。該片段含有所述末端反向重複，但缺少啟動子。卡那黴素抗性(Kanr)或潮黴素抗性是由新黴素磷酸轉移酶基因或氨基環醇磷酸轉移酶基因產生的。Chlorosulfuron抗性(chlorosulfuronr)是在將Ds從含有Ds378—GUS的結構上切除之後獲得的，並且由35S啟動子激活了源於擬南芥屬的突變型乙醯乳酸合酶基因(Federoff和Smith，1993)。BAR基因產生對除草劑Basta的抗性。
質粒Ds—螢光素酶按以下方法構建用圖6所示的上述Ds因子取代位於Ds378—GUS上的Ds因子(圖3)，用於取代的Ds因子在Ac臂之間含有螢光素酶和卡那黴素抗性基因。然後將35S啟動子—Ds—ALSAsp718片段克隆到二元載體SLJ525(獲自Jonathan Jones博士，Norwich，UK)。按例3所述方法將質粒Ds—螢光素酶轉入小型番茄栽培品種『Micro—Tom』。
總共培養了1，000株含有Ds螢光素酶獨立轉座的植物。在諸如幼苗、花和果實的植物器官中篩選螢光素酶的表達。所述篩選是通過用1mM螢光素噴灑植物組織，然後在完全無光線的條件下顯像而進行的。顯像是用冷CCDP Princeton儀表用相機進行的，其能檢測超低光信號。如圖7所示，檢測到100個在黑暗中發光的植物，即能在各個組織中表達螢光素酶。在篩選過的1000個植株中，有一個植株的幼苗在正常條件下表達螢光素酶，但通過冷處理能抑制其表達(圖7，下圖)。為了檢測啟動子或增強子的特定類型，需要對較大的突變型群體進行篩選。
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權利要求
1．一種篩選具有理想性狀的突變型小型植物的方法，包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；(b)通過用突變誘導劑處理所述小型植物在所述小型植物群體中產生突變型小型植物，以便產生誘變型小型植物群體；和(c)在所述誘變的小型植物群體中選擇具有所述理想性狀的突變型小型植物。
2．如權利要求1的方法，其中，所述小型植物群體是通過天然或誘發突變、通過遺傳工程、或通過用植物生長因子處理的方式產生的。
3．如權利要求2的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品種。
4．如權利要求1的方法，其中，所述同一物種的商業植物被用於生產糧食、纖維或花卉。
5．如權利要求4的方法，其中，所述同一物種的商業植物是能產生漿果型果實的植物或茄科的植物。
6．如權利要求5的方法，其中，所述能產生漿果型果實的商業植物選自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘類果實、蘋果。
7．如權利要求1的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的化學誘變劑乙基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基—N—亞硝基脲(MNU)和博來黴素。
8．如權利要求1的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的射線UV、γ—射線、X—射線、和快速中子。
9．如權利要求1的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的可動DNA序列T—DNA和轉座因子。
10．如權利要求9的方法，其中，所述轉座因子選自自主性轉座子、非自主性轉座子和自主性轉座子／非自主性轉座子系統。
11．如權利要求10的方法，其中，所述轉座因子是玉米Ac／Ds轉座因子。
12．用權利要求1—11任一項所述方法選擇的突變型小型植株。
13．如權利要求12的突變型小型植株，其中，所述小型植株是小型番茄栽培品種。
14．一種突變型小型植物群體，其中，所述群體的小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；和(ⅳ)具有用一種製劑誘導的突變，該製劑是化學誘變劑、射線、或可動DNA序列。
15．如權利要求14的突變型小型植物，其中，所述同一物種的商業植物被用於生產糧食、纖維或花卉。
16．如權利要求15的突變型小型植物群體，其中，所述同一物種的商業植物是能產生漿果型果實的植物或茄科的植物。
17．如權利要求16的突變型小型植物群體，其中，所述產生漿果型果實的商業植物選擇番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘類果實、蘋果。
18．一種鑑定含有插入感興趣的基因的可動DNA序列的小型植物的方法，包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；(b)通過用可動DNA序列處理所述植物在所述小型植物群體中產生突變型植物；(c)通過PCR篩選從所述突變型植物中提取的DNA，使用具有相當於所述可動DNA序列的核苷酸序列的第一引物和相當於所述感興趣的基因的核苷酸序列的第二引物；和(d)鑑定包括能在有所述第一和第二引物的條件下產生PCR產物的DNA的小型植物。
19．如權利要求18的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品種。
20．如權利要求18的方法，其中，所述可動DNA序列選自T—DNA或轉座因子。
21．如權利要求20的方法，其中，所述轉座因子是玉米Ac／Ds轉座因子。
22．一種生產突變型小型植物群體的方法，包括以下步驟(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；和(b)通過用一種突變誘導劑處理所述小型植物在所述小型植物群體中產生所述突變植物，以便產生所述小型作物栽培品種的突變群體。
23．如權利要求22的方法，其中，所述小型植物群體是通過天然或誘發突變、通過遺傳工程、或通過用植物生長因子處理的方式產生的。
24．如權利要求22的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的化學誘變劑乙基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基—N—亞硝基脲(MNU)和博來黴素。
25．如權利要求22的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的射線UV、γ—射線、X—射線、和快速中子。
26．如權利要求22的方法，其中，步驟(b)中的所述突變誘導劑是選自下列一組的可動DNA序列T—DNA和轉座因子。
27．如權利要求26的方法，其中，所述突變誘導劑是T—DNA，並用農桿菌屬感染所述小型植物，從而產生多個轉化體，其中，每一個轉化體包括一個插入不同基因組位點的T—DNA。
28．如權利要求26的方法，其中，所述突變誘導劑是轉座子，而所述突變型小型植物群體是從含有活性轉座系統的小型植物的後代獲得的。
29．如權利要求28的方法，其中，所述活性轉座系統是植物固有的轉座子或通過遺傳工程技術導入所述植物的轉座子。
30．如權利要求29的方法，其中，所述活性轉座系統選自自主性轉座子，而轉座因子是通過讓含有非自主性轉座子的植物與轉座酶源或與含有自主性轉座子的植物雜交獲得的。
31．如權利要求29的方法，其中，所述轉座因子包括玉米Ac／Ds轉座子系統。
32．如權利要求22—31的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品種。
33．一種鑑定控制植物基因表達的核苷酸序列的方法，包括以下步驟(a)用一種DNA結構轉化一種小型植物，以便產生一個隨機誘變植物的群體，其中，所述DNA結構包括一個編碼選擇標記的基因序列，該基因缺少啟動子或者含有一個最小啟動子，所述基因序列克隆到可動DNA序列的臂內，其中，所述小型植物具有下列特徵(ⅰ)與同一物種的商業植物相比具有較小的體形；(ⅱ)在比用於同一物種的商業植物的標準生長條件至少高10倍的種植密度下能夠成熟，並產生有活力的種子或塊莖；和(ⅲ)能夠與同一物種的商業植物雜交；(b)在所述植物群體中鑑定由所述DNA結構轉化的並能表達所述選擇標記的小型植物；和(c)克隆所述核苷酸序列，該序列可操作地連接於從在步驟(b)中鑑定的所述轉化小型植物中提取的總DNA的編碼所述選擇標記的基因上。
34．如權利要求33的方法，其中，所述選擇標記選自GUS和螢光素酶。
35．如權利要求33或34的方法，其中，所述可動DNA序列是T—DNA或轉座因子。
36．如權利要求33的方法，其中，所述控制植物基因表達的核苷酸序列是啟動子或增強子。
37．一種生產具有理想性狀的突變型商業植物群體的方法，包括以下步驟(a)讓按照權利要求1的方法選擇的具有所述理想性狀的所述突變型小型植物與同一物種的商業植物雜交；和(b)選擇與所述商業親本植物相似並表達所述理想性狀的後代。
38．如權利要求37的方法，其中，所述商業植物被用於生產糧食、纖維或花卉。
39．如權利要求38的方法，其中，所述商業植物是能產生漿果型果實的植物或茄科的植物。
40．如權利要求39的方法，其中，所述能產生漿果型果實的商業植物選自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘類果實、蘋果。
41．一種用權利要求37的方法生產的具有理想性狀的商業植物。
42．如權利要求41的商業植物，其中，所述商業植物被用於產生糧食、纖維或花卉。
43．如權利要求42的商業植物，其中，所述商業植物是能產生漿果型果實的植物或茄科的植物。
44．如權利要求43的方法，其中，所述能產生漿果型果實的商業植物選自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘類果實、蘋果。
全文摘要
本發明可以在作物中迅速並大規模產生突變體。這一目的是通過使用能夠與同物種的商業植物雜交的小型植物實現的。在所述小型栽培品種中誘發突變,然後在所得到的突變型植物群體中鑑定突變體。通過讓選擇的突變型小型植物與商業栽培品種雜交,將感興趣的突變基因逐漸滲透到商業栽培品種中。可以用含有隨機T－DNA或轉座子插入現象的小型作物的植物群體進行反向遺傳學,並選擇該群體中所插入的感興趣的基因。類似地,用一種DNA結構轉化所述小型植物群體,該DNA結構包括位於一個可動DNA上的無啟動子選擇標記基因。由該結構衍生的突變體可以通過所述選擇標記基因的表達快速選擇,並克隆了所述轉化體中的可操作地連接於所述選擇標記基因上的啟動子。
文檔編號A01H1/04GK1278701SQ98811051
公開日2001年1月3日 申請日期1998年9月10日 優先權日1997年9月11日
發明者A·A·萊維, R·梅斯納, Y·艾金德 申請人:耶達研究及發展有限公司, 耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司