一種製備乳酸脫氫酶的方法及應用的製作方法
2023-05-30 13:54:36 1
專利名稱：一種製備乳酸脫氫酶的方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程和蛋白表達領域，涉及一種用生物工程技術高效製備乳酸脫氫酶的方法，產物可作為抗原物質進行動物免疫，篩選相關抗體，同時為臨床化學診斷所需校準品、標準物質和參考品的製備開發奠定基礎。
背景技術：
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)是一種糖酵解酶,催化乳酸與丙酮酸之間可逆反應的一種脫氫酶。乳酸脫氫酶廣泛存在於各種組織中，以心肌、肝、骨骼肌、肺含量最多，其活力約為血清的500 1000倍。若器官或組織損傷，可釋放此酶至血液中，血清此酶含量即見增高，但由於其分布廣泛而缺乏特異性。血清此酶含量升高主要見於急性心肌梗塞、病毒性心肌炎、肝硬化、肺梗塞、惡性腫瘤及白血病等。在急性心肌梗塞患者，血清 此酶水平於發作後12 24小時開始增高，48 72小時達高峰，升高可持續10天。與肌酸激酶相比該酶升高出現較晚，陽性率低，但維持時間長。該酶和谷-草轉氨酶聯合檢測有助於鑑別心肌梗塞，兩者均升高多見於心肌梗塞；乳酸脫氫酶和膽紅質升高，而谷-草轉氨酶正常多見於肺梗塞。LDH是由H(心肌型)和M(骨骼肌型)兩類亞基組成，其同功酶有五種形式，即LDH-1 (H4)、LDH-2 (H3M)、LDH_3 (H2M2)、LDH_4 (HM3)及 LDH-5 (M4)，LDH 同功酶的分布有明顯的組織特異性，所以可以根據其組織特異性來協助診斷疾病。正常人血清中LDH2含量大於LDHl，如有心肌酶釋放入血則LDHl含量大於LDH2，利用此指標可以觀察診斷心肌疾病。LDH正常範圍血清100 300U/L ;尿560 2050UL ;腦脊液含量為血清的1/10。臨床意義(I)急性心肌梗塞發作後，早期血清中LDHl和LDH2活性均升高，但LDHl增高更早，更明顯，導致LDH1/LDH2的比值升高。(2)肝炎、急性肝細胞損傷及骨骼肌損傷時LDH5都會升高。(3)患活動性風溼性心臟病、急性病毒性心肌炎、溶血性貧血、腎壞死等病LDHl也
可升聞。我國幅員遼闊，人口眾多，臨床診斷試劑市場巨大，前景廣闊。就國內的現狀來說，我國的診斷試劑行業仍處於成長初期，即產品研發與生產的投入初期，成長期還沒有真正到來，而我國診斷試劑市場規模約為全球市場的1/14，有較大的成長空間。研製價廉物美的診斷試劑產品無疑是非常必要且具重要意義的。目前國外的產品通常是把試劑、參考品(校準品、質控品)、儀器作為一個系統(封閉系統)推入市場，在檢測重複性、準確性上有很大的優勢，並且具有市場壟斷性。國內主要的診斷試劑生產廠家幾乎都沒有生產相應質控品的經驗和實力，市場上認可的國產產品
寥寥無幾
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種操作簡單、製備成本低廉，成功率高的製備乳酸脫氫酶的方法。為實現上述目的，本發明一種製備乳酸脫氫酶的方法，該方法包括I)改造並全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子;2)將步驟I)中改造後的乳酸脫氫酶編碼基因序列插入表達載體中，並用大腸桿菌菌株轉化表達；3)將轉化表達菌株接種於LB培養基，IPTG誘導；4)所得菌體破菌，離心分離，過N1-NTA柱純化；
其中，步驟I)中改造後的全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列為I ATGGATCATC ATCATCATCA CCACGAAAAC CTGTATTTTCAGGGCGCAAC TCTAAAGGAT61 CAGCTGATTT ATAATCTTCT AAAGGAAGAA CAGACCCCCCAGAATAAGAT TACAGTTGTT121 GGGGTTGGTG CTGTTGGCAT GGCCTGTGCC ATCAGTATCTTAATGAAGGA CTTGGCAGAT181 GAACTTGCTC TTGTTGATGT CATCGAAGAC AAATTGAAGGGAGAGATGAT GGATCTCCAA241 CATGGCAGCC TTTTCCTTAG AACACCAAAG ATTGTCTCTGGCAAAGACTA TAATGTAACT301 GCAAACTCCA AGCTGGTCAT TATCACGGCT GGGGCACGTCAGCAAGAGGG AGAAAGCCGT361 CTTAATTTGG TCCAGCGTAA CGTGAACATC TTTAAATTCATCATTCCTAA TGTTGTAAAA421 TACAGCCCGA ACTGCAAGTT GCTTATTGTT TCAAATCCAGTGGATATCTT GACCTACGTG481 GCTTGGAAGA TAAGTGGTTT TCCCAAAAAC CGTGTTATTGGAAGCGGTTG CAATCTGGAT541 TCAGCCCGAT TCCGTTACCT AATGGGGGAA AGGCTGGGAGTTCACCCATT AAGCTGTCAT601 GGGTGGGTCC TTGGGGAACA TGGAGATTCC AGTGTGCCTGTATGGAGTGG AATGAATGTT661 GCTGGTGTCT CTCTGAAGAC TCTGCACCCA GATTTAGGGACTGATAAAGA TAAGGAACAG721 TGGAAAGAGG TTCACAAGCA GGTGGTTGAG AGTGCTTATGAGGTGATCAA ACTCAAAGGC781 TACACATCCT GGGCTATTGG ACTCTCTGTA GCAGATTTGGCAGAGAGTAT AATGAAGAAT841 CTTAGGCGGG TGCACCCAGT TTCCACCATG ATTAAGGGTC
TTTACGGAAT AAAGGATGAT901 GTCTTCCTTA GTGTTCCTTG CATTTTGGGA CAGAATGGAATCTCAGACCT TGTGAAGGTG961 ACTCTGACTT CTGAGGAAGA GGCCCGTTTG AAGAAGAGTGCAGATACACT TTGGGGGATC1021 CAAAAGGAGC TGCAATTTTA A進一步，步驟2)中所述表達載體為pRSF Duet, pET表達系列。進一步，步驟2)中所述大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。 進一步，所述BL21(DE3)菌株用於高效表達克隆於含有噬菌體T7啟動子的表達載體的基因。進一步，λ噬菌體DE3區含有Τ7噬菌體RNA聚合酶，該區整合於BL21的染色體上形成所述BL21(DE3)。進一步，步驟4)中所述破菌方法為高壓破碎、超聲或者溶菌酶酶解。一種如權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法在校準品、標準物質和參考品製備中的應用。進一步，所述製備乳酸脫氫酶的純品添加入人源或動物源的血清，配製成指定濃度的標準品或校準品。一種利用權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法製成的產物作為免疫用的抗原物質，來篩選相關抗體。本發明的有益效果在於本發明製備乳酸脫氫酶操作非常簡單，製備成本低，成品產率高，純度高而且具有高生物活性，可作為抗原物質進行動物免疫，篩選相關抗體，為儘快建立國內臨床化學診斷急需的校準品製備平臺，研製診斷試劑標準物質和參考品奠定基礎。
圖1為構建的6His_LDH pRSF用Nco I和EcoR I酶切，得到約Ikb的插入片段，表明目的基因已插入載體，構建成功；圖2為純化的LDH成品的SDS-PAGE電泳圖，產品純度可達90 %以上。
具體實施例方式下面，參考附圖，對本發明進行更全面的說明，附圖中示出了本發明的示例性實施例。然而，本發明可以體現為多種不同形式，並不應理解為局限於這裡敘述的示例性實施例。而是，提供這些實施例，從而使本發明全面和完整，並將本發明的範圍完全地傳達給本領域的普通技術人員。本發明建立了操作簡單、迅速、成本較低的一種製備乳酸脫氫酶的方法。這種方法的原理主要在於將優化後的乳酸脫氫酶編碼基因插入構建好的表達載體，在大腸桿菌中誘導其高效表達，該方法具體為1.乳酸脫氫酶表達載體的構建改造人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子，從北京invitrogen公司全基因合成改造後的LDH編碼序列；利用http:// www. faculty, ucr. edu/ mmaduro/codonusage/usage, htm 網頁分析，在原始LDH編碼基因序列中，大腸桿菌中密碼子使用頻率在10%以內佔20%;改造後的基因序列完全去除大腸桿菌稀有密碼子，大腸桿菌密碼子完全被激活。通過基因工程手段利用Nco I和EcoRI位點將其克隆至PRSF Duet載體內，並轉化大腸桿菌TOPlO菌株，挑取數個轉化克隆提取質粒，通過限制性內切酶酶切鑑定目的基因是否插入載體(如圖1所示)，選取插入目的基因的質粒進行DNA序列測定，結果表明乳酸脫氫酶基因成功克隆至pRSF Duet載體內，我們將其命名為6His-LDH pRSF。改造後的全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列為
I ATGGATCATC ATCATCATCA CCACGAAAAC CTGTATTTTCAGGGCGCAAC TCTAAAGGAT61 CAGCTGATTT ATAATCTTCT AAAGGAAGAA CAGACCCCCCAGAATAAGAT TACAGTTGTT121 GGGGTTGGTG CTGTTGGCAT GGCCTGTGCC ATCAGTATCTTAATGAAGGA CTTGGCAGAT181 GAACTTGCTC TTGTTGATGT CATCGAAGAC AAATTGAAGGGAGAGATGAT GGATCTCCAA241 CATGGCAGCC TTTTCCTTAG AACACCAAAG ATTGTCTCTGGCAAAGACTA TAATGTAACT301 GCAAACTCCA AGCTGGTCAT TATCACGGCT GGGGCACGTCAGCAAGAGGG AGAAAGCCGT361 CTTAATTTGG TCCAGCGTAA CGTGAACATC TTTAAATTCATCATTCCTAA TGTTGTAAAA421 TACAGCCCGA ACTGCAAGTT GCTTATTGTT TCAAATCCAGTGGATATCTT GACCTACGTG481 GCTTGGAAGA TAAGTGGTTT TCCCAAAAAC CGTGTTATTGGAAGCGGTTG CAATCTGGAT541 TCAGCCCGAT TCCGTTACCT AATGGGGGAA AGGCTGGGAGTTCACCCATT AAGCTGTCAT601 GGGTGGGTCC TTGGGGAACA TGGAGATTCC AGTGTGCCTGTATGGAGTGG AATGAATGTT661 GCTGGTGTCT CTCTGAAGAC TCTGCACCCA GATTTAGGGACTGATAAAGA TAAGGAACAG721 TGGAAAGAGG TTCACAAGCA GGTGGTTGAG AGTGCTTATGAGGTGATCAA ACTCAAAGGC781 TACACATCCT GGGCTATTGG ACTCTCTGTA GCAGATTTGGCAGAGAGTAT AATGAAGAAT841 CTTAGGCGGG TGCACCCAGT TTCCACCATG ATTAAGGGTCTTTACGGAAT AAAGGATGAT
901 GTCTTCCTTA GTGTTCCTTG CATTTTGGGA CAGAATGGAATCTCAGACCT TGTGAAGGTG961 ACTCTGACTT CTGAGGAAGA GGCCCGTTTG AAGAAGAGTGCAGATACACT TTGGGGGATC1021 CAAAAGGAGC TGCAATTTTA A2.乳酸脫氫酶的表達
I)以BL21(DE3)為宿主菌，將6His_LDH pRSF進行轉化，挑取單菌落於3ml LB培
養基培養過夜；2)以1: 500比例將菌液轉接至400ml LB培養基，恆溫在37°C，230rpm培養至0D600 = O.4-0. 6 ；3)加IPTG誘導，IPTG誘導終濃度為O. 5mM，保持25°C條件下表達8小時後收菌。BL21(DE3)菌株用於高效表達克隆於含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如pET系列)的基因。普通大腸桿菌沒有t7RNA聚合酶，所以不能表達那些載體上的基因。λ噬菌體DE3區含有Τ7噬菌體RNA聚合酶，該區整合於BL21的染色體上，就叫BL21(DE3)。3.乳酸脫氫酶的純化I)取400ml培養液3000rpm離心分離10分鐘後收集菌體，菌體重懸於IOml蛋白提取緩衝液中(50mM Na-PO4, pH8. 0,500mM NaCl，IOmMImidazle)，15MPa 高壓破菌，12, OOOrpm, 4°C離心lOmin,上清液與N1-NTA冰上孵育I小時；2)過N1-NTA親和層析柱，用蛋白提取buffer洗滌，最後用250mMImidaZle洗脫，收集洗脫液。3)蛋白洗脫液過G50柱去除Imidazle，這樣可以得到90%以上純度的LDH(如圖2所示)。4.乳酸脫氫酶活性測定製備乳酸脫氫酶的純品用奧林巴斯AU5400生化儀測定活性，酶活可達20000U/L，且_20°C甘油凍存6個月，酶活基本保持不變。該純品可添加入人源或動物源的血清，配製成指定濃度的標準品或校準品。上述製備乳酸脫氫酶的方法可以作為抗原物質進行動物免疫，篩選相關抗體，以及在校準品、標準物質和參考品製備中應用，不是以診斷為目的，不屬於疾病的診斷方法。除非特殊定義，本發明描述所用的術語是在有關技術領域中公知的術語。標準的化學符號及縮寫符號可以與其全名互換使用。除非特殊指明，本發明所用到但未明確闡述或簡單闡述的技術和方法是指本技術領域通常使用的技術和方法，可按照本領域公知的技術和方法進行。試劑盒的使用是根據製造商或供應商提供的說明書進行。
權利要求
1.一種製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，該方法包括 1)改造全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子； 2)將步驟I)中改造後的乳酸脫氫酶編碼基因序列插入表達載體中，並用大腸桿菌菌株轉化表達； 3)將轉化表達菌株接種於LB培養基，IPTG誘導； 4)所得菌體破菌，離心分離，過N1-NTA柱純化； 其中，步驟I)中改造後的全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列為IATGGATCATC ATCATCATCA CCACGAAAAC CTGTATTTTCAGGGCGCAAC TCTAAAGGAT.61 CAGCTGATTT ATAATCTTCT AAAGGAAGAA CAGACCCCCCAGAATAAGAT TACAGTTGTT.121 GGGGTTGGTG CTGTTGGCAT GGCCTGTGCC ATCAGTATCTTAATGAAGGA CTTGGCAGAT.181 GAACTTGCTC TTGTTGATGT CATCGAAGAC AAATTGAAGGGAGAGATGAT GGATCTCCAA.241 CATGGCAGCC TTTTCCTTAG AACACCAAAG ATTGTCTCTGGCAAAGACTA TAATGTAACT.301 GCAAACTCCA AGCTGGTCAT TATCACGGCT GGGGCACGTCAGCAAGAGGG AGAAAGCCGT.361 CTTAATTTGG TCCAGCGTAA CGTGAACATC TTTAAATTCATCATTCCTAA TGTTGTAAAA.421 TACAGCCCGA ACTGCAAGTT GCTTATTGTT TCAAATCCAGTGGATATCTT GACCTACGTG.481 GCTTGGAAGA TAAGTGGTTT TCCCAAAAAC CGTGTTATTGGAAGCGGTTG CAATCTGGAT.541 TCAGCCCGAT TCCGTTACCT AATGGGGGAA AGGCTGGGAGTTCACCCATT AAGCTGTCAT.601 GGGTGGGTCC TTGGGGAACA TGGAGATTCC AGTGTGCCTGTATGGAGTGG AATGAATGTT.661 GCTGGTGTCT CTCTGAAGAC TCTGCACCCA GATTTAGGGACTGATAAAGA TAAGGAACAG.721 TGGAAAGAGG TTCACAAGCA GGTGGTTGAG AGTGCTTATGAGGTGATCAA ACTCAAAGGC.781 TACACATCCT GGGCTATTGG ACTCTCTGTA GCAGATTTGGCAGAGAGTAT AATGAAGAAT.841 CTTAGGCGGG TGCACCCAGT TTCCACCATG ATTAAGGGTCTTTACGGAAT AAAGGATGAT.901 GTCTTCCTTA GTGTTCCTTG CATTTTGGGA CAGAATGGAATCTCAGACCT TGTGAAGGTG·961 ACTCTGACTT CTGAGGAAGA GGCCCGTTTG AAGAAGAGTGCAGATACACT TTGGGGGATC · 1021 CAAAAGGAGC TGCAATTTTA A
2.如權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，步驟2)中所述表達載體為pRSF Duet, pET 表達系列。
3.如權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，步驟2)中所述大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。
4.如權利要求3所述製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，所述BL21(DE3)菌株用於高效表達克隆於含有噬菌體T7啟動子的表達載體的基因。
5.如權利要求4所述製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，λ噬菌體DE3區含有Τ7噬菌體RNA聚合酶，該區整合於BL21的染色體上形成所述BL21 (DE3)。
6.如權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法，其特徵在於，步驟4)中所述破菌方法為高壓破碎、超聲或者溶菌酶酶解。
7.—種如權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法在校準品、標準物質和參考品製備中的應用。
8.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述製備乳酸脫氫酶的純品添加入人源或動物源的血清，配製成指定濃度的標準品或校準品。
9.一種利用權利要求1所述製備乳酸脫氫酶的方法製成的產物作為免疫用的抗原物質,來篩選相關抗體。
全文摘要
本發明公開了一種製備乳酸脫氫酶的方法及應用，該方法包括改造全基因合成人源化乳酸脫氫酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；將改造後的乳酸脫氫酶編碼基因序列插入表達載體中，並用大腸桿菌菌株轉化表達；將轉化表達菌株接種於LB培養基，IPTG誘導；所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；本發明製備乳酸脫氫酶操作非常簡單，製備成本低，成品產率高，純度高而且具有高生物活性，作為抗原物質可進行動物免疫，篩選相關抗體，同時為儘快建立國內臨床化學診斷急需的校準品製備平臺，研製診斷試劑標準物質和參考品奠定基礎。
文檔編號C12N15/53GK103014028SQ20121056747
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者肖飛, 黃薇 申請人:肖飛