一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒的製作方法
2024-02-03 18:58:15 1
一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒,屬於病毒檢測領域。本發明通過設計的可檢測豬瘟病毒的通用引物，並將PT-PCR技術與核酸膠體金免疫層析技術相結合，建立的適用於豬瘟病毒的快速檢測試劑盒。本發明設計和優化了一種檢測豬瘟病毒的通用引物，並與核酸膠體金層析試紙條技術聯用在短時間內即可完成不同種錦紫蘇類病毒的PCR產物的檢測，不需要電泳和溴化乙錠的染色，更為快速實用，簡單，靈敏，且安全無汙染。
【專利說明】一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於病毒檢測領域，具體涉及一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]豬痕病毒是ssRNA病毒,黃病毒科痕病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38~44nm,核衣殼是立體對稱二十面體,氯化銫中浮密度1.15~1.17g/ml,有包膜。豬瘟病毒在細胞質內複製，不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關抗原。該病毒對乙醚敏感，對溫度、紫外線、化學消毒劑等抵抗力較強。
[0003]利用RT-PCR檢測類病毒是一種非常靈敏的方法。通常RT-PCR靈敏度比cRNA探針的斑點雜交靈敏度高10-100倍(Nakahara et al, 1999)。RT-PCR對模板的純度要求高，如果檢測樣品中存在擴增抑制物的話，將很難擴增出目的條帶，尤其是果樹類的材料，含有大量的多酚類和糖類等。糖類一般可以用乙二醇單甲醚來去除。PVP能有效束縛酚類化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去從組織中製備的RNA中的阻遏物(Koonjul etal, 1999)。但是PCR產物的檢測常規方法是採用瓊脂糖凝膠電泳進行，電泳後需要進行溴化乙錠染色後在紫外光下觀察，溴化乙錠對人具有中等毒性和致癌性，易造成環境汙染，這也嚴重限制了此方法的推廣。
【發明內容】
[0004]本發明的目的正是針對上述現有技術所存在的問題而專門研製的一種豬瘟病毒的快速檢測試劑盒，快速，靈敏，準確檢測出帶有錦紫蘇類病毒的植株。
[0005]本發明的試劑盒主要由以下幾種試劑和層析試紙條組成:
試劑A:病毒RNA提取液，由常規現有技術的RNA提取液構成；
試劑 B:包括 10XOne step RNA PCR buffer, MgCl2, DNTP Mixture, RNase Inhibitor,AMV-Optimized Taq, AMV RTase,正向引物,反向引物，所述正向引物,反向引物分別標記了地高辛、螢光素，所述正向引物(F-primer)序列為5』 -ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3』，
反向引物(R-primer)序列為 5』 -CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC-3』 ；
試紙條:由玻璃纖維膜、NC膜、吸水紙和雙面膠塑料板組成，硝酸纖維素膜(NC膜)粘貼在雙面膠塑料板上，玻璃纖維膜和吸水紙分別粘貼在NC膜的兩側並且與NC膜有部分重疊；NC膜上有T點(檢測點)和C點(質控點)，T點位於靠近玻璃纖維膜的一側，玻璃纖維膜上固定有膠體金標記的兔抗地高辛抗體，T點固定的是鼠抗螢光素抗體，C點固定的是羊抗兔多克隆抗體。
[0006]本劑盒中試紙條中所述的膠體金標記的兔抗地高辛抗體的溶液配製方法為:
(1)取純化好的兔抗地高辛多克隆抗體300μ g，在磁力攪拌下緩慢加入膠體金溶液18mL,室溫攪拌30 min ；
(2)加入10%牛血清白蛋白ImL，室溫攪拌5 min ；
(3)加入10%聚乙二醇0.4 mL,室溫攪拌5 min ；(4)12,000 r/min,離心30 min,去上清,加入2 mL保存液(取四硼酸鈉0.1 g, BSA 0.25g，溶於250 mL蒸懼水)懸浮沉澱；
(5)加入8 mL 稀釋液(取 Na2HP04 ?12Η20 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEGI g, 10% BSA 50 mL，溶於1000 mL蒸餾水)，取小量進行檢定，其餘置4°C保存。
[0007]上述步驟(1)中的膠體金溶液的製備法如下:
a.取1%氯金酸0.6 mL,加30 mL超純水加熱煮沸；
b.加37°C預熱的1%檸檬酸鈉溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由藍逐漸變為紫紅色，煮沸3-5 min,補水至總體積31.5 mL ；
c.冷卻後，用0.2mol/LK2C03調pH至8.0-9.0，用0.45 μ m濾膜過濾，4°C保存。
[0008]本試劑盒中試紙條玻璃纖維素膜上固定有膠體金標記的兔抗地高辛多克隆抗體，T點上噴有鼠抗螢光素單克隆抗體；c點上噴有羊抗兔多克隆抗體。
[0009]本發明的優點是:設計和優化了一種檢測豬瘟病毒的通用引物，並與核酸膠體金層析試紙條技術聯用，設計成試劑盒，在短時間內即可完成不同種錦紫蘇類病毒的PCR產物的檢測，不需要電泳和溴化乙錠的染色，更為快速實用，簡單，靈敏，且安全無汙染。 [0010]
【具體實施方式】
[0011]1.樣品RNA的提取:
將患病仔豬組織病料充分研磨製成懸浮溶液，反覆凍溶3次，離心取上清，加入試劑A，抽提RNA作為模板進行RT-PCR擴增待檢測液。
[0012]2.RT-PCR:
取一定量待檢測液，加入試劑B，反應條件為50°C 15 min ；94°C 2 min使RTase失活；94°C預變性 2min ;然後以 94°C 30s,56°C 30 s、72°C I min 進行 35 個循環；72°C延伸 lOmin。反應結束，取5微升PCR產物待用。正向引物，反向引物分別標記了地高辛、螢光素。
[0013]3.PCR產物的膠體金核酸免疫層析檢測:
在試紙條抗體固相硝酸纖維素層析膜(NC膜)上靠近玻璃纖維素膜的一端點上I μ L的小鼠抗螢光素單克隆抗體作為檢測點(Τ點)，並固定。在NC膜上靠近吸水紙一端點上Iμ L羊抗兔多克隆抗體作為質控點(C點)，並固定。
[0014]在離心管中加入200 μ L PBS緩衝液，然後加入5 μ L的標記地高辛和螢光素引物的PCR產物。插入試紙條,15 min內觀察顯色結果。
[0015]T點顯色:檢測時，將PCR產物鏈上標記的地高辛能夠和兔抗地高辛多克隆抗體結合，形成膠體金-兔抗地高辛抗體-PCR產物複合物；而PCR產物鏈上標記螢光素可以和T點上小鼠抗螢光素單克隆抗體結合，則層析時該複合物可以被T點所捕獲，形成膠體金-兔抗地高辛抗體-PCR產物-小鼠抗螢光素單克隆抗體的結構而使T點顯色。
[0016]C點顯色:試紙條的C點上噴上羊抗兔多克隆抗體，則能形成膠體金-兔抗地高辛抗體-羊抗兔多克隆抗體或膠體金-兔抗地高辛多克隆抗體-(PCR產物)-羊抗兔多克隆抗體的複合物。檢測帶毒材料時，形成的膠體金-兔抗地高辛多克隆抗體-PCR產物先被T點上螢光素抗體所捕獲，多餘的複合物或沒有完全被T點捕獲的，則被隨後的C點所捕獲形成膠體金-兔抗地高辛多克隆抗體-(PCR產物)-羊抗兔多克隆抗體的複合物使C點顯色。而檢測健康的材料或緩衝液時，C點所捕獲的只是膠體金-兔抗地高辛多克隆抗體，形成膠體金-兔抗地高辛多克隆抗體-羊抗兔多克隆抗體而顯色。
[0017]因此，如果C、T點都顯色，結果為陽性；陰性和空白對照應僅C點顯色，T點不顯色，結果為陰性和空白對照。C，T點都不顯色，則試劑條失效，結果不能判定。
【權利要求】
1.一種豬瘟病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於，主要由以下幾種試劑和層析試紙條組成: 試劑A:病毒RNA提取液，由常規現有技術的RNA提取液構成；
試劑 B:包括 10XOne step RNA PCR buffer, MgCl2, DNTP Mixture, RNase Inhibitor,AMV-Optimized Taq, AMV RTase,正向引物,反向引物，所述正向引物,反向引物分別標記了地高辛、螢光素，所述正向引物(F-primer )序列為5 』 -ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3 』， 反向引物(R-primer)序列為 5』 -CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC-3』 ； 試紙條:由玻璃纖維膜、NC膜、吸水紙和雙面膠塑料板組成，硝酸纖維素膜(NC膜)粘貼在雙面膠塑料板上，玻璃纖維膜和吸水紙分別粘貼在NC膜的兩側並且與NC膜有部分重疊；NC膜上有T點(檢測點)和C點(質控點)，T點位於靠近玻璃纖維膜的一側，玻璃纖維膜上固定有膠體金標記的兔抗地高辛抗體，T點固定的是鼠抗螢光素抗體，C點固定的是羊抗兔多克隆抗體。
2.如權利要求1所述的豬瘟病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於:所述的膠體金標記的兔抗地高辛抗體的溶液配製方法為: (1)取純化好的兔抗地高辛多克隆抗體300μ g，在磁力攪拌下緩慢加入膠體金溶液18mL,室溫攪拌30 min ； (2)加入10%牛血清白蛋白ImL，室溫攪拌5 min ； (3)加入10%聚乙二 醇0.4 mL，室溫攪拌5 min ； (4)12,000 r/min,離心30 min,去上清,加入2 mL保存液(取四硼酸鈉0.1 g, BSA 0.25g，溶於250 mL蒸懼水)懸浮沉澱；
(5)加入8 mL 稀釋液(取 Na2HP04 ?12Η20 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEGI g, 10% BSA 50 mL，溶於1000 mL蒸餾水)，取小量進行檢定，其餘置4°C保存。
3.如權利要求2所述的豬瘟病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於，所述膠體金溶液的製備法如下: a.取1%氯金酸0.6 mL,加30 mL超純水加熱煮沸； b.加37°C預熱的1%檸檬酸鈉溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由藍逐漸變為紫紅色，煮沸3-5 min,補水至總體積31.5 mL ； c.冷卻後，用0.2mol/LK2C03調pH至8.0-9.0，用0.45 μ m濾膜過濾，4°C保存。
【文檔編號】G01N33/577GK104034897SQ201410274790
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲雲, 藍文苑 申請人:廣西博士海意信息科技有限公司