單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法

2024-02-03 10:28:15 1

專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定單胺氧
化酶活性濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
現有技術中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有螢光法、免疫抑制法和化 學分光光度法。螢光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據是e-苯乙胺 在10 100mg時反應速度最大，高於苄胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單 胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發生反應，測定反應後形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較 多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相對而言，化學分光光度法應有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放 出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲醯基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)等發色劑進行測定，也可以應用苄胺(Benzylamine)、對苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine，又稱"3-對羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型 底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測 得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用苄胺和對苯甲 胺-e-偶氮萘酚作為底物。苄胺法的原理是苄胺在單胺氧化酶的作用下生成苄醛，然後在 強鹼性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動 生化儀分析。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔 酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發明還 將給出用以實現該方法的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，採用該試劑(盒)不僅可以在 紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定 速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產物+氨+過氧化氫
氨+2水+6高鐵細胞色素c亞硝酸還原酶亞硝酸+
6亞鐵細胞色素c 亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶
3
這種萬法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1.4.3.6) 酶(偶)聯亞硝酸還原酶(nitrite reductase ;EC 1.7.2.2)、硝酸還原酶 (nitratereductase ;EC 1. 7. 1. 1 ;EC 1. 7. 1. 2 ;EC 1. 7. 99. 4)酶促反應連續監測法。單胺 氧化酶酶解胺類化合物反應產生氨，再通過(偶)聯合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用， 最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度， 可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想
100,1/L 500,1/L 3mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L
硝酸還原酶 8000U/L
胺類化合物 3mmol/L
高鐵細胞色素C 7mmol/L 本發明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩衝液、穩定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C。 試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，
直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔酶可以
液劑
衝定酶
緩穩輔
o o o
o o o是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
亞硝酸還原酶 6000U/L
硝酸還原酶 8000U/L
胺類化合物 3mmol/L
高鐵細胞色素C 7mmol/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，加入純淨 水，復溶後使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反 應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值 4180。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例二 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 10Ommol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
胺類化合物 3mmol/L
高鐵細胞色素C 7mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L 硝酸還原酶 8000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C ，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，
理論K值2170。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例三 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
胺類化合物 3mmol/L
高鐵細胞色素C 7mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L
穩定劑 500mmol/L
硝酸還原酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 500mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間
10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與
試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間
大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應曲線應呈直 線上升；試劑可測有效(R > 0. 99)線形範圍可達500U/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏
差不超過±5% ;試劑測試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《3% ;試劑的靈敏度可
達O. 0003±0. 0002 A A/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；——本發明靈 敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應醛類產物+氨+過氧化氫氨+2水+6高鐵細胞色素c 亞硝酸還原酶 亞硝酸+ 6 亞鐵細胞色素c亞硝酸+水+輔酶 硝酸還原酶 硝酸+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括本發明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述"胺類化合物"優選以下物 質之一苄胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者 這七種物質的衍生物，但選擇範圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範圍外，試劑仍會 反應作用。其特徵在於試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、輔酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C組成；試劑2，由 緩衝液、穩定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成。輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化 合物、高鐵細胞色素C在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、輔酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C組成；試劑2，由 緩衝液、穩定劑、硝酸還原酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、亞硝酸還原酶組成。輔酶、亞 硝酸還原酶、硝酸還原酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C在試劑1、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。
6. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於還包括穩定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。6亞鐵細胞色素c緩衝液 穩定劑 輔酶亞硝酸還原酶 硝酸還原酶 胺類化合物 高鐵細胞色素C
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩衝液、輔酶、胺類化合物、高鐵細胞色素C、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793722SQ20091002823
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司