一種基於CRISPR/Cas9高通量技術篩選藥物靶點基因的方法與流程
2024-01-21 23:10:15 2
本發明屬於高通量測序技術領域，尤其是涉及一種基於CRISPR/Cas9高通量技術篩選藥物靶點基因的方法。
背景技術：
致癌基因和抑癌基因都是癌症基因治療的潛在靶點，因此其鑑定在癌症的治療中有著巨大的應用前景，目前已經針對致癌基因EGFR、Alk等基因開發出治療癌症的藥物。但是目前有效的癌症基因靶向藥物還遠遠不能滿足臨床治療的需要。基於CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9)的大規模功能基因篩選技術作為近幾年的基因工程新興技術，能夠在全基因組層面篩選癌症相關基因，從而為癌症的治療提供藥物靶點候選基因。
目前CRISPR/Cas9 screen技術只在國內外少數實驗室應用，並未推廣。CRISPR/Cas9 screen技術的關鍵是保證sgRNA的覆蓋率，因此前期的sgRAN文庫的構建的有效性，sgRAN文庫擴增的高效性以及病毒包裝的有效性成為問題的關鍵。目前在國際期刊論文中長出現sgRNA文庫質量不高或是後期sgRNA測序sgRNA文庫分布有偏態性的問題。另外傳統建庫方法費時費力，並且需要大量的PCR酶，經濟負擔也比較大。為解決以上問題，需要一種sgRNA文庫建立、擴增、病毒包裝及測序的方法，以保證大規模癌症基因靶點篩選的有效性和高效性。
技術實現要素：
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種基於CRISPR/Cas9高通量技術篩選藥物靶點基因的方法。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
一種基於CRISPR/Cas9高通量技術篩選藥物靶點基因的方法，該方法包括以下步驟：
(1)用電轉的方法建立sgRNA文庫：
將合成的sgRNA的oligo片段用PCR擴增的方法加接頭，然後用Gibson assembly的方法連接進入lentiCRISPRv2質粒，用Bio-rad電轉儀將連接產物轉化至感受態中，從而獲得sgRNA文庫；
(2)用慢病毒包裝sgRNA文庫：
無菌條件下，培養293FT細胞，並用轉染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒；
(3)sgRNA文庫在細胞中的篩選：
選取合適的病毒量，感染待檢測的癌細胞系，感染48小時後，用puromycin篩選2天，所得陽性細胞收取部分作為對照組，其他細胞繼續培養至42-46天(優選為45天)後收取；
(4)提取篩選所得細胞及篩選前細胞的基因組DNA：
用細胞裂解液裂解細胞，吹打混勻後，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜，用純化液抽提DNA片段；
(5)富集基因組DNA中的sgRNA：
用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，37℃反應過夜，將酶切後的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點瓊脂糖膠中，80V，1小時電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段。
(6)sgRNA文庫構建與測序：
文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構建，將建好文庫進行Hiseq2000的50SE進行高通量測序，結果進行生物信息分析。
在第(1)步驟用電轉的方法建立sgRNA文庫前，先進行sgRNA文庫設計，具體操作為：利用網站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設計感興趣的基因群的sgRNA，針對每種基因設計10個sgRNA。
步驟(1)中，oligo的PCR擴增條件為：
步驟(1)中，Gibson assembly的條件為：
步驟(1)中，所述的病毒包裝過程Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質粒質量按照4：3：1的比例轉染293FT細胞；以10cm的培養皿為例Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質粒質量分別為6μg，4.5μg，1.5μg，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent的量為30μL。轉染時採用懸浮轉染的方法。並於之後的48小時和72小時收取病毒液。
步驟(2)中利用感染病毒細胞對puromycin的抗性來檢測病毒感染效率，具體操作為：
在六孔板中培養細胞至融合度70％，用25μL、50μL、100μL、200μL、400μL的病毒液感染細胞，取能感染48-52％(優選為50％左右)細胞的病毒量作為合適病毒量進行後續試驗。
步驟(4)中，細胞裂解液的成分為400μMNaCl、0.2％SDS、2mMEDTA、10mMTris-HCl。
步驟(4)中，所述的純化液指體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液。
步驟(5)中，限制性內切酶反應體系為：50μL中，含有6μg DNA，5μL 10×NEB buffer，限制性內切酶EcoNⅠ3μL。
待檢測的癌細胞系包括肺癌細胞與肝癌細胞細胞系。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
本發明對細胞的篩選過程做了改進，利用被感染細胞的puromycin抗性，用簡便的方法確定了病毒感染效率，確定了病毒MOI值；限制性內切酶切方法與高通量方法的結合，而且能夠降低非特異性PCR擴增產生的假陽性，提高了建庫效率；採用懸浮轉染包裝病毒的方法大大提高了病毒滴度，轉染試劑價格昂貴，此方法節約了篩選成本。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
實施例1
對乳腺癌細T47D進行藥物基因靶點的篩選。具體方法如下：
(1)sgRNA文庫設計：
利用網站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設計感興趣的基因群的sgRNA,針對每種基因設計10個sgRNA。
(2)用電轉的方法建立sgRNA文庫
將合成的sgRNA的oligo片段用PCR擴增的方法加接頭，然後用Gibson assembly的方法連接進入lentiCRISPRv2質粒。用Bio-rad電轉儀將連接產物轉化至感受態中，從而獲得sgRNA文庫。
(3)用慢病毒包裝sgRNA文庫：
無菌條件下，培養293FT細胞，並用Roche的轉染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒。細胞轉染後15小時換液，並於之後的24小時和48小時收取病毒液；
(4)T47D細胞中篩選sgRNA文庫
選取合適的病毒量，感染T47D，48小時後，用puromycin篩選2天,所得陽性細胞收取部分作為對照組，其他細胞繼續培養至40天後收取。
(5)提取篩選所得細胞及篩選前細胞的基因組DNA
用細胞裂解液A裂解細胞，吹打混勻後，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；
(6)富集基因組DNA中的sgRNA
用細胞裂解液A裂解細胞，吹打混勻後，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；
用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，37℃反應過夜，將酶切後的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點瓊脂糖膠中，80V，1小時電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段；
(7)sgRNA文庫構建與測序：
文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構建，將建好文庫進行Hiseq2000的50SE進行高通量測序，結果進行生物信息分析。
實施例2
應用於前列腺癌細胞系LNcap的CRISPR/Cas9應用於大規模篩選癌症基因靶點的CRISPR/Cas9篩選方法，包括以下步驟：
(1)sgRNA文庫建立：
利用網站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設計與全基因組的sgRNA。sgRNA的載體採用Lenti CRISPRv2。
(2)用慢病毒包裝sgRNA文庫：
無菌條件下，培養293FT細胞，並用Roche的轉染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒。按照4：3：1的比例轉染293FT細胞，以10cm的培養皿為例Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質粒質量分別為6μg,4.5μg,1.5μg,X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent的量為30μL。細胞轉染後15小時換液，並於之後的24小時和48小時收取病毒液；
(3)sgRNA文庫在細胞中篩選：
選取合適的病毒量，感染待檢測的癌細胞系，感染48小時後，用puromycin篩選2天,所得陽性細胞收取部分作為對照組，其他細胞繼續培養至45天左右後收取。為確定病毒量，要確定病毒的感染效率。發明利用感染病毒細胞對puromycin的抗性進行檢測。在六孔板中培養細胞至融合度70％，用50μL、100μL、200μL、400μL、500μL的病毒液感染細胞，取能感染50％左右細胞的病毒量作為合適病毒量進行後續試驗；
(4)提取篩選所得細胞及篩選前細胞的基因組DNA：
用細胞裂解液A裂解細胞，吹打混勻後，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；細胞裂解液A的成分為400μMNaCl2,0.2％SDS,2mMEDTA,10mMTris-HCl。
(5)富集基因組DNA中的sgRNA
用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，37℃反應過夜，將酶切後的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點瓊脂糖膠中，80V，1小時電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段；限制性內切酶反應體系為50μL中：6μg DNA,5μL 10×NEB buffer,限制性內切酶EcoNⅠ3μL。
(6)sgRNA文庫構建與測序：
文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構建，將建好文庫進行Hiseq2000的50SE進行高通量測序，結果進行生物信息分析。
上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。