農作物抗病蛋白質的檢出法的製作方法

2023-08-07 08:04:51

專利名稱：農作物抗病蛋白質的檢出法的製作方法
據國際有關部門統計，因病害全世界每年損失的農作物為總量的10%[1]，即每年約損失500億美元。這個巨大的損失還是在化費了巨大的人力、物力的防治基礎上。病害不僅使農作物減產，還常使農產品質量下降且防礙了國際上農產品的貿易及帶來檢疫上的麻煩。目前，防治農作物病害的最好方法之一就是利用基因工程技術培育出有良好性狀的抗病新品種。要實現這基因工程的前提之一就是檢出、分離抗病基因。如過果檢出了抗病蛋白質就可以用常規方法從蛋白質中檢出相應的抗病基因。不僅如此，抗病蛋白質的檢出還將大大促進抗病分子生物學和抗病機理研究的發展。
雖經人們多年來多方的努力，農作物抗病蛋白質或抗病基因至今尚未檢出成功。這個原因有方法學上的問題也有對抗病基因及抗病蛋白質的看法不正確。現就方法學上的問題加以述評。綜合起來，人們提出的或應用於檢出抗病基因或抗病蛋白質的方法大致有以下數種(a)克隆戰略。即把抗病品種的基因全部克隆，然後分批逐次轉化感病品種，根據轉化後代的表型求出抗病基因在哪一批中。已知半倍體植物的平均基因組約5×106Kb，按50Kb每克隆就得要106克隆才能得好的復蓋率。這麼多的克隆，加上實際操作的問題，至今無成功的例子。(b)染色體步行法(Chromosome Walking)。由於農作物基因組內有眾多的重複順序DNA，走步又得雙向進行;加上對抗病基因與附近的已知基因的認識了解太少，使得本法在實際上是行不通的。(c)可動元件標籤法。應用此法已從細菌和昆蟲中分離出未知基因。但對農作物內源可動元件和可動元件的形式、功能了解不多，加上測試手段的麻煩，至今未見成功的報導。人們對玉米的可動元件情況了解較多，即便為此Bennetzen[2]等人對RP1基因的檢出研究就遇到了不少困難未獲成功。(C)差比法。即比較感、抗兩品種或誘導前後蛋白質的差異來尋找抗病蛋白質。農作物受誘導後有許多保衛基因的表達及與保衛基因有關連的基因也得到表達，這個方法易把別的蛋白質誤認為抗病蛋白質。又如果比較感、抗兩品種的蛋白質差別來尋找抗病蛋白質，按目前常規方法也是難以成功的。由於抗病蛋白質與感病蛋白質的高度相菩袁即使應用等基因系的感、抗兩品種為材料也難以成功。Gabriel和Ellingboe[2]的工作就是一個例子。(e)雷射法。此法是染色體工程加上雷射技術的方法，在建立抗病附加系或置換系的基礎上利用雷射逐步破壞載有抗病基因的染色體，再從表型求得抗病基因。此法構思合理但費時費事，也未有成功的報導。
本發明提供了一個簡便、可行的檢出農作物抗病蛋白質的方法。從蛋白質信息到基因的檢出已有常規方法可循。利用抗病或感病品種的蛋白質提取物或部分純化的蛋白質提取物與各不同的原生理小種(生理型或菌株)之間的特異相互作用檢出抗病蛋白質。
本發明提供了一個簡易的純化抗病蛋白質的步驟。由於抗病蛋白質或識別蛋白質是處在細胞的膜壁上，膜壁組分一般均含有脂質，可利用正辛醇的親脂性把膜壁的碎片從上清液中富集在正辛醇層內，達到濃縮的目的。我們把上清液的蛋白質收集起來，並證明它不再含有抗病蛋白質。經此一步純化後可使抗病蛋白質或感病蛋白質得到高度濃縮;這樣，抗病蛋白質的檢出成為簡易可行。
本發明的內容在以下的實施例具體敘述。
實施例1.
棉枯萎病抗病蛋白質的檢出法。取50克棉花葉子加入150ml 0.5M Tris-Hcl，PH7.8的緩衝液(含1%Polyvinyl pyrolidone聚乙烯吡咯烷酮，1mM Phenyl Methyl sulfonyl fluoride苯甲基磺醯氟)及2ml正辛醇。在搗碎機內勻漿。此勻漿在4℃下25000g離心30分鐘。收集浮在離心液上的脂狀物。棄去上清液及殘渣，經分析此上清液中的蛋白質已不含有抗病蛋白質。在此脂狀物中加入約5ml 0.05M Tris-Hcl PH7.8-1mM苯甲基磺醯氟，放在0℃下30分鐘，時時振蕩，抽提脂狀物中的可溶物。再次離心收集上清液，此上清液中含有抗病蛋白質(從抗病品種)或感病蛋白質(從感病品種)。應用等電聚焦方法可純化此抗病蛋白質及感病蛋白質。此抗病蛋白質R在7μg/ml時即能抑制不親和病原菌孢子的萌發但不抑制親和病原菌孢子的萌發。感病蛋白質S即使在40μg/ml的濃度下也不抑制孢子的萌發。蛋白質R還有殺傷Hela細胞的能力，其活性與蓖麻毒蛋白(ricin)基本均等。
檢出抗病蛋白質的關鍵在於把部分純化的製劑與孢子混合後，此蛋白質R能與不親和的孢子相結合而在繼後的等電聚焦電泳圖譜上消失。但蛋白質S與親和的孢子不相結合而仍出現在等電聚焦電泳圖譜上。
3072棉種為52-128(抗)DNA+江蘇1號(感)的選擇後的穩定後代，我們也從3072中檢出蛋白質R。
實施例2.
我們選用五個水稻品種(IR26，TN1，NG15，IR1545及DV85)和九個白葉枯病病原菌(Xanthomonas Campestris PV.Oxyzae)為試驗材料，經反覆交叉測試證明(1)在不親和關係時(即寄主呈抗性，病原菌無毒)，各水稻中有一個蛋白質(多肽)能與菌體相結合而在親和關係時(寄主感病，病原菌有毒)無此特異吸附作用。(2)NG15為一成株期抗性品種，即在成株期呈抗病而在幼苗期(或10葉期以下)呈感病。而我們的實驗表明NG15中的此特異性蛋白質僅在成株期表達出來，在幼苗期不表達。(3)經典遺傳學證明DV85含有二個抗病基因。而我們的體外檢測也證明有二個特疫抗病蛋白質。由於體外檢測(1)與抗病表型完全一致(無一例外)。(2)與不同生理髮育時期的抗性表型一致。(3)與經典遺傳學數據一致;因此我們認為由此法檢出的抗病蛋白質是抗病基因的產物。
實施例3應用與實施例1及2的相同方法正辛醇純化法及樣品製劑與病原菌(或孢子)相作用的方法]檢測出小麥赤黴病(ear scab of wheat)的抗病蛋白質和感病蛋白質。抗病品種的製劑能抑制病原菌的生長而感病品種的無此抑制現象。我們所採用的抗病小麥品種為蘇麥3號及望水白，感病品種為寧麥6號。所用的菌株為F15(大豐)及F22(無錫)。
實施例4.
又應用上述方法，檢測出棉花黃萎病(Verticillum-wilt in cotton)的抗病蛋白質。結果與實施例3相同。
實施例1、2是不親和結合(Incompatible combination)模式，即宿主的抗病蛋白質(抗病基因產物)與無毒的病原菌相結合生成不親和反應;反之生成親和反應(即宿主感病、病原菌有毒)。實施例之3、4是屬於親和結合(compatible combination)模式，即宿主的感病蛋白質與有毒的病原菌相結合生成親和反應;反之生成親和反應(即宿主抗病、病原菌無毒)。因此，我們的抗病方法對農作物兩個抗病模式均為適用。
參考文獻[1]James e.Seed.Sci Technol.(1981)G679-685.Bennetzen，J.L.etal.Nature(1988)332369-370)。Gabriel，D.W. Ellingboe，A.H.Physiol Plant Pathology(1982)20349-357.倪萬潮等小麥黴病品種特異性抗病蛋白質的初步鑑定。
中國農業科學(1990)，23第3期(出版中)。
權利要求
1.一種農作物抗病品種的檢出方法，其特徵在於用抗病或感病器種的蛋白質提取物或部分純化的蛋白質提取物製劑與各不同的病原生理小種(生理性或菌株)之間的特異性相互作用，檢出抗病蛋白質。
2.權利要求1中的抗病或感病蛋白質提取物或部分純化的蛋白質提取物製劑，其特徵在於用正辛醇的純化步驟，使抗病或感病品種的蛋白質富集於正辛醇，達到檢出方法簡便可行。
全文摘要
本發明是一種農作物抗病蛋白質的檢出方法。用簡便有效的步驟使抗病蛋白質富集於製劑中，並將製劑與各不同的病原生理小種(生理型或菌株)產生特異性的相互作用，檢出抗病蛋白質，用常規的方法可從抗病蛋白質檢出相應的抗病基因。本發明可大大促進抗病新品種的培育和分子生物學的研究。
文檔編號G01N33/50GK1054313SQ9010097
公開日1991年9月4日 申請日期1990年2月23日 優先權日1990年2月23日
發明者曾以申 申請人:中國科學院上海生物化學研究所