酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的簡便化工業技術的製作方法

2024-01-28 12:34:15

專利名稱：酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的簡便化工業技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及原核表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的簡便化方法。
背景技術：
成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，簡稱FGF)是一個蛋白質家族，現已發現了 9個成員。它們共同的特點是與肝素結合，因此也將其稱之為肝素結合的生長因子。酸性成纖維細胞生長因子(aFGF，亦稱為AFGF)是這一家族中的重要成員，它是一類對來源於中胚層和神經外胚層的多種細胞具有營養和促分裂分化作用的多肽，最初由 Thomas於1984年從牛腦中分離純化得到。1986年，Michael Jaye首次從人腦中克隆了人酸性成纖維細胞生長因子(haFGF)基因，並測定了核苷酸序列，由此aFGF的研究進入了 DNA 重組階段。研究表明，haFGF有著廣泛的生物學活性，在損傷修復、血管形成及神經滋養等方面發揮著重要作用。由於這些生物學功能，aFGF可望被開發成有廣泛臨床應用價值的多肽性藥物。由於haFGF是人體內源性的微量活性物質，難於在體液或組織中提取，因而得率不高，經濟意義也大為降低。

發明內容
本發明的目的在於採用重組DNA技術構建重組haFGF基因的工程菌，實現人來源的成纖維細胞生長因子-1在原核細胞中的大量表達，並通過簡化的純化步驟，獲得純度較高的目的蛋白。用這種生物工程方法生產haFGF，易行成規模生產能力，產量大而且成本低。本發明通過體外PCR擴增的方法，從人來源的hepG2的eDNA中擴增得到aFGF基因，並通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET_26b連接。隨後將質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得高效可溶表達，獲得天然結構的酸性成纖維細胞生長因子蛋白。


圖1是AFGF誘導表達每小時取樣SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker ； 1為誘導前取樣；2為誘導後取樣)。圖2是AFGF超聲細胞破碎SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker，1為上清，2為沉澱)。圖3是SDS-PAGE電泳檢測AFGF經Q sepharose純化各個步驟流出液結果圖(M 為marker ；FT為流穿液；W為buffer A洗脫，1 25為0 IM NaCl梯度洗脫各部分收集液)。圖4是SDS-PAGE電泳檢測AFGF經sp sepharose純化各個步驟流出液結果圖(M 為marker ；FT為流穿液；W為bufferA洗脫，1 7為0 IM NaCl梯度洗脫各部分收集液)。
圖 5 是 AFGF 經 superdex 75 純化峰圖。圖6是AFGF的SDS-PAGE分析純化純度結果圖，SDS-PAGE驗證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度>95%。
具體實施例方式1、酸性成纖維細胞生長因子的原核表達編碼人來源的aFGF基因通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET_26b 連接。隨後將質粒轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)。挑取單克隆並接入含有IOmL LB和終濃度為100 μ g/ml卡那黴素的培養基中，搖床37°C，250rpm培養約16小時。將上述菌液按1 100的比例接入含有IOOOmL LB和終濃度為IOOu g/ml卡那黴素的培養基中，搖床37°C，250rpm培養至0D600約為0. 8，將菌液置於冰上冷卻。加入 IPTG至終濃度為0. 8mM, 30°C條件下誘導4小時之後收菌，離心，5000rpm, 20min,棄上清，菌體_80°C保存。aFGF誘導表達結果SDS-PAGE電泳分析結果見附圖1 (M為marker ；1為誘導前取樣；2為誘導4h後取樣)。結論aFGF理論分子量為17. 4kDa，圖中條帶符合目的條帶大小。且從取樣中看出，誘導4小時後AFGF獲得大量表達2、細胞破碎收集的菌體置於冰上融化，並按1 10(m/v)比例懸浮於Lysis buffer(50mM TrispH8. 0,5mM EDTA, ImM PMSF, ImM DTT)中。細胞經超聲破碎儀裂解(450w，破碎 9. 9s，停 9. 9s，共6min)。離心13000rpm，20min以除去細胞碎片等雜質。收集上清和沉澱，SDS-PAGE 電泳檢測蛋白的可溶性(電泳結果顯示該蛋白為可溶蛋白)。AFGF超聲細胞破碎SDS-PAGE電泳分析結果見附圖2結論電泳圖中顯示，aFGF為可溶蛋白。3、離子交換層析純化目的蛋白將上述收集的蛋白用lysis buffer等體積稀釋一倍。取5mLQ s印harose，經Lysis buffer平衡後，將上述收集的上清液緩慢上柱，約0. 5mL/min,收集flow through。經相同 buffer洗滌後，用0 IM NaCl洗脫。每管收集2ml，SDS-PAGE檢測。收集純度較高的蛋白。取5mL sp s印harose，用lysis buffer平衡後，將上一步收集的蛋白緩慢上柱， 收集flowthrough。經相同buffer洗滌後，用0 IM NaCl洗脫。每管收集2ml，SDS-PAGE 檢測。收集純度較高的蛋白用於下一步實驗。aFGF經q s印harose和sp s印harose純化後的SDS-PAGE電泳分析結果見附圖 3,4.結論經過Q wpharose純化，蛋白大部分存在於流穿液中，雜蛋白結合到樹脂上，從而得到了部分純化。再經過sp s印harose的純化，蛋白結合到樹脂上，部分雜蛋白存在於流穿液中，蛋白得到進一步純化。經過兩輪離子交換層析的純化，獲得較純的目的蛋白，但純度還須進一步提高。4、凝膠過濾層析進一步純化目的蛋白
將上述收集的蛋白濃縮至約5mL，上superdex 7510/300進一步純化。上柱前先用 S75gelfiltration column buffer (PBS pH7. 4,5mM EDTA)平衡柱子，上樣後用相同的緩衝液淋洗蛋白，組分收集器收集洗脫液ImL/管。洗脫後的蛋白經SDS-PAGE電泳驗證後，濃縮至濃度為lmg/mL，_80°C冰箱保存。最終獲得的aFGF蛋白量為4. 5mg。AFGF經superdex 75純化峰圖見附圖5及SDS-PAGE分析純化純度結果見附圖6，結論經superdex 75進一步純化，SDS-page驗證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度> 95%。
權利要求
1.一種通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的簡便化方法，其特徵在於該方法通過如下步驟通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)酸性成纖維細胞生長因子的原核表達，細胞破碎，離子交換層析純化目的蛋白，離子交換層析純化目的蛋白
2.如權利要求1所述的通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子 (aFGF)的簡便化方法，特徵在於所述人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)是從大腸桿菌高效表達的上清液中進行製備純化的。
3.如權利要求1所述的通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子 (aFGF)的簡便化方法，特徵在於所述人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的表達溫度為37°C
4.如權利要求1所述的通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子 (aFGF)的簡便化方法，特徵在於所述人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的純化溫度為室溫或4°C。
5.如權利要求1所述的通過原核細胞表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子 (aFGF)的簡便化方法，特徵在於所述人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)液氮冷激後於-80°C保存。
全文摘要
本發明涉及原核表達並純化人來源的酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的簡便化方法。本發明的目的在於採用重組DNA技術構建重組haFGF基因的工程菌，實現人來源的成纖維細胞生長因子-1在原核細胞中的大量表達，並通過簡化的純化步驟，獲得純度較高的目的蛋白。用這種生物工程方法生產haFGF，易行成規模生產能力，產量大而且成本低。
文檔編號C07K1/16GK102344930SQ20111027439
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者吳咪佳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅 申請人:江蘇普羅賽生物技術有限公司