一種真核表達時酶切回收的方法
2024-02-01 01:47:15
一種真核表達時酶切回收的方法
【專利摘要】本發明公開了一種真核表達時酶切回收pcDNA3.1(-)的方法。具體步驟為：首先與目的基因連接並鑑定陽性,重溫質粒,應用EcoRI和BamHI對pcDNA3.1(-)進行雙酶切反應,反應體系為50μl:質粒20μl,EcoRI、BamH各I1μl,10×kBuffer5μl加水至50μl。本發明的有益效果是，基因測序能夠證實RT-PCR產物包含VEGF-CcDNA全長。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全長序列。結論:成功構建了人類VEGF-C真核表達載體並檢測到載體在真核細胞中的表達。
【專利說明】—種真核表達時酶切回收的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生化的實驗方法，具體來說，一種真核表達時酶切回收PCDNA3.1 (-)的方法。
【背景技術】
[0002]]血管內皮生長因子C(VEGF-C)屬VEGF/PDGF家族成員，其受體為VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通過VEGFR -2調節血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表達則局限於淋巴管內皮，VEGF -C為VEGFR-2的結合，產生生物學效應的所需濃度遠高於VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特異性調節因子，用VEGF -C轉基因鼠實驗證實，VEGF -C的高表達可以選擇性地引起淋巴管增生，經研究，VEGF -C表達與腫瘤淋巴管增生和轉移的關係是VEGF -C高表達可促進腫瘤的淋巴轉移，其機理是VEGF -C促進了腫瘤周圍及間質的淋巴管生長以及腫瘤組織中淋巴管增生。為進一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其機制，我們構建了攜帶人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表達載體，研究了它在真核細胞內的表達，為探討VEGF -C與淋巴管增生的關係，VEGF -C基因用於治療淋巴水腫和某些癌腫的可行性提供實驗依據。
【發明內容】
[0003]為克服上述技術問題，我們提出了以下技術方案:
一種真核表達時酶切回收pc DNA3.1 (-)的方法，與目的基因連接並鑑定陽性，重溫質粒，應用EcoR I和BamH I對pc DNA3.1 (-)進行雙酶切反應，反應體系為50 μ 1:質粒 20 μ 1，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I。37°C 水浴酶切反應2.5 μ I, 65°C水浴滅活30min，取10 μ I反應產物行瓊脂糖凝膠電泳鑑定；連接體系為10 μ 1，目的DNA片段I μ 1，pcDNA 3.1㈠雙酶切回收片段I μ 1，T4連接酶I μ 1，10XBuffer I μ I,加dH20至10 μ I。反應條件:16 °C過夜，將連接後的pcDNA3.1㈠轉化至DH5 α感受態細胞200 μ I中鋪於LA平板，37°C孵育16h ;隨機挑取LA平板上幾個單菌落，分別接種於5ml LA培養液，37°C 180r/min震蕩培養過夜，按質粒提取說明提取質粒，加入EcoR I和BamH I行雙酶切反應。酶切體系:質粒20 μ 1，EcoR 1.BamH
I各 I μ 1，IOXk Buffer 5 μ 1，加 dH20 至 50 μ 1，37°C水浴酶切反應 2.5h, 65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應產物進行1%瓊脂糖凝膠反應，篩選陽性重組質粒。
[0004]本發明的有益效果是，基因測序能夠證實RT -PCR產物包含VEGF -C cDNA全長。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF -C cDNA全長序列，Western -blotting檢測到細胞培養上清中以及細胞內有VEGF -C蛋白存在。結論:成功構建了人類VEGF -C真核表達載體並檢測到載體在真核細胞中的表達。
【具體實施方式】
[0005]具體步驟為:首先與目的基因連接並鑑定陽性，重溫質粒，應用EcoR I和BamHI對pc DNA3.1(-)進行雙酶切反應，反應體系為50 μ 1:質粒20 μ I，EcoR I ,BamH各I 1μ I, IOXk Buffer 5μ I加水至50 μ I。37°C水浴酶切反應5 μ 1，65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應產物行瓊脂糖凝膠電泳鑑定；連接體系為10 μ I，目的DNA片段I μ I, pcDNA 3.1 (-)雙酶切回收片段 I μ I，Τ4 連接酶 I μ I，10 XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I。反應條件:16 °C過夜，將連接後的pcDNA3.1 (-)轉化至DH5 α感受態細胞200 μ I中鋪於LA平板，37°C孵育16h;隨機挑取LA平板上幾個單菌落，分別接種於5ml LA培養液，37°C 180r/min震蕩培養過夜，按質粒提取說明提取質粒，加入EcoRI和BamH I行雙酶切反應。酶切體系:質粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各Ιμ?，IOXkBuffer 5μ I,加dH20至50μ1，37 °C水浴酶切反應2.5h，65°C水浴滅活30min，取10μ1反應產物進行1%瓊脂糖凝膠反應，篩選陽性重組質粒。本發明的有益效果是，基因測序能夠證實RT -PCR產物包含VEGF -C cDNA全長。
[0006]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種真核表達時酶切回收的方法，其特徵在於，與目的基因連接並鑑定陽性，重溫質粒，應用EcoR I和BamH I對pc DNA3.1 (-)進行雙酶切反應，反應體系為50 μ 1:質粒 20 μ I，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I ;37°C 水浴酶切反應2.5 μ 1，65°C水浴滅活30min，取10 μ I反應產物行瓊脂糖凝膠電泳鑑定；連接體系為10 μ I,目的DNA片段Ιμ?，pcDNA 3.1 (-)雙酶切回收片段I μ I，Τ4連接酶I μ I，10XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I ;反應條件:16 °C過夜，將連接後的pcDNA3.1 (-)轉化至DH5 α感受態細胞200 μ I中鋪於LA平板，37°C孵育16h ;隨機挑取LA平板上幾個單菌落，分別接種於5ml LA培養液，37°C 180r/min震蕩培養過夜，按質粒提取說明提取質粒，加入EcoR I和BamH I行雙酶切反應；酶切體系:質粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各1μ I , IOXk Buffer 5 μ I,加 dH20 至 50μ1, 37 °C水浴酶切反應 2.5h，65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應產物進行1%瓊脂糖凝膠反應，篩選陽性重組質粒。
【文檔編號】C12N15/10GK103602660SQ201310519305
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】王景文 申請人:王景文