一種修飾的山羊防禦素基因及製備方法和應用的製作方法
2024-01-19 12:46:15 4
專利名稱：一種修飾的山羊防禦素基因及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種修飾的山羊防禦素基因，還涉及一種修飾的山羊防禦素，還涉及一種修飾的山羊防禦素的製備方法，還涉及一種修飾的山羊防禦素在抑制細菌生長上的應用。
背景技術：
防禦素是廣泛存在於動物、植物和昆蟲等生物體中的小肽，目前已經分離鑑定的生物防禦素已經超過100種。防禦素是一類小的陽離子抗菌肽，大約由21 45個胺基酸殘基組成，分子量為3 6kD。大多數防禦素分子內含有6 8個保守的半胱氨酸殘基，形成三對或四對分子內二硫鍵，並通過分子內二硫鍵形成一個β_摺疊片狀結構。富含精氨酸，分子在中性溶液中帶正電荷，具有高效、廣譜抗菌活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌(念珠菌屬、隱球菌屬、麴黴)、被膜病毒(愛滋病病毒)等具有一定的殺滅效果，並且不會使微生物產生耐藥性，對正常動物的細胞表現出非特異性的細胞毒害作用。山羊生殖道系統疾病對山羊生產具有較大的危害，目前普遍採用抗生素進行治療。由於大量使用抗生素，在山羊機體內可能產生耐藥菌株而使治療失敗；同時，大量抗生素還可能對羊肉、羊奶等羊產品造成汙染而影響食品安全。防禦素是小分子肽類，具有廣譜抗菌活性，由於其特殊的抗菌機制，機體對其不產生耐藥性，可以解決細菌耐藥性問題，是新一代抗菌素。天然防禦素在動植物體中含量很少，提取分離的成本費用也很高，這就制約了防禦素工業化生產和在畜禽疾病中的應用，因此通過基因工程的方法大量生產防禦素，獲得足夠的、有活性的防禦素成了研究熱點。目前許多實驗通過基因工程的方法，成功地將防禦素基因導入到各種生物體中並得到良好表達，比如人類防禦素、豬防禦素、牛防禦素等都是將防禦素基因導入到真核表達載體中並得到表達並申請專利，表達出的防禦素具有較好的生物學活性。目前尚未有對山羊防禦素進行基因工程方法大量製備的公開報導。
發明內容
本發明的一個目的是在於提供了一種修飾的山羊防禦素基因，根據防禦素序列(GenBank:DQ532360.1),針對畢赤酵母密碼子偏好性對其進行修飾，獲得了一種優化了的山羊防禦素基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。本發明還有一個目的是在於提供了一種修飾的山羊防禦素，其胺基酸序列為SEQID N0.2所示，其活性優於天然防禦素，成本低廉，價格實惠，性價比高。可替代傳統的抗生素及一些化學性的防腐劑，對食品安全及臨床治療具有重要的意義。本發明還有一個目 的是在於提供了一種修飾的山羊防禦素的製備方法，方法簡單，易行，適於大規模生產。本發明最後一個目的是提供了一種修飾的山羊防禦素在抑制細菌生長上的應用，通過對鮮肉進行防禦素蛋白液的處理，極大的提高了肉類的保鮮時間。溫度越低保鮮時間越長。為了達到上述目的，本發明採取以下技術措施:1.修飾的山羊防禦素基因的獲得:根據山羊防禦素基因(GenBank:DQ532360.1)，針對畢赤酵母密碼子偏好性對其進行修飾，獲得了一種優化了的山羊防禦素基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。設計含有部分互補序列的引物，在引物兩端設計EcoR I和Not I兩個限制性內酶切位點，通過重疊PCR的方法擴增得到完整的經過修飾的GBD-1基因。
權利要求
1.一種人工合成的修飾的山羊防禦素基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一種修飾的山羊防禦素，其序列為SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列。
3.權利要求2所述的一種修飾的山羊防禦素的製備方法，其步驟是: .1)GBD-1基因的PCR擴增:引物1、2、3互為模板和引物進行PCR，反應體系為:引物1、.2、3 分別加入 2 μ L> I μ L、2 μ L, 2.5 mM dNTPs 3.5 μ L, 10 Y^EasyTaq Buffer 5 μ L,EasyTaq DNA Polymerase I μ L,補無菌雙蒸水至 50 μ L ； 擴增條件:94 °C預變性 4 min ；94 V 30 s，62 V 30 s，72 V 30 s，32個循環；72°C充分延伸10 min ； PCR產物經2 %質量體積比的瓊脂糖凝膠電泳後，用DNA凝膠純化回收試劑盒回收目的片段，編號為1-2-3 ； 引物1、1-2-3、4再互為模板和引物進行PCR，反應體系為:引物1、1-2-3、4分別加入.2 μ L> I μ L、2 μ L, 2.5 mM dNTPs 3.5 μ L, 10 Y^EasyTaq Buffer 5 μ L, EasyTaq DNAPolymerase I μ L,補無菌雙蒸水至50 μ L ； 擴增條件:94 °C預變性 4 min ；94 V 30 s，62 V 30 s，72 V 30 s，32 個循環；72°C充分延伸10 min ； PCR產物經2.0 %質量體積比的瓊脂糖凝膠電泳後，用DNA凝膠純化回收試劑盒回收目的片段，該目的片段即為修飾的山羊防禦素目的序列； 所述的引物為:1:ACTGAATTCATGAGTCGTCGAAGCTGCCATAGGAATAAAGGCGTCTGTGCT2: CTGTCTCATGTTTCTAGGGCATCTGGTCAGAGCACAGACGCCTTT3:AACTGGGGGACCGAAACAGGTGCCAATCTGTCTCATGTTTCT4:CAGGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTAACTGGGGGACCGAA ； 2)重組表達質粒的構建與鑑定: 將測序正確的目的片段和PPICZ a A表達載體分別用EcoR I和Not I進行雙酶切，酶切之後用T4 DNA連接酶進行連接，構建重組表達質粒pPICZ a A/GBD-1 ;將重組表達質粒在含有Zeocin的LB培養基中培養、篩選，用小量提取試劑盒提取質粒，進行雙酶切，並將重組表達質粒pPICZ a A/GBD-1測序，測序正確的，為重組表達質粒pPICZ a A/GBD-1 ； 3)重組質粒的轉化: 將鑑定好的重組表達質粒pPICZ a A/GBD-1用Sac I線性化，轉化感受態畢赤酵母中，利用電轉儀進行電轉，同時轉化pPICZ a A空載體作為對照；電轉後塗布於含有Zeocin的YPD平板中，30°C培養至有單菌落出現，將單菌落接種到含有Zeocin的YPD液體培養基中進一步培養，取部分菌落，提取酵母基因組DNA，並利用載體特異引物5』AOX和3』 AOX進行PCR鑑定，並測序；5』 AOX: GACTGGTTCCAATTGACAAGC3』 AOX: GCAAATGGCATTCTGACATCC ； .4)重組酵母的誘導表達: 將步驟3)中獲得的陽性重組質粒接種到BMGY培養液中活化15h，離心，去上清，沉澱用BMMY培養液懸浮後誘導， 每24h加甲醇至終濃度為l%，84h後Iml菌液兩管，離心留上清，-20°C保存。
4.權利要求2所述的山羊防禦素在抑制大腸桿菌生長上的應用。
5.權利要求2所述的山羊防禦素在抑制金黃色葡萄球菌生長上的應用。
6.權利要求2所述的山羊防禦素在抑制肺炎鏈球菌生長上的應用。
7.權利要求2所述的山羊防禦素`在豬肉保鮮上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種修飾的山羊防禦素基因及製備方法和應用，針對畢赤酵母密碼子偏好性對其進行修飾，獲得了一種優化了的山羊防禦素基因，將目的基因連入pPICZαA表達載體，獲得重組表達質粒pPICZαA/GBD-1，再將該質粒轉入畢赤酵母，經誘導得到了一種優化了的山羊防禦素，方法簡單，易行，適於大規模生產，獲得的山羊防禦素其活性優於天然防禦素，成本低廉，價格實惠，性價比高。可替代傳統的抗生素及一些化學性的防腐劑，對食品安全及臨床治療具有重要的意義。
文檔編號C12N15/12GK103103196SQ201310042508
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者劉桂瓊, 姜勳平, 劉勝敏, 康建鋒 申請人:華中農業大學