精確育種的製作方法

2023-09-14 16:30:45 2

專利名稱：精確育種的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過修改植物的基因組中特定的、良好表徵的DNA來改進植物的營養、健康和農學特徵的方法。與經典的植物育種相反，該發明性的過程不向植物的遺傳構成中導入未知的或有潛在毒性的基因。此外，與常規的遺傳工程策略不同，該發明性的方法不向植物基因組中摻入來自外源物種，即，與將通過遺傳工程修改的植物不是互交可孕的物種的核酸。經由該發明性植物育種過程開發的植物展現出改進的農學特性。本發明的特別優選的植物包括顯示出改進的健康和塊莖貯藏特徵的馬鈴薯，和顯示出改進的疾病和乾旱耐受性的草皮草。
背景技術：
一般地已經通過經典的植物育種或遺傳工程改進了植物的農學性能。經典的育種一般導致未知的核酸從一個植物轉移到另一個植物。遺傳工程技術將外源核酸導入植物基因組，即，不是來自植物的DNA、或不是來自與將通過遺傳工程修改的植物天然互交可孕的植物的DNA。例如，遺傳工程將非植物核酸導入植物基因組。經典的育種和遺傳工程策略都產生含有不希望的和不需要的遺傳物質的植物基因組，得到的雜交種或轉基因植物可能顯示出不利的性狀。兩種策略的不足之處可能是對轉基因植物、以及對消費這種產品的動物和人是有害的。
1.常規的育種依靠未知DNA的轉移植物育種一般依靠植物染色體的隨機重組來產生具有新的和改進的特徵的品種。因而，通過篩選植物雜交產生的大量子代群體，育種者可以鑑定那些展現了期望的性狀的植物，所述性狀例如提高的產量、改進的活力、增強的對疾病和昆蟲的抗性、或在乾旱條件下生存的更強的能力。然而，經典的育種方法是費力和耗時的，新品種一般僅顯示出相對不多的改善。此外，經典的植物育種一般導致數百個未知基因轉移到植物基因組中。有可能的是，某些轉移的基因編碼潛在有害的過敏原，例如馬鈴薯糖蛋白(patatin)、凝集素、幾丁質酶、蛋白酶、奇異果甜蛋白樣蛋白、脂質轉移蛋白、澱粉酶、胰蛋白酶抑制劑和種子貯藏蛋白(Breiteneder et al.，J Allergy Clin Immunol 10627-36)。類似地，種質滲入的基因(introgressed genes)可能涉及毒素的生物合成，所述毒素包括山黧豆素(lathyrogens)、肼、芥子油苷(glucosinolates)和甲狀腺腫原、香豆素、皂角苷、生物鹼、配糖生物鹼、生物胺、酶抑制劑，例如凝集素(血細胞凝集素)、胰蛋白酶抑制劑，螯合物質例如植酸鹽和草酸鹽，核毒素、抗微生物肽、胺基酸，例如β-N-草醯氨基-L-丙氨酸，蒼朮苷、夾竹桃苷、紫杉醇、和異喹啉(Pokorny，Cas Lek Cesk 136267-70，1997)。由於「打開」用於食物消費前尚未使用過的野生作物親緣植物的遺傳多樣性的工作，無意地將這些毒物引入到人和動物食物供應品中的風險進一步增加了(Hoisington et al.，Proc Natl Acad Sci USA 965937-43，1999)。儘管經典的植物育種可以容易地將涉及不希望的抗營養化合物的基因導入到糧食作物和植物中，但不能容易地移除它們。舉例來說，花費了約15年通過鈍化Lpa基因來減少玉米和稻米中有害的植酸鹽(phytate)水平(Raboy，J Nutr 132503S-505S，2002)。用很長時間來獲得積極的成果是不實際的，特別是因為急需更有效地和更高效地改進糧食作物的品質的方法。僅在近來發現與抗營養化合物的合成有關的基因的一個實例是多酚氧化酶(PPO)基因，其氧化某些酚類化合物生產致突變的、致癌的和細胞毒的試劑，如苯氧基基團和醌型衍生物(Kagan et al.，Biochemistry 339651-60，1994)。在植物，例如馬鈴薯的基因組中存在著這個基因的多個拷貝，使得特別難以通過育種來降低PPO活性。如果對它們的遺傳基礎了解很少或不了解，就需要更多的時間來除去抗營養化合物(anti-nutritional compounds)。舉例來說，還沒有基因與被加熱到1600℃或更高溫度的某些馬鈴薯中高濃度的丙烯醯胺累積聯繫起來，丙烯醯胺是一種強力的神經毒素和誘變劑(Tarekeet al.，J Agric Food Chem.504998-5006，2002)。因此很難在利用常規育種的過程期間有效地開發出產生更少的丙烯醯胺的新的馬鈴薯品種。因而，需要種植具有降低水平的這種危險化合物的馬鈴薯及其他富含碳水化合物的食物，例如小麥，但是不利用未知的或外源的核酸。其他可在加工期間積累的、並難以通過育種減少或消除的抗營養化合物包括Maillard反應產物N-亞硝基-N-(3-酮基-1，2-丁二醇)-3′-硝基酪胺(Wang et al.，Arch Toxicol 7010-5，1995)，和5-羥基甲基-2-糠醛(Janzowski et al.，Food Chem Toxicol 38801-9，2000)。還知道尚未被很好表徵的其他的Maillard反應產物也展現了致突變的性質(Shibamoto，Prog Clin Biol Res 304359-76，1989)。由於常規植物育種的固有不精確性，同樣難以快速地增加糧食作物中積極營養化合物(positive nutritional compounds)的水平。舉例來說，增加各種作物中「抗性澱粉」(Topping et al.，Physiol Rev811031-64，2001)的水平是所希望的。這種澱粉最終是促進免疫反應、抑制潛在的病原體和降低疾病包括結腸直腸癌症的發病率的原因(Bird et al.，Curr Issues Intest Microbiol 125-37，2000)。然而，具有升高的抗性澱粉水平的僅有的可用植物是低產量的品種，象玉米突變株「amylose extender」、「dull」和「sugary-2」。創造新的高抗性澱粉來源，例如馬鈴薯，將允許這種促進健康成分的更廣泛的飲食加入。不能安全地操作植物的基因型常常導致使用外部的化學藥品來誘導期望的表型。例如，儘管很多育種項目延遲塊莖的發芽，但仍沒有商業上可獲得的馬鈴薯品種能夠在不用發芽抑制劑處理的情況下保存數月。發芽抑制劑，例如異丙基-N-氯苯基-氨基甲酸酯(CIPC)與急性毒性和腫瘤發展有關，可以以1mg/kg到5mg/kg之間的濃度存在於加工的馬鈴薯食物中。
2.遺傳工程依靠外源DNA的轉移遺傳工程可用於修改、產生或從植物除去某些性狀。雖然在增加植物的營養價值和健康特徵方面只有有限的進展，大多數改進的目標是提高作物栽培容易性的植物性狀。因而，由於含有細菌基因5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸酯合酶，某些植物對草甘膦除草劑有抗性(Padgette et al.，Arch Biochem Biophys.258564-73，1987)。類似地，遺傳工程已經生產出昆蟲、病毒、和真菌抗性的植物品種(Shah etal.，Trends in Biotechnology 13362-368，1995；Gao et al.，NatBiotechnol.181307-10，2000；Osusky et al.，Nat Biotechnol.181162-6，2000)，但很少有增強的營養或健康益處。根據標準的、公知的技術，將包含基因和調節元件的遺傳「表達盒「插入到土壤桿菌(Agrobacterium)分離的轉移DNA(「T-DNA」)的邊界內，並整合到植物基因組中。因而，T-DNA材料的土壤桿菌介導的轉移一般包括以下標準步驟(1)遺傳元件的體外重組，其中至少一個是外源來源的，以產生用於轉化選擇的表達盒，(2)通常與至少一個其他的含有外源DNA的表達盒一同，將這個表達盒插入到二元載體的T-DNA區中，其通常由側翼是T-DNA邊界序列的數百個土壤桿菌DNA鹼基對組成(3)通常與某些或所有的來自土壤桿菌的其它二元載體序列一同，將位於T-DNA邊界之間的序列轉移給植物細胞，和(4)選擇穩定轉化的植物細胞。參見，例如，美國專利號4,658,082，6,051,757，6,258,999，5,453,367，5,767,368，6,403,865，5,629,183，5,464,763，6,201,169，5,990,387，4,693,976，5,886,244，5,221,623，5,736,369，4,940,838，6,153,812，6,100,447，6,140,553，6,051,757，5,731,179，5,149,645和EP 0 120,516，EP 0257,472，EP 0 561,082，1,009,842A1，0 853,675A1，0 486,233B1，0554,273A1，0 270,822A1，0 174,166A1，和WO 01/25459。因而，遺傳工程方法依靠將外源核酸導入到食物供應品中。那些技術將從病毒、細菌和植物分離的、對於被轉化的植物物種是非天然的幾個到超過20個遺傳元件的複雜融合物轉移。這種外源元件包括調節元件例如啟動子和終止子，和涉及新性狀的表達的、或起標記作用來鑑定或選擇轉化事件的基因。儘管在規章批准之前測試含有外源DNA的食物的安全性，許多消費者還是關心食用表達外源蛋白的食物的長期影響，所述外源蛋白是由從其他的、非植物物種獲得的基因產生的。一個通常使用的調節元件是花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S「超級」啟動子，其一般被用於植物工程來誘導與之直接連接的轉基因的高水平表達。然而，35S啟動子也可以增強其附近的天然基因的表達(Weigel et al.，Plant Physiol.，1221003-13，2000)。因而這種啟動子可能誘導在內源基因表達方面的不可預見的改變，可能產生不希望的效果，例如生物鹼產生的升高。優選的「強」啟動子一般是那些從病毒分離的啟動子，例如，大米tungro杆狀病毒、玉米條紋病毒、木薯葉脈病毒、紫茉莉(mirabilis)病毒、花生褐綠條死病花葉病毒(peanut chlorotic streak caulimovirus)、玄參花葉病毒和小球藻病毒。其他經常使用的啟動子是從細菌物種克隆的，包括胭脂鹼合酶和章魚鹼合酶基因的啟動子。為了獲得基因翻譯的適當的終止，終止子序列被融合到轉基因的3′-端，包括來自土壤桿菌的胭脂鹼合酶和章魚鹼合酶基因的遺傳元件。其他遺傳元件可被用於進一步增強基因表達，或將表達的蛋白靶向某些細胞區室。這些元件包括促進轉基因表達的內含子，和將外源基因靶向某些細胞區室的信號肽序列，通常來源於外源植物物種。某些涉及新性狀的表達的基因最經常地來源於外源的來源。如果使用天然的(native)基因，通常將它們反轉以使轉基因植物中該基因的表達沉默，並與外源DNA例如選擇性標記共轉化。這種「反義」技術的主要缺陷是反轉的DNA通常含有插入在啟動子和終止子之間的、新的和未表徵的開放閱讀框。因而，用來源於澱粉相關基因R1(Kossmann et al.，美國專利6,207,880)、L和H型葡聚糖磷酸化酶基因(Kawchuk et al.，美國專利5,998,701，1999)、多酚氧化酶基因(Steffens，美國專利6,160,204，2000)，和澱粉分支酶I和II的基因(Schwall et al.，Nature Biotechnology 18551-554，2000)的反義構建體遺傳性修改的馬鈴薯植物，都潛在地表達由至少50個胺基酸組成的新肽(表1)。這些新肽可能干擾植物發育和/或降低馬鈴薯的營養價值，因此是不希望的。常規的標記基因被合併到遺傳結構中，用於選擇轉化事件。它們為被轉化植物賦予抗生素或除草劑抗性(美國專利No.6,174,724)、代謝優勢(美國專利No.5,767,378)或形態學上異常的表型(美國專利No.5,965,791)。這種標記一般來源於細菌來源。此外，由於T-DNA轉移的不精確性，在植物，例如番茄、菸草和馬鈴薯中約75％的轉化事件除T-DNA之外還含有質粒「主幹(backbone)」序列(Kononov et al.，Plant J.11945-57，1997)。這種主幹序列的存在是不合需要的，因為它們是外源的，並且一般含有複製起點和抗生素抗性基因標記。確實存在用於除去像外源標記基因的元件的各種方法，但是很少是容易適用於植物遺傳工程的。根據一種此類方法，將標記基因和期望的基因或核苷酸序列置於不同的載體上。用攜帶兩個載體的單個土壤桿菌菌株(美國專利No.6,265,638)、或用各攜帶一個載體的兩個土壤桿菌菌株感染植物，可以偶爾地產生不聯鎖的整合事件，其可以通過遠系繁殖遺傳性地分離。這種方法的主要的缺點是基因座的遺傳分離是非常費力和耗時的，特別是如果T-DNA整合事件是連鎖的時。此外，在無性繁殖的單性生殖植物，例如肯塔基藍草，或營養體繁殖的作物例如馬鈴薯中，由於近交抑制、高水平的異型接合性和低生育水平不能容易地育種，因而在這些植物中這種方法不是廣泛適用的。用於除去外源遺傳元件的另一個方法依靠將外源基因，如選擇性標記插入到轉座元件中。然後可以以低頻率將修飾的轉座元件從基因組中剪切出來。然後必需進行與未轉化植物的傳統雜交來從宿主中分離該轉座的元件(美國專利No.5,482,852)。如對前述方法所描述的，這種替換性方法不能被用於營養體繁殖或單性生殖的的植物系統。第三種除去標記基因的方法使用了噬菌體P1的Cre/lox位點特異性重組系統(Dale Ow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810558-62，1991)。與Cre重組酶基因和涉及Cre的誘導的嵌合基因(兩個基因都帶有它們自己的啟動子和終止子)一同將標記基因插入到兩個lox位點之間，引起再生過程期間由lox位點劃定的區域的切除(Zuoet al.，Nat.Biotechnol.，19157-61，2001)。這個複雜的過程是低效的和不可靠的，可能導致基因組的不穩定性。近來的研究報導說，一些植物基因本身可被用作轉化標記。這種植物標記的實例包括Pga22(Zuo et al.，Curr Opin Biotechnol.13173-80，2002)、Cki1(Kakimoto，Science 274982-985，1996)和Esr1(Banno et al.，Plant Cell 132609-18，2001)。然而，所有這些基因都觸發細胞分裂素反應，其給予轉化的植物不合需要的表型。此外，這種植物標記仍需要通過上述的任何一種方法在轉化時除去。轉化植物的替換性的方法也基於外源遺傳元件的體外重組，並依靠用於在E.coli中維持的細菌質粒序列，其部分序列在轉化過程期間被共同整合了。這種用外源DNA轉化植物的方法的實例在美國專利Nos.5,591,616，6,051,757，4,945,050，6,143,949，4,743,548，5,302,523和5,284,253中有描述。通過在再生之前省略任何選擇步驟，也可以獲得無標記的轉基因植物。這種方法的缺點是通過這種方法產生的大多數事件將代表未轉化的或嵌合的植物，因為它們通常不是來源於單個轉化的植物細胞的。使用無標記的步驟來鑑定在所有它們的細胞中含有相同DNA插入物的轉基因植物是極為困難和費力的。因而，除了可通過經典的育種雜交和常規的遺傳工程技術得到的，和不依靠將未知或外源核酸插入到植物基因組的之外，存在著非常重要的需求來改進植物。因此，本發明提供了用於精確地修改植物自己的遺傳物質的方法和組合物。因而，發明性的「精確育種」策略不會誘導不合需要的表型，不會向植物基因組中導入未知的或外源的核酸。
發明概述本發明提供了在不將未知的或外源的DNA永久地或穩定地結合到植物的基因組中的情況下、遺傳性地增強植物的營養價值和農學性能的方法。根據本發明的方法，將特定的、良好表徵的核酸、基因元件和基因從期望的植物物種或與期望的植物性上相容的植物物種中分離，進行修改，然後重新插入回該期望的植物物種的基因組中。所述修改可能要求對分離的核酸序列進行突變、刪除部分分離的核酸、或簡單地將該分離的核酸連接到另一個多核苷酸，例如將該分離的核酸亞克隆到質粒載體中。因此，通過該發明性的方法生產的轉基因植物不具有包含任何外源物種的核酸的基因組。因而，本發明的方法生產一種轉基因植物，其基因組不包含非植物物種啟動子、不包含非植物物種終止子、不包含非植物物種5′-非翻譯區、不包含非植物物種3′-非翻譯區、不包含非植物物種標記基因，不包含非植物物種調節元件、不包含非植物物種基因、以及不包含其他任何從非植物物種基因組獲得的多核苷酸。因而，本發明提供一種生產顯示出出修改的表型的、穩定的轉基因植物的方法，所述修改的表型不被未轉化的植物展現，包括(a)用期望的多核苷酸轉化植物細胞；(b)從轉化的細胞培植植物；和(c)挑選出展現新的表型、用所述期望的多核苷酸穩定地轉化的植物，所述表型不被相應的未轉化的植物細胞長成的植物展現。優選的，所述期望的多核苷酸基本上由以下組成(i)對於植物細胞的基因組或相同物種的其它植物是天然的、和/或從中分離的，或者對於與分離出所述植物細胞的植物性上相容的植物物種的基因組是天然的、和/或從中分離的核酸序列；和(ii)至少一個DNA序列，所述DNA序列是具有一種序列的邊界樣序列，所述一種序列對於所述植物細胞的基因組是天然的，或對於相同物種的植物細胞的基因組是天然的，或對於與分離出所述植物細胞的植物性上相容的植物是天然的，其中所述邊界樣序列能夠穩定地將期望的多核苷酸整合到所述植物細胞的基因組中。本發明的優選的方法要求生產展現出修改的表型的轉基因植物，所述修改的表型不被未轉化的植物展現，包括(a)用土壤桿菌感染外植體，所述土壤桿菌攜帶(i)「P-DNA」載體，其含有對於所述轉基因植物是天然的、期望的多核苷酸，和(ii)「LifeSupport」載體，其含有包含選擇性標記基因的表達盒；(b)選擇選擇性標記基因的短暫表達，優選的1-10天、3-7天、或4-5天；(c)將外植體轉移到再生培養基以容許幼苗形成；(d)篩選幼苗群體，確定哪一些在它們的基因組中包含所述期望的多核苷酸的至少一個拷貝，在這些之中，確定哪些幼苗在它們的基因組中不含有任何外源核酸，例如選擇性標記基因；和(e)容許在它們的基因組中含有期望的多核苷酸但不含任何標記基因DNA的幼苗發育成完整植物，其中得到的完整植物展現出修改的表型，所述修改的表型不被相同物種的未轉化植物細胞長成的植物展現。根據這種方法，期望的多核苷酸(i)基本上僅由對於植物細胞物種或其性上相容的物種的基因組是天然的、和/或從中分離的元件組成；(ii)包含至少一個具有一種序列的邊界元件，所述一種序列對於植物細胞物種或其性上相容的物種的基因組是天然的、或是從中分離的，並能夠穩定地將所述期望的多核苷酸整合到暴露於載體的植物細胞的基因組中；和(iii)被穩定地整合到被轉化植物的基因組中；其中所述方法不將非植物物種的或外源的DNA整合到被轉化植物的基因組中。此外，可以使用任何選擇性標記基因作為成功轉化的指示物。舉例來說，可以使用「新黴素磷酸轉移酶」標記基因，或「hpt」標記基因來分別賦予對氨基糖苷類抗生素、卡那黴素和潮黴素的抗性。其他標記基因包括「bar」標記基因，其賦予對除草劑膦絲菌素的抗性；「DHFR」標記基因，其賦予對氨甲蝶呤的抗性；和「ESPS」標記基因，其賦予對Round-up除草劑的抗性。如何根據這些標記基因的表達來確定標記基因是否已經穩定地表達到轉化的植物細胞的基因組中是本領域公知的。因此，熟練技術人員知道如何根據標記基因的表達來確定在被轉化植物細胞中標記基因僅被短暫地表達。在本發明的另一個方面，提供一種製造穩定地轉化的植物的方法，包括步驟(1)鑑別目標基因；(2)分離與所述目標基因相關的前導區或尾隨區DNA序列；(3)任選地修改所述分離的前導區或尾隨區DNA；(4)可操作地將所述前導區或尾隨區DNA連接到天然調節元件以形成表達盒；(5)將所述表達盒插入到位於二元載體上的P-DNA中，其中所述二元載體還攜帶可操作的細胞分裂素基因，從而外源來源的、其它二元載體序列的不經意插入可以通過細胞分裂素基因的表達來檢測；(6)將修改的二元載體導入到土壤桿菌中；(7)利用LifeSupport介導的轉化將重排的天然DNA穩定地整合到植物細胞的基因組中；(8)再生含有重排的天然DNA的植物細胞；(9)棄去顯示出過度產生細胞分裂素表型和沒有完全再生的植物；和(10)維持著不能與未轉化的植物相區別的期望的植物用於進一步分析。在本發明的另一個方面，提供了修改選定的植物物種中性狀表達的方法。在一個實施方式中，所述方法包括(1)鑑定待修改的性狀；(2)構建重組DNA分子，所述重組DNA分子基本上由對於選定的植物物種是天然的、或從中分離的遺傳元件組成，其中當所述重組DNA分子被整合到所述選定植物物種的基因組中時，修改該轉化的植物物種中性狀的表達；(3)利用LifeSupport介導的轉化將所述重組DNA分子穩定地整合到所述選定植物物種的細胞中；和(4)鑑定展現出被修改的性狀表達的轉化的植物。在優選的實施方式中，通過用兩種不同的土壤桿菌菌株感染外植體，將對於期望的植物是天然的多核苷酸插入到該期望的植物的基因組中。第一土壤桿菌菌株能夠將天然DNA從P-DNA載體轉移給植物細胞；第二菌株能將攜帶用於選擇性標記基因的表達盒的T-DNA轉移給植物細胞。後一種載體的實例包括在此描述的所謂的「LifeSupport」載體。通過優選地選擇短暫表達標記基因1-10天、3-7天或4-5天的植物，隨後將外植體轉移到再生培養基，獲得事件(events)的群體，其中一部分是含有所述多核苷酸的至少一個拷貝、但缺少任何T-DNA或標記基因拷貝的植物。在另一個實施方式中，使用攜帶P-DNA載體以及LifeSupport載體的單個土壤桿菌菌株，所述P-DNA載體在P-DNA邊界樣序列之間容納了期望的、天然的目標基因或多核苷酸，所述LifeSupport載體含有標記基因。可以、或可以不將所述標記基因插入到P-DNA邊界樣序列、T-DNA邊界樣序列或其它T-DNA樣邊界序列之間。因而，在另一個優選的實施方式中，P-DNA載體含有至少兩個表達盒，其中之一含有由天然啟動子驅動、尾隨著天然終止子的、天然的可篩選或可選擇的標記基因。通過優選地選擇至少2天、更優選的至少5天的天然標記基因表達，隨後將外植體轉移到再生培養基，獲得事件的群體，其為含有被穩定地整合到它們的基因組中的、導入的DNA的至少一個拷貝的植物。在優選的實施方式中，植物衍生的標記基因編碼突變的5-烯醇丙酮醯-3-磷酸莽草酸合酶或色氨酸脫羧酶。在更優選的實施方式中，選擇性標記編碼耐鹽性。在最優選的實施方式中，耐鹽性基因具有SEQID 35中所示的核苷酸序列，用於選擇馬鈴薯中的轉化事件。在又一個實施方式中，性狀表達的修改的特徵在於表達的增加、表達的下降、或不可檢測的表達。在本發明的另一個方面，提供了由一種方法製造的植物，所述方法是(1)確定待修改的性狀；(2)構建重組DNA分子，所述重組DNA分子基本上由分離自選定的植物物種的遺傳元件組成，其中當所述重組DNA分子被整合到所述選定植物物種的基因組中時，修改該轉化的植物物種中性狀的表達；(3)經由LifeSupport介導的轉化將所述重組DNA分子穩定地整合到所述選定植物物種的細胞中；和(4)鑑定展現出修改的性狀表達的轉化的植物。在進一步的方面，提供了修改選定的植物物種中性狀表達的方法。這種方法包括(1)確定待修改的性狀；(2)構建重組DNA分子，所述重組DNA分子基本上由(a)從選定植物物種分離的遺傳元件，其中當所述遺傳元件被整合到所述選定植物物種的基因組中時，修改該轉化的植物物種中性狀的表達；和(b)從相同植物物種分離的選擇性標記基因組成；(3)經由LifeSupport介導的轉化將所述重組DNA分子穩定地整合到所述選定植物物種的細胞中；(4)檢測所述選擇性標記基因；和(5)鑑定展現出修改的性狀表達的轉化的植物。在又一個方面，提供了展現修改的性狀表達的植物。在一個實施方式中，所述植物具有穩定地整合到其基因組中的重組DNA分子，所述重組DNA分子基本上由從相同物種的植物、或與該物種性上相容的植物分離的遺傳元件組成，其中所述重組DNA分子修改所述性狀的表達。在本發明的另一個方面，提供了被稱為「植物-DNA」(「P-DNA」)的分離的核苷酸序列。在優選的實施方式中，P-DNA本身缺乏任何基因或其部分，通過末端的T-DNA「邊界樣」序列劃定，所述「邊界樣」序列與任何強毒土壤桿菌菌株的T-DNA邊界的核苷酸序列有至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的序列同一性，其支持完整P-DNA有效地從土壤桿菌轉移到植物細胞。在優選的實施方式中，「邊界樣」序列促進和便於與之連接的多核苷酸的整合。在另一個優選的實施方式中，修改的P-DNA的每個末端序列的長度在5-100bp、10-80bp、15-75bp、15-60bp、15-50bp、15-40bp、15-30bp、16-30bp、20-30bp、21-30bp、22-30bp、23-30bp、24-30bp、25-30bp、或26-30bp之間。更優選的，邊界樣序列的長度在20個和28個核苷酸之間。在優選的實施方式中，本發明的P-DNA左側和右側邊界序列對於待修改的植物的基因組是天然的和/或是從中分離的，並且在核苷酸序列上與任何已知的土壤桿菌衍生的T-DNA邊界序列不相同。因而，在一個實施方式中，P-DNA邊界序列可具有與來自土壤桿菌物種，例如根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或Agrobacteriumrhizogenes的T-DNA邊界序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個核苷酸。做為選擇，在另一個實施方式中，本發明的P-DNA邊界或邊界樣序列與來自土壤桿菌物種，例如根癌土壤桿菌或Agrobacterium rhizogenes的T-DNA邊界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的序列同一性。更優選的，是與土壤桿菌T-DNA邊界序列有大於或等於99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的核苷酸序列同一性的天然的植物P-DNA邊界序列。在另一個優選的實施方式中，可以從植物基因組中分離邊界樣序列，然後進行修改或突變來改變它們能夠將核苷酸序列整合到另一個核苷酸序列中的效率。在另一個實施方式中，可以將其他的多核苷酸序列添加到或摻合(incorporate)到本發明的邊界樣序列內部。因而，在又一個實施方式中，可以修改P-DNA左側邊界或P-DNA右側邊界以便具有5′-和3′-多克隆位點，或其他限制性位點。在進一步的實施方式中，可以修改P-DNA邊界序列來增加來自伴隨載體的主幹DNA不整合到植物基因組中的可能性。在更優選的實施方式中，通過在聚合酶鏈式反應中利用簡併引物將P-DNA從任何植物中分離。在一個優選的實施方式中，P-DNA來自馬鈴薯，由與常規T-DNA邊界分別具有80％和88％的同一性的25-bp末端劃定，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.98所示的序列。在另一個最優選的實施方式中，P-DNA來自小麥，由與常規T-DNA邊界分別具有72％和92％的同一性的25-bp末端劃定，含有SEQ ID NO.34所示的序列。可以修改這種P-DNA以便包含位於邊界樣序列之間的其他多核苷酸。在優選的實施方式中，修改的P-DNA在5′-到3′-方向上，基本上由促進DNA轉移的第一邊界樣序列、啟動子、可操作性連接到啟動子的期望的多核苷酸、終止子和同樣促進DNA轉移的第二邊界樣序列組成。在一個其他的實施方式中，該期望的多核苷酸是在有義和/或反義方向上的前導區、尾隨區或基因的一個或幾個拷貝。在更優選的實施方式中，修改的P-DNA含有突變PPO基因和轉化酶抑制物基因的表達盒。因而，在優選的實施方式中，期望的多核苷酸包含前導區序列的有義和反義序列。在更優選的實施方式中，前導區序列與對於選定植物物種的細胞是內源的基因相連。在再更優選的實施方式中，前導區與選自以下構成的組的基因相連PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基轉移酶基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸4-羥化酶基因、肉桂醯基-輔酶A還原酶基因、肉桂醯基乙醇脫氫酶基因、咖啡醯基輔酶A O-甲基轉移酶基因、肌動蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、過敏原基因、P450羥化酶基因、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內切-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質環氧酶基因、和1-氨基環丙烷-1-羧化物合酶基因。在又一個優選實施方式中，期望的多核苷酸序列包含尾隨序列的有義和反義序列。在優選的實施方式中，尾隨序列與選自以下構成的組的基因相連PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基轉移酶基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸4-羥化酶基因、肉桂醯基-輔酶A還原酶基因、肉桂醯基乙醇脫氫酶基因、咖啡醯基輔酶A O-甲基轉移酶基因、肌動蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、過敏原基因、P450羥化酶基因、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內切-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質環氧酶基因、和1-氨基環丙烷-1-羧化物合酶基因。在優選的實施方式中，期望的多核苷酸，例如基因，對於待轉化的植物是天然的或是從中分離的。在另一個優選的實施方式中，修改或突變期望的多核苷酸。在一個實施方式中，對分離的多核苷酸的突變可以使得期望的核苷酸與其未突變的形式有大於或等於99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的不同。在本發明優選的實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的啟動子是組成型啟動子。在更優選的實施方式中，該組成型啟動子是馬鈴薯的遍在蛋白-3基因的啟動子。在更優選的實施方式中，該組成型啟動子是馬鈴薯的遍在蛋白-7基因的啟動子。在另一個實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的啟動子是可調節啟動子。在更優選的實施方式中，該可調節啟動子對溫度敏感。在更優選的實施方式中，該可調節啟動子是ci21A啟動子或C17啟動子，都是從馬鈴薯分離的(Schneider et al.，Plant Physiol.113335-45，1997；Kirch et al.，Plant Mol Biol 33897-909，1997)。在另一個實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的啟動子可以以時序方式調節。在優選的實施方式中，該啟動子是rbcS啟動子(Ueda et al.，Plant Cell 1217-27，1989)。在又一個實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的啟動子通過脫落酸、創傷、甲基茉莉酮酸酯(methyl jasmonate)或赤黴酸來調節。在進一步的實施方式中，這個啟動子是選自Rab 16A基因啟動子、□-澱粉酶基因啟動子或pin2基因啟動子的啟動子。在另一個實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的啟動子是組織特異性啟動子。在特別優選的實施方式中，這個啟動子是從S.tuberosum分離的GBSS啟動子。在一個實施方式中，本發明提供能夠在E.coli和土壤桿菌中複製的、並含有P-DNA或修改的P-DNA的P-DNA載體。在優選的實施方式中，這個載體還在其主幹中含有細胞分裂素表達盒，以允許針對主幹整合事件的選擇。在另一個優選的實施方式中，期望的核苷酸序列進一步包含間隔區元件。在更優選的實施方式中，間隔區元件是Ubi內含子序列或GBSS間隔區序列。在另一個優選的實施方式中，期望的核苷酸序列包含編碼功能上無活性的蛋白的、突變的天然基因，如果在轉基因植物中被表達，其可降低這個蛋白的整體活性。在又更優選的實施方式中，這個突變的基因編碼功能上無活性的、缺少銅結合結構域的多酚氧化酶。在另一個優選的實施方式中，期望的核苷酸序列包含編碼功能上有活性的蛋白的天然基因。在又更優選的實施方式中，這個基因編碼與菸草液泡轉化酶抑制物具有同源性的蛋白。在另一個實施方式中，位於P-DNA內部的表達盒的終止子是Ubi3終止子序列或選定植物物種的基因的3′-非翻譯區。在本發明的另一個方面，提供了修改目標植物細胞的方法。在一個實施方式中，所述方法包括(1)利用LifeSupport介導的轉化將修改的P-DNA插入到目標植物細胞中的至少一個細胞的基因組中；和(2)觀察在目標植物細胞中是否存在表型的變化；其中在修改的P-DNA中的啟動子轉錄與天然基因相連的有義和/或反義非翻譯序列來減少這個天然基因的表達，從而修改目標植物細胞。在另一個優選的實施方式中，在修改的P-DNA中的啟動子轉錄基因來在目標植物細胞中過量表達這個基因。在又一個方面，提供一種製造含有修改的P-DNA的、選定植物物種的轉基因植物細胞的方法。該方法包括用P-DNA載體和LifeSupport載體共轉染選定植物物種的植物細胞，LifeSupport載體包含側翼是T-DNA左側邊界和T-DNA右側邊界的標記基因和插入到載體主幹中的突變virD2基因，選擇短暫地表達標記基因的植物細胞，分離含有整合到其基因組中的修改的P-DNA、但不含有任何來自LifeSupport載體的核苷酸的植物細胞。在優選的實施方式中，標記基因賦予對卡那黴素的抗性。在最優選的實施方式中，在卡那黴素抗性基因之後是酵母ADH終止子。在優選的實施方式中，用於轉化的選定植物物種的植物細胞位於培養基中。在另一個實施方式中，用於轉化的選定植物物種的植物細胞在植物內。本發明還提供了包含至少一個細胞的選定物種的植物，所述細胞具有含修改的P-DNA的基因組。在優選的實施方式中，修改的P-DNA在5′-到3′-方向上，基本上由後面是P-DNA序列的、象T-DNA邊界一樣起作用的第一末端、啟動子、與啟動子可操作地連接的期望的核苷酸序列、終止子和由第二末端劃定的其他P-DNA序列組成。在另一個實施方式中，期望的多核苷酸是在有義和/或反義方向上的前導區、尾隨區和基因的一個或幾個拷貝。在另一個實施方式中，預想了包含至少一個細胞的植物，所述細胞具有含修改的P-DNA的基因組。在本發明的另一個方面，提供了降低選定植物物種中基因表達的方法。該方法包括用P-DNA載體對來自選定植物物種的植物細胞進行LifeSupport介導的轉化，其中這個載體的修改的P-DNA被穩定地整合到植物細胞的基因組中。在本發明的另一個方面，修改的P-DNA包含降低來自該選定植物物種的內源基因的表達的期望的多核苷酸。在本發明的另一個方面，可以利用發明性的方法，對對於選定植物物種是天然的基因進行突變並再導入到植物中。優選的，利用P-DNA載體將突變的基因，舉例來說，突變的PPO基因整合到植物細胞基因組中。本發明還提供了降低選定植物物種中多酚氧化酶基因的不合需要的表達的方法。在優選的實施方式中，該方法包括將修改的P-DNA整合到選定植物物種的基因組中，所述P-DNA僅包含分離自選定植物物種或與該選定植物物種性上相容的植物的核苷酸序列，在5′-到3′-方向，基本上由後面是側翼P-DNA序列的、象T-DNA邊界一樣起作用的第一P-DNA末端；啟動子；期望的核苷酸，其是與特定PPO基因相連的有義方向的尾隨區核苷酸序列；來自特定PPO基因的尾隨區核苷酸序列的反義方向序列；終止序列，和由象T-DNA邊界一樣起作用的第二末端劃定的其他P-DNA序列組成，其中啟動子產生降低特定PPO基因表達的雙鏈RNA分子，從而降低植物的特定組織中的黑斑擦傷。在另一個實施方式中，來自前導區核苷酸序列的有義和反義方向的核苷酸序列是從特定PPO基因前面的5′-非翻譯區獲得的。在進一步的實施方式中，與PPO基因相連的有義和反義方向的前導區或尾隨區序列可以由在此被稱為內含子或「間隔區」的另一個多核苷酸序列分開。在優選的實施方式中，前導區或尾隨區序列與馬鈴薯PPO基因相連。在更優選的實施方式中，前導區或尾隨區序列與在馬鈴薯塊莖中表達的馬鈴薯PPO基因相連。在最優選的實施方式中，前導區或尾隨序列與在除表皮之外的馬鈴薯塊莖所有部分中表達的馬鈴薯PPO基因相連。本發明還提供了用於在選定植物物種的塊莖中降低丙烯醯胺產生、儲藏期間的發芽誘導、磷酸鹽累積、和/或冷誘導的糖化的方法。在優選的實施方式中，該方法包括用修改的P-DNA進行LifeSupport介導的選定植物物種的轉化，所述P-DNA僅包含分離自選定植物物種或與該選定植物物種性上相容的植物的核苷酸序列，在5′-到3′-方向，基本上由具有左側邊界樣序列的第一P-DNA、啟動子、期望的核苷酸序列，其是來自與R1基因相連的前導區序列的有義方向的核苷酸序列、來自這個前導區序列的反義方向序列、終止序列和右側邊界樣序列組成。在表達時，產生降低R1基因表達的前導區RNA雙鏈體，從而降低植物中冷誘導的糖化。在另一個實施方式中，期望的有義和反義方向的核苷酸序列是與R1基因相連的尾隨區。在進一步的實施方式中，與R1相連的有義和反義方向的前導區或尾隨區序列可以由在此被稱為內含子或「間隔區」的另一個多核苷酸序列分開。在另一個優選的實施方式中，該方法包括用修改的P-DNA進行LifeSupport介導的選定植物物種的轉化，所述P-DNA與上述的類似，但是含有與α葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區或尾隨區序列。在又一個優選的實施方式中，該方法包括用修改的P-DNA進行LifeSupport介導的選定植物物種的轉化，所述P-DNA含有轉化酶抑制物基因。在另一個優選的實施方式中，使用在之前的段落中描述的修改的P-DNA來降低Maillard反應的其他不合需要的產物的累積，Maillard反應在加熱富含碳水化合物的食物例如馬鈴薯塊莖時發生。這些不合需要的產物包括已經與各種病變相聯繫的高級糖基化終產物(AGE)。本發明還提供了提高植物和糧食作物的儲藏器官中抗性澱粉水平的方法。在優選的實施方式中，該方法包括用修改的P-DNA進行LifeSupport介導的選定植物物種的轉化，所述P-DNA含有與澱粉分支酶I和II基因相連的尾隨區序列的融合物的表達盒。本發明還提供了分離的核苷酸序列，其包含在塊莖中優勢表達的馬鈴薯GBSS基因和馬鈴薯蛋白酶抑制因子基因的啟動子。該分離的啟動子分別具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.40中所示的核苷酸序列。在一方面，本發明提供了修改選定植物的性狀的方法，包括a.用期望的多核苷酸穩定地轉化來自選定植物的細胞，其中所述期望的多核苷酸基本上由對於所述選定植物是天然的、對於來自相同物種的植物是天然的、或對於與所述選定植物性上互交可孕的植物是天然的核酸序列組成，b.從轉化的植物細胞中獲得穩定地轉化的植物，其中轉化的植物含有穩定地整合到基因組中的多核苷酸，和其中所述期望的多核苷酸修改所述性狀。在優選的實施方式中，該方法進一步包括用在植物細胞中短暫表達的選擇性標記基因共轉染植物細胞，鑑定轉化的植物細胞，從轉化的植物細胞獲得轉化的植物，其中選擇性標記基因沒有被穩定地整合，期望的多核苷酸被穩定地整合到基因組中。在優選的實施方式中，期望的多核苷酸包含P-DNA、GBSS啟動子、Ubi7啟動子、Ubi3啟動子、PIP啟動子、修改的PPO基因、轉化酶抑制物基因、耐鹽性基因、R1相連的前導區、磷酸化酶的相連前導區、R1相連的尾隨區、SBE相連的尾隨區、Ubi內含子、GBSS間隔區、UbiT。在另一個優選的實施方式中，本發明的「植物」是單子葉植物，選自由小麥、草皮(turf)、草皮草(turfgrass)、穀類、玉米、稻米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱和棕櫚構成的組。在又一個實施方式中，本發明的「植物」是雙子葉植物，選自由avacado、馬鈴薯、菸草、番茄、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、棉花、poinsetta、豆莢、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊和仙人掌構成的組。在又一個實施方式中，當前發明性方法的植物和植物細胞是通過土壤桿菌介導的轉化方法轉化的。優選的，土壤桿菌介導的轉化依靠使用至少一個二元載體。在又一個實施方式中，土壤桿菌介導的轉化方法使用第一二元載體和第二二元載體。在優選的實施方式中，第一二元載體含有期望的多核苷酸，第二二元載體含有選擇性標記基因，其中所述選擇性標記基因可操作地連接到啟動子和終止子。根據本方法，修改的性狀選自由增強的健康和營養特性、增加的儲藏、提高的產量、增強的耐鹽性、增強的重金屬耐受性、提高的乾旱耐受性、提高的抗病性、提高的昆蟲耐受性、提高的水脅迫耐受性、增強的寒冷和霜凍耐受性、增強的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的味道、改善的紋理、降低的磷酸鹽含量、提高的發芽、提高的微量元素攝取、改善的澱粉組成、增加的花壽命構成的組。本發明還包括用當前方法製造的植物。在另一個方面，本發明提供了修改選定植物中的性狀的方法，包括(a)鑑定待修改的性狀；(b)構建第一多核苷酸，所述第一多核苷酸基本上由從所述選定植物、來自相同物種的植物、或與所述選定植物性上互交可孕的植物分離的天然遺傳元件組成，其中所述天然遺傳元件能夠修改控制性狀的基因的表達(c)構建第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含與啟動子和終止子可操作地連接的選擇性標記基因；(d)用第一和第二多核苷酸共轉染來自所述選定植物的植物細胞；(e)選擇選擇性標記基因的短暫表達；(f)篩選用第一多核苷酸穩定地轉化的、但是不含有整合到基因組中的第二DNA分子的植物細胞；和(g)從展現出修改的性狀表達的轉化的植物細胞獲得穩定地轉化的植物。在一個實施方式中，遺傳元件包含至少一個啟動子、目標序列、終止子、增強子、內含子、間隔區或調節元件。在另一個實施方式中，權利要求4的方法，其中在第二多核苷酸之前用第一多核苷酸轉染植物細胞，或反之。在一個實施方式中，目標序列是基因。在另一個實施方式中，所述基因是突變的或野生型多酚氧化酶基因或突變的或野生型R1基因。在一個其他的實施方式中，目標序列是前導區或尾隨區序列，其中所述前導區或尾隨區序列是位於對植物細胞是天然的基因的上遊或下遊的序列。在又一個實施方式中，目標序列包含可操作地與反義前導區序列連接的有義方向的前導區序列。在又一個實施方式中，目標序列包含可操作地與反義尾隨區序列連接的有義方向的尾隨區序列。在另一個實施方式中，啟動子是可誘導的啟動子。在另一個實施方式中，終止子是酵母ADH終止子序列。根據本發明，前導區構建體從5′-到3′-方向包含啟動子、有義方向前導區序列、前導區的反義序列、和終止子，其中前導區構建體的表達生產雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子促進與之相關的基因的表達的下調。在一個其他的實施方式中，前導區序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因或α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區相連(associated with)，並位於它們的上遊。在另一個實施方式中，尾隨區構建體從5′-到3′-方向包含啟動子、有義方向尾隨區序列、尾隨區的反義序列、和終止子，其中尾隨區構建體的表達生產雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子促進與之相關的基因的表達的下調。在優選的實施方式中，尾隨區序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因或α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區相連，並位於它們的下遊。該方法進一步包括使植物細胞暴露於第二載體，所述第二載體包含標記元件，其中所述標記在被轉化植物中短暫地表達，不被穩定地整合到被轉化植物的基因組中。在一個實施方式中，標記是除草劑抗性基因、抗生素抗性基因或NPTII。優選的，通過土壤桿菌介導的轉化來轉化植物細胞。在一個實施方式中，土壤桿菌介導的轉化依靠使用至少一個二元載體。在又一個實施方式中，土壤桿菌介導的轉化方法使用第一二元載體和第二二元載體。在一個其他的實施方式中，第一二元載體攜帶第一多核苷酸，第二二元載體攜帶第二多核苷酸。本發明提供了修改選定植物中的基因表達的另一個方法，包括(a)鑑定所述功能基因；(b)構建第一多核苷酸，所述第一多核苷酸基本上由從所述選定植物、與選定植物相同物種的植物、或與所述選定植物性上互交可孕的植物分離的天然遺傳元件組成，其中所述天然遺傳元件能夠修改所述基因的表達；(c)構建含有功能性選擇性標記基因的第二多核苷酸；(d)用第一和第二多核苷酸共轉染來自所述選定植物的植物細胞；(e)選擇選擇性標記基因的短暫表達；(f)篩選用第一多核苷酸穩定地轉化的、但是不含有整合到基因組中的第二多核苷酸的植物細胞；和(g)從展現出修改的基因表達的轉化的植物細胞獲得穩定地轉化的植物。優選的，通過土壤桿菌介導的轉化來轉化植物細胞。在一個實施方式中，土壤桿菌介導轉化依靠使用至少一個二元載體。在又一個實施方式中，土壤桿菌介導的轉化方法使用第一二元載體和第二二元載體。在一個其他的實施方式中，第一二元載體攜帶第一多核苷酸，第二二元載體攜帶第二多核苷酸。在另一個實施方式中，第一多核苷酸包含P-DNA、GBSS啟動子、Ubi7啟動子、Ubi3啟動子、PIP啟動子、修改的PPO基因、轉化酶抑制物基因、耐鹽性基因、R1相連的前導區(R1-associatedleader)、磷酸化酶相連的前導區、R1相連的尾隨區、SBE相連的尾隨區、Ubi內含子、GBSS間隔區、UbiT中的至少一個。在另一個實施方式中，第二多核苷酸包含選擇性標記基因、ω-突變的virD2多核苷酸、codA多核苷酸和codA∷upp融合多核苷酸中的至少一個。本發明還包括通過這種方法製造的植物。在一個其他的實施方式中，提供了一種轉基因植物，與非轉基因植物相比其展現出修改的性狀表達，所述轉基因植物衍生自所述非轉基因植物，其中所述轉基因植物被期望的多核苷酸穩定地轉化，所述期望的多核苷酸基本上由分離自所述植物、相同物種的植物、或與所述植物性上互交可孕的植物的天然遺傳元件組成，其中所述多核苷酸修改所述性狀的表達。在另一個優選的實施方式中，本發明的「植物」是單子葉植物，選自由小麥、草皮、草皮草、穀類、玉米、稻米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱和棕櫚構成的組。在又一個實施方式中，本發明的「植物」是雙子葉植物，選自由avacado、馬鈴薯、菸草、番茄、甜菜、椰菜(broccoli)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、poinsetta、豆莢、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊和仙人掌構成的組。在另一個實施方式中，該性狀選自由增強的健康和營養特性、增加的儲藏、提高的產量、增強的耐鹽性、增強的重金屬耐受性、提高的乾旱耐受性、提高的抗病性、提高的昆蟲耐受性、提高的水脅迫耐受性、增強的寒冷和霜凍耐受性、增強的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的味道、改善的紋理、降低的磷酸鹽含量、提高的發芽、提高的微量元素攝取、改善的澱粉組成、增加的花壽命構成的組。在另一個實施方式中，期望的多核苷酸包含P-DNA、GBSS啟動子、Ubi7啟動子、Ubi3啟動子、PIP啟動子、修改的PPO基因、轉化酶抑制物基因、耐鹽性基因、R1相連的前導區、磷酸化酶相連的前導區、R1相連的尾隨區、SBE相連的尾隨區、Ubi內含子、GBSS間隔區、UbiT中的至少一個。本發明還包括大小在20到100bp的範圍內的、分離的邊界樣核苷酸序列，其與來自Agrobacterium tumafaciens的T-DNA邊界序列具有52％到96％之間的序列同一性。在優選的實施方式中，分離的核苷酸序列分離自單子葉植物，所述單子葉植物選自由小麥、草皮、草皮草、穀類、玉米、稻米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱和棕櫚構成的組。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列分離自雙子葉植物，所述雙子葉植物選自由avacado、馬鈴薯、菸草、番茄、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、棉花、poinsetta、豆莢、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊和仙人掌構成的組。在又一個實施方式中，所述分離的核苷酸序列分離自馬鈴薯，具有SEQ ID NO.94或95所示的核苷酸序列。在優選的實施方式中，所述分離的核苷酸序列與來自Agrobacterium tumafaciens的T-DNA邊界序列具有52％的序列同一性。本發明包括包含這種核苷酸序列的載體。本發明還提供了製造用期望的多核苷酸穩定地轉化的植物的方法，包括(a)從所述植物中分離側翼是邊界樣序列的P-DNA，其中所述邊界樣序列與來自Agrobacterium tumafaciens的T-DNA邊界序列具有52％到96％之間的序列同一性；(b)將所述期望的多核苷酸插入到P-DNA邊界樣序列之間，形成P-DNA構建體；和(c)用所述P-DNA構建體轉化來自所述植物的植物細胞；和(d)從用所述P-DNA構建體穩定地轉化的植物細胞中再生植物。在一個實施方式中，所述P-DNA構建體被攜帶在包含主幹整合標記基因的載體上，選擇不包含所述主幹整合標記基因的轉化的植物細胞。在另一個實施方式中，所述主幹整合標記基因是細胞分裂素基因。在另一個實施方式中，不選擇展現出過度產生細胞分裂素的表型的植物幼苗。在又一個實施方式中，所述主幹整合標記基因是IPT基因，不選擇展現出異常的表型或不能發育根系的植物幼苗。在一個其他的實施方式中，所述植物細胞來自單子葉植物，所述單子葉植物選自由小麥、草皮、草皮草、穀類、玉米、稻米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱和棕櫚構成的組。在另一個實施方式中，所述植物細胞來自雙子葉植物，所述雙子葉植物選自由avacado、馬鈴薯、菸草、番茄、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、棉花、poinsetta、豆莢、苜蓿、大豆、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊和仙人掌構成的組。優選的，通過土壤桿菌介導的轉化來轉化植物細胞。在一個實施方式中，土壤桿菌介導轉化依靠使用至少一個二元載體。在又一個實施方式中，土壤桿菌介導的轉化方法使用第一二元載體和第二二元載體。在一個其他的實施方式中，第一二元載體攜帶第一多核苷酸，第二二元載體攜帶第二多核苷酸。在一個進一步的實施方式中，第二二元載體包含至少一個陰性選擇性標記基因和ω-突變的virD2基因，其中所述陰性選擇性標記基因位於右側的T-DNA邊界和左側的T-DNA邊界內，其中所述ω-突變的virD2基因位於第二二元載體的主幹內。在優選的實施方式中，第二二元載體包含位於右側的T-DNA邊界和左側的T-DNA邊界內的陰性選擇性標記基因，以及位於第二二元載體的主幹內的ω-突變的virD2基因。本發明還提供了一種P-DNA，在5′-到3′-方向上，其基本上由第一T-DNA邊界樣序列、啟動子、與啟動子可操作地連接的期望的多核苷酸序列、終止子、第二T-DNA邊界樣序列，其中所述邊界樣序列與T-DNA邊界序列有低於100％的序列同一性。在優選的實施方式中，所述T-DNA邊界樣序列、啟動子、期望的多核苷酸和終止子都分離自相同植物、相同植物物種、或性上互交可孕的植物。在另一個實施方式中，所述P-DNA進一步的基本上由選擇性標記基因組成。在又一個實施方式中，所述T-DNA邊界樣序列、啟動子、期望的多核苷酸、終止子和選擇性標記基因都分離自相同植物、相同植物物種、或性上互交可孕的植物。在又一個實施方式中，P-DNA中的所述期望的多核苷酸序列是位於基因的編碼區的上遊或下遊的序列，其中所述上遊序列是前導區序列，其中所述下遊的序列是尾隨區序列。在這個實施方式中，所述T-DNA邊界樣序列、啟動子、前導區序列、尾隨區序列、終止子和選擇性標記基因都分離自相同植物、相同植物物種、或性上互交可孕的植物。在另一個實施方式中，本發明提供了包含這種P-DNA構建體的載體。在另一個實施方式中，啟動子是可調節啟動子。在又一個實施方式中，所述可調節啟動子是對溫度敏感的。在優選的實施方式中，所述可調節啟動子是小麥wcs120啟動子。在另一個實施方式中，所述啟動子處於時序調節之下。在又一個實施方式中，所述可調節啟動子是羧化酶啟動子。在進一步的實施方式中，所述羧化酶啟動子是玉米羧化酶啟動子。所述啟動子可通過脫落酸、創傷、甲基茉莉酮酸酯或赤黴酸的任何一個來調節。在另一個實施方式中，所述啟動子是選自Rab 16A基因啟動子、□-澱粉酶基因啟動子或pin2基因啟動子的啟動子。在又一個實施方式中，所述啟動子是組織特異性啟動子。在一個其他的實施方式中，前導區序列是基因的5′-非翻譯區的一部分，所述基因對於選定植物物種的細胞是內源的。在另一個實施方式中，所述5′-非翻譯區位於基因的起始密碼子的上遊，所述基因選自以下構成的組PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸4-羥化酶基因、肉桂醯基-輔酶A還原酶基因、肉桂醯基乙醇脫氫酶基因、咖啡醯基輔酶A O-甲基轉移酶基因、肌動蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、過敏原基因、P450羥化酶基因、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內切-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質環氧酶基因、和1-氨基環丙烷-1-羧化物合酶基因。在另一個實施方式中，所述尾隨區序列是位於基因的終止密碼子下遊的基因的3′-非翻譯區的一部分，所述基因選自以下構成的組PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸4-羥化酶基因、肉桂醯基-輔酶A還原酶基因、肉桂醯基乙醇脫氫酶基因、咖啡醯基輔酶A O-甲基轉移酶基因、肌動蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、過敏原基因、P450羥化酶基因、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內切-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質環氧酶基因、和1-氨基環丙烷-羧化物合酶基因。當前的載體可進一步包含間隔區元件，其是Ubi內含子序列或GBSS間隔區序列。在另一個實施方式中，所述載體包含終止子，其是Ubi3終止子序列或內源植物基因的3′-非翻譯區。在另一個實施方式中，所述載體包含與組成型啟動子可操作性連接的選擇性標記基因和與可誘導啟動子可操作性連接的Cre基因，其中所述選擇性標記基因和所述Cre基因的側翼是第一重組酶識別位點和第二重組酶識別位點。在另一個實施方式中，第一重組酶識別位點和第二重組酶識別位點是lox位點。在另一個實施方式中，所述可誘導啟動子是溫度敏感的啟動子、化學誘導的啟動子或時序啟動子。在又一個實施方式中，所述可誘導啟動子是Ha hsp17.7G4啟動子、小麥wcs120啟動子、Rab 16A基因啟動子、α-澱粉酶基因啟動子、pin2基因啟動子、羧化酶啟動子。在又一個優選的實施方式中，進一步包含植物衍生的標記基因。在另一個優選的實施方式中，植物衍生的標記基因是烯醇丙酮醯-3-磷酸莽草酸合酶基因。在本發明的另一個方面，提供了一種修改植物細胞的方法，包括將P-DNA序列整合到植物細胞的基因組中，其中所述P-DNA在5′-到3′-方向上，基本上由第一T-DNA邊界樣序列、啟動子、與所述啟動子可操作性連接的期望的多核苷酸序列、終止子、第二T-DNA邊界樣序列組成，其中所述邊界樣序列與T-DNA邊界序列具有低於100％的序列同一性，和其中所述T-DNA邊界樣序列、啟動子、期望的多核苷酸和終止子對於所述植物細胞的基因組都是天然的或都是從中分離的，其中所述期望的多核苷酸包含與植物中基因的上遊或下遊非編碼區相連的前導區序列或尾隨區序列的有義和反義序列，和其中期望的多核苷酸的表達產生了靶向與所述期望的多核苷酸相連的基因的雙鏈RNA轉錄產物，從而修改所述植物細胞。本發明還包括修改植物的方法，包括(i)用本發明的載體轉染所述植物中的至少一個細胞；(ii)選擇表達功能性選擇性標記的細胞；(iii)分離所述表達功能性選擇性標記的細胞；(iii)在所述分離的細胞中誘導功能性Cre基因的表達；(iv)培養所述分離的細胞；和(ii)觀察培養的細胞的表型；其中與未轉化的植物細胞不同的表型表明目標植物細胞已經被修改。在優選的實施方式中，本發明的這個及其他方法的選擇步驟通過鑑定對抗生素有抗性的細胞來進行。在另一個方面，用於識別其基因組含有P-DNA的目標植物細胞的方法，包括用本發明的載體和第二土壤桿菌衍生的載體共轉染植物靶細胞，所述第二土壤桿菌衍生的載體包含側翼是T-DNA左側邊界和T-DNA右側邊界的標記基因和ω-突變的virD2基因，其中將所述P-DNA整合到所述植物目標細胞的基因組中，和其中沒有所述第二土壤桿菌衍生的載體的部分被整合到所述植物靶細胞的基因組中。在優選的實施方式中，在第二土壤桿菌衍生的載體中的標記是新黴素磷酸轉移酶基因。在另一個方面，提供了用於識別其基因組含有整合盒的至少一部分的目標植物細胞的方法，進一步包括選擇在含卡那黴素的培養基上暫時生長存活的細胞，其中所述選擇的細胞的基因組僅含有所述整合盒。在一個實施方式中，所述目標植物細胞在植物內。本發明還包括包含至少一個細胞的植物，所述細胞的基因組包含這種P-DNA。本發明還包括包含至少一個細胞的植物，所述細胞的基因組被人工地操作來僅含有植物衍生的核酸，其中沒有所述植物的細胞含有整合到細胞基因組中的外源核酸。本發明還包括包含SEQ ID NO.93的多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸的長度在20到80個核苷酸之間。在一個實施方式中，所述多核苷酸的長度在21到70個核苷酸、22到50個核苷酸、23到40個核苷酸或24到30個核苷酸之間。在另一個方面，本發明包括如SEQ ID NO.40所示的塊莖特異性啟動子。本發明還包括製造轉基因植物細胞的基於土壤桿菌的方法，所述植物細胞不含有被穩定地整合到核DNA中的選擇性標記基因，包括a.構建包含多核苷酸的第一二元載體，所述多核苷酸基本上由期望的功能基因組成，在所述期望的功能基因的5′和3′末端可操作地連接T-DNA邊界或T-DNA邊界樣序列；b.構建包含功能性選擇性標記基因的第二二元載體，在所述功能性選擇性標記基因的5′和3′末端可操作地連接T-DNA邊界或T-DNA邊界樣序列；c.將植物細胞與(i)攜帶第一和第二二元載體的土壤桿菌菌株；或(ii)攜帶第一二元載體的第一土壤桿菌菌株和攜帶第二二元載體的第二土壤桿菌菌株孵化；d.在孵化適當的時間後在含有合適的選擇試劑的培養基上，選擇植物細胞，其中在所述植物細胞中期望的功能基因被整合到植物的核DNA中，而沒有所述選擇性標記基因被整合到植物核DNA中。在優選的實施方式中，選擇性標記基因是除草劑抗性基因或抗生素抗性基因。在另一個優選的實施方式中，所述抗生素抗性基因是nNPTII基因。在另一個實施方式中，所述抗生素抗性基因是與來自遍在蛋白-7基因的啟動子和來自酵母乙醇脫氫酶1(ADH1)基因的終止子可操作地連接的npt II結構基因。依據這種方法，所述植物細胞首先與第一土壤桿菌菌株孵化，然後隨後地與第二土壤桿菌菌株孵化，或反之。在優選的實施方式中，第一二元載體進一步的包含二元整合標記基因，所述二元整合標記基因可被用於檢測用二元載體主幹序列穩定地轉化的植物細胞。在另一個實施方式中，所述二元載體整合標記基因選自由除草劑抗性基因、抗生素抗性基因或NPTII構成的組。在又一個實施方式中，第二二元載體進一步包含細菌胞嘧啶脫氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶(upp)基因之間的基因融合物，其被插入到T-DNA或T-DNA邊界樣序列之間，在與第一和第二土壤桿菌菌株孵化後使植物暴露於5-氟胞嘧啶來選擇用第二二元載體轉化的那些植物細胞。在又一個實施方式中，所述第二二元載體進一步包含降低主幹整合概率的基因。在一個實施方式中，這種基因是ω-突變的virD2基因，其中所述ω-突變的virD2基因降低選擇性標記基因整合到植物核DNA中的頻率。本發明還包括包含從S.tuberosum分離的GBSS啟動子的分離的核苷酸序列。在優選的實施方式中，這個分離的核苷酸序列具有SEQ ID NO.6或13的核苷酸序列。本發明還預期用於分離包含T-DNA邊界樣序列的植物多核苷酸的方法，包括(i)片段化植物基因組；(ii)將已知序列的多核苷酸連接到植物DNA片段來產生連接的DNA；(iii)從所述連接的DNA產生PCR產物，其包含(a)與T-DNA邊界序列的一部分同源的序列，(b)來自所述植物基因組的DNA序列，和(c)來自已知序列的多核苷酸的序列，其中所述(a)和(b)的序列是連接的；(iv)對PCR產物測序；(v)根據來自所述植物基因組的DNA序列設計至少一個PCR引物；(vi)在植物基因組DNA的反向PCR中使用至少一個(v)的PCR引物來鑑定來自植物基因組DNA的、是T-DNA邊界樣序列的序列。在一個實施方式中，步驟(iii)的PCR產物通過引物對產生，在引物對中，一個引物具有包含5′-YGR CAG GAT ATA T-3或5′-CAG GAT ATA TNN NNN KGT AAA C-3′的序列。本發明還預期用於產生不含有T-DNA的修改的植物的方法，包括(1)用(i)包含P-DNA內的期望的多核苷酸的土壤桿菌轉化載體，和(ii)包含T-DNA內的選擇性標記的土壤桿菌轉化載體轉化植物細胞；(2)從所述轉化的植物細胞獲得轉化的植物，所述植物在其基因組中包含所述P-DNA的至少一個拷貝和所述T-DNA的至少一個拷貝；(3)使轉化的植物自交或雜交來產生分離了T-DNA和P-DNA的子代植物；和(4)篩選子代植物來鑑定不包含所述T-DNA但包含所述P-DNA的修改的植物。在本發明的另一個方面，預期一種修改的塊莖。在此描述的任何修改的塊莖可以是成熟的塊莖，例如至少12周齡的塊莖。因而，在一個實施方式中，修改的塊莖，其可以是成熟的塊莖，與所述修改的塊莖的物種相同物種的野生型塊莖通常相關的丙烯醯胺水平相比，包含更低至少約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的丙烯醯胺水平。在另一個實施方式中，所述塊莖選自由ahipa、apio、秘魯胡蘿蔔、慈茹、竹芋、baddo、苦樹薯、巴西竹芋、木薯、中國薊、荸薺、椰子、cocoyam、芋、芋根、象耳、菊芋、goo、日本薊、日本馬鈴薯、耶路撒冷薊、豆薯、百合根、ling gaw、mandioca、manioc、墨西哥馬鈴薯、墨西哥豆薯、old cocoyam、馬鈴薯、saa got、sato-imo、seegoo、sunchoke、sunroot、甜樹薯、甘薯、tanier、tannia、tannier、木薯塊根、topinambour、蓮藕、豆薯、薯蕷、和yautia構成的組。在優選的實施方式中，所述馬鈴薯是Russet馬鈴薯、RoundWhite馬鈴薯、Long White馬鈴薯、Round Red馬鈴薯、Yellow Flesh馬鈴薯或Blue和Purple馬鈴薯。在另一個實施方式中，提供了一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖的直鏈澱粉水平相比，包含更大至少約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的直鏈澱粉水平。在另一個實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。在另一個實施方式中，修改的、成熟的塊莖包含與相同物種的野生型塊莖的直鏈澱粉水平相比，約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍的直鏈澱粉水平。在又一個實施方式中，所述修改的塊莖是至少12周齡的。還預期一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的葡萄糖水平相比，包含更低至少約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的冷誘導的葡萄糖水平。在一個其他的實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。在又一個實施方式中，在所述修改的塊莖中的葡萄糖水平比相同物種的野生型塊莖中的葡萄糖水平低約40％。本發明還包括修改的、成熟的塊莖，與相同物種的野生型塊莖中的丙烯醯胺水平相比，其包含減少至1/5的丙烯醯胺水平。在另一個實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。在又一個實施方式中，所述修改的塊莖是至少12周齡的。還包括一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的磷酸鹽水平相比，包含更低至少約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的磷酸鹽水平。在一個實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。在另一個實施方式中，所述修改的塊莖是至少12周齡的。本發明還提供了一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖的物種相同物種的野生型塊莖相關的多酚氧化酶活性水平相比，包含更低至少約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的多酚氧化酶活性水平。在一個其他的實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。本發明還提供了一種包含至少一個細胞的修改的塊莖，所述細胞過量表達無活性的多酚氧化酶基因，其中與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的多酚氧化酶活性水平相比，在所述修改的塊莖中多酚氧化酶活性水平減少了99％、98％、98％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一個實施方式中，所述修改的塊莖是成熟塊莖。在另一個實施方式中，所述修改的塊莖是至少12周齡的。在進一步的實施方式中，在所述修改的塊莖或所述修改的成熟塊莖中多酚氧化酶活性水平減少了50％-90％。在本發明的另一個方面，提供了一種生產不包含T-DNA的轉基因植物的方法。該方法包括用P-DNA載體和T-DNA載體共轉化植物組織；通過在培養基上孵化所述植物組織從轉化的植物組織培植植物苗，所述培養基含有破壞不含所述P-DNA載體或所述T-DNA載體的細胞的物質；選擇含有所述P-DNA或所述T-DNA之一、或兩者的植物苗；將所述植物苗培植到性成熟，使所述性成熟的植物與未轉化的植物雜交；和將細胞僅含有P-DNA的子代植物與含有T-DNA的子代植物分離。在一個實施方式中，所述植物苗被培植到性成熟，然後自交來生產子代植物，在子代植物中的一些將含有僅含P-DNA的細胞。在一個實施方式中，所述P-DNA載體基本上與pSIM340類似。在另一個實施方式中，所述T-DNA載體實質上與pSIM363類似。在又一個實施方式中，所述培養基中的物質是timentine。在另一個實施方式中，所述培養基中的物質是卡那黴素。在又一個實施方式中，timentine和卡那黴素都是所述培養基中的物質。在這些方法任何一個之中，所述T-DNA含有選擇性標記基因。在另一個方面，提供了一種生產不包含T-DNA的轉基因植物的方法。該方法包括用第一P-DNA載體和第二P-DNA載體共轉化植物組織，其中所述第一P-DNA載體包含目標多核苷酸，和其中所述第二P-DNA載體包含選擇性標記基因；通過在培養基上孵化所述植物組織從轉化的植物組織培植植物苗，所述培養基含有破壞不含任何一個所述P-DNA載體的細胞的物質；選擇含有所述P-DNA載體之一、或兩者的植物苗；將所述植物苗培植到性成熟，使所述性成熟的植物與未轉化的植物雜交、或使所述性成熟的植物自交；和將細胞僅包含來自所述第一P-DNA載體的P-DNA的子代植物，與在它們基因組中含有來自所述第二P-DNA載體的P-DNA的子代植物分離。本發明還提供了包含SEQ ID NO.96中描述的序列的核酸，其能將一種多核苷酸轉移到另一種多核苷酸中。在一個其他的實施方式中，提供了一種含有與SEQ ID NO.96中描述的序列具有90％的序列同一性的序列的核酸。還包括包含SEQ ID NO.97中描述的序列的核酸，其能將一種多核苷酸轉移到另一種多核苷酸中。在一個實施方式中，提供了一種含有與SEQ ID NO.97中描述的序列具有90％的序列同一性的序列的核酸。
附圖的簡要說明附

圖1.用於本發明的某些P-DNA載體的示意圖。P-DNA區用灰色框表示。「ipt」＝ipt基因的表達盒；「npt」＝nptII基因的表達盒；「mPPO」＝修改的PPO基因的表達盒；「INH」＝轉化酶抑制物基因的表達盒；「GUS」＝GUS基因的表達盒；「LPPO」＝與PPO基因相連的前導區的有義和反義拷貝的表達盒；「LPH」＝與磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的表達盒；「Alf」＝馬鈴薯Alfin同源物的表達盒。詳情參見正文。附圖2.無基因的表達盒附圖3.馬鈴薯和菸草轉化酶抑制物蛋白的比對。「St」＝Solanum tuberosum(馬鈴薯)；「Nt」＝Nicotiana tabacum(菸草)附圖4.與各種PPO基因相連的尾隨區的對比。附圖5.用於本發明的某些LifeSupport載體的示意圖。「codA」是codA基因的表達盒；「codA∷upp」是與upp融合的codA基因的表達盒；「ΩvirD2」是ΩvirD2基因的表達盒。
優選實施方式的詳細說明本發明的「精確育種」策略改進了植物和作物的農學性能、營養價值和健康特徵，而不將未知的核酸、或來自外源物種的核酸導入到植物物種基因組中，不產生不合需要的表型或有害的副作用。因而，本發明提供了轉基因植物，和製造這種植物的方法，所述方法不將來自非植物物種的核酸整合到該植物的基因組中。整合到選定植物基因組中的核酸、啟動子、調節元件、其他非編碼基因序列、標記、多核苷酸和基因優選的都是從待轉化的植物、與待轉化植物相同物種的植物、或與待轉化植物在性上互交可孕的植物中分離的。可以根據在此描述的方法對這種「天然」核酸進行突變、修改或在表達盒中與其他天然的核酸共連接並重整合到選定植物基因組中。因此，僅利用選定植物自己的核酸、或利用來自與選定植物在性上相容的植物的核酸，改變了轉基因植物的基因型和表型。為了便於產生這種轉基因植物，本發明利用了這樣的事實，不是所有在土壤桿菌介導的轉化中使用的T-DNA載體都實際上整合到植物基因組中；即，雖然植物細胞可能接受了載體，可能不發生實際的整合事件。根據本發明，人們可以使用這種載體來將選擇性標記基因運入植物細胞。然後可以篩選植物細胞，以通過測定標記基因表達多久來確定所述標記是否被穩定地整合到植物基因組中。因此，僅短暫地表達選擇性標記基因的植物細胞是期望的，因為它們代表接受了選擇性標記基因、但沒有將選擇性標記基因整合到它們的基因組中的細胞。因而，通過用這種「標記載體」和用另一個含有期望的天然基因或多核苷酸的載體共轉化植物，人們可以選擇接受了兩個載體的植物細胞，從這些植物細胞中，確定哪些細胞具有僅含期望的基因或多核苷酸的基因組。可以修改「標記載體」來進一步降低標記整合到植物基因組中的可能性。本發明以「LifeSupport」載體的形式提供這種「標記載體」。如果沒有另外定義，此處使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬技術領域的一個普通技術人員通常所理解的相同含義。一般地，在此使用的命名，細胞培養、分子遺傳學和核酸化學中的實驗方法，和在此描述的雜交是本領域公知和常用的。對於重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、轉化、轉染、轉導、分析化學、有機合成化學、化學合成、化學分析和藥物製劑和遞送，使用標準技術。一般地，根據廠家的說明進行酶促反應和純化和/或分離步驟。一般根據公開的常規方法，例如，Molecular cloning alaboratory manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1989)，和Current protocols in molecular biology，John Wiley Sons，Baltimore，MD(1989)中公開的，來進行這些技術和步驟。胺基酸序列如在此使用的，包括低聚肽、肽、多肽或蛋白和其片段，是從植物分離的、對於植物是天然的、或在植物中天然存在的，或是合成製成的但包含內源對應物的核酸序列。人工操作的如在此使用的，「人工操作的」是指通過手工或機械手段或重組手段，例如通過遺傳工程技術，來移動、調整、操作或控制植物或植物細胞，以便產生與未操作的、天然發生的對應物相比具有不同的生物學的、生物化學的、形態學的或生理學上的表型和/或基因型的植物或植物細胞。無性繁殖通過不涉及配子體融合的，從葉插(leafcuttings)、枝插、根插、塊莖芽眼、匍匐枝、單個植物細胞原生質體、愈傷組織等等產生完整的植物，來生產子代。主幹(backbone)除了用於轉移的T-DNA或P-DNA序列之外的二元載體的核酸序列。邊界和邊界樣序列「邊界序列」是特定的土壤桿菌衍生的序列。一般地，左側邊界序列和右側邊界序列在T-DNA的兩側，它們都作為virD2催化的切割反應的識別位點起作用。這種活性釋放了位於這樣的邊界之間的核酸。邊界序列的例子參見下文的表2。與virD2和virE2複合的、釋放的核酸被靶向植物細胞核，在細胞核中所述核酸常被整合到植物細胞的基因組中。通常，兩個邊界序列，左側邊界和右側邊界，被用於將位於它們之間的核苷酸序列整合到另一個核苷酸序列中。也可能僅使用一個邊界，或使用多於兩個的邊界，來以這種方式實現期望核酸的整合。根據本發明，「邊界樣」序列分離自待修改的(to bemodified)選定植物物種，或分離自與待修改的植物物種性上相容的植物，象土壤桿菌的邊界序列一樣起作用。也就是說，本發明的邊界樣序列促進和便於與之連接的多核苷酸的整合。本發明的植物DNA，即P-DNA優選的含有邊界樣序列。P-DNA的邊界樣序列長度在5-100bp、10-80bp、15-75bp、15-60bp、15-50bp、15-40bp、15-30bp、16-30bp、20-30bp、21-30bp、22-30bp、23-30bp、24-30bp、25-30bp、或26-30bp之間。本發明的邊界樣序列可以分離自任何植物，例如分離自馬鈴薯和小麥。對於在兩個末端含有分離自馬鈴薯和小麥的邊界樣序列的序列，參見SEQ ID NOs.1和98和SEQ ID NO.34。因而，用於本發明的P-DNA左側和右側邊界序列對於待修改的植物是天然的和/或是從中分離的。P-DNA邊界樣序列在核苷酸序列上與任何已知的、土壤桿菌衍生的T-DNA邊界序列是不相同的。因而，P-DNA邊界樣序列可具有與來自土壤桿菌物種，例如根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或Agrobacterium rhizogenes的T-DNA邊界序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個核苷酸。也就是說，本發明的P-DNA邊界或邊界樣序列與來自土壤桿菌物種，例如根癌土壤桿菌或Agrobacteriumrhizogenes的T-DNA邊界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的序列同一性，但不是100％的序列同一性。如在此使用的，描述性術語「P-DNA邊界」和「P-DNA邊界樣」是可互換的。天然P-DNA邊界序列與土壤桿菌T-DNA邊界序列在核苷酸序列上有大於或等於99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的相似性。因此，可以從植物基因組中分離邊界樣序列，然後進行修改或突變來改變它們能夠將核苷酸序列整合到另一個核苷酸序列中的效率。可以將其他的多核苷酸序列添加到或摻合到本發明的邊界樣序列內。因而，可以修改P-DNA左側邊界或P-DNA右側邊界以便具有5′-和3′-多克隆位點，或其他限制性位點。可以修改P-DNA邊界序列來增加來自伴隨載體的主幹DNA不整合到植物基因組中的可能性。下文的表2描述了已知T-DNA邊界序列的序列，和在此被鑑定為邊界樣序列的序列。在表2中的被鑑定為「邊界樣」的序列先前都未被鑑定為具有T-DNA邊界樣結構。馬鈴薯邊界樣序列是通過當前的發明性方法，利用簡併引物在聚合酶鏈式反應中從馬鈴薯基因組DNA分離的。本發明包括任何P-DNA邊界樣序列用於將連接的多核苷酸轉移到植物細胞的基因組中的用途。實際上，本發明包括具有SEQ ID NO.93ANGATNTATN6GT(SEQ ID NO.93)的核酸序列結構的任何邊界樣序列，其中「N」是任何核苷酸，例如那些由「A」、「G」、「C」或「T」表示的核苷酸。這個序列代表由本發明鑑定出的邊界樣核酸的共有序列。
表2.「邊界」和「邊界樣」序列
Y＝C或T；R＝A或G；K＝G或T；M＝A或C；W＝A或T；S＝C或G；V＝A，C，或G；B＝C，G，或T。
邊界樣序列的登記號是Oryza sativa染色體10BACOSJNBa0096G08基因組序列(AC078894.11)；Arabidopsis thaliana染色體3(NM_114337.1)；Arabidopsis thaliana染色體1(NM_105664.1)；T.tengcongensis菌株MB4T，完整基因組的244的118節(AE013091.1)；Homo sapiens克隆HQ0089(AF090888.1)；Rhizobium克隆rhiz98e12.q1k.*馬鈴薯左右邊界序列是根據當前描述的發明性方法獲得和分離的。載運體(carrier)DNA「載運體DNA」是一種用於攜帶某些遺傳元件並將它們遞送到植物細胞中的DNA片段。在常規的外源DNA轉移中，這種載運體DNA常常是土壤桿菌的T-DNA，由邊界序列劃定。在此描述的載運體DNA是從待修改的選定植物物種獲得的，含有末端，所述末端在結構和功能上可以不同於T-DNA邊界，但與這種T-DNA一樣具有支持將DNA從土壤桿菌轉移到植物細胞或某些其他真核生物的核中，並且隨後將這個DNA整合到這種真核生物的基因組中的能力。基本上由......組成組合物「基本上由」某些元素「組成」，限於包括那些元素，以及實質上不影響所述發明性組合物的基本的和新的特徵的那些元素。因而，只要組合物不影響當前發明的基本的和新的特徵，也就是說，不含有不是來自選定植物物種或與所述選定植物物種性上相容的植物的外源DNA，那麼這樣的組合物就可認為是以「實質上由......組成」的措辭表徵的發明性組合物的一員。簡併引物「簡併引物」是含有足夠的核苷酸變異的寡核苷酸，從而使得它可以在與近似同源度、但不是完全同源的序列雜交時容許鹼基錯配。雙子葉植物(dicot)其胚具有兩個籽葉或子葉的有花植物。雙子葉植物的實例包括，但不限於，菸草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、豆類包括苜蓿和大豆、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、和仙人掌。調節序列是指對於本領域技術人員而言是標準的和已知的那些序列，可以被包括在表達載體中來在植物系統中增加和/或最大化目標基因的轉錄或產生的RNA的翻譯。這些序列包括，但不限於，啟動子、肽輸出信號序列、內含子、聚腺苷酸和轉錄終止位點。修改核酸構建體來增加植物中的表達水平的方法也是本領域一般已知的(參見，例如Rogers et al.，260 J.Biol.Chem.3731-38，1985；Cornejo et al.，23 Plant Mol.Biol.56781，1993)。在工程化植物系統來影響蛋白的轉錄速率時，各種因子是本領域已知的，包括調節序列，例如正或負作用序列、增強子、沉默子、以及可能具有嵌塞(impact)的染色質結構。本發明規定，在工程化植物表達目標蛋白時至少可以使用這些因子之一。本發明的調節序列是天然的遺傳元件，即，是從待修改的選定植物物種中分離的。外源的關於核酸「外源的」是指該核酸來源於非植物有機體、或來源於與待轉化的植物不同物種的植物、或來源於與待轉化植物不是互交可孕的植物，不屬於目標植物的物種。根據本發明，外源的DNA或RNA代表天然地存在於真菌、細菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥類的遺傳組成中，但不是天然地存在於待轉化的植物中的核酸。因而，外源核酸是編碼，例如，不由被轉化植物天然地產生的多肽的核酸。外源核酸不必編碼蛋白產物。根據本發明，期望的轉基因植物是不含有整合到其基因組中的任何外源核酸的植物。另一方面，根據本發明，天然的遺傳元件可以被摻合和整合到選定植物物種的基因組中。天然的遺傳元件是從屬於選定植物物種的植物、或從與選定植物物種性上相容的植物分離的。舉例來說，摻合到培養的馬鈴薯(Solanum tuberosum)中的天然DNA可以來源於S.tuberosum的任何基因型、或與S.tuberosum性上相容的野生馬鈴薯物種的任何基因型。基因「基因」指編碼區，並且不包括該區的5′-或3′-的核苷酸序列。功能基因是與啟動子或終止子可操作地連接的編碼區。遺傳重排是指可能自發地在體內以及體外發生的、引入遺傳物質的新結構的遺傳元件的重新組合。舉例來說，在不同的染色體座位上將多核苷酸拼接在一起，可以在植物發育和有性重組期間在體內自發地發生。因此，通過非天然遺傳修改技術的體外遺傳元件重組，與也可通過有性重組在體內發生的重組事件是同類的。In frame核苷酸三聯體(密碼子)在植物細胞中被翻譯為期望的重組蛋白的初生胺基酸序列。特別地，本發明預期在閱讀框中與第二核酸連接的第一核酸，其中，第一核苷酸序列是基因，第二核苷酸序列是啟動子或類似的調節元件。整合是指將來自選定植物物種、或來自與選定植物相同物種的植物、或來自與選定植物物種性上相容的植物的核酸序列，插入到選定植物物種的細胞的基因組中。「整合」是指僅將天然的遺傳元件摻合到植物細胞基因組中。為了整合天然的遺傳元件，例如通過同源重組整合，本發明可以「使用」非天然DNA作為這種過程中的步驟。因而，本發明在「使用」特定DNA分子和「整合」特定DNA分子到植物細胞基因組中之間是有區分的。導入如在此使用的，是指通過包括感染、轉染、轉化和轉導的方法將核酸序列插入到細胞中。分離的「分離的」是指物理上與其正常的、天然的環境分開的任何核酸或化合物。所述分離的材料可以維持在適合的溶液中，所述溶液含有，舉例來說，溶劑、緩衝液、離子、或其他成分，可以是純化的或未純化的形式。前導區在基因之前(或基因的5′)的轉錄但不翻譯的序列。LifeSupport載體(vector)LifeSupport載體是含有可表達的選擇性標記基因，例如位於T-DNA或T-DNA樣邊界之間的新黴素磷酸轉移酶標記，的構建體。可以修改LifeSupport載體來限制這種標記以及位於所述邊界或邊界樣序列之間的其他多核苷酸整合到植物基因組中。舉例來說，LifeSupport載體可包含突變的virD2、codA∷upp融合物、或這些遺傳元件的任何組合。因而，修改的virD2蛋白將仍然支持T-DNA轉移到植物核中，但將限制隨後的T-DNA的基因組整合的效率(Shurvinton et al.，Proc Natl Acad Sci USA，8911837-11841，1992；Mysore et al.，Mol Plant Microbe Interact，11668-683，1998)。做為選擇，codA∷upp基因融合物可在再生前被用作陰性選擇性標記。在優選的構建體中，LifeSupport載體包含與酵母ADH終止子元件可操作地連接的npt標記。單子葉植物(monocot)其胚具有一個籽葉或子葉的有花植物。單子葉植物的實例包括，但不限於草皮草、玉米、稻米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥和棕櫚。天然的(native)「天然的」遺傳元件是指天然地存在於、或來源於、或屬於待轉化植物的基因組的核酸。因而，分離自待轉化植物或植物物種的基因組的、或分離自與待轉化植物物種性上相容或互交可孕的植物或物種的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，對於所述植物物種是天然的，即，是天生的。換句話說，天然的遺傳元件代表植物育種家通過經典植物育種來改進植物所可以使用的所有遺傳物質。根據本發明，天然的核酸的任何變體也認為是「天然的」。在這點上，「天然的」核酸可以分離自植物或其性上相容(sexually compatible)的物種，並且可以被修改或突變，從而產生的變體在核苷酸序列上與從植物分離的未修改的、天然的核酸具有大於或等於99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％ 75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性。天然的核酸變體也可在核苷酸序列上具有少於約60％、少於約55％，或少於約50％的相似性。分離自植物的「天然的」核酸也可編碼由該核酸轉錄和翻譯的、天然發生的蛋白產物的變體。因而，「天然的」核酸可以編碼蛋白質，所述蛋白質在胺基酸序列上與未修改的、在植物中表達的天然蛋白質相比，具有大於或等於99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％ 90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％ 75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性，所述核酸分離自所述植物。天然發生的核酸這個術語是指，所述核酸在選定植物物種的基因組中被發現，可以是DNA分子或RNA分子。通常存在於植物物種的基因組中的限制性位點序列可以被工程化到外源DNA分子，例如載體或寡核苷酸中，即使該限制性位點沒有物理上地從所述基因組分離。因而，本發明允許核苷酸序列，例如限制性內切酶識別序列的合成性生成，只要該序列天然地存在於選定植物物種的基因組中或與待轉化的選定植物物種性上相容的植物中。可操作地連接以這樣的方式組合兩個或多個分子，從而它們在植物細胞中以組合方式適當地起作用。舉例來說，當啟動子控制結構基因的轉錄時，啟動子可操作地連接到結構基因。P-DNA根據本發明，P-DNA(「植物-DNA」)分離自植物基因組，在每個末端或僅在一個末端包含T-DNA邊界樣序列。邊界樣序列優選的與來自土壤桿菌物種，例如Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes的T-DNA邊界序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或至少95％，但少於100％的序列同一性。因而，P-DNA可被用來替代T-DNA來將核苷酸序列從土壤桿菌轉移到另一個多核苷酸序列。可以修改P-DNA來促進克隆，並且應當優選的不天然地編碼蛋白或蛋白的部分。P-DNA的特徵在於，其在每個末端含有至少一個邊界序列，被稱為「P-DNA邊界序列」或「P-DNA邊界樣序列」，其是可互換的術語。參見上文「邊界序列」和「邊界樣」的定義。P-DNA也可被認為是「T-DNA樣」序列，參見下文的定義。植物包括被子植物和裸子植物例如馬鈴薯、番茄、菸草、苜蓿、萵苣、胡蘿蔔、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草皮草、小麥、稻米、大麥、高粱、燕麥、橡樹、桉樹、胡桃和棕櫚。因而，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在此使用的詞語「植物」，還包括植物細胞、種子、植物子代、不管是有性地還是無性地產生的繁殖體、和這些的任何一種的派生物，例如插條或種子。植物細胞包括懸浮培養物、愈傷組織、胚、分生組織區、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物可以處於各種成熟階段，可以在液體或固體培養基中，或在土壤中或在罐中的適合的培養基中、溫室或田地中生長。導入的前導區、尾隨區或基因序列在植物中的表達可以是短暫的或永久的。「選定的植物物種」可以是，但不限於，這些「植物」的任何一個的物種。精確的育種是指通過將從選定植物物種、或從與選定植物相同物種的另一個植物、或從與選定植物物種性上相容的物種分離的核酸，例如天然的基因和調節元件，穩定地導入植物細胞個體中，隨後將這些遺傳修改的植物細胞再生成完整植物，來改進植物。由於沒有未知的或外源的核酸被永久地摻合到植物基因組中，該發明性的技術利用了常規的植物育種也可使用的相同的遺傳物質。植物物種屬於各種正式命名的植物物種的、至少展現了某些性相容性的植物的群體。植物轉化和細胞培養泛指通過它們來遺傳地修改植物細胞，並轉移到適合的植物培養基，用於維持、進一步生長、和/或進一步發育的過程。重組如在此使用的，廣泛地描述各種技術，通過這些技術可以克隆基因、對DNA測序、產生蛋白產物。如在此使用的，該術語還描述將基因轉移到植物宿主系統的細胞中後產生的蛋白質。選擇性標記「選擇性標記」一般是基因，所述基因編碼賦予對抗生素、除草劑或有毒化合物的某種抗性的蛋白質，被用來鑑定轉化事件。選擇性標記的實例包括編碼鏈黴素抗性的鏈黴素磷酸轉移酶(spt)基因，將甘露糖-6-磷酸轉變成果糖-6磷酸的磷酸甘露糖異構酶(pmi)基因；編碼卡那黴素和geneticin抗性的新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因，編碼潮黴素抗性的潮黴素磷酸轉移酶(hpt或aphiv)基因，編碼對磺醯脲型除草劑的抗性的乙醯乳酸合酶(als)基因，編碼對抑制穀氨醯胺合酶的作用的除草劑，例如膦絲菌素或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或其他本領域已知的類似基因。有義抑制通過在轉基因植物中表達基因的全部或部分的一個或多個額外的拷貝來減少內源基因的表達。T-DNA樣「T-DNA樣」序列是從選定植物物種或從與所述選定植物物種性上相容的植物分離的、與土壤桿菌物種T-DNA具有至少75％、80％、85％、90％、或95％，但不是100％的序列同一性的核酸。T-DNA樣序列可含有每個都能將核苷酸序列整合到另一個多核苷酸中的一個或多個邊界或邊界樣序列。如在此使用的「P-DNA」是T-DNA樣序列的實例。尾隨區(trailer)在基因之後(或3′)轉錄但不翻譯的序列。轉錄的DNA包含基因以及與該基因相連的非翻譯的前導區和尾隨區序列的DNA，其在前方的啟動子的作用下被轉錄為單個mRNA。轉錄和翻譯終止子本發明的表達載體一般在轉錄起始調節區的相反的末端具有轉錄終止區。可以選擇轉錄終止區，用來穩定mRNA來增加表達和/或用於將聚腺苷酸尾部添加到基因轉錄產物(Alber Kawasaki，Mol. Appl.Genetics 419-34，1982)。說明性的轉錄終止區包括豌豆RBCS基因的E9序列(Mogen et al.，Mol.CellBiol.，125406-14，1992)和各種遍在蛋白基因的終止信號。植物細胞的轉化一種過程，通過它將DNA穩定地整合到植物細胞的基因組中。「穩定地」是指在細胞基因組中和通過細胞基因組，多核苷酸的永久的、或非短暫的保留和/或表達。因而，穩定地整合的多核苷酸是在轉化的細胞基因組中的固定成分，可以通過所述細胞或產生的轉化植物的連續子代來複製和繁殖。轉化可以在天然的或人工的條件下利用本領域公知的各種方法來進行。轉化可以依靠任何已知的方法來將核酸序列插入到原核的或真核的宿主細胞中，包括土壤桿菌介導的轉化方案、病毒感染、頸鬚(whishkers)、電穿孔、熱激、脂轉染、聚乙二醇處理、顯微注射和粒子轟擊。轉基因將被插入到宿主基因組中的基因，包含蛋白編碼區。在本發明的上下文中，包含轉基因的元件是從宿主基因組分離的。轉基因植物含有至少一個轉基因的遺傳地修改的植物。塊莖塊莖是加厚的、通常是地下的、食物貯藏器官，其缺乏基板(basal plate)和種皮樣覆蓋，而球莖和鱗莖具有。根和芽從塊莖的表面上的生長芽，稱作「芽眼」長出。某些塊莖，例如杯芋caladiums，隨著植物生長大小減小，在芽眼處形成新的塊莖。其他的，例如有塊莖的秋海棠，在生長季節中保存養分時大小增加，同時發育新的生長芽。塊莖可以是皺縮的和堅硬的或稍微肉質的。它們可以是圓形、扁平的、奇形怪狀的或粗糙的。塊莖的實例包括，但不限於ahipa、apio、秘魯胡蘿蔔、慈茹、竹芋、baddo、苦樹薯、巴西竹芋、木薯、中國薊、荸薺、椰子、cocoyam、芋、芋根、象耳、菊芋、goo、日本薊、日本馬鈴薯、耶路撒冷薊、豆薯、百合根、ling gaw、mandioca、manioc、墨西哥馬鈴薯、墨西哥豆薯、old cocoyam、馬鈴薯、saa got、sato-imo、seegoo、sunchoke、sunroot、甜樹薯、甘薯、tanier、tannia、tannier、木薯塊根、topinambour、蓮藕、豆薯、薯蕷、和yautia。馬鈴薯的實例包括，但不限於Russet馬鈴薯、Round White馬鈴薯、LongWhite馬鈴薯、Round Red馬鈴薯、Yellow Flesh馬鈴薯和Blue和Purple馬鈴薯。塊莖可以被分類為「微型塊莖」、「迷你塊莖」、「半成熟」塊莖，和「成熟」塊莖。微型塊莖是在組織培養基中生長的，大小很小的塊莖。「很小」是指約0.1cm-1cm。「迷你塊莖(minituber)」是比微型塊莖大，在土壤中生長的塊莖。「半成熟」塊莖來自開始衰老的植物，如果在溫室中生長是約9周齡。「成熟」的塊莖是來自已經經歷了衰老的植物。成熟的塊莖是，例如，約12周齡或更多周齡的塊莖。使用/利用本發明預想利用來自不是待轉化的選定植物物種的物種的核酸，來促進天然的遺傳元件整合到選定植物基因組中，只要這種外源核酸不被穩定地整合到同樣的宿主植物基因組中。舉例來說，天然遺傳元件被克隆、置入或操縱到其中的質粒、載體或克隆構建體可以來源於與衍生所述天然遺傳元件的物種不同的物種。變體在此使用的「變體」被理解為是指與標準的、或給定的特定基因或蛋白的核苷酸或胺基酸序列有區別的核苷酸或胺基酸序列。術語「同種異形」「同種型」和「類似物」也是指核苷酸或胺基酸序列的「變體」形式。通過添加、移除或替換一個或多個胺基酸而改變的胺基酸序列，或在核苷酸序列中的變化，可被認為是「變體」序列。變體可具有「保守性」變化，其中被取代的胺基酸具有類似的結構或化學性質，例如，用異亮氨酸替換亮氨酸。變體也可具有「非保守性」變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的較小的變異也可包括胺基酸刪除或插入，或刪除和插入。利用本領域公知的電腦程式，例如Vector NTI Suite(InforMax，MD)軟體，可以獲得在確定哪個胺基酸殘基可以被取代、插入或刪除方面的指導。應當理解的是，本發明不限於在此描述的特定方法、方案、載體和試劑等，這些都可以變化。還需要理解的是，在此使用的專有名詞僅用於描述特定實施方式的目的，不意在限制本發明的範圍。必須指出的是，在此使用的和在附隨的權利要求中，單數形式「a」、「an」和「the」包括複數的引用，除非上下文中另有明顯的指示。因而，例如，提及「a gene」是指一個或多個基因，包括本領域技術人員公知的其等同體等。實際上，本領域技術人員可以使用在此描述的方法來在植物宿主系統中表達任何天然的基因(目前或後來知道的)。
P-DNA載體土壤桿菌介導的轉化方法是將重組NDA摻合到植物細胞中的優選的方法。根據本發明，開發一種二元載體來生產僅含有天然的馬鈴薯核酸的、遺傳地修改的馬鈴薯植物。這種載體在三個方面不同於常規的土壤桿菌介導的轉化載體(1)不同於由T-DNA邊界劃定的土壤桿菌衍生的T-DNA序列，當前的載體含有側翼是邊界樣序列的天然植物DNA(P-DNA)片段，所述邊界樣序列儘管在結構和功能上不同於T-DNA邊界，它們支持P-DNA從土壤桿菌轉移到植物細胞，(2)當前載體的主幹可含有標記，從而，如果被整合到植物細胞的基因組中，可防止這些細胞發育成成熟植物，和(3)當前載體在P-DNA末端之間不含有外源的選擇性標記基因。令人驚訝地，本發明表明，側翼是邊界樣序列的P-DNA片段支持DNA從土壤桿菌轉移到植物細胞中。P-DNA可以利用引物從任何植物的基因組中分離，所述引物是根據馬鈴薯P-DNA的末端和常規T-DNA邊界之間的同源性設計的。然後可以測試這種片段，如果是有效的，可專門地用於用天然DNA轉化該植物。也可能通過利用如『blastn』(Altschul et al.，J Mol Biol 215403-10，1990)的程序來在植物基因組資料庫中搜索帶有顯示了與T-DNA的同源性的區域的DNA片段。然後可以修改鑑定出的P-DNA來增加它們的實用性。舉例來說，可以刪除分離的P-DNA的內部片段，可以添加限制性位點來便於克隆。在末端序列導入點突變也可能是有效的，來使P-DNA在轉移DNA方面更有效。本發明還包括用於分離對於植物基因組是天然的植物邊界樣序列的各種聚合酶鏈式反應策略。這種策略的目標是獲得位於天然「邊界樣」序列的上遊或下遊的、植物基因組的一部分的核酸序列。然後這種序列可被用於設計兩個或多個引物，用於隨後對消化和環化的基因組植物DNA進行反向PCR，其產物含有天然植物邊界樣元件的真實序列。舉例來說，本發明考慮了一種方法，通過這種方法，在第一步，用限制性內切酶消化總植物DNA，並連接到已知序列的多核苷酸上。這個連接產物用引物對通過PCR擴增，其中引物之一，「邊界」引物，與植物邊界樣序列退火，其中另一個引物，「錨」引物，與已知序列退火。將這個反應的產物連接到已知序列的第二多核苷酸，產生的模板被用於用邊界引物和第二錨引物進行PCR。將終產物克隆到質粒中並測序。這個產物的序列包含與邊界引物退火的核酸序列、鄰近的植物DNA序列、來自第一已知多核苷酸的序列和來自第二已知多核苷酸的序列。根據鄰近的植物DNA的序列，設計至少兩個引物來對用限制性內切酶消化的和自我環化的總植物DNA進行反向PCR。在將反向PCR產物克隆到載體中之後，進行分子的分析來測定所述植物邊界樣元件的真實序列。所有提及的方法都是標準的實驗室做法。可以將任何基因表達盒插入到P-DNA邊界樣序列之間。對於馬鈴薯轉化，這種表達盒可以由馬鈴薯啟動子，其可操作地與馬鈴薯基因連接，和/或與該基因相連的前導區或尾隨區序列，和隨後的馬鈴薯終止子組成。表達盒可含有其他馬鈴薯遺傳元件，例如框內與該基因的5′-末端融合的信號肽序列，和馬鈴薯內含子，例如可以置於啟動子和目標基因之間來增加表達的內含子。為了用修改的P-DNA轉化小麥，在小麥P-DNA上插入的所有遺傳元件，包括P-DNA本身，可來源於小麥或與小麥性上相容的植物物種。分離P-DNA的另一個途徑是產生土壤桿菌菌株的文庫，其含有隨機的植物DNA片段，而不是選擇性標記側翼的T-DNA。可以將用這個文庫感染的外植體置於含有適合的選擇試劑的增殖培養基上，來鑑定支持標記基因從土壤桿菌中的載體轉移到植物細胞的P-DNA。有可能的是，不僅天然的修改的P-DNA，還有其他的質粒序列，在轉化過程期間從土壤桿菌共轉移到植物細胞。對於本發明的目的，這是不合需要的過程，因為這種質粒「主幹」序列代表非植物的、外源的DNA，如細菌DNA。本發明防止含有主幹序列的轉化的植物細胞發育成成熟的植物。因而，本發明使得在再生的幼苗階段區分含主幹的和無主幹的轉化事件成為可能。選擇或篩選主幹整合事件的方法依靠載體主幹中、P-DNA之外標記表達盒的存在，標記例如異戊烯磷酸轉移酶(IPT)基因。在主幹整合後，IPT誘導的細胞分裂素的累積將改變轉化的幼苗的形狀，防止這些幼苗發育根。除IPT基因之外，可以使用可改變轉化植物的葉、根、莖的形狀、紋理、或顏色，高度或某些其他形態特徵的其他基因，來篩選和/或選擇主幹整合事件。這種基因在此被稱為「主幹整合標記」。因而，可以知道展現出可歸因於主幹整合標記基因表達的改變的形態特徵的被轉化植物，在它的基因組中除期望的P-DNA外含有外源DNA。因此，展現出與主幹整合標記有關的表型的植物不是期望的。本發明不局限於僅使用IPT基因作為主幹整合標記，可以按這種方式使用其他基因。例如，主幹整合標記可以是土壤桿菌transzeatine合酶(TZS)基因(Krall et al.，FEBS Lett 527315-8，2002)或隱性Arabidopsis基因hoc1(Catterou et al.，Plant J 30273-87，2002)。這個方法比在載體主幹序列中插入有毒基因的某些方法能更容易地應用於本發明中。參見，例如，EP 1009,842。通過將主幹整合標記基因，例如功能性細胞分裂素基因置於P-DNA的上遊或下遊，可以直接地區分轉化事件。棄去展現出改變的形態特徵的轉化的植物，因為它們含有整合到基因組中的非天然DNA序列。用於鑑定僅用天然DNA穩定地轉化的植物的另一個策略，是使用聚合酶鏈式反應。通過使用為檢測主幹序列特別設計的引物，可以鑑定植物並丟棄那些除P-DNA外含有外源主幹序列的那些植物。可以隨後使用其他引物組來證實P-DNA的完整轉移。因而，通過使用基因的表達來改變植物的形態特徵，或通過篩選轉化的植物中穩定地整合的外源DNA，可以鑑定和選擇出僅用天然DNA序列穩定地轉化的植物。可以將來自特定宿主植物的遺傳元件插入到在E.coli和土壤桿菌中都能複製的二元載體的P-DNA序列中。將產生的載體導入到解毒的土壤桿菌菌株，例如LBA4404，可以通過對化學上的感受態細胞進行電穿孔、三親雜交或熱休克處理來實現。然後新的菌株可被用於通過感染整個植物或外植體來轉化單個植物細胞。可以將來自特定宿主植物的遺傳元件插入到在E.coli和土壤桿菌中都能複製的二元載體的P-DNA序列中。將產生的載體導入到土壤桿菌菌株，例如LBA4404，可以通過對化學上的感受態細胞進行電穿孔、三親雜交或熱休克處理來實現。然後新的菌株可被用於通過感染整個植物或外植體來轉化單個植物細胞。LBA4404含有解毒的(disarmed)Ti質粒pAL4404，其帶有致病功能和鏈黴素抗性基因。
LifeSupport載體儘管細菌標記基因穩定地整合到植物細胞的基因組中便於鑑定轉化事件，這種對植物基因組的修改是不合需要的，因為標記基因代表外源的DNA。通過開發新的基於土壤桿菌的轉化方法可以避免使用外源的標記基因。一個優選的實施方式是依靠使用兩個土壤桿菌菌株的新方法一個菌株含有二元載體，所述二元載體帶有要在植物核中短暫表達的選擇性標記基因，另一個菌株攜帶P-DNA，所述P-DNA帶有要在植物基因組中穩定整合的目標真實序列(見實施例7)。在用土壤桿菌菌株共感染後，某些植物細胞將接受帶有標記基因的T-DNA和帶有目標序列的P-DNA。作為隨後通過使感染的外植體長期置於合適的抗生素中來選擇標記基因的穩定整合的替代，外植體僅暫時地暴露於抗生素中。這樣，短暫表達標記基因的所有植物細胞都將存活。因為，在大多數情況下T-DNA將由於內源核酸酶活性被降解而不是穩定地整合到它們宿主的基因組中，在短暫選擇中存活的大多數植物細胞在此顯示出將發育成缺乏標記基因的幼苗。此外，本發明表明，相當高比例的這些無標記幼苗含有穩定地整合的P-DNA。有各種工具來增加無標記轉化的效率。首先，本發明表明，可以通過順序地用兩個攜帶T-DNA/標記和P-DNA/目標序列的土壤桿菌菌株分別感染外植體，來增加這種頻率。首先用P-DNA菌株感染外植體，在約4到6小時後用T-DNA菌株感染。第二，可以修改T-DNA菌株來表達ω-突變的virD2基因。修改的virD2蛋白將仍然支持T-DNA轉移到植物核中，但將限制隨後的T-DNA的基因組整合的效率(Shurvinton et al.，Proc Natl Acad SciUSA，8911837-11841，1992；Mysore et al.，Mol Plant MicrobeInteract，11668-683，1998)。表達修改的virD2基因的最優選的方法是將由virD啟動子驅動的ω-突變的virD2基因插入到T-DNA載體的主幹中。第三，可以通過在靠近T-DNA的左側和右側邊界序列的地方插入端粒序列來進一步削弱穩定的T-DNA整合(Chiurazzi Signer，Plant Mol.Biol.，26923-934，1994)。第四，可以增加攜帶標記基因的T-DNA區的大小來增加T-DNA和P-DNA一同移動到植物細胞核中的頻率，和減少T-DNA的基因組整合的頻率。第五，通過利用攜帶兩個分別帶有T-DNA和P-DNA的兼容的二元載體的單個土壤桿菌菌株，也可以增加T-DNA和P-DNA一同移動到植物細胞核中的頻率。兩個兼容二元載體的實例是pSIM 1301衍生的載體和pBI121衍生的載體。由於短暫表達的標記基因一般不整合到植物基因組中，這個基因和它的調節序列都為天然DNA是不必要的。實際上，使用外源的調節序列來促進被感染植物細胞中短暫基因表達的高水平是有利的。本發明的一個令人驚訝的發現是，含有GUS基因、之後是酵母醇脫氫酶1(ADH1)的終止子的表達盒在馬鈴薯細胞中以高水平短暫地表達。然而，帶有酵母CYC1終止子的類似構建體沒有充分地起作用。也有可能通過將標記基因可操作地連接到非天然啟動子來增加短暫表達水平。這種啟動子的實例是，例如，合成性啟動子例如糖皮質激素可誘導的啟動子(Mori et al.，Plant J.，2779-86，2001；Bohner et al.，Mol.Gen.Genet.，264860-70 2001)，和非天然啟動子，例如花椰菜花葉病毒和玄參花葉病毒的35S啟動子，和真菌的啟動子。作為對如上所述的兩個菌株的土壤桿菌介導的轉化方法的替代，也可以用含有帶有天然標記基因和目標真實序列的P-DNA的單個菌株來轉化植物。本發明表明，有可能使用耐鹽性基因作為用於轉化的天然標記。這種耐鹽性基因包括Arabidopsis基因SOS1(Shi et al.，Nat Biotechnol.2002)、AtNHX1(Apse et al.，Science.2851256-8，1999)、Avp1(Gaxiola et al.，Proc Natl Acad Sci USA.9811444-9，2001)和CBF3(Kasuga et al.，Nat Biotechnol.17287-91，1999)的作物同源物。因而，本發明表明，可以通過用同時攜帶LifeSupport載體和P-DNA載體的土壤桿菌菌株感染外植體，然後短暫地或穩定地選擇標記基因的表達來產生含有P-DNA的植物。通過這些步驟產生的其他植物的一部分是「共轉化的」並同時含有T-DNA和P-DNA的。這些T0植物對商業生產是不合需要的，因為它們含有外源的DNA，即，T-DNA部分。然而，在很多情況下可以使這種植物自交或雜交，然後可以在它們的分離子代中篩選僅含P-DNA插入物的期望的T1植物。做為選擇，有可能使用兩個不同的P-DNA載體，一個含有期望的天然多核苷酸，另一個含有選擇性標記基因。在短暫的或穩定的選擇之後，可以通過篩選程序鑑定出同時含有至少一個帶有期望的多核苷酸的P-DNA和至少一個帶有選擇性標記基因的P-DNA的T0植物。可以使這些植物自交或雜交來產生分離的T1子代。可以再次在這種子代中針對期望的多核苷酸的存在和標記基因的缺乏進行篩選。篩選程序可以包括ELISA、抗生素耐受性分析、PCR和Southern印跡分析。通過發明性的精確育種方法實現的遺傳元件的重排，也可以自發地通過遺傳重組過程發生。舉例來說，所有植物都含有可以從一個染色體位置到另一個染色體位置轉位的元件。通過插入到啟動子或基因中，這種轉位元件可以增強、改變和/或降低基因表達。舉例來說，在轉錄調節基因P-wr的啟動子中玉米Mutator元件的AMu4插入導致有條紋的紅色果皮。在葉特異性MADS盒基因ZMM19的啟動子中插入相同元件引起該基因在玉米花序中的表達，導致穎片的葉狀伸長和在雄性和雌性花序中的其他變化，產生著名的有莢玉米表型。由於其奇異的須和穗，有莢玉米對於某些美洲土著部落具有宗教上的意義。許多基因還通過其他轉位子誘導的修改，例如倒置、刪除、添加和異位重組來重排(Bennetzen，Plant Mol Biol 42251-69，2000)。此外，植物DNA重排經常通過基因內重組的過程發生。舉例來說，通過對涉及針對特定病原體的抗性的基因進行重組，植物能夠發展出具有新的特異性的抗性基因，從而與它們的病原體一同進化(Ellis.，Trends PlantSci 5373-9，2000)。基因內重組的另一個實例涉及植物如何繁殖通過重組涉及自交不親和性的基因，植物從雜交(cross-fertilizing)轉變為自交(self-fertilizing)(Kusaba et al.，Plant Cell 13627-43，2001)。促進基因組進化的其他過程包括，舉例來說，染色體斷裂和染色體間的重組。
增強植物和糧食作物的營養價值為了通過精確育種修改作物植物中的消極的性狀，例如加工過程中的丙烯醯胺累積、配糖生物鹼累積、不合需要的高級糖基化(glycation)產物的累積、CIPC累積、抗性澱粉的低水平、擦傷敏感性、冷誘導的糖化、疾病敏感、低產量和低質量，將至少一個特定的表達盒摻合(incorporated)到宿主基因組中。使用三種不同的方法來消除消極性狀(1)過量表達防止消極性狀發生的基因，(2)過量表達與消極性狀相關基因的突變型來用無功能的蛋白滴定掉(titrateout)野生型基因產物，和(3)通過按有義和/或反義方向表達與該基因相連的前導區或尾隨區片段的至少一個拷貝，使與消極性狀有關的特定基因沉默。在馬鈴薯中與消極性狀有關的、並可以體外修改使之編碼無功能蛋白的內源基因的一個實例是多酚氧化酶(PPO)基因。在碰撞傷時，PPO基因產物從質體釋放到細胞質中(Koussevitzky et al.，J.Biol.Chem.，27327064-9，1998)，在細胞質中它將介導苯酚的氧化來產生各種苯氧基基團和醌型衍生物，這些是有毒的和/或最終形成不合需要的、在作物中留下黑暗變色或「黑斑」的聚合物。過量表達含有無功能的銅結合結構域的突變PPO基因可以降低主要在塊莖和相關器官例如芽中表達的所有PPO基因的活性。由於不能結合銅，突變使得多酚氧化酶蛋白沒有活性。熟練技術人員可以了解在何處進行點突變，所述點突變在這種情況下將損害基因產物的功能。申請人通過將馬鈴薯PPO蛋白序列與甘薯PPO蛋白序列比對，鑑定了馬鈴薯PPO中的銅結合結構域(Klabunde et al.，Nat Struct.Biol.，51084-90，1998)。在銅結合位點中保守的區域，特別是那些含有保守的組氨酸殘基的區域，是用於鈍化轉基因產物的靶點。由於在這種器官中PPO活性的幾乎完全缺失可能負面地影響植物抵抗病原體的能力，本發明還描述了一種改進的方法，僅降低在成熟塊莖除表皮之外的所有部分中優勢表達的特定PPO基因。利用與該基因相連的尾隨區序列來沉默這個特定PPO基因，不會降低塊莖表皮中的PPO表達，塊莖的這個部分是最直接地暴露於試圖進行感染的病原體的。由PPO基因誘導的酶性褐變不僅降低馬鈴薯塊莖的品質，還負面地影響作物食物例如小麥、鱷梨、香蕉、萵苣、蘋果和梨。與消極性狀有關的、可以通過使用與那些基因相連的前導區或尾隨區序列來沉默的其他基因包括馬鈴薯R1基因和L型磷酸化酶基因。兩個基因都涉及澱粉降解為還原糖，例如葡萄糖和果糖，其在加熱時參與Maillard反應產生有毒產物例如丙烯醯胺。本發明表明，通過降低R1或磷酸化酶活性來降低冷誘導的糖化，引起了在馬鈴薯的油炸加工期間非酶性褐變和丙烯醯胺累積的降低。本發明還表明了在遺傳修改的作物中過量表達某些天然基因的實用性。通過在馬鈴薯中過量表達新近分離的液泡轉化酶抑制物基因來降低蔗糖向還原糖的轉化，顯著地降低了Maillard反應產物例如丙烯醯胺的水平。本發明還預計，展現出升高的轉化酶抑制物表達水平、或降低的R1或磷酸化酶表達水平的馬鈴薯塊莖將不需要在儲藏前用化學的發芽抑制劑例如CIPC進行強化處理，因為它們降低的還原糖水平將(1)延緩發芽，和(2)容許在更低的溫度儲藏，從而進一步延緩發芽。高度降低的CIPC殘留水平、或它的完全缺失，進一步增加了加工的食物的營養價值，所述食物來源於含有在此描述的某些修改的P-DNA的植物。因而，來源於含有所述修改的P-DNA的塊莖的炸薯條或薯片，將含有強烈降低的CIPC殘留水平，進一步提升了它們的營養價值。在馬鈴薯塊莖中同時地下調PPO以及R1或磷酸化酶基因的表達的效果是協同的，因為還原糖不僅是通過Maillard反應的非酶性褐變所需的，也是PPO酶介導的褐變所需的。在轉基因馬鈴薯塊莖中降低的還原糖水平，因此還將限制PPO活性和黑斑擦傷敏感性。因而，PPO、R1和磷酸化酶基因，和/或與這些基因相連的前導區或尾隨區序列，代表可以被分離、修改和再導入回植物中來下調這些基因的表達的目標DNA片段。除了開發擦傷抗性和降低的冷誘導的糖化之外，還有許多其他性狀可以通過精確育種不使用外源的DNA來導入。舉例來說，可以從野生馬鈴薯物種中分離疾病抗性基因，插入到疾病敏感品種的基因組中。因而，本發明預期一種遺傳修改的塊莖，其包含一定水平的某種物質，例如葡萄糖、直鏈澱粉或丙烯醯胺，不同於相同物種的野生型、未修改的塊莖相關的正常水平。本發明的修改的塊莖可以與相同物種的未修改的塊莖進行比較，所述未修改的塊莖在大小和形狀方面與修改的塊莖也是類似的。做為選擇，修改的塊莖的一部分可以與未修改的塊莖的同一部分進行比較。例如，可以在修改的和未修改的塊莖的相同大小的切片之間比較某一物質的水平，或在修改的和未修改的塊莖的勻化製備物上進行生化分析，其中所述勻化製備物是相等的。類似地，本發明預期(contemplate)一種遺傳修改的塊莖，其包含一種基因，所述基因的表達水平不同於相同物種的野生型、未修改的塊莖中的相同基因相關的正常表達水平。因而，天然基因的表達可以是過量表達的或被抑制的。還預期的是一種修改的塊莖，其產生一種基因產物，所述基因產物在結構上和/或功能上不同於相同物種的野生型、未修改的塊莖中產生的相同基因產物。因此，所述修改的塊莖可以表達無活性的或改變速率的蛋白，生物學途徑以所述速率正常進展。例如，修改的塊莖除天然的野生型對應物之外可以表達具有很少的、或沒有酶活性的蛋白的突變型。用這種方式，可以產生具有某些性狀的塊莖，例如降低的冷誘導葡萄糖產生和降低的擦傷敏感性。因而，本發明預期一種修改的、成熟的塊莖，其包含至少一種性狀，所述性狀被增加、降低或不同於與相同物種的成熟塊莖正常相關的性狀。
修改的植物和作物的環境效益如上所述，降低的R1或者磷酸化酶水平引起降低的澱粉磷酸化作用。這種在澱粉磷酸化作用方面的降低引起馬鈴薯塊莖的磷酸鹽含量方面90％的下降(Vikso-Nielsen，Biomacromolecules，2836-43，2001)。這將引起來自馬鈴薯加工工廠的廢水中磷酸鹽水平的降低，當前該水平是約25-40mg/L。因而，低磷酸鹽塊莖的使用將降低磷酸鹽對環境的釋放，幫助保護重要的生態系統。此外，低磷酸鹽馬鈴薯可能需要更少的磷酸鹽施肥來獲得最優的生長和產量，這將通過延遲可用磷酸鹽資源的消耗來支持更加可持續的農業。
增強植物和糧食作物的農業性能除了降低的擦傷敏感性和降低的冷糖化之外，這是兩個重要的加工性狀，本發明還提供了耐鹽性——一種日益重要的輸入性狀(input trait)。在本發明中描述的某些修改的P-DNA構建體含有耐鹽性基因作為天然標記用於轉化。重要地，這個基因的實用性不限於轉化過程中的篩選步驟。在馬鈴薯植物中耐鹽性基因的過量表達減少了由高鹽土壤水平誘導的應激症狀，使得在含鹽水平超過種植常規品種最佳的最大2毫姆/cm電導水平的、百分比不斷增加的農業用地上，種植含有修改的P-DNA的新型品種成為可能。
使用從選定植物物種、或從與所述選定植物物種性上相容的物種分離的調節元件一旦從目標植物物種中分離出、並任選地修改了前導區、基因或尾隨區，其可以與植物啟動子或類似的調節元件可操作地連接用於在植物中適當的表達。象這些一樣的調節元件用來在特定組織中、或以某種水平、或在特定時間表達與目標基因相連的非翻譯序列。取決於修改性狀涉及的策略，限制對植物的特定區域的沉默可能是必需的。通常驅動內源基因的表達的啟動子可能不適合於組織特異性的表達。如在上節中描述的，細菌或病毒調節元件，例如花椰菜花葉病毒35S「超級」啟動子的穩定整合可能引起不可預見的和不合需要的事件。因而，本發明的一個方面使用了從選定宿主植物物種中分離的啟動子。在本發明的優選的實施方式中，為了在S.tuberosum中使用，與R1、磷酸化酶和PPO基因相連的前導區或尾隨區序列與微粒結合澱粉合酶基因啟動子(Rohde et al.，J Gen Breed，44 311-315，1990)可操作地連接。其他人已經經常地使用該啟動子來驅動基因表達，該啟動子在馬鈴薯塊莖中是特別有活性的(van der Steege et al.，Plant Mol Biol，2019-30，1992；Beaujean et al.，Biotechnol.Bioeng，709-16，2000；Oxenboll et al.，Proc Natl Acad Sci USA，97639-44，2000)。在優選的實施方式中，該啟動子也可用於表達R1、磷酸化酶和PPO基因的修改的前導區或尾隨區序列。做為選擇，可以將其他馬鈴薯啟動子與來自馬鈴薯的目標序列可操作地連接。這種啟動子包括patatin基因啟動子(Bevan et al.，Nucleic Acids Res，144625-38，1986)或其片段，其促進馬鈴薯塊莖中的表達，馬鈴薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子(美國專利No.5,932,783)和遍在蛋白基因的啟動子(Garbarino et al.，Plant Physiol，1091371-8，1995)。通過使用在構建體中與目標多核苷酸可操作地連接的可誘導啟動子和調節區，也可以調節前導區和/或尾隨區的轉錄。可誘導啟動子的實例包括那些對溫度敏感的啟動子，例如熱休克或冷休克啟動子。舉例來說，馬鈴薯ci21A-和C17-啟動子是冷可誘導的(Kirch et al.，Plant Mol.Biol，33897-909，1997；Schneider et al.，Plant Physiol，113335-45，1997)。可以使用對某些底物，象抗生素、其他化學物質、或pH起反應的其他可誘導啟動子。舉例來說，已知的是脫落酸和赤黴酸影響植物細胞的細胞內pH，並且在這種情況下調節Rab 16A基因和α-澱粉酶1/6-4啟動子(Heimovaara-Dijkstra et al.，Plant Mol Biol，4815-20，1995)。脫落酸、創傷和甲基茉莉酮酸酯也已知是誘導馬鈴薯pin2啟動子的(Lorberth et al.，Plant J，2477-86，1992)。在另一個實施例中，某些核苷酸序列是受時序性(temporal)調節的，僅在植物的某些發育階段期間，或在一天的某幾小時期間被激活來表達下遊序列。舉例來說，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rbcS)基因的小亞基的馬鈴薯啟動子可以指導細胞特異性的、光調節的表達(Fritz et al.，Proc Natl Acad Sci USA，884458-62，1991)。熟練技術人員將通曉可誘導啟動子和調節序列的這些示範性的形式。通過改變mRNA轉錄物的穩定性，在調節表達時使用某些多腺苷酸化信號可能也是有用的。特別是，當與多核苷酸的3′末端可操作地連接時，某些多腺苷酸化信號使得mRNA轉錄物成為可受降解影響的。因而，有可能通過使基因與一個或多個這種啟動子、調節序列、3′多腺苷酸化信號、3′非翻譯區、信號肽等等可操作地連接來調節基因的表達。根據本發明，最終將被整合到植物基因組中的DNA序列和調節元件，例如在此描述的那些，是從將要通過本發明的精確育種過程修改的選定植物物種的DNA獲得的。也就是說，從其他物種，例如從細菌、病毒、微生物、哺乳動物、鳥類、爬行動物、和性上不相容的植物物種衍生、分離和克隆的DNA序列和調節元件不被整合到被轉化植物的基因組中。對於選定植物物種的基因組是外源的DNA，只要該外源DNA不被整合到植物基因組中，可以被用於本發明來產生轉化構建體。本發明不僅提供了一種通過整合從選定植物物種、或從與所述選定植物物種性上相容的植物獲得的DNA來轉化植物物種的方法，還提供了一種方法，通過這種方法可以調節這種DNA的表達。因此，有可能通過如先前所描述的組織特異性的或某些其他策略來優化某種序列的表達。
使用從選定植物物種分離的3′終止子序列除了起始轉錄的調節元件之外，天然表達盒還需要位於轉錄起始調節區的3′末端的、終止轉錄的元件。轉錄終止區和轉錄起始區可以從相同的基因或從不同的基因獲得。可以選擇轉錄終止區，特別地為了mRNA的穩定性來選擇，以增強表達。這個特別的元件，所謂的「3′非翻譯區」在轉運、穩定、定位和終止基因轉錄產物方面是重要的。在這點上，對於本領域技術人員公知的是，3′-非翻譯區可以形成某種髮夾環。因此，本發明預想將3′非翻譯區可操作地連接到克隆的多核苷酸的3′末端的可能性，使得產生的mRNA轉錄產物可暴露於對由3′非翻譯區賦予的序列和結構起作用的因子。可以從植物物種亞克隆出遍在蛋白基因的3′序列，並插入到轉基因的下遊來確保轉錄的適當終止，啟動子和轉基因是從所述植物物種分離的。兩個示範性的轉基因都可以被融合到馬鈴薯遍在蛋白基因(Ubi3)的終止子序列上，不論用哪個啟動子來驅動它們的表達。
實施例實施例1P-DNA的克隆這個實施例表明了T-DNA邊界是特異於土壤桿菌的。還顯示了植物含有T-DNA邊界樣序列，提供了從馬鈴薯和小麥分離的、由這種邊界樣序列劃定的DNA片段的序列。常規的轉化系統使用土壤桿菌衍生的T-DNA作為載體將外源的DNA從土壤桿菌轉移到植物細胞(Schilperoort et al.，美國專利4940838，1990)。儘管T-DNA通常包含由左側邊界(LB)和右側邊界(RB)重複來劃定的數百個鹼基對，它們也可以僅由這種邊界組成。T-DNA邊界在DNA轉移過程中起到了重要作用，因為它們起到了virD2催化的切割反應的特異性識別位點的作用。與土壤桿菌virD2和virE2複合的、釋放的單鏈DNA被轉移到植物細胞核，在植物細胞核中其常常成功地整合到植物基因組中。所有已經被用於外源DNA轉移的T-DNA邊界都來源於Agrobacterium tumefaciens和A.rhizogenes的胭脂鹼和章魚鹼菌株(表2)。這些邊界和通常某些側翼土壤桿菌DNA存在於數千個二元載體中，包括，例如pPAM(AY027531)，pJawohl(AF408413)，pYL156(AF406991)，pINDEX(AF294982)，pC1300(AF294978)，pBI121(AF485783)，pLH9000(AF458478)，pAC161(AJ315956)，BinHygTOp(Z37515)，pHELLSGATE(AJ311874)，pBAR-35S(AJ251014)，pGreen(AJ007829)，pBIN19(X77672)，pCAMBIA(AF354046)，pX6-GFP(AF330636)，pER8(AF309825)，pBI101(U12639)，pSKI074(AF218466)，pAJ1(AC138659)，pAC161(AJ315956)，pSLJ8313(Y18556)，和pGV4939(AY147202)。近來，在chrysopine型Ti質粒pTiChry5中鑑定出兩個T-DNA邊界的同源物(Palanichelvam et al.，Mol Plant Microbe Interact 131081-91，2000)。左側邊界同源物與位於pTi15955T-DNA中間的非活性邊界同源物相同。右側邊界同源物顯著地不同於功能性T-DNA邊界的序列。因此這些同源物不太可能在支持將DNA從pTiChry5轉移到植物細胞方面是功能上有活性的。能使僅用天然DNA轉化植物成為可能的新方法的開發，首先需要對包括LB和RB的T-DNA的替換。令人遺憾地，對公眾資料庫，包括由國家生物技術信息中心、基因組研究機構和SANGER維護的那些資料庫的高級BLAST搜索未能在植物中鑑定出任何邊界序列。因此必需考慮類似於T-DNA邊界、但與T-DNA邊界不同的植物DNA序列，在此被稱為「邊界樣」(邊界樣)。在公眾資料庫中鑑定出的植物邊界樣序列的實例在表2中示出。在嘗試用邊界樣序列替換T-DNA邊界方面的挑戰是，邊界序列是高度保守的(參見表2)。在其他細菌DNA轉移系統，例如IncP、PC194和φX174的切口區(nickregion)中，這些序列的大部分也是高度保守的，表明這些序列對於接合樣DNA轉移是必不可少的(Waters et al.，Proc Natl Acad Sci 881456-60，1991)。由於關於邊界序列的必要條件沒有可靠的的數據，因此在切割過程中完整的邊界似乎是重要的。通過測試邊界突變體在支持DNA轉移方面的效力嘗試解決這個問題的單獨研究是不可靠的，因為陰性對照似乎不能適當地起作用(van Haaren et al.，Plant Mol Biol13523-531，1989)。此外，這個研究的結果都沒有被分子上地證實。不考慮這些關切，在表2中還是顯示了兩個可能有效的邊界突變體。根據邊界序列之間的同源性，鑑定出T-DNA邊界基序(motif)(表2)。儘管這個基序包含13,824種變體，其中許多可能不起作用或在轉移DNA方面是不足夠的，其仍然代表對T-DNA邊界序列是什麼或可能是什麼的最廣泛可能的定義。然後利用「基序比對和搜索工具(Motif Alignment and Search Tool)」(Bailey andGribskov，Bioinformatics 1448-54，1998)和「「advanced BLASTN」(「核苷酸錯配的罰分」＝-1；「預期」＝105；Altschul et al.，Nucleic AcidsRes 253389-3402，1997)用這個邊界基序在公眾可用的DNA資料庫中搜索同源物。再一次地，這些搜索沒有在除土壤桿菌外的生物中鑑定出任何同一的匹配。通過這種檢索策略鑑定出的序列的實例在表2中舉例說明，其列出了從，例如，Arabdopsis和稻米核酸資料庫條目鑑定出的各種邊界樣序列。為了嘗試和提高分離含有相應於邊界基序的邊界樣序列的馬鈴薯DNA片段的機會，從100個遺傳上各異的登記(所謂的″核心保藏″，由美國馬鈴薯Genebank，WI提供)分離DNA。將該DNA集中，用作利用各種被設計與邊界或邊界樣序列退火的寡核苷酸進行聚合酶鏈式反應的模板。對擴增的片段進行序列分析，然後用嵌套引物使用反向PCR證實序列。特別感興趣的馬鈴薯DNA片段之一含有由邊界樣序列劃定的、沒有任何主要開放閱讀框的新序列(表2)。這個片段的邊界樣序列之一含有與T-DNA邊界的至少5個錯配；另一個邊界樣序列含有至少2個錯配。儘管兩個序列都含有與邊界基序的一個錯配，還是測試它們支持DNA轉移的能力。為此，首先通過進行內部刪除將片段降低到0.4k鹼基對的大小(SEQ ID NO.1)。產生的片段被命名為「P-DNA」(植物DNA)，以與土壤桿菌衍生的T-DNA相區別。從馬鈴薯品種Russet Ranger的基因組中分離了類似的片段，但沒有被用於任何進一步的實驗。根據P-DNA和T-DNA邊界之間的差異，用以下簡併引物使用延長酶放大系統(Life Technologies)從小麥分離P-DNA5′-GTTTACANHNBNATATATCCTGYCA-3′(Bor-F)(SEQ ID NO.56)，和5′-TGRCAGGATATATNVNDNTGTAAAC-3′(Bor-R)(SEQ ID NO.57)。產生的825bp片段在SEQ ID NO.2中示出，被用於替換常規二元載體的T-DNA。通過將GUS基因的表達盒插入到P-DNA末端之間，用攜帶產生的載體的土壤桿菌菌株感染小麥，可以測試這個構建體的效力。作為對1步PCR法來分離由邊界樣序列(P-DNA)劃定的植物DNA片段的替代，開發出2步PCR法，根據以下的基本原理來在植物DNA中鑑定單個邊界樣序列1.用限制性酶部分地或完全地消化植物DNA。可以使用常用的切割酶，例如SauIIIA。2.用具有已知序列的DNA片段連接消化的DNA。這種已知DNA片段的實例是pBR322的192-bp BamHI-EcoRV片段。3.用可以是簡併的和與T-DNA邊界樣序列退火的「邊界」引物、和與已知連接的DNA片段退火的「錨」引物進行PCR。一般地，在凝膠電泳上觀察到反應產物的彌散條帶。邊界引物的一個實例是5′-YGR CAG GAT ATA TNN NNN KGT AAA C-3′；錨引物的實例是5′-GAC CAC ACC CGT CCT GTG-′3。儘管在進行這個方法時可以改變PCR擴增反應的任何參數，成功地使用這些引物的退火溫度是49℃；2.5分鐘的延伸時間被用於這個擴增反應。4.用另一個已知序列連接PCR產物，例如連接到質粒樣pGEM-T。5.用「邊界」引物和與所述質粒，例如SP6或T7退火的引物進行PCR。這個第二PCR的條件需要被優化，使得產生的PCR產物在凝膠上顯示特定的條帶，可能具有某些其它彌散條帶。可以成功使用的退火溫度是52℃。6.將產生的條帶克隆到載體，例如pGEM-T中用於序列分析。7.使用測序的DNA來設計4個引物，對用酶例如SauIIA完全消化然後自我連接的植物DNA進行反向RCR。兩個引物被用於第一PCR，然後這個第一PCR的產物被用作利用嵌套引物進行第二PCR的模板。然後將擴增的DNA片段克隆到載體例如PGEM-T中，然後進行序列分析來測定實際的邊界樣序列。做為選擇，在這個方法的步驟3，用與邊界樣序列5′部分退火的第一短引物，例如5′-YGR CAG GAT ATA T-3′和與具有已知序列的連接的DNA片段退火的第二短引物，例如5′-ATG GCG ACCACA-3′，使用限制錯配數目的相對高的退火溫度，例如34℃，來進行擴增反應。將這個DNA稀釋約100倍，使用1μL稀釋的DNA作為模板，用與至少邊界樣序列的中部和3′部分退火的一個引物，例如5′-CAGGAT ATA TNN NNN KGT AAA C-3′，和與具有已知序列的連接的DNA退火的、理想地與如上所述短「已知DNA」引物嵌套(nested)的另一個引物，進行第二PCR。可以成功使用的退火溫度是52℃。
實施例2用P-DNA載體轉化菸草這個實例表明，儘管P-DNA末端和T-DNA邊界之間具有結構的(序列差異)和功能的(轉化頻率)差異，P-DNA可以以與T-DNA類似的方式用於將DNA從土壤桿菌轉移到菸草細胞。在E.coli和A.tumefaciens中都能維持的無T-DNA載體，通過移除常規二元載體pCAMBIA1301(Cambia，AU)的完整T-DNA區獲得。通過同時地將pSIM1301的5.9kb SacII-SphI片段與從pCAMBIA1301擴增的2個片段連接來實現，所述擴增分別使用寡核苷酸對5′-CCGCGGTGATCACAGGCAGCAAC-3′(SEQ ID NO.58)和5′-AAGCTTCCAGCCAGCCAACAGCTCCCCGAC-3′(SEQ ID NO.59)，和5′-AAGCTTGGCTACTAGTGCGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA-3′(SEQ ID NO.60)，和5′-GCATGCTCGAGATAGGTGACCACATACAAATGGACGAACGG-3′(SEQ IDNO.61)。為了使篩選主幹整合事件成為可能，將包含由Ubi3啟動子驅動的土壤桿菌異戊烯轉移酶(IPT)基因，之後是Ubi3終止子(SEQID NO.3)的表達盒作為2.6kbp SacII片段插入到如上所述無T-DNA載體的主幹中，產生pSIM100-OD-IPT。預期表達IPT基因的轉化的植物細胞積累細胞分裂素，生長成不能發育根系的異常的幼苗。將實施例1中描述的0.4kb P-DNA片段插入到pSIM100-OD-IPT中來產生pSIM111(附圖1；SEQ ID NO.4)。為了測試pSIM111是否可被用於獲得沒有其他的載體主幹、攜帶P-DNA(包括位於P-DNA末端之間的任何序列)的轉化的植物，將新黴素磷酸轉移酶(NPTII)基因表達盒插入到pSIM111的P-DNA中來產生pSIM108(附圖1)。通過比較pSIM108和含有帶有常規T-DNA邊界的修改的P-DNA的對照載體之間的轉化頻率，測試P-DNA末端支持DNA轉移的效力。這個對照載體，被命名為pSIM109，通過用寡核苷酸對5′-ACTAGTGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAGAG-3′(SEQ ID NO.62)，和5′-AAGCTTTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACGAAG-3′(SEQ IDNO.63)。
擴增含NPTII基因表達盒的完整P-DNA產生。用於這些實驗的第二對照載體是常規的二元載體pBI121(Genbank登錄號AF485783)，其含有插入到常規T-DNA中的相同的NPTII表達盒。如下將二元載體導入Agrobacterium tumefaciens LBA4404細胞。感受態LB4404細胞(50uL)在37℃在存在1μg載體DNA的情況下孵化5分鐘，在液氮(約-196℃)中冷凍約15秒，再次在37℃孵化5分鐘。在添加1mL的液體肉湯(LB)後，在28℃使處理的細胞生長3小時，平鋪到含鏈黴素(100mg/L)和卡那黴素(100mg/L)的LB/瓊脂上。然後從單個LBA4404菌落的過夜培養物分離載體DNA，通過限制性分析檢查證實完整質粒DNA的存在。通過使10倍稀釋的過夜生長的LBA4404∷pSIM108細胞生長5-6小時，在2,800RPM沉澱細胞15分鐘，用補充有蔗糖(3％，pH5.7)的MS液體培養基(Phytotechnology)洗滌細胞，將細胞重懸浮在相同培養基中直到OD600nm為0.2，對模式植物菸草的轉化進行測試。然後該懸浮液用於感染體外生長的Nicotiana tabacum植物的4周齡葉外植體。感染的菸草外植體在含6g/L瓊脂的共培養培養基(1/10MS鹽，3％蔗糖，pH 5.7)上在Percival生長箱(16小時光照)中25℃孵化2天，隨後轉移到含timentine(150mg/L)和卡那黴素(100mg/L)的M401/瓊脂培養基上。在接下來4周內每個外植體發育的愈傷組織數目在表3中示出。數據表明，由天然末端或常規的T-DNA邊界劃定的P-DNA在轉化菸草方面，比T-DNA更有效約50％。增加的P-DNA轉移效率可能是由於其不同的CG含量或P-DNA的其他未知結構特徵。此外，不僅用pSIM108(含有插入到P-DNA中的nptII表達盒的載體，參見實施例2)，還用pSIM118(含有插入到衍生的P-DNA中的nptII表達盒的載體)感染菸草外植體。用SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.98的P-DNA實施的實驗具有相同的轉化頻率。SEQ ID NO 1和98的不同僅在於左側和右側邊界中單個鹼基的變化。因而，有可能改變P-DNA的序列並且仍然獲得可接受的轉化頻率。
實施例3用P-DNA載體轉化馬鈴薯這個實施例表明，P-DNA可以以與T-DNA類似的方式來將DNA從土壤桿菌轉移到馬鈴薯細胞。根據以下步驟，通過用土壤桿菌菌株感染體外生長的RussetRanger植物苗的4周齡莖外植體，進行馬鈴薯轉化。使10倍稀釋的過夜生長的培養物生長5-6小時，在2,800RPM沉澱15分鐘，用補充有蔗糖(3％，pH 5.7)的MS液體培養基(Phytotechnology)洗滌，重懸浮在相同培養基中直到OD600nm為0.2。然後將重懸浮的細胞用於感染0.4-0.6mm節間馬鈴薯片段。感染的莖在含6g/L瓊脂的共培養基(1/10MS鹽，3％蔗糖，pH 5.7)上在Percival生長箱(16小時光照)中22℃孵化2天，隨後轉移到含timentine(150mg/L)和卡那黴素(100mg/L)的愈傷組織誘導培養基(CIM，補充有3％蔗糖3、2.5mg/L玉米素核糖甙、0.1mg/L萘乙酸和6g/L瓊脂的MS培養基)上。在CIM上培養一個月後，將外植體轉移到含timentine和卡那黴素(分別為150和100mg/L)的幼苗誘導培養基(SIM，補充有3％蔗糖、2.5mg/L玉米素核糖甙、0.3mg/L赤黴酸GA3和6g/L瓊脂的MS培養基)。3-4周後，統計發育轉基因的愈傷組織和/或幼苗的外植體數目。如在菸草中所示，用pSIM108感染的、顯示了愈傷組織的莖外植體的數目，比用常規二元載體pBI121的對照實驗中高(表3)。隨後由這些愈傷組織產生的幼苗可以分為兩種不同的類型。第一類的幼苗是在表型上不能與用LBA∷pBI121轉化的對照幼苗相區別的。第二類幼苗展現了IPT表型。後一類的幼苗在生長中受到阻礙，僅有非常小的葉子、展現出淺綠到黃的顏色、在轉移到無激素培養基時不能生根。為了證實具有IPT表型的幼苗含有穩定地整合到它們的基因組中的IPT基因，將所有幼苗轉移到包含補充有3％蔗糖和timentine 150mg/L的MS培養基的Magenta盒中，容許生長額外的3到4周，用於分離DNA。這個植物DNA充當PCR反應的模板，其中使用被設計與IPT基因退火的寡核苷酸對5′-GTC CAA CTT GCA CAG GAA AGA C-3′和5′-CATGGA TGA AAT ACT CCT GAG C-3′。如表4所示，PCR實驗證實了IPT表型與存在IPT基因之間的嚴格相關。還檢查了在用pBI121轉化獲得的植物中主幹DNA的存在。這通過用「pBI121主幹引物」5′-CGGTGTAAGTGAACTGCAGTTGCCATG-3′(SEQ ID NO.64)，和5′-CATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTG-3′(SEQ ID NO.65)。對從轉化事件分離的DNA進行PCR反應來進行。0.7kbp條帶的擴增是主幹整合的指示。通過比較表4中呈現的數據，可以斷定主幹整合頻率對於P-DNA載體和T-DNA載體是類似的。進行第二PCR實驗來測試無IPT的植物是否不含有任何其他主幹序列。由於IPT表達盒的位置靠近左側邊界樣序列，用於這個實驗的寡核苷酸對被設計為與靠近右側邊界樣序列的主幹序列退火5′-CACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAG-3′(SEQ ID NO.66)，和5′-TCCTAATCGACGGCGCACCGGCTG-3′(SEQ ID NO.67)。來自這個實驗的數據證實對於IPT基因是陽性的植物對於主幹的這個其他部分也是陽性的。對馬鈴薯品種Russet Burbank進行類似的實驗。根據對IPT表型的評定，顯示了pSIM108和pSIM109的主幹整合頻率，與在RussetRanger中的那些相當(參見表4和5)。
實施例4馬鈴薯轉化酶抑制物基因使用常規的轉化方法，這個實施例表明，過量表達新的馬鈴薯轉化酶抑制物基因(potato invertase inhibitor gene)增強了馬鈴薯塊莖的加工和健康特徵。設計以下引物來擴增菸草液泡轉化酶抑制物Nt-inhh1(Greiner et al.，Nature Biotechnology，17，708-711，1999)的新型馬鈴薯同源物5′AAAGTTGAATTCAAATGAGAAATTTATTC-3′(SEQ ID NO.68)，和5′TTTTAAGCTTTCATAATAACATTCTAAT-3′(SEQ ID NO.69)。通過混合以下成分進行擴增反應4μl植物DNA、2μl正向引物(10pM/ml)、2μl反向引物，25μl Hot Start Master Mix(Qiagen CatalogNr.203443)和17μl水。將這個反應混合物置於使用PTC-100熱循環儀(MJ Research)的以下聚合酶鏈式反應(PCR)條件中(1)95℃5分鐘(1循環)，(2)94℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃4分鐘(35循環)，和(3)72℃10分鐘(1循環)。將總產物加載到0.8％瓊脂糖凝膠上，利用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen，CA)從凝膠中純化出540鹼基對的條帶。然後將這個純化的片段連接到pGEM-T Easy(Promega，WI)中，利用Max Efficiency Competent Cells(GibcoBRL，MD)轉化到E.coli DH5-α中。對從轉化的DH5-α分離的重組質粒DNA的序列分析顯示，存在由543個鹼基對組成的、編碼推定的181胺基酸蛋白(SEQ ID NO.5)的單個開放閱讀框；clustal比對顯示了與Nt-inhh的70％同源性(附圖2)。這種高水平的同源性延伸至15胺基酸的N-末端結構域，表明馬鈴薯同源物是靶向液泡的。有趣地，馬鈴薯轉化酶抑制物同源物，命名為St-inh1，與專利的命名為Nt-inh1的菸草細胞壁轉化酶抑制物(專利WO98/04722；附圖2)僅有43％的同源性。儘管St-inh1基因存在於未修改的馬鈴薯塊莖中，其表達水平對於完全抑制轉化酶和降低冷誘導的糖化是不足夠的。為了增強馬鈴薯的貯藏特性，將St-inh1基因與微粒結合澱粉合酶(GBSS)基因的新型塊莖增強的啟動子融合，已知該啟動子能促進塊莖中高水平的基因表達。通過利用正向引物5′-GAACCATGCATCTCAATC-3′(SEQ ID NO.70)和反向引物5′-GTCAGGATCCCTACCAAGCTACAGATGAAC-3′(SEQ ID NO.71)進行PCR反應從馬鈴薯栽培種Russet Ranger分離GBSS啟動子。對克隆到pGEM-T中的該擴增產物的序列分析表明，這個新型啟動子含有658個鹼基對(SEQ ID NO.6)。然後將產生的啟動子/基因融合物連接到馬鈴薯遍在蛋白基因的3′調節序列(UbiT；SEQ ID NO.7)，因而確保轉化酶抑制物基因的轉錄的轉錄的適當的終止。將這個表達盒插入到二元載體的T-DNA邊界之間，產生的載體pSIM320被用於如上所述轉化Russet Ranger。將九個獨立轉基因系(transgenic lines)的三個插枝種植在土壤中，在生長箱中生長四周(11小時光照；20℃)。然後從每個株系(line)收穫至少3個迷你塊莖，轉移到冷櫃在4℃誘導冷糖化(cold sweetening)。4周後，通過使用Accu-Chek計和測試條(Roche Diagnostics，IN)，或葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑(Megazyme，Ireland)測定冷藏的迷你塊莖中的葡萄糖水平。將這些水平與6個未轉化的株系和6個用缺乏轉化酶抑制物基因的pSIM110衍生載體轉化的「載體對照」株系中的平均葡萄糖水平進行比較。如表6中所示，三個轉基因株系積累了比「載體對照」株系中少40％的葡萄糖，表明馬鈴薯轉化酶抑制物同源物是功能上有活性的。以下實驗顯示了在塊莖中存在的還原糖數量與塊莖加工期間丙烯醯胺產生有關。從田地裡新鮮收穫Russet Ranger馬鈴薯塊莖，並保藏在4℃來誘導冷糖化；對照塊莖保藏在18℃。4周後，測定兩組塊莖中的葡萄糖水平。隨後，洗滌塊莖，在165_白化8分鐘或12分鐘，切成0.290×0.290的鞋帶狀條，在160_浸泡在1％酸式焦磷酸鈉溶液中，在160_乾燥直到達到14±2％的乾重損失，在390_油炸40秒達到64±2％的第一油炸溼度，在-15_冷凍20分鐘，在第一個6分鐘內搖動託盤2-3次。然後產生的炸薯條由Covance實驗室(WI)分析丙烯醯胺水平。如表7所示，保藏在18℃的塊莖中葡萄糖水平低於0.1mg/g的檢測水平，而冷藏的塊莖中含有平均3.4mg/g的葡萄糖。這個表格還顯示了由後一種馬鈴薯生產的油炸食物含有比保存在18℃的馬鈴薯生產的油炸食物高約10倍的丙烯醯胺水平。即使對18℃保藏的馬鈴薯使用比4℃保藏的馬鈴薯更短的漂白時間，來產生具有類似顏色(顏色ids分別為78和71)的油炸食物，在丙烯醯胺累積方面仍得到了5倍的差異(表7)。因而，在塊莖中的還原糖例如葡萄糖的數量和來源於這些塊莖的油炸食物中丙烯醯胺的累積之間似乎存在直接的關聯。為了測定在pSIM320株系中降低的葡萄糖水平是否限制加工誘導的丙烯醯胺累積，加工冷藏的pSIM320迷你塊莖，切成楔形，白化(blanching)8分鐘，在0.5％SAPP中浸泡30秒，在160_乾燥4.5分鐘，在380_油炸40秒，在-15_冷凍15分鐘，最後在160_乾燥3分鐘和10秒。然後將加工的材料交給Covance實驗室用於丙烯醯胺測定。如表6所示，從迷你塊莖獲得的炸薯條具有最低數量的葡萄糖積累和最低水平的丙烯醯胺。在株系「320-2」和「320-4」中葡萄糖水平方面40％的降低，與丙烯醯胺水平的5倍降低相關。為了在成熟塊莖中證實這些結果，將馬鈴薯植物苗種植在更大的1加侖罐中，容許在溫室中生長。9周後(衰老之前)從一組植物分離塊莖，12周後(衰老之後)從重複組植物分離塊莖。收穫的塊莖在4℃保藏1個月，如上所述分析葡萄糖水平。這個分析表明，在幾個轉基因的(半)成熟塊莖中發現的冷誘導的葡萄糖水平甚至比相應的迷你塊莖中更低。為了測定在pSIM320株系中降低的葡萄糖水平是否限制加工誘導的丙烯醯胺累積，加工冷藏的pSIM320迷你塊莖，切成楔形，白化8分鐘，在0.5％SAPP中浸泡30秒，在160_乾燥4.5分鐘，在380_油炸40秒，在-15_冷凍15分鐘，最後在160_乾燥3分鐘和10秒。然後將加工的材料交給Covance實驗室用於丙烯醯胺測定。如表6所示，從具有最低數量的葡萄糖的迷你塊莖獲得的炸薯條積累最低水平的丙烯醯胺。在株系「320-2」和「320-4」中葡萄糖水平方面40％的降低，與丙烯醯胺水平的5倍降低相關。可以從成熟的(12周齡)、溫室生長的塊莖獲得類似的結果。
實施例5與馬鈴薯R1基因相連的前導區和尾隨區序列使用常規的轉化方法，這個實施例表明，可以有效的使用與馬鈴薯R1基因相連的新型前導區序列來增強馬鈴薯塊莖的加工和健康特徵。還預計，可以同樣地採用與同一基因相連的新型尾隨區。作為對過量表達轉化酶抑制物基因的替代，開發出限制丙烯醯胺產生而不使用任何實際的基因序列的方法。這種方法基於沉默塊莖表達的R1基因。早先已經表明，可以通過來源於澱粉相關基因的1.9kb基因片段的反義表達來沉默澱粉相關基因(Kossmann et al.，美國專利6,207,880)。然而，大DNA片段的反義表達是不合需要的，因為這種片段含有新的開放閱讀框(表1)。作為比上述方法更安全的方法，從馬鈴薯中分離與R1基因相連的小的前導區序列。通過用GIBCOBRL提供的5′RACE試劑盒，對來自Russet Ranger馬鈴薯植物的塊莖的總RNA進行cDNA末端的快速擴增獲得這個前導區(leader)。序列分析表明，與R1相連的前導區由179個鹼基對組成(SEQ ID NO.8)。由馬鈴薯遍在蛋白內含子(SEQ ID NO.9)分隔的這個前導區序列的有義拷貝和反義拷貝，被置於GBSS啟動子和UbiT之間。產生的與R1相連的前導區序列的表達盒在附圖3中示出(SEQ ID NO.10)。含有來源於GBSS啟動子的間隔區(SEQ ID NO.11)的類似的盒在(附圖3；SEQ ID NOs.12))中示出，所述來源於GBSS啟動子的間隔區代替Ubi內含子來分隔所述R1尾隨區的有義拷貝和反義拷貝。具有GBSS啟動子的更長版本(SEQ ID NO.13)的其他變體在附圖3中示出(SEQ ID NO.14-15)。為了測試R1相連的前導區在限制丙烯醯胺產生方面的效力，將附圖3所示的表達盒作為KpnI-XbaI片段插入到二元載體的T-DNA邊界之間。攜帶產生的載體pSIM332的土壤桿菌LBA4404菌株被用於轉化Russet Ranger馬鈴薯。為了誘導塊莖形成，將代表獨立轉化事件的25個幼苗轉移到土壤中，並置於生長箱(11小時光照，25℃)中。三周後，將至少3個迷你塊莖/株系在4℃保藏4周來誘導澱粉活化。隨後如實施例4中描述的測定這些冷藏的迷你塊莖中的葡萄糖水平，與未轉化植物和載體對照中的平均葡萄糖水平對比。如表8所示，來自所有25個株系的迷你塊莖在冷藏後展現了降低的葡萄糖水平。在來自展現出降低的R1表達水平的迷你塊莖的炸薯條中，與對照相比，丙烯醯胺水平被期待有約2倍的降低。在成熟塊莖中，下調R1基因表達的更強烈的效應被預期。作為對基於前導區的方法的替代，產生含有與R1相連的尾隨區序列的有義和反義拷貝的表達盒。通過對分離自馬鈴薯栽培種Russet Ranger的微型塊莖的總RNA進行逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)獲得這個尾隨區(trailer)。利用Omniscript RT試劑盒(Qiagen，CA)產生互補DNA，然後用作PCR反應的模板，PCR反應使用Hot start DNA聚合酶(Qiagen，CA)和基因特異性的反向引物R1-1(5′-GTTCAGACAAGACCACAGATGTGA-3′)。對克隆到pGEM-T中的擴增的DNA片段的序列分析表明，與R1相連的尾隨區由333個鹼基對組成(SEQ ID NO.16)。尾隨區的有義拷貝和反義拷貝由Ubi內含子或GBSS間隔區分隔，並夾在GBSS啟動子和Ubi3終止子之間(附圖3；SEQ ID NOs.17-18)。使用更大的GBSS啟動子的類似方案在附圖3中示出(SEQ ID NOs.19-20)。如上所述測定葡萄糖和丙烯醯胺水平。在葡萄糖濃度方面展現出約50％或更多的降低的塊莖，預期在油炸加工過程中也積累更少約50％的丙烯醯胺。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵可以在成熟的、田地生長的塊莖中被證實。通過利用AOAC Method 995.11 Phosphorus(Total)in Foods(45.1.33 Official Methods of Analysis of AOAC International，17thEdition)測定馬鈴薯塊莖中的磷酸鹽水平。通過在馬弗爐中幹灰化之後酸解來製備樣品。然後中和溶解的樣品，用鉬酸鹽-抗壞血酸溶液處理，與磷標準的系列(類似地處理)比較。使用雙波束分光光度計在823納米進行比色分析。對環境有益的磷酸鹽含量方面的顯著下降是預期的。
來自所有25個株系的迷你塊莖在冷藏後展現了降低的葡萄糖水平。在半成熟的(9周齡)和成熟的(12周齡)溫室生長的塊莖中發現了下調R1基因表達對葡萄糖累積的更強的效應。在許多轉基因株系的塊莖中降低的葡萄糖水平與加工期間降低的丙烯醯胺累積相關。如上所述測定葡萄糖和丙烯醯胺水平。在葡萄糖濃度方面展現出約50％或更多的降低的成熟的塊莖，預期在油炸加工過程中也積累更少約50％的丙烯醯胺。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵可以在成熟的、田地生長的塊莖中被證實。通過利用AOAC Method 995.11 Phosphorus(Total)in Foods(45.1.33 Official Methods of Analysis of AOAC International，17thEdition)測定馬鈴薯塊莖中的磷酸鹽水平。通過在馬弗爐中幹灰化之後酸解來製備樣品。然後中和溶解的樣品，用鉬酸鹽-抗壞血酸溶液處理，與磷標準的系列(類似地處理)比較。使用雙波束分光光度計在823納米進行比色分析。對環境有益的磷酸鹽含量方面的顯著下降是預期的。
實施例6與L-α葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區序列使用常規的轉化方法，這個實施例表明，可以使用與馬鈴薯L-α葡聚糖磷酸化酶基因相連的新型前導區序列來有效地增強馬鈴薯塊莖的加工和健康特徵。早先已經表明，可以通過來源於α葡聚糖磷酸化酶基因的0.9-kb片段的反義表達來降低冷誘導的糖化(Kawchuk et al.，美國專利5,998,701，1999)。然而，這些相對大的DNA片段的反義表達是不合需要的，因為它們含有新的和未表徵的開放閱讀框，如果在轉基因植物中表達，可能影響食物的營養品質(表1)。作為比上述方法更安全的方法，從成熟塊莖的RNA分離與L型葡聚糖磷酸化酶基因相連的小的前導區和尾隨區序列。用於這個目的的引物對是
5′-GGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAG-3′(SEQ ID NO.72)，和5′-GAATTCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGC-3′(SEQ ID NO.73)。擴增得到的273bp前導區序列，在SEQ ID NO.21中示出。類似地，「直接」引物5′-GGAACATTGAAGCTGTGG-3′(SEQ ID NO.74)與寡-dT引物一起使用來擴增與L型磷酸化酶基因相連的158bp「尾隨區序列」(SEQID NO.22)。然後利用這些尾隨區或前導區序列設計表達盒來修改L型磷酸化酶基因的表達，在這種情況下，通過限制澱粉活化降低油炸產品中的丙烯醯胺水平。按與實施例5中描述的類似的方式構建這些盒，在附圖3中示出(SEQ ID NO.23-26)。含有帶這個表達盒的二元載體，命名為pSIM216，的土壤桿菌，被用於感染馬鈴薯莖，產生25個轉基因植物。將來源於這些植物的迷你塊莖保藏在4℃4周來誘導冷糖化。然後分析冷藏的迷你塊莖的葡萄糖水平。如表9所示，來自所有轉基因株系的迷你塊莖展現了降低的葡萄糖水平。四個展現出至少降低50％的葡萄糖濃度的株系(株系216-2、216-5、216-10和216-21)被用於評定加工誘導的丙烯醯胺水平。儘管在來源於前三個株系的油炸塊莖中丙烯醯胺水平與對照的類似，來源於株系216-21的炸薯條僅積累了野生型丙烯醯胺水平的45％(十億分之136比305)。這些結果證實了實施例4中描述的關於過量表達馬鈴薯轉化酶抑制物基因的塊莖的實驗，因為葡萄糖(和果糖)濃度方面相對大的降低是限制冷藏的迷你塊莖中加熱誘導的丙烯醯胺累積所需的。因為期望磷酸化酶基因的沉默在成熟的「216」塊莖中更為有效，還預期在由這種塊莖產生的炸薯條中丙烯醯胺水平的降低更為顯著。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵可以在成熟塊莖中被證實。四個展現出至少降低50％的葡萄糖濃度的株系(株系216-2、216-5、216-10和216-21)被用於評定加工誘導的丙烯醯胺水平。儘管在來源於前三個株系的油炸塊莖中丙烯醯胺水平與對照的類似，來源於株系216-21的炸薯條僅積累了野生型丙烯醯胺水平的45％(十億分之136比305)。這些結果證實了實施例4中描述的關於過量表達馬鈴薯轉化酶抑制物基因的塊莖的實驗，因為葡萄糖(和果糖)濃度方面相對大的降低是限制冷藏的迷你塊莖中加熱誘導的丙烯醯胺累積所需的。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵可以在成熟塊莖中被證實。
實施例7修改的多酚氧化酶基因使用常規的轉化方法，這個實施例表明了，能有效地使用缺少功能性銅結合位點的修改的多酚氧化酶基因來降低塊莖中的擦傷敏感性(bruise susceptibility)。早先已經表明了，通過1.8kb PPO基因的反義表達可以降低黑斑擦傷敏感性(Steffens，美國專利6,160,204，2000)。然而，這個大基因的反向互補物的表達是不合需要的，因為它含有編碼由超過100個胺基酸組成的肽的、新的和未表徵的開放閱讀框，其可能潛在地影響食物的營養品質(表1)。作為比上述方法更安全的方法，修改PPO基因來編碼無功能的蛋白。利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法從Russet Ranger分離出野生型馬鈴薯PPO基因。首先，從Russet Ranger的芽中分離出基因組DNA。然後從馬鈴薯基因組DNA使用DNA聚合酶和寡核苷酸引物5′CGAATTCATGGCAAGCTTGTGCAATAG-3′(PPO-F)(SEQ ID NO.75)，和5′-CGAATTCTTAACAATCTGCAAGACTGATCG-3′(PPO-R)(SEQ ID NO.76)。擴增馬鈴薯PPO基因。這些引物是被設計與馬鈴薯PPO基因的5′-和3′-末端互補的。將擴增的1.6kb片段克隆到pGEM-T EASY載體(Promega)中，通過序列分析證實是功能性PPO基因(SEQ ID NO.27)。通過將這個蛋白與甘薯PPO蛋白比對鑑定出馬鈴薯PPO中的銅結合結構域，甘薯PPO蛋白顯示出含有保守的，在位置92的半胱氨酸(Cys)殘基、在位置236的穀氨醯胺殘基(Glu)、和在位置88、109、118、240、244和274的組氨酸(His)殘基，與兩個活性位點的銅配位(Klabunde et al.，Nature Structural Biol.，51084-1090，1998)。這些Cys、Glu和His殘基也存在於馬鈴薯PPO中。通過使用PCR突變置換方法創造無活性的PPO基因。通過Proof Start Taq DNA聚合酶(Qiagen)使用3對引物和野生型RussetRanger PPO作為模板擴增出三個片段。第一對、分別被命名為P1-F和P2-R的序列是5′-GAGAGATCTTGATAAGACACAACC-3′(SEQ ID NO.77)，和5′-CATTACC1ATAAGCC2CAC3TGTATATTAGCTTGTTGC-3′(SEQ ID NO.78)(1「A」到「C」突變，引起位置186的半胱氨酸到甘氨酸的替換；2「A」到「C」突變，引起位置183的半胱氨酸到色氨酸的替換；3「A」到「C」突變，引起位置182的組氨酸到穀氨醯胺的替換)。第二對、分別被命名為P3-F和P4-R的序列是5′-GTGCTTATAGAATTGGTGGC-3′(SEQ ID NO.79)，和5′-TAGTTCCCGGGAGTTCAGTG-3′(SEQ ID NO.80)。第三對、分別被命名為P5-F和P6-R的序列是5′-CTCCCGGGAACTATAGG4AAACATTCCTCT5CGGTCCTGTCCACATCTGGTC-3′(SEQ ID NO.81)和5′-GTGTGATATCTGTTCTTTTCC-3′(SEQ ID NO.82)(4「A」到「G」突變，引起位置326的穀氨醯胺到甘氨酸的替換；5「A」到「T」突變，引起位置330的組氨酸到亮氨酸的替換)。使用引物P1-F和P2-R擴增出80bp片段，用BglII消化。這個片段含有一個粘性末端(BglII)和一個平端，帶有銅結合位點I中的三個突變。使用引物P3-F和P4-R擴增出0.4kb片段，用XmaI消化，含有一個平端和一個粘性末端(XmaI)。使用引物P5-F和P6-R擴增出0.2Kb片段，用XmaI和EcoRV消化。這個具有粘性末端(XmaI)和平端(EcoRV)的第三個片段具有在銅結合位點II中的兩個突變。然後用上述三個連接的PCR擴增的片段替換克隆的野生型馬鈴薯PPO的BglII和EcoRV片段。通過序列分析證實在修改的PPO基因中存在總共5個點突變(SEQ ID NO.28)。為了產生修改的PPO(mPPO)的表達盒，同時地一起連接以下四個片段(1)含有GBSS啟動子的BamHI-HindIII片段，(2)含有突變PPO的HindIII-SacI片段，(3)含有Ubi-3終止子的SacI-KpnI片段，和(4)用KpnI和BamHI消化的質粒pBluescript。然後將這個表達盒插入到二元載體的邊界之間來產生pSIM314。通過用pSIM314轉化Russet Ranger莖外植體評定mPPO基因表達盒的效力。將含有這個表達盒的轉基因植物的結節插枝置於補充有7％蔗糖的MS培養基上。在18℃在黑暗中孵化5周之後，分離微型塊莖，分析PPO活性。為此，在液氮中粉碎1g馬鈴薯塊莖。然後將該粉未添加到5ml的含有50mM鄰苯二酚的50mM MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷-磺酸)緩衝液(pH 6.5)中，在室溫下旋轉孵化約1小時。然後沉澱固體餾分，將上清液轉移到另一個試管，通過測量隨著時間過去的OD-410的變化來測定PPO活性。如表10所示，與未轉化的對照或用不合突變PPO基因的構建體轉化的對照相比，從某些轉基因株系分離的微型塊莖展現出顯著降低的多酚氧化酶活性。在PPO活性方面最強烈的降低在株系「314-9」、「314-17」和「314-29」中觀察到。為了測試突變PPO基因的表達是否還降低迷你塊莖中的PPO活性，將轉基因株系的生根的植物苗種植在土壤中，在生長箱中培育4周。對分離的迷你塊莖的PPO分析表明，在微型塊莖中降低的PPO活性大多數情況下與迷你塊莖中降低的活性相關(表10)。展現出降低的PPO活性的轉基因株系可以在溫室中和在田地中進行繁殖和測試，來證實成熟塊莖中的「低擦傷」表型。因為微型和迷你塊莖表達各種多酚氧化酶，其中一些僅與在成熟塊莖中優勢表達的目標多酚氧化酶有有限的序列同源性，在株系例如「314-9」和「314-17」的成熟塊莖中可以預期更為劇烈的PPO活性降低。數據表明，功能上無活性的PPO基因的過量表達可以引起降低的擦傷敏感性。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵也可以在成熟的、田地生長的塊莖中被證實。因為微型和迷你塊莖表達各種多酚氧化酶，其中一些僅與在成熟塊莖中優勢表達的目標多酚氧化酶有有限的序列同源性，在成熟塊莖中可以預期更為劇烈的PPO活性降低。為了測試這個假設，將8個轉基因株系的植物苗種植在1加侖罐中，在溫室中生長。9周後(衰老之前)從一組植物分離塊莖，12周後(衰老之後)從重複組植物分離塊莖。後一組植物的塊莖可以認為是「成熟的」。如表10所示，如果與迷你塊莖相比較，在株系314-9和314-17的「成熟」塊莖中PPO活性實際上被進一步降低了。數據表明，功能上無活性的PPO基因的過量表達可以引起降低的擦傷敏感性。修改的植物的改進的健康和貯藏特徵也可以在成熟的、田地生長的塊莖中被證實。
表10.在表達修改的PPO基因的馬鈴薯株系中的PPO活性
實施例8特異於馬鈴薯塊莖的非表皮組織的多酚氧化酶基因的尾隨區序列使用常規的轉化方法，這個實施例表明了，能有效地使用與馬鈴薯PPO基因相連的新型尾隨區序列來降低塊莖中的擦傷敏感性。使用逆轉錄PCR來還分離與在馬鈴薯塊莖中表達的PPO基因相連的尾隨區序列。用於第一PCR反應的引物是PPO-1(5′-GAATGAGCTTGACAAGGCGGAG-3′，(SEQ ID NO.83))和寡-dT；用於第二嵌套PCR反應的引物是PPO-2(5′-CTGGCGATAACGGAACTGTTG-3′，(SEQ ID NO.84))和寡-dT。對克隆入pGEM-T中的擴增的DNA片段的序列分析顯示了154-bp尾隨區(SEQ ID NO.29)的存在。然後將通過Ubi內含子分隔的這個尾隨區的有義拷貝和反義拷貝，如前所述與GBSS啟動子和Ubi3終止子融合，來產生表達盒，在附圖3中示出(SEQ ID NO.30)。含有由GBSS間隔區分隔的尾隨區片段的替換性構建體在附圖3中示出(SEQ ID NO.31)。具有更大的GBSS啟動子的類似方案在附圖3中示出(SEQ ID NOs.32-33)。有趣地，在成熟的塊莖中優勢表達的PPO基因的尾隨區(在附圖4中用P-PPO3表示)，與在其他組織包括微型塊莖中優勢表達的PPO基因的尾隨區(在附圖4中用PPOM-41和PPOM-44表示)不同。由於與不同的PPO基因相連的尾隨區之間的低同源性，使用P-PPO3尾隨區將引起僅沉默成熟塊莖特異性的PPO基因。用來源於PPO基因本身的序列將難以實現這種非常特異的基因沉默，因而表現了使用非編碼序列進行基因沉默的優勢。為了使PPO活性的擴展直觀化，將0.5mL的50mM鄰苯二酚滴到切開的遺傳修改的迷你塊莖的切面上。與對照相比，塊莖區域的可見的褐色降低了約5-10倍。有趣地，然而，在馬鈴薯皮上沒有觀察到褐色的降低。似乎是，使用的尾隨區序列特異性地沉默在皮層和木髓中優勢地表達、但不在外皮中表達的PPO基因。這個意外的發現對於塊莖保護自身免於某些病原體通過表皮的感染是有益的，因為PPO基因在某些防衛反應中可以起到一些作用。為了定量地測定PPO活性，如實施例7描述的進行分析。表11顯示了與未轉化的對照相比，在轉化的迷你塊莖中PPO活性的多達80％的降低。在成熟塊莖中預期降低的水平會更大，因為這些塊莖與迷你和微型塊莖相比更優勢地表達目標PPO基因。可以在成熟塊莖中證實株系例如「217-7」和「217-26」的改進的特徵。表11顯示了與未轉化的對照相比，在轉化的迷你塊莖中PPO活性的多達80％的降低。在溫室生長的成熟塊莖中降低的水平更大，因為這些塊莖與迷你和微型塊莖相比更優勢地表達目標PPO基因(表11)。
表11.在表達與PPO基因相連的修改的尾隨區序列的馬鈴薯迷你塊莖中的PPO活性
實施例9增加抗性澱粉水平的表達盒提高塊莖中直鏈澱粉/支鏈澱粉的比例可以進一步增強馬鈴薯產品的營養價值。使得提高直鏈澱粉含量成為可能的一個方法基於編碼澱粉分支酶(SEB)I和II的基因的反義表達(Schwall et al.，NatureBiotechnology 18551-554，2000)。這個方法的缺點是，(1)通過利用反義技術同時沉默兩個不同基因的效率是非常低的，(2)相對大的SBE-I和SEB-II基因序列的反義表達引起不合需要的開放閱讀框的表達(表1)，(3)攜帶兩個反義表達盒的相應構建體不必要地大和複雜，因而增加了重組的機會和降低了轉化頻率。增加馬鈴薯中直鏈澱粉含量的這種方法基於與兩個基因相連的尾隨區序列的表達。用引物對5′-GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTA-3′(SEQ ID NO.85)，和5′-CTAATATTTGATATATGTGATTGT-3′(SEQ ID NO.86)，和5′-ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAG-3′(SEQ ID NO.87)，和5′-ACTAAGCAAAACCTGCTGAAGCCC-3′(SEQ ID NO.88)。分離出這些尾隨區(SEQ ID No.34和35)。單個啟動子驅動兩個尾隨區的有義和反義融合物表達，有義和反義融合物由遍在蛋白-7內含子分隔，之後是遍在蛋白-3終止子。完整表達盒的大小僅為2.5-kb。用於增加馬鈴薯中直鏈澱粉含量的這種方法基於與兩個基因相連的尾隨區序列的表達。用引物對5′-GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTA-3′(SEQ ID NO.85)，和5′-CTAATATTTGATATATGTGATTGT-3′(SEQ ID NO.86)，和5′-ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAG-3′(SEQ ID NO.87)，和5′-ACTAAGCAAAACCTGCTGAAGCCC-3′(SEQ ID NO.88)。分離出這些尾隨區(SEQ ID No.34和35)。從馬鈴薯品種Russet ranger分離了類似的尾隨區(SEQ ID NOs.96和97，見下文)。
SEQ ID NO.96GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTAGCATTGACTGATTGCATCATAGTTGTTTTTTTTTTTTAAAGTATTTCCTCTATGCATATTATTAGCATCCAATAAATTTACTGGTTGTTGTACATAGAAAAAGTGCATTTGCATGTATGTGTTTCTCTGAAATTTTCCCCAGTTTTTGGTGCTTTGCCTTTGGAGCCAAGTCTCTATATGTAATAAGAAAACTAAGAACAATCACATATATCAAATATTASEQ ID NO.97ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAGATTTGAACGCTACATAGAGCTTCTTGACGTATCTGGCAATATTGCATCAGTCTTGGCGGAATTTCATGTGACAAAAGGTTTGCAATTCTTTCCACTATTAGTAGTGCAACGATATACGCAGAGATGAAGTGCTGAACAAACATATGTAAAATCGATGAATTTATGTCGAATGCTGGGACGGGCTTCAGCAGGTTTTGCTTAGT單個啟動子驅動兩個尾隨區的的有義和反義融合物表達，有義和反義融合物由遍在蛋白-7內含子分隔，之後是遍在蛋白-3終止子。完整表達盒的大小僅為2.5kb。
實施例10無標記轉化方法的開發這個實施例表明，不需要選擇性標記基因的穩定整合就可以有效地轉化植物。這種方法首次利用了這樣的現象，靶向植物細胞的核的DNA隨後常常未能整合到植物細胞的基因組中。發明人作出了令人驚訝的發現，有可能通過將受感染外植體置於具有合適的選擇性試劑的植物培養基上5天，來選擇暫時地表達未整合的、含有選擇性標記基因的T-DNA的細胞。用來開發當前方法的第二種現象是，來自不同二元載體的T-DNA常常靶向相同的植物細胞核。通過使用兩個不同的二元載體，一個含有T-DNA上的選擇性標記，另一個攜帶具有目標真實序列的T-DNA或P-DNA，有可能應用一種短暫的選擇系統，獲得愈傷組織、幼苗或植物的群體，其中的很大部分代表無標記轉化事件。命名為pSIM011的常規二元載體被用於代表具有「目標序列」的載體，在這個測試情況中，所述目標序列是位於常規T-DNA上的β葡糖醛酸酶(GUS)基因的表達盒。用於這些實驗的第二二元載體含有表達盒，所述表達盒包含位於pSIM011衍生物的T-DNA邊界之間的、由遍在蛋白-7基因的強啟動子驅動的新黴素磷酸轉移酶(NPTII)基因和隨後的胭脂鹼合酶(nos)基因的終止子序列。令人驚訝地，通過用酵母乙醇脫氫酶1(ADH1)基因的終止子(Genbank登錄號V01292，SEQ ID NO.56)替換nos終止子，也可以獲得短暫NPTII基因表達水平的很強水平。這個發現是使人感興趣的，因為酵母ADH1終止子與任何植物終止子都不具有同源性。重要地，在此應當指出，許多酵母終止子不能在植物中充分地起作用。舉例來說，使用GUS基因和隨後的酵母異-1-細胞色素C(CYC1)終止子(Genbank登錄號SCCYT1)在如上所述的類似實驗中幾乎沒有觀察到GUS基因表達。通過用酵母ADH1終止子替換nos終止子產生了攜帶選擇性標記基因NPTII的改進的載體。含有選擇性標記基因用於短暫轉化的二元載體被命名為「LifeSupport」(附圖5)。同時用兩個分別含有pSIM011和LifeSupport的A.tumefaciens LBA4404菌株感染馬鈴薯莖外植體。如實施例3描述的，在進行沉澱、洗滌和重懸浮至OD600nm0.4之前，使1/10稀釋的每個菌株的過夜生長培養物生長5-6小時。然後將重懸浮的細胞以0.2(OD600nm)的每個細菌的最終密度用於感染0.4-0.6cm節間馬鈴薯片段。感染的莖如實施例3中一樣處理，主要區別是用卡那黴素選擇被限於在愈傷組織誘導培養基上培養的第一個5天。然後，容許外植體在新鮮的CIM和僅含有timentine 150mg/L、但不含選擇性抗生素的SIM中進一步發育。幼苗來源於在40-60％的受感染莖中發育的愈傷組織，從感染那天起約3個月內，來自所述幼苗的葉片都進行GUS表達測試和PCR分析，來鑑定含有目標序列但不含標記基因的事件。如表12所示，11％的幼苗代表無標記的轉化事件。如上所述雙菌株的方法也可以用來轉化菸草。對約2個月內發育的幼苗進行GUS分析和PCR分析。鑑定出的高頻率無標記轉化事件(18％)意味著，開發出的該方法適合於除馬鈴薯以外的植物物種(表12)。重要地，用兩個不同的土壤桿菌菌株次序地而不是同時地感染，引起無標記轉化的效率方面的增加。通過用含pSIM011的土壤桿菌菌株感染馬鈴薯莖外植體，將被感染外植體置於共培養平板上4小時，然後用LifeSupport載體再感染它們，發現了次序感染的令人驚訝的效果。在這個實施例中，雙重感染的外植體按先前描述的一樣處理。如表13所示，在兩次不同的感染之間的4小時延遲時間引起了馬鈴薯中2倍增加的無標記轉化事件頻率。
實施例11用pSIM340精確育種這個實施例說明了精確育種的效力。通過將馬鈴薯遺傳元件插入到馬鈴薯中(參見實施例1、4和7)，使用無標記轉化(實施例10)，增強了馬鈴薯的健康和農學特徵。通過將突變PPO和轉化酶抑制物的兩個表達盒插入到二元載體pSIM112′中，創造了含有插入在P-DNA末端之間的轉化酶抑制物和突變多酚氧化酶基因的兩個表達盒的、被命名為pSIM340的二元載體(附圖1)。用pSIM340和進一步改進的LifeSupport載體同時地感染馬鈴薯莖外植體。然後如之前討論的共培養感染的外植體，進行短暫選擇，進行誘導來增殖和發育幼苗。3個月後，將小幼苗轉移到新的培養基，容許額外生長3周。然後如在實施例2和3中描述的，對幼苗進行表型分析，收集葉片材料用於分子分析來測定主幹、標記基因和帶有目標序列的P-DNA的存在。如表14所示，1.2％的事件代表含有pSIM340的修改的P-DNA、不含LifeSupport的植物。這個無標記轉化的頻率比用T-DNA的更低，再次顯示了P-DNA和T-DNA之間的功能差異。
實施例12選擇LifeSupport T-DNA的穩定整合這個實施例表明，可以通過利用細菌胞嘧啶脫氨酶基因選擇LifeSupport T-DNA的穩定整合來提高精確育種方法的效率。上述實施例表明，用修改的P-DNA的無標記轉化的效率比使用常規的T-DNA低好幾倍。為了提高產生僅含有修改的P-DNA的幼苗的效率，將包含細菌胞嘧啶脫氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶(upp)基因(InvivoGen，CA)的自殺基因融合物的表達盒插入到LifeSupport載體的T-DNA邊界之間，產生pSIM346(附圖5)。用攜帶pSIM340的一個菌株和攜帶pSIM346的另一個菌株感染馬鈴薯莖外植體，隨後置於以下培養基上(1)共培養培養基2天，(2)CIMTK培養基5天，選擇短暫的標記基因表達，(3)CIMT培養基30天，容許短暫表達標記基因的植物細胞增殖，(4)含有500mg/L的無毒的5-氟胞嘧啶(5-FC)的SIMT培養基，5-氟胞嘧啶將由表達codA∷upp的植物細胞轉變為有毒的毒性5-氟尿嘧啶(5-FU)，來選擇LifeSupport T-DNA的穩定整合。在4周內愈傷組織在SIMT上生出幼苗。將這些幼苗轉移到有timentin的MS培養基，容許生長，直到獲得用於PCR分析的足夠多的組織。然後從100個幼苗中提取DNA，用於測定P-DNA、LifeSupport和主幹的存在。如表15所示，被分析的幼苗都不含LifeSupport T-DNA，首次表明，codA∷upp基因融合物可在再生前被用做陰性選擇性標記。更重要地，這些結果表明，針對LifeSupport T-DNA整合的陰性選擇增加了僅含有修改的P-DNA的幼苗的頻率。通過將短暫標記基因表達的陽性選擇與針對codA∷upp基因融合物的穩定整合的陰性選擇結合，僅含修改的P-DNA的幼苗的頻率是僅應用短暫標記基因表達的陽性選擇的約5倍高(表15)。通過使用LifeSupport載體pSIM350(附圖5)，其類似於pSIM346但含有代替codA∷upp基因融合物的codA基因，獲得了在無標記轉化效率方面甚至更大的增加。用pSIM340和pSIM350同時地感染的馬鈴薯莖外植體如上所述進行處理，對產生的51個幼苗進行分子檢測，檢測僅含來自pSIM340的T-DNA區的事件的發生。有趣地，這個PCR分析顯示，某些幼苗含有codA基因(表15)。這個發現表明，codA在植物中作為陰性選擇性標記不象codA∷upp一樣嚴密(tight)。更重要地，大量的幼苗(29％)被顯示代表無標記轉化事件。通過不是同時地、而是次序地用pSIM340和pSIM350感染外植體，可以進一步增加效率。通過用pSIM340感染外植體，4小時後用pSIM350再感染它們，預期無標記轉化頻率可達約30-40％。
實施例13削弱LifeSupport T-DNA的整合這個實施例表明，可以通過使用ω-突變的virD2基因削弱LifeSupport T-DNA整合入植物基因組來提高精確育種方法的效率。已經顯示了土壤桿菌蛋白vird2的ω結構域對於該蛋白支持將T-DNA整合到植物基因組中的能力是很重要的(Mysore et al.，Mol Plant Microbe Interact 11668-83，1998)。根據這個觀察結果，創造含有ω-突變virD2蛋白的表達盒的修改的LifeSupport載體，所述ω-突變的virD2蛋白的表達盒被插入到載體的主幹序列中的SacII位點中。通過從質粒pCS45(Dr.Walt Ream-Oregon State University，OR，USA的惠贈，SEQ ID NO.36)擴增2.2kb DNA片段獲得所述表達盒。攜帶這個表達盒的LifeSupport衍生物，被命名為pSIM401Ω(附圖5)，用於支持用pSIM340的修改的P-DNA轉化馬鈴薯植物。在短暫選擇和幼苗誘導之後，對100個幼苗進行分子測試，測試轉基因的存在。如表15所示，4.4％的幼苗僅含有修改的P-DNA，表明使用ω-virD2使無標記轉化的效率增加了約4倍(表15)。通過將LifeSupport T-DNA的大小從3.7kb(在pSIM401Ω中)提高到8.1kb(在被命名為pSIM341Ω的pSIM401Ω衍生物中；附圖5)進一步改進了效率。通過從同時用pSIM340和pSIM341Ω感染的馬鈴薯莖外植體再生幼苗，分析的81個事件中的7個(7％)被顯示代表無標記轉化事件(表15)。通過次序地而不是同時地用pSIM340和LifeSupport感染外植體，可以獲得進一步的改進。按照與實施例10中的描述類似的方法，通過用pSIM340感染外植體、4小時後用LifeSupport再次感染它們，僅含修改的P-DNA的植物的頻率可被近乎加倍。
實施例141-菌株法的開發這個實施例表明，通過使用同時含有P-DNA載體和LifeSupport的單個土壤桿菌菌株，也可以獲得高頻率的無標記轉化。創造可以在土壤桿菌中同時維持的兩個兼容的二元載體。作為對使用這個系統來穩定地整合分別攜帶目標DNA和標記基因的兩個T-DNA的替代(Komari et al.美國專利5731179，1998)，其計劃用於僅整合修改的P-DNA。第一載體，被命名為pSIM356，含有插入到P-DNA末端之間的表達盒，所述表達盒包含由Ubi7啟動子驅動的GUS基因和隨後的UbiT。這個載體的主幹部分含有來自pVS1和pBR322的細菌複製起點、用於細菌選擇的奇黴素抗性基因，和IPT基因的表達盒，來允許在植物中選擇主幹整合(附圖1)。第二載體，被命名為pSIM363，含有插入到常規T-DNA邊界之間的表達盒，所述表達盒包含由Ubi7啟動子驅動的NPTII基因和隨後的酵母ADH1終止子(附圖5)。這個載體的主幹部分含有來自ColE1(Genbank號V00268)和ori V(Genbank號M20134)的細菌複製起點，和用於細菌選擇的卡那黴素抗性基因。在100個菸草幼苗中測試使用pSIM356和pSIM363來提高無標記轉化頻率的構想。如表16所示，約19％的再生幼苗含有目標DNA，不含標記基因。通過對馬鈴薯應用這種1菌株法，也發現了無標記轉化效率方面的增加。被測的60個獨立幼苗中的9個(15％)含有pSIM340T-DNA並缺乏LifeSupport T-DNA(表16)。可以將這種1-菌株法與實施例12中描述的方法組合，來將短暫標記基因表達的陽性選擇與針對codA基因穩定整合的陰性選擇結合。為此，開發了LifeSupport載體pSIM365(附圖5)。攜帶這個載體和P-DNA載體的土壤桿菌菌株可被用於有效地開發植物，所述植物僅含有穩定地整合到它們的基因組中的、位於P-DNA內部的目標表達盒。
實施例15依靠天然標記的精確育種方法除了用僅含有期望序列的P-DNA轉化作物植物來導入有益性狀之外，本發明還提供了用含有其他天然標記基因的P-DNA轉化這種植物的方法。備選的新的和天然的標記基因是Arabidopsis液泡Na+/H+反向運轉基因和苜蓿alfin-1基因的馬鈴薯同源物。這些基因的表達不僅容許鑑定轉化事件，還為轉化的植物提供了耐鹽性。因而，在不斷擴大的農業用地中的高含鹽水平將更少地影響含有耐鹽性標記的馬鈴薯植物。液泡Na+/H+反向運轉同源物的兩個版本，被命名為Pst(馬鈴薯耐鹽性)，是從獲自美國馬鈴薯Genbank(WI)的、被命名為「LBR4」的晚疫病抗性品種的cDNA擴增的，使用的寡核苷酸對是5′-CCCGGGATGGCTTCTGTGCTGGCT-3′(SEQ ID NO.89)和5′-GGTACCTCATGGACCCTGTTCCGT-3′(SEQ ID NO.90)。它們的序列在SEQ ID NO.37和38中示出。與alfin-1同源的第三個基因(SEQ ID NO.39)是使用引物5′-CCCGGGTATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTG-3′(SEQ ID NO.91)和5′ACTAGTTAAACTCTAGCTCTCTTGC-3′(SEQ ID NO.92)。從LBR4馬鈴薯DNA擴增的。通過將與Ubi7啟動子的融合物插入到修改的pSIM341載體的常規T-DNA邊界之間，評估了Pst基因發揮轉化標記功能的效力。在短暫選擇階段之後，容許卡那黴素抗性細胞增殖和發育幼苗。然後將這些幼苗轉移到含100-150mM氯化鈉的培養基中。耐鹽性的幼苗代表含有修改的pSIM341的T-DNA的轉化事件。
實施例16塊莖特異性啟動子新近分離的塊莖特異性啟動子可以替換使用的GBSS啟動子來開發上述實施例中描述的表達盒。通過用特異於馬鈴薯蛋白酶抑制因子基因(Genbank登記號D17332)(SEQ ID NO.39)的引物使用反向聚合酶鏈式反應，從Russet Burbank馬鈴薯植物的基因組分離出這個啟動子。通過創造含有由該啟動子驅動的GUS基因和NPTII標記基因的表達盒的二元載體來測試這種PIP啟動子的效力。用GBSS啟動子來代替PIP啟動子的類似構建體被用作對照。通過用攜帶所述二元載體的土壤桿菌菌株感染莖外植體獲得轉化的幼苗，共培養2天，在CIMTK培養基上選擇2個月。將這些幼苗轉移到新鮮培養基來誘導根系形成，然後種植到土壤中。在溫室中3個月的生長期後，可以分析塊莖的GUS表達。
實施例17用於精確育種的優選的構建體和轉化方法除pSIM340之外，許多其他載體可被用於用修改的P-DNA進行轉化來改進馬鈴薯植物。兩個這種載體含有與PPO基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒，所述PPO基因在除表皮之外的所有塊莖組織中表達(參見實施例8)。載體pSIM370含有與磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的其他表達盒(參見實施例6)。載體pSIM371含有馬鈴薯alfin-1同源物的第三個表達盒(附圖1)。第三個替換性的載體，被命名為pSIM372，含有馬鈴薯alfin-1同源物的表達盒，以及PPO相連的尾隨區、R1相連的前導區和磷酸化酶相連的前導區的融合物的有義和反義拷貝的表達盒。1-菌株法的優選的LifeSupport載體是pSIM365。對於2-菌株法，優選的載體是pSIM367，其含有在T-DNA邊界之間的NPTII和codA的表達盒，和在質粒主幹中的額外的ωvirD2表達盒(附圖5)。用攜帶pSIM365和載體pSIM370、371和372之一的1個菌株感染馬鈴薯莖外植體，或次序地用分別攜帶pSIM366和優選的目標載體之一的2個菌株感染。2天的共培養和5天的短暫選擇期之後，將外植體轉移到培養基中用於增殖/再生和消除土壤桿菌。三十天後，將外植體再次轉移到相同的、但現在還含有5-FU的培養基，來消除含有LifeSupport T-DNA的事件。將隨後在愈傷組織上產生的幼苗轉移到可含有100-200mM鹽的再生培養基，來篩選耐鹽性的事件。容許IPT陰性的幼苗生根並發育為成熟植物。預期這些植物的一大部分(10％-100％)代表無標記和無主幹的、含有被穩定整合到它們基因組中的帶有目標核苷酸序列的P-DNA的植物。
實施例18產生P-DNA轉化事件的替換性方法共轉化之後分離可以用同時攜帶P-DNA載體(例如pSIM340)和T-DNA載體(例如pSIM363)的土壤桿菌感染植物組織，例如外植體。2天的共培養期之後，將感染的外植體轉移到含timentine和卡那黴素的CIM培養基。然後可以將外植體轉移到含timentine和卡那黴素的SIM培養基，在25℃孵化以容許幼苗形成。可以使產生的幼苗生根並轉移到土壤中(轉化過程的詳情參見實施例3)。這種方法產生的轉化的植物苗可以進行PCR篩選，篩選P-DNA和T-DNA的至少一個拷貝的存在。可以將這種植物轉移到溫室中並容許成熟。然後可以用性成熟植物與未轉化的植物雜交。做為選擇，可以容許轉基因植物自交。對馬鈴薯來說，舉例來說，徹底地洗滌從T0植物的漿果分離的T1種子(不乾燥)，與2000ppm GA3孵化約16小時，種植到含有Promix或另一種適合的混合物的3英寸罐中。然後用例如3mm蛭石覆蓋罐，來保持溼度，直到幼苗開始發芽。這種子代植物可被用於育種計劃中來開發僅含天然DNA的轉基因品種。作為對同時使用P-DNA和T-DNA的替換，也有可能使用兩個P-DNA，一個含有期望的多核苷酸(例如pSIM340)，另一個含有選擇性標記基因(例如pSIM108)。按與如上所述類似的方法，可以產生含有每種P-DNA的至少一個拷貝的植物。可以使這些植物自交和雜交來獲得僅攜帶含期望的多核苷酸的P-DNA的子代植物。
表1.在反義馬鈴薯株系中潛在地表達的未表徵的肽
表3.轉化效率
表4.Russet Ranger轉化產生的主幹整合
NA不適用表5.Russet Burbank轉化產生的主幹整合
表6.來源於冷藏的pSIM320迷你塊莖的炸薯條中的丙烯醯胺水平
NA未獲得表7.來源於未轉化的成熟塊莖的炸薯條中的丙烯醯胺水平
*更高的數值表明最終的油炸產品的更淺的顏色表8.冷藏的pSIM332迷你塊莖中的葡萄糖水平
表9.冷藏的pSIM216迷你塊莖中的葡萄糖水平
表10.在表達修改的PPO基因的馬鈴薯株系中的PPO活性
表11.在表達與PPO基因相連的修改的尾隨區序列的馬鈴薯迷你塊莖中的PPO活性
表12.用LifeSupport載體+pSIM011的無標記轉化
共轉化的GUS和NPT都是PCR陽性僅目標基因的GUS PCR陽性未轉化的對於GUS和NPT，植物都是PCR陰性的表13.用LifeSupport載體和pSIM011次序轉化馬鈴薯
未轉化的對於標記和目標基因，植物是PCR陰性的表14.用P-DNA載體pSIM340+LifeSupport無標記轉化
共轉化的對於pSIM340的PPO基因和來自LifeSupport的NPT基因都是PCR陽性未轉化的對於PPO和NPTII，植物是PCR陰性的表15.用pSIM340+改進的LifeSupport載體無標記轉化馬鈴薯
共轉化的對於pSIM340的PPO基因和來自LifeSupport的NPT基因都是PCR陽性未轉化的對於PPO和NPTII，植物是PCR陰性的表16.用同時攜帶pSIM356和pSIM363的單個土壤桿菌菌株無標記轉化馬鈴薯
共轉化的對於pSIM356的GUS基因和來自LifeSupport的NPT基因都是PCR陽性未轉化的對於PPO和NPTII，植物是PCR陰性的
SEQ ID NO.標識SEQ ID NO.1馬鈴薯P-DNA。SEQ ID NO.1的加粗下劃線的部分分別代表P-DNA的左側(5′-)和右側(3′-)邊界樣序列。
SEQ ID NO.2小麥P-DNASEQ ID NO.3IPT基因的表達盒SEQ ID NO.4二元載體pSIM111SEQ ID NO.5馬鈴薯轉化酶抑制物基因SEQ ID NO.6馬鈴薯GBSS啟動子SEQ ID NO.7馬鈴薯遍在蛋白-3基因終止子SEQ ID NO.8與R1基因相連的馬鈴薯前導區SEQ ID NO.9馬鈴薯遍在蛋白內含子SEQ ID NO.10與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.11間隔區SEQ ID NO.12與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.13更長的馬鈴薯GBSS啟動子SEQ ID NO.14與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.15與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.16與R1基因相連的馬鈴薯尾隨區SEQ ID NO.17與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.18與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.19與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.20與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.21與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的馬鈴薯前導區SEQ ID NO.22與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的馬鈴薯尾隨區
SEQ ID NO.23與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.24與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.25與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.26與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.27馬鈴薯PPO基因SEQ ID NO.28修改的無活性的馬鈴薯PPO基因SEQ ID NO.29與PPO基因相連的馬鈴薯尾隨區SEQ ID NO.30與PPO基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的表達盒SEQ ID NO.31與PPO基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.32與PPO基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.33與PPO基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒SEQ ID NO.34與澱粉分支酶基因相連的馬鈴薯尾隨區SEQ ID NO.35與澱粉分支酶基因相連的馬鈴薯尾隨區SEQ ID NO.36ω-突變的virD2基因的表達盒SEQ ID NO.37馬鈴薯耐鹽性基因Pst1SEQ ID NO.38馬鈴薯耐鹽性基因Pst2SEQ ID NO.39馬鈴薯耐鹽性基因Pst3SEQ ID NO.40馬鈴薯塊莖特異性啟動子SEQ ID NOs.41-55參見表2SEQ ID NO.56酵母ADH終止子SEQ ID NO.94小麥左側邊界樣序列SEQ ID NO.95小麥右側邊界樣序列SEQ ID NO.96來自Ranger的SBE尾隨區SEQ ID NO.97來自Ranger的SBE尾隨區
SEQ ID NO.98馬鈴薯P-DNA。SEQ ID NO.98的加粗下劃線的部分分別代表P-DNA的左側(5′-)和右側(3′-)邊界樣序列。
SEQ ID NO.1GTTTACA TACCATATATCCTGTCAGAGGTATAGAGGCATGACTGGCATGATCACTAAATTGATGCCCACAGAGGAGACTTATAACCTACAGGGGCACGTAGTTCTAGGACTTGAAAGTGACTGACCGTAGTCCAACTCGGTATAAAGCCTACTCCCAACTAAATATATGAAATTTATAGCATAACTGCAGATGAGCTCGATTCTAGAGTAGGTACCGAGCTCGAATTCCTTACTCCTCCACAAAGCCGTAACTGAAGCGACTTCTATTTTTCTCAACCTTCGGACCTGACGATCAAGAATCTCAATAGGTAGTTCTTCATAAGTGAGACTATCCTTCATAGCTACACTTTCTAAAGGTACGATAGATTTTGGATCAACCACACACACTTCGTTTACA CGGTATATATCCTGCCASEQ ID NO.2TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAACAACCATAATCAGGCTGTAATTATCAAGAGAACTAATGACAAGAAGCAGAGCTTATCAAGTGTTTCGTCCAGCTGTAACATGGGCACAAAAGCTTGCTTGATGCATGTCTGGCTTTTCAAAGAGCAATGTATTCTCAGGTACCTGCACGTTTGATCCCCTACCACGTACAAGACGAGCAGAAAGGACATGTCTGCAGAAACTTAGACACATCCATTGCAGACTCGTTCCGAAGCATCAGGAGAGTAGTCAGCAATGGTCATCTGCTGATGTAAATTAATTGATTGTTGGTAATCAAATTTTAACAGCAATATATATAATATATCAATAGTATATTGAACTATGAAAGACTGTAATCATATATAACAGCATACAAATTGTCGTGGAAACAAGAGGAGCTCATCAAGTGTTTAGTTCAGAAATAGCTAACCAAGAATGCAATATAATAGGGGTACTGAGCTCCCTTCAAAATTACTAACTTCAGAAATAGCTAACCAAGAATGCAATGGCATTGCATAATTTAAACAACTGTCAGCACCAATCTCTGACTGAAGGCAGTTTACCCATTCAGAAGAGCACACATTTTCTGAACGACAACTCTGAGCGGGGATTGTTGACAGCAGCAATTAATCTGGCCTCAAGATGGTTTCCAACAACATAGATCAGATACAGCACTCAAGCACCCAATAATCAGCCAGTACTGATCTGGTTACCACTGCAATTGATTAACAGATGAACTGTGAAATTAAGATTTAACTGACAGTAATATATAGCAGTTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAACSEQ ID NO.3CTGCAGCCAAAGCACATACTTATCGATTTAAATTTCATCGAAGAGATTAATATCGAATAATCATATACATACTTTAAATACATAACAAATTTTAAATACATATATCTGGTATATAATTAATTTTTTAAAGTCATGAAGTATGTATCAAATACACATATGGAAAAAATTAACTATTCATAATTTAAAAAATAGAAAAGATACATCTAGTGAAATTAGGTGCATGTATCAAATACATTAGGAAAAGGGCATATATCTTGATCTAGATAATTAACGATTTTGATTTATGTATAATTTCCAAATGAAGGTTTATATCTACTTCAGAAATAACAATATACTTTTATCAGAACATTCAACAAAGTAACAACCAACTAGAGTGAAAAATACACATTGTTCTCTAAACATACAAAATTGAGAAAAGAATCTCAAAATTTAGAGAAACAAATCTGAATTTCTAGAAGAAAAAAATAATTATGCACTTTGCTATTGCTCGAAAAATAAATGAAAGAAATTAGACTTTTTTAAAAGATGTTAGACTAGATATACTCAAAAGCTATCAAAGGAGTAATATTCTTCTTACATTAAGTATTTTAGTTACAGTCCTGTAATTAAAGACACATTTTAGATTGTATCTAAACTTAAATGTATCTAGAATACATATATTTGAATGCATCATATACATGTATCCGACACACCAATTCTCATAAAAAGCGTAATATCCTAAACTAATTTATCCTTCAAGTCAACTTAAGCCCAATATACATTTTCATCTCTAAAGGCCCAAGTGGCACAAAATGTCAGGCCCAATTACGAAGAAAAGGGCTTGTAAAACCCTAATAAAGTGGCACTGGCAGAGCTTACACTCTCATTCCATCAACAAAGAAACCCTAAAAGCCGCAGCGCCACTGATTTCTCTCCTCCAGGCGAAGATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTAACGGGGAAGACGATCACCCTAGAGGTTGAGTCTTCCGACACCATCGACAATGTCAAAGCCAAGATCCAGGACAAGGAAGGGATTCCCCCAGACCAGCAGCGTTTGATTTTCGCCGGAAAGCAGCTTGAGGATGGTCGTACTCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGTCAACTCTCCATCTCGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGCGTCGCACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCGTAATTGTTTTTGGCTTTGTCCTGTTGTGGCAGGGCGGCAAATACTTCCGACAATCCATCGTGTCTTCAA
ACTTTATGCTGGTGAACAAGTCTTAGTTTCCACGAAAGTATTATGTTAAATTTTAAAATTTCGATGTATAATGTGGCTATAATTGTAAAAATAAACTATCGTAAGTGTGCGTGTTATGTATAATTTGTCTAAATGTTTAATATATATCATAGAACGCAATAAATATTAAATATAGCGCTTTTATGAAATATAAATACATCATTACAAGTTGTTTATATTTCGGGTGGACTAGTTTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGGAATTCSEQ ID NO.4AGCTTTGGCAGGATATATACCGGTGTAAACGAAGTGTGTGTGGTTGATCCAAAATCTATCGTACCTTTAGAAAGTGTAGCTATGAAGGATAGTCTCACTTATGAAGAACTACCTATTGAGATTCTTGATCGTCAGGTCCGAAGGTTGAGAAAAATAGAAGTCGCTTCAGTTACGGCTTTGTGGAGGAGTAAGGGTACCTACTCTAGAATCGAGCTCATCGTTATGCTATAAATTTCATATATTTAGTTGGGAGTAGGCTTTATACCGAGTTGGACTACGGTCAGTCACTTTCAAGTCCTAGAACTACGTGCCCCTGTAGGTTATAAGTCTCCTCTGTGGGCATCAATTTAGTGATCATGCCAGTCATGCCTCTATACCTCTGACAGGATATATGGTACTGTAAACACTAGTTGTGAATAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGGTCACCTATCTCGAGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGG
CGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGATCCTGCAGCCAAAGCACATACTTATCGATTTAAATTTCATCGAAGAGATTAATATCGAATAATCATATACATACTTTAAATACATAACAAATTTTAAATACATATATCTGGTATATAATTAATTTTTTAAAGTCATGAAGTATGTATCAAATACACATATGGAAAAAATTAACTATTCATAATTTAAAAAATAGAAAAGATACATCTAGTGAAATTAGGTGCATGTATCAAATACATTAGGAAAAGGGCATATATCTTGATCTAGATAATTAACGATTTTGATTTATGTATAATTTCCAAATGAAGGTTTATATCTACTTCAGAAATAACAATATACTTTTATCAGAACATTCAACAAAGTAACAACCAACTAGAGTGAAAAATACACATTGTTCTCTAAACATACAAAATTGAGAAAAGAATCTCAAAATTTAGAGAAACAAATCTGAATTTCTAGAAGAAAAAAATAATTATGCACTTTGCTATTGCTC
GAAAAATAAATGAAAGAAATTAGACTTTTTTAAAAGATGTTAGACTAGATATACTCAAAAGCTATCAAAGGAGTAATATTCTTCTTACATTAAGTATTTTAGTTACAGTCCTGTAATTAAAGACACATTTTAGATTGTATCTAAACTTAAATGTATCTAGAATACATATATTTGAATGCATCATATACATGTATCCGACACACCAATTCTCATAAAAAGCGTAATATCCTAAACTAATTTATCCTTCAAGTCAACTTAAGCCCAATATACATTTTCATCTCTAAAGGCCCAAGTGGCACAAAATGTCAGGCCCAATTACGAAGAAAAGGGCTTGTAAAACCCTAATAAAGTGGCACTGGCAGAGCTTACACTCTCATTCCATCAACAAAGAAACCCTAAAAGCCGCAGCGCCACTGATTTCTCTCCTCCAGGCGAAGATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTAACGGGGAAGACGATCACCCTAGAGGTTGAGTCTTCCGACACCATCGACAATGTCAAAGCCAAGATCCAGGACAAGGAAGGGATTCCCCCAGACCAGCAGCGTTTGATTTTCGCCGGAAAGCAGCTTGAGGATGGTCGTACTCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGTCAACTCTCCATCTCGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGCGTCGCACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCGTAATTGTTTTTGGCTTTGTCCTGTTGTGGCAGGGCGGCAAATACTTCCGACAATCCATCGTGTCTTCAAACTTTATGCTGGTGAACAAGTCTTAGTTTCCACGAAAGTATTATGTTAAATTTTAAAATTTCGATGTATAATGTGGCTATAATTGTAAAAATAAACTATCGTAAGTGTGCGTGTTATGTATAATTTGTCTAAATGTTTAATATATATCATAGAACGCAATAAATATTAAATATAGCGCTTTTATGAAATATAAATACATCATTACAAGTTGTTTATATTTCGGGTGGACTAGTTTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGGAATTCTATCCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGASEQ ID NO.5ATGAGAAATTTATTCCCCATATTGATGCTAATCACCAATTTGGCACTCAACAACGATAACAACAACAACAACAACAACAACAATAATTATAATCTCATACACGCAACGTGTAGGGAGACCCCATATTACTCCCTATGTCTCACCACCCTACAATCCGGTCCACGTAGTAACGAGGTTGAGGGTGGTGATGCCATCACCACCCTAGGCCTCATCATGGTGGACGCGGTGAAATCAAAGTCCATAGAAATAATGGAAAAAATAAAAGAGCTAGAGAAATCGAACCCTGAGTGGCGGGCCCCACTTAGCCAGTGTTACGTGGCGTATAATGCCGTCCTACGAGCCGATGTAACGGTAGCCGTTGAAGCCTTAAAGAAGGGTGCCCCCAAATTTGCTGAAGATGGTATGGATGATGTTGTTGCTGAAGCACAAACTTGTGAGTATAGTTTTAATTATTATAATAAATTGGATTTTCCAATTTCTAATTTGAGTAGGGAAATAATTGAACTATCAAAAGTTGCTAAATCCATAATTAGAATGTTATTATGASEQ ID NO.6GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCG
TGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGSEQ ID NO.7TTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGSEQ ID NO.8ACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAAAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATSEQ ID NO.9GTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGSEQ ID NO.10GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTA
AATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.11GTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGSEQ ID NO.12GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.13GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACSEQ ID NO.14GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAG
AAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.15GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQ ID NO.16TCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGSEQ ID NO.17GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.18GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGC
CTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.19GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.20GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTT
CCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.21TTAGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAAASEQ ID NO.22GAGGGGGAAGTGAATGAAAAATAACAAAGGCACAGTAAGTAGTTTCTCTTTTTATCATGTGATGAAGGTATATAATGTATGTGTAAGAGGATGATGTTATTACCACATAATAAGAGATGAAGAGTCTCATTTTCTGCTTAAAAAAACAATTCACTGGCSEQ ID NO.23GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGA
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ATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.26GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.27ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACATTGTGCTTATTGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCAT
AGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGAAAACATTCCTCACGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAASEQ ID NO.28ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACAGTGGGCTTATGGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGGAAACATTCCTCTCGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAASEQ ID NO.29TTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGTTTGGG
SEQ ID NO.30GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.31GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.32GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTG
CAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQ ID NO.33GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGA
SEQ ID NO.34GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTAGCATTGACTGATGGCATCATAGTTTTTTTTTTAAAAGTATTTCCTCTATGCATATTATTAGTATCCAATAAATTTACTGGTTGTTGTACATAGAAAAAGTGCATTTGCATGTATGTGTTTCTCTGAAATTTTCCCCAGTTTTTGGTGCTTTGCCTTTGGAGCCAAGTCTCTATATGTATAAGAAAACTAAGAACAATCACATATATCAAATATTAGSEQ ID NO.35ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAGATTTGAACGCTACATAGAGCTTCTTGACGTATCTGGCAATATTGCATCAGTCTTGGCGGAATTTCATGTGACAACAAGGTTTGCAATTCTTTCCACTATTAGTAGTGCAACGATATACGCAGAGATGAAGTGCTGAACAAACATATGTAAAATCGATGAATTTATGTCGAATGCTGGGACGGGCTTCAGCAGGTTTTGCTTAGTSEQ ID NO.36CCGCGGTTTTCTCTCCATCGCGTCAGAGGCCGGTTTTCGTCGGCATCGAAGAGGGCCACTCGTTTACCGTCATTTGCCAAAGCAGCGCAAAGGCCCATGAGTGCGGTGGTTTTGCCAGCACCCCCTTTGAAAGAGCAAAACGTCAAAAGTTGCATATTCTGATCCCGCCTGTCCTGTGAAACGGAGTGCATTTGTATTTTTGTTCGTATAAATGTTTTTGTGATTATCGATGAGTAAAAGCGTTGTTACACTATTTTTTATTTCAAATTCGTTATAATTAAATTGCAATTGTAGCAATTATATTCGGTTTTTCCTGTAAATATACTGTTGATTTCATATCGAGTAGGGCTAGACTTTAATCTGTCTACCCGGGCACATTTCGTGCTGGAGTATTCAGACCTTCCGCTTTTTTTGGAGGAAGCTATGTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACTGCCATCAACCAGCATCGATCCCTGAACGTTGAAGGGTTTAAGGTCGTGAGTGCCCGTCTGCGATCGGCCGAGTATGAAACCTTTTCCTATCAAGCGCGCCTGCTGGGACTTTCGGATAGTATGGCAATTCGCGTTGCGGTGCGTCGCATCGGGGGCTTTCTCGAAATAGATGCACACACCCGAGAAAAGATGGAAGCCATACTTCAGTCCATCGGAATACTCTCAAGTAATGTATCCATGCTTCTATCTGCCTACGCCGAAGACCCTCGATCGGATCTGGAGGCTGTGCGAGATGAACGTATTGCTTTTGGTGAGGCTTTCGCCGCCCTCGATGGCCTACTCCGCTCCATTTTGTCCGTATCCCGGCGACGGATCGACGGTTGCTCGCTATTGAAAGGTGCCTTGTAGCACTTGACCACGCACCTGACGGGAGAAAATTGGATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATCATTCGCATTGTGCCAGGAGGTGGAACCAAGACCCTTCAGCAGATAATCAATCAGTTGGAGTACCTGTCCCGTAAGGGAAAGCTGGAACTGCAGCGTTCAGCCCGGCATCTCGATATTCCCGTTCCGCCGGATCAAATCCGTGAGCTTGCCCAAAGCTGGGTTACGGAGGCCGGGATTTATGACGAAAGTCAGTCAGACGATGATAGGCAACAAGACTTAACAACACACATTATTGTAAGCTTCCCCGCAGGTACCGACCAAACCGCAGCTTATGAAGCCAGCCGGGAATGGGCAGCCGAGATGTTTGGGTCAGGATACGGGGGTGGCCGCTATAACTATCTGACAGCCTACCACGTCGACCGCGATCATCCACATTTACATGTCGTGGTCAATCGTCGGGAACTTCTGGGGCACGGGTGGCTGAAAATATCCAGGCGCCATCCCCAGCTGAATTATGACGGCTTACGGAAAAAGATGGCAGAGATTTCACTTCGTCACGGCATAGTCCTGGATGCGACTTCGCGAGCAGAAAGGGGAATAGCAGAGCGACCAATCACATATGCTGAACATCGCCGCCTTGAGCGGATGCAGGCTCAAAAGATTCAATTCGAAGATACAGATTTTGATGAGACCTCGCCTGAGGAAGATCGTCGGGACCTCAGTCAATCGTTCGATCCATTTCGATCGGACCCATCTACCGGCGAACCGGACCGTGCAACCCGACATGACAAACAACCGCTTGAACAGCACGCCCGTTTCCAGGAGTCCGCCGGCTCCAGCATCAAAGCCGACGCACGGATCCGCGTATCATTGGAGAGCGAGCGGAGTGCCCAACCATCCGCGTCCAAAATCCCTGTAATTGGGCATTTCGGGATTGAGACTTCCTATGTCGCTGAAGCCAGCGTGCGCAAACGAAGCGGCATTTTCGGTACTTCTCGCCCGGTGACTGACGTTGCCATGCACACAGTCAAGCGCCAGCAGCGATCAAAACGACGTAATGACGAGGAGGCAGGTCCGAGCGGAGCAAACCGTAAAGGATTGAAGGCTGCGCAAGTTGATTCCGAGGCAAATGTCGGTGAGCAAGACACTCGCGATGACAGCAACAAGGCGGCTGATCCGGTGTCTGCTTCCATCGGTACCGAGCAACCGGAAGCTTCTCCAAAGCGTCCGCGTGACCGTCACGATGGAGAATTGGGTGGACGCAAACGTGCAAGAGGTAATCGTCGCTCGAGCTCGAGCGGGGGGACCTAGAGACAGGAAGGACCGAATAATGGCCGCGGSEQ ID NO.37ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAGCTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTAAACTTCATTACTATAATGATG
TTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCCATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTCGACCTTACGAGCATGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTATATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACTTGCTGGCCGAATTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACCGTCTTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCACTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACACTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGACTAATCTTGCTTGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTATCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGCGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCATGAGGTACCAATCSEQ ID NO.38ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAACTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTGAACTTCATTACTATAATGATGTTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCAATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTTGACCTTACGAGCGTGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTGTATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACATGCTGGCTGAACTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACTGTATTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCATTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACGCTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGATTAATCTTGCTGGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTCTCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGTGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCATGAGGTACAATCSEQ ID NO.39ATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTGTAGAAGAAGTATTCAACGATTTCAAAGGTCGTAGAGCTGGTTTAATCAAAGCACTAACTACAGATGTCGAGAAGTTTTATCAATCGTGTGATCCTGAAAAGGAGAACTTGTGTCTCTATGGGCTTCCTAATGAAACATGGGAAGTAAACCTCCCTGTAGAGGAGGTGCCTCCAGAACTTCCGGAGCCAGCATTGGGCATAAACTTCGCACGTGATGGAATGCAAGAGAAAGACTGGTTATCACTTGTTGCTGTTCACAGTGATTCATGGCTGCTTTCTGTTGCATTTTACTTTGGTGCAAGGTTTGGGTTCGGCAAGAGTGAAAGGAAGAGGCTTTTCCAAATGATAAATGATCTCCCAACAGTGTTTGAAGTTGTTACCGGAGCTGCTAAACAGACACGTGATCCCCCTCACAACAATAGCAACAAAAGCAAATCAAGTGGAAAGCCTCGACAGCCA
GAGTCCCAACTCAAGGCAGTAAAGGTGTCTCCACCTAAAATGGAGAACGACAGTGGGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAGGATGAACAAGGAGCAACTCTCTGTGGAGCTTGTGGTGATAATTATGCCACTGATGAATTCTGGATTTGCTGTGATATTTGTGAGAGATGGTTCCATGGCAAATGTGTGAAGATTACCCCAGCAAAAGCTGAGCATATCAAGCAGTACAAGTGTCCTAGTTGCAGTAGCAAGAGAGCTAGAGTTTAASEQ ID NO.40TGACATCTGCCAATAAAGCCAAGAATAATTGGCATTAACATGACCAAAAAAATGGTTTGGCAGCATTAAGTCAAATAAAAAAGCTACTTTAATATAAAATAATATTAAAATGCTTAATAACCAACAGTTTATAAGAAGGTTAATGTTAACATGGATGAGGAATGACCAAAAGGGGAATTATATATTAACCTTTAAATCAATCTAATTCTCTCTTTTTGTTTCTAGCTATATTTACTCGATAGATAAACTCTCTTACTTGACGAATTTTTTGATACAAGAAGACATATTTCATCATGATTTTAATTCGTCGTGTCAAATTTATTAAATAGTTTAATTTTAATCGTAAATTTAGATATGAAATTTAAAAAAAAATAAATATATACATATTTGAAGAATACATAAAAAGTACATATAAATCACAAATATTTAATAATTCAAGATATTAAAACACATAGAAAAATAATTACTTACAAAGAAATTCTTATTTGAATCCTCTAAATTCGAGAAGTGCAACACAAACTGAGACGAAGAAAATGAATAATATTTGATAAGAAATTTATTATAATTGAATGACCATTTAAGTAATTACGGGTAATAACAACACAATAAGGAACTGTAGTCATTTTTAATACATGGCAAGGAATATGAGAGTGTGATGAGTCTATAAATAGAAGGCTTCATTAGTGTAGAGGAGTCACAAACAAGCAATACACAAATAAAATTAGTAGCTTAAACAAGATGSEQ ID NO.56TTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCSEQ ID NO.94TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAACSEQ ID NO.95TTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAACSEQ ID NO.96GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTAGCATTGACTGATTGCATCATAGTTTTTTTTTTTTTTTTAAGTATTTCCTCTATGCATATTATTAGTATCCAATAAATTTACTGGTTGTTGTACATAGAAAAAGTGCATTTGCATGTATGTGTTTCTCTGAAATTTTCCCCAGTTTTTGGTGCTTTGCCTTTGGAGCCAAGTCTCTATATGTAATAAGAAAACTAAGAACAATCACATATATCAAATATTASEQ ID NO.97ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAGATTTGAACGCTACTTGGTCATCCACATAGAGCTTCTTGACGTATCTGGCAATATTGCATCAGTCTTGGCGGAATTTCATGTGACAAAAGGTTTGCAATTCTTTCCACTATTAGTAGTGCAACGATATACGCAGAGATGAAGTGCTGAACAAACATATGTAAAATCGATGAATTTATGTCGAATGCTGGGACGGGCTTCAGCAGGTTTTGCTTAGTSEQ ID NO.98GTTTACA TACCATATATCCTGTCAGAGGTATAGAGGCATGACTGGCATGATCACTAAATTGATGCCCACAGAGGAGACTTATAACCTACAGGGGCACGTAGTTCTAGGACTTGAAAGTGACTGACCGTAGTCCAACTCGGTATAAAGCCTACTCCCAACTAAATATATGAAATTTATAGCATAACTGCAGATGAGCTCGATTCTAGAGTAGGTACCGAGCTCGAATTCCTTACTCCTCCACAAAGCCGTAACTGAAGCGACTTCTATTTTTCTCAACCTTCGGACCTGACGATCAAGAATCTCAATAGGTAGTTCTTCATAAGTGAGACTATCCTTCATAGCTACACTTTCTAAAGGTACGATAGATTTTGGATCAACCACACACACTTCGTTTACA CGGTATATATCCTGCCA
序列表110ROMMENS，CAIUSYE，JINGSONGHUMARA，JAIME M.
YAN，HUASWORDS，KATHY120精確育種130058951/016714010/607,5381412003-06-2715010/369,3241512003-02-2015060/357,6611512002-02-2015060/377,6021512002-05-06160139170PatentIn Ver.3.22101211416212DNA213Solanum tuberosum4001gtttacagta ccatatatcc tgtcagaggt atagaggcat gactggcatg atcactaaat 60tgatgcccac agaggagact tataacctac aggggcacgt agttctagga cttgaaagtg 120actgaccgta gtccaactcg gtataaagcc tactcccaac taaatatatg aaatttatag 180cataactgca gatgagctcg attctagagt aggtaccgag ctcgaattcc ttactcctcc 240acaaagccgt aactgaagcg acttctattt ttctcaacct tcggacctga cgatcaagaa 300tctcaatagg tagttcttca taagtgagac tatccttcat agctacactt tctaaaggta 360cgatagattt tggatcaacc acacacactt cgtttacacc ggtatatatc ctgcca 4162102
211824212DNA213Triticum sp.
4002tggcaggata tatgagtgtg taaacaacca taatcaggct gtaattatca agagaactaa 60tgacaagaag cagagcttat caagtgtttc gtccagctgt aacatgggca caaaagcttg 120cttgatgcat gtctggcttt tcaaagagca atgtattctc aggtacctgc acgtttgatc 180ccctaccacg tacaagacga gcagaaagga catgtctgca gaaacttaga cacatccatt 240gcagactcgt tccgaagcat caggagagta gtcagcaatg gtcatctgct gatgtaaatt 300aattgattgt tggtaatcaa attttaacag caatatatat aatatatcaa tagtatattg 360aactatgaaa gactgtaatc atatataaca gcatacaaat tgtcgtggaa acaagaggag 420ctcatcaagt gtttagttca gaaatagcta accaagaatg caatataata ggggtactga 480gctcccttca aaattactaa cttcagaaat agctaaccaa gaatgcaatg gcattgcata 540atttaaacaa ctgtcagcac caatctctga ctgaaggcag tttacccatt cagaagagca 600cacattttct gaacgacaac tctgagcggg gattgttgac agcagcaatt aatctggcct 660caagatggtt tccaacaaca tagatcagat acagcactca agcacccaat aatcagccag 720tactgatctg gttaccactg caattgatta acagatgaac tgtgaaatta agatttaact 780gacagtaata tataccagtt ggcaggatat atccctctgt aaac 82421032112595212DNA213人工序列220
223人工序列的描述IPT基因的表達盒4003ctgcagccaa agcacatact tatcgattta aatttcatcg aagagattaa tatcgaataa 60tcatatacat actttaaata cataacaaat tttaaataca tatatctggt atataattaa 120ttttttaaag tcatgaagta tgtatcaaat acacatatgg aaaaaattaa ctattcataa 180tttaaaaaat agaaaagata catctagtga aattaggtgc atgtatcaaa tacattagga 240aaagggcata tatcttgatc tagataatta acgattttga tttatgtata atttccaaat 300gaaggtttat atctacttca gaaataacaa tatactttta tcagaacatt caacaaagta 360acaaccaact agagtgaaaa atacacattg ttctctaaac atacaaaatt gagaaaagaa 420tctcaaaatt tagagaaaca aatctgaatt tctagaagaa aaaaataatt atgcactttg 480ctattgctcg aaaaataaat gaaagaaatt agactttttt aaaagatgtt agactagata 540tactcaaaag ctatcaaagg agtaatattc ttcttacatt aagtatttta gttacagtcc 600tgtaattaaa gacacatttt agattgtatc taaacttaaa tgtatctaga atacatatat 660ttgaatgcat catatacatg tatccgacac accaattctc ataaaaagcg taatatccta 720aactaattta tccttcaagt caacttaagc ccaatataca ttttcatctc taaaggccca 780agtggcacaa aatgtcaggc ccaattacga agaaaagggc ttgtaaaacc ctaataaagt 840
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223人工序列的描述pSIM111核苷酸序列4004agctttggca ggatatatac cggtgtaaac gaagtgtgtg tggttgatcc aaaatctatc 60gtacctttag aaagtgtagc tatgaaggat agtctcactt atgaagaact acctattgag 120attcttgatc gtcaggtccg aaggttgaga aaaatagaag tcgcttcagt tacggctttg 180
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213Solanum tuberosum4006gaaccatgca tctcaatctt aatactaaaa aatgcaacaa aattctagtg gagggaccag 60taccagtaca ttagatatta tcttttatta ctataataat attttaatta acacgagaca 120taggaatgtc aagtggtagc ggtaggaggg agttggttca gttttttaga tactaggaga 180cagaaccgga ggggcccatt gcaaggccca agttgaagtc cagccgtgaa tcaacaaaga 240gagggcccat aatactgtcg atgagcattt ccctataata cagtgtccac agttgccttc 300cgctaaggga tagccacccg ctattctctt gacacgtgtc actgaaacct gctacaaata 360aggcaggcac ctcctcattc tcacactcac tcactcacac agctcaacaa gtggtaactt 420ttactcatct cctccaatta tttctgattt catgcatgtt tccctacatt ctattatgaa 480tcgtgttatg gtgtataaac gttgtttcat atctcatctc atctattctg attttgattc 540tcttgcctac tgaatttgac cctactgtaa tcggtgataa atgtgaatgc ttcctcttct 600tcttcttctt ctcagaaatc aatttctgtt ttgtttttgt tcatctgtag cttggtag 6582107211355212DNA213Solanum tuberosum4007ttttaatgtt tagcaaatgt cctatcagtt ttctcttttt gtcgaacggt aatttagagt 60tttttttgct atatggattt tcgtttttga tgtatgtgac aaccctcggg attgttgatt 120tatttcaaaa ctaagagttt ttgcttattg ttctcgtcta ttttggatat caatcttagt 180tttatatctt ttctagttct ctacgtgtta aatgttcaac acactagcaa tttggctgca 240gcgtatggat tatggaacta tcaagtctgt gggatcgata aatatgcttc tcaggaattt 300gagattttac agtctttatg ctcattgggt tgagtataat atagtaaaaa aatag 3552108211179212DNA213Solanum tuberosum4008accttatttc actaccactt tccactctcc aatccccata ctctctgctc caatcttcat 60tttgcttcgt gaattcatct tcatcgaatt tctcgacgct tcttcgctaa tttcctcgtt 120acttcactaa aaatcgacgt ttctagctga acttgagtga attaagccag tgggaggat 1792109211569212DNA
213Solanum tuberosum4009gttagaaatc ttctctattt ttggtttttg tctgtttaga ttctcgaatt agctaatcag 60gtgctgttat agcccttaat tttgagtttt ttttcggttg ttttgatgga aaaggcctaa 120aatttgagtt tttttacgtt ggtttgatgg aaaaggccta caattggagt tttccccgtt 180gttttgatga aaaagcccct agtttgagat tttttttctg tcgattcgat tctaaaggtt 240taaaattaga gtttttacat ttgtttgatg aaaaaggcct taaatttgag tttttccggt 300tgatttgatg aaaaagccct agaatttgtg ttttttcgtc ggtttgattc tgaaggccta 360aaatttgagt ttctccggct gttttgatga aaaagcccta aatttgagtt tctccggctg 420ttttgatgaa aaagccctaa atttgagttt tttccccgtg ttttagattg tttggtttta 480attctcgaat cagctaatca gggagtgtga aaagccctaa aatttgagtt tttttcgttg 540ttctgattgt tgtttttatg aatttgcag 569210102111738212DNA213人工序列220
223人工序列的描述與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的表達盒40010ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420ccaccttatt tcactaccac tttccactct ccaatcccca tactctctgc tccaatcttc 480attttgcttc gtgaattcat cttcatcgaa tttctcgacg cttcttcgct aatttcctcg 540ttacttcact agaaatcgac gtttctagct gaacttgagt gaattaagcc agtgggagga 600tgaattcaag gttagaaatc ttctctattt ttggtttttg tctgtttaga ttctcgaatt 660agctaatcag gtgctgttat agcccttaat tttgagtttt ttttcggttg ttttgatgga 720aaaggcctaa aatttgagtt tttttacgtt ggtttgatgg aaaaggccta caattggagt 780tttccccgtt gttttgatga aaaagcccct agtttgagat tttttttctg tcgattcgat 840tctaaaggtt taaaattaga gtttttacat ttgtttgatg aaaaaggcct taaatttgag 900tttttccggt tgatttgatg aaaaagccct agaatttgtg ttttttcgtc ggtttgattc 960tgaaggccta aaatttgagt ttctccggct gttttgatga aaaagcccta aatttgagtt 1020tctccggctg ttttgatgaa aaagccctaa atttgagttt tttccccgtg ttttagattg 1080tttggtttta attctcgaat cagctaatca gggagtgtga aaagccctaa aatttgagtt 1140tttttcgttg ttctgattgt tgtttttatg aatttgcaga tggatatcat cctcccactg 1200
gcttaattca ctcaagttca gctagaaacg tcgatttcta gtgaagtaac gaggaaatta 1260gcgaagaagc gtcgagaaat tcgatgaaga tgaattcacg aagcaaaatg aagattggag 1320cagagagtat ggggattgga gagtggaaag tggtagtgaa ataaggtaag cttttgattt 1380taatgtttag caaatgtcct atcagttttc tctttttgtc gaacggtaat ttagagtttt 1440ttttgctata tggattttcg tttttgatgt atgtgacaac cctcgggatt gttgatttat 1500ttcaaaacta agagtttttg cttattgttc tcgtctattt tggatatcaa tcttagtttt 1560atatcttttc tagttctcta cgtgttaaat gttcaacaca ctagcaattt ggctgcagcg 1620tatggattat ggaactatca agtctgtggg atcgataaat atgcttctca ggaatttgag 1680attttacagt ctttatgctc attgggttga gtataatata gtaaaaaaat agtctaga 173821011211237212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的間隔區序列40011gtaactttta ctcatctcct ccaattattt ctgatttcat gcatgtttcc ctacattcta 60ttatgaatcg tgttatggtg tataaacgtt gtttcatatc tcatctcatc tattctgatt 120ttgattctct tgcctactga atttgaccct actgtaatcg gtgataaatg tgaatgcttc 180ctcttcttct tcttcttctc agaaatcaat ttctgttttg tttttgttca tctgtag237210122111406212DNA213人工序列220
223人工序列的描述與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40012ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420ccaccttatt tcactaccac tttccactct ccaatcccca tactctctgc tccaatcttc 480attttgcttc gtgaattcat cttcatcgaa tttctcgacg cttcttcgct aatttcctcg 540
ttacttcact agaaatcgac gtttctagct gaacttgagt gaattaagcc agtgggagga 600tgaattcgtg gtaactttta ctcatctcct ccaattattt ctgatttcat gcatgtttcc 660ctacattcta ttatgaatcg tgttatggtg tataaacgtt gtttcatatc tcatctcatc 720tattctgatt ttgattctct tgcctactga atttgaccct actgtaatcg gtgataaatg 780tgaatgcttc ctcttcttct tcttcttctc agaaatcaat ttctgttttg tttttgttca 840tctgtagctt gatatcatcc tcccactggc ttaattcact caagttcagc tagaaacgtc 900gatttctagt gaagtaacga ggaaattagc gaagaagcgt cgagaaattc gatgaagatg 960aattcacgaa gcaaaatgaa gattggagca gagagtatgg ggattggaga gtggaaagtg 1020gtagtgaaat aaggtaagct tttgatttta atgtttagca aatgtcctat cagttttctc 1080tttttgtcga acggtaattt agagtttttt ttgctatatg gattttcgtt tttgatgtat 1140gtgacaaccc tcgggattgt tgatttattt caaaactaag agtttttgct tattgttctc 1200gtctattttg gatatcaatc ttagttttat atcttttcta gttctctacg tgttaaatgt 1260tcaacacact agcaatttgg ctgcagcgta tggattatgg aactatcaag tctgtgggat 1320cgataaatat gcttctcagg aatttgagat tttacagtct ttatgctcat tgggttgagt 1380ataatatagt aaaaaaatag tctaga 140621013211686212DNA213Solanum tuberosum40013gaaccatgca tctcaatctt aatactaaaa aatgcaacaa aattctagtg gagggaccag 60taccagtaca ttagatatta tcttttatta ctataataat attttaatta acacgagaca 120taggaatgtc aagtggtagc ggtaggaggg agttggttca gttttttaga tactaggaga 180cagaaccgga ggggcccatt gcaaggccca agttgaagtc cagccgtgaa tcaacaaaga 240gagggcccat aatactgtcg atgagcattt ccctataata cagtgtccac agttgccttc 300cgctaaggga tagccacccg ctattctctt gacacgtgtc actgaaacct gctacaaata 360aggcaggcac ctcctcattc tcacactcac tcactcacac agctcaacaa gtggtaactt 420ttactcatct cctccaatta tttctgattt catgcatgtt tccctacatt ctattatgaa 480tcgtgttatg gtgtataaac gttgtttcat atctcatctc atctattctg attttgattc 540tcttgcctac tgaatttgac cctactgtaa tcggtgataa atgtgaatgc ttcctcttct 600tcttcttctt ctcagaaatc aatttctgtt ttgtttttgt tcatctgtag cttggtagat 660tccccttttt gtagaccaca catcac 686210142112046212DNA213人工序列220
223人工序列的描述與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒
40014ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420cctcatattc tagttgtatg ttgttcagag aagaccacag atgtgatcat attctcattg 480tatcagatct gtgaccactt acctgatacc tcccatgaag ttacctgtat gattatacgt 540gatccaaagc catcacatca tgttcacctt cagctattgg aggagaagtg agaagtagga 600attgcaatat gaggaataat aagaaaaact ttgtaaaagc taaattagct gggtatgata 660tagggagaaa tgtgtaaaca ttgtactata tatagtatat acacacgcat tatgtattgc 720attatgcact gaataatacc gcagcatcaa agaaggaatt caaggttaga aatcttctct 780atttttggtt tttgtctgtt tagattctcg aattagctaa tcaggtgctg ttatagccct 840taattttgag ttttttttcg gttgttttga tggaaaaggc ctaaaatttg agttttttta 900cgttggtttg atggaaaagg cctacaattg gagttttccc cgttgttttg atgaaaaagc 960ccctagtttg agattttttt tctgtcgatt cgattctaaa ggtttaaaat tagagttttt 1020acatttgttt gatgaaaaag gccttaaatt tgagtttttc cggttgattt gatgaaaaag 1080ccctagaatt tgtgtttttt cgtcggtttg attctgaagg cctaaaattt gagtttctcc 1140ggctgttttg atgaaaaagc cctaaatttg agtttctccg gctgttttga tgaaaaagcc 1200ctaaatttga gttttttccc cgtgttttag attgtttggt tttaattctc gaatcagcta 1260atcagggagt gtgaaaagcc ctaaaatttg agtttttttc gttgttctga ttgttgtttt 1320tatgaatttg cagatggata tccttctttg atgctgcggt attattcagt gcataatgca 1380atacataatg cgtgtgtata tactatatat agtacaatgt ttacacattt ctccctatat 1440catacccagc taatttagct tttacaaagt ttttcttatt attcctcata ttgcaattcc 1500tacttctcac ttctcctcca atagctgaag gtgaacatga tgtgatggct ttggatcacg 1560tataatcata caggtaactt catgggaggt atcaggtaag tggtcacaga tctgatacaa 1620tgagaatatg atcacatctg tggtcttctc tgaacaacat acaactagaa tatgaaagct 1680tttgatttta atgtttagca aatgtcctat cagttttctc tttttgtcga acggtaattt 1740agagtttttt ttgctatatg gattttcgtt tttgatgtat gtgacaaccc tcgggattgt 1800tgatttattt caaaactaag agtttttgct tattgttctc gtctattttg gatatcaatc 1860ttagttttat atcttttcta gttctctacg tgttaaatgt tcaacacact agcaatttgg 1920ctgcagcgta tggattatgg aactatcaag tctgtgggat cgataaatat gcttctcagg 1980aatttgagat tttacagtct ttatgctcat tgggttgagt ataatatagt aaaaaaatag 2040tctaga2046210152111714212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述與R1基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40015ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420cctcatattc tagttgtatg ttgttcagag aagaccacag atgtgatcat attctcattg 480tatcagatct gtgaccactt acctgatacc tcccatgaag ttacctgtat gattatacgt 540gatccaaagc catcacatca tgttcacctt cagctattgg aggagaagtg agaagtagga 600attgcaatat gaggaataat aagaaaaact ttgtaaaagc taaattagct gggtatgata 660tagggagaaa tgtgtaaaca ttgtactata tatagtatat acacacgcat tatgtattgc 720attatgcact gaataatacc gcagcatcaa agaaggaatt cgtggtaact tttactcatc 780tcctccaatt atttctgatt tcatgcatgt ttccctacat tctattatga atcgtgttat 840ggtgtataaa cgttgtttca tatctcatct catctattct gattttgatt ctcttgccta 900ctgaatttga ccctactgta atcggtgata aatgtgaatg cttcctcttc ttcttcttct 960tctcagaaat caatttctgt tttgtttttg ttcatctgta gcttgatatc cttctttgat 1020gctgcggtat tattcagtgc ataatgcaat acataatgcg tgtgtatata ctatatatag 1080tacaatgttt acacatttct ccctatatca tacccagcta atttagcttt tacaaagttt 1140ttcttattat tcctcatatt gcaattccta cttctcactt ctcctccaat agctgaaggt 1200gaacatgatg tgatggcttt ggatcacgta taatcataca ggtaacttca tgggaggtat 1260caggtaagtg gtcacagatc tgatacaatg agaatatgat cacatctgtg gtcttctctg 1320aacaacatac aactagaata tgaaagcttt tgattttaat gtttagcaaa tgtcctatca 1380gttttctctt tttgtcgaac ggtaatttag agtttttttt gctatatgga ttttcgtttt 1440tgatgtatgt gacaaccctc gggattgttg atttatttca aaactaagag tttttgctta 1500ttgttctcgt ctattttgga tatcaatctt agttttatat cttttctagt tctctacgtg 1560ttaaatgttc aacacactag caatttggct gcagcgtatg gattatggaa ctatcaagtc 1620tgtgggatcg ataaatatgc ttctcaggaa tttgagattt tacagtcttt atgctcattg 1680ggttgagtat aatatagtaa aaaaatagtc taga 171421016211333212DNA213Solanum tuberosum40016tcatattcta gttgtatgtt gttcagagaa gaccacagat gtgatcatat tctcattgta 60tcagatctgt gaccacttac ctgatacctc ccatgaagtt acctgtatga ttatacgtga 120tccaaagcca tcacatcatg ttcaccttca gctattggag gagaagtgag aagtaggaat 180
tgcaatatga ggaataataa gaaaaacttt gtaaaagcta aattagctgg gtatgatata 240gggagaaatg tgtaaacatt gtactatata tagtatatac acacgcatta tgtattgcat 300tatgcactga ataataccgc agcatcaaag aag 333210172112046212DNA213人工序列220
223人工序列的描述與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40017ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420cctcatattc tagttgtatg ttgttcagag aagaccacag atgtgatcat attctcattg 480tatcagatct gtgaccactt acctgatacc tcccatgaag ttacctgtat gattatacgt 540gatccaaagc catcacatca tgttcacctt cagctattgg aggagaagtg agaagtagga 600attgcaatat gaggaataat aagaaaaact ttgtaaaagc taaattagct gggtatgata 660tagggagaaa tgtgtaaaca ttgtactata tatagtatat acacacgcat tatgtattgc 720attatgcact gaataatacc gcagcatcaa agaaggaatt caaggttaga aatcttctct 780atttttggtt tttgtctgtt tagattctcg aattagctaa tcaggtgctg ttatagccct 840taattttgag ttttttttcg gttgttttga tggaaaaggc ctaaaatttg agttttttta 900cgttggtttg atggaaaagg cctacaattg gagttttccc cgttgttttg atgaaaaagc 960ccctagtttg agattttttt tctgtcgatt cgattctaaa ggtttaaaat tagagttttt 1020acatttgttt gatgaaaaag gccttaaatt tgagtttttc cggttgattt gatgaaaaag 1080ccctagaatt tgtgtttttt cgtcggtttg attctgaagg cctaaaattt gagtttctcc 1140ggctgttttg atgaaaaagc cctaaatttg agtttctccg gctgttttga tgaaaaagcc 1200ctaaatttga gttttttccc cgtgttttag attgtttggt tttaattctc gaatcagcta 1260atcagggagt gtgaaaagcc ctaaaatttg agtttttttc gttgttctga ttgttgtttt 1320tatgaatttg cagatggata tccttctttg atgctgcggt attattcagt gcataatgca 1380atacataatg cgtgtgtata tactatatat agtacaatgt ttacacattt ctccctatat 1440catacccagc taatttagct tttacaaagt ttttcttatt attcctcata ttgcaattcc 1500tacttctcac ttctcctcca atagctgaag gtgaacatga tgtgatggct ttggatcacg 1560tataatcata caggtaactt catgggaggt atcaggtaag tggtcacaga tctgatacaa 1620tgagaatatg atcacatctg tggtcttctc tgaacaacat acaactagaa tatgaaagct 1680tttgatttta atgtttagca aatgtcctat cagttttctc tttttgtcga acggtaattt 1740agagtttttt ttgctatatg gattttcgtt tttgatgtat gtgacaaccc tcgggattgt 1800
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223人工序列的描述與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40018ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420cctcatattc tagttgtatg ttgttcagag aagaccacag atgtgatcat attctcattg 480tatcagatct gtgaccactt acctgatacc tcccatgaag ttacctgtat gattatacgt 540gatccaaagc catcacatca tgttcacctt cagctattgg aggagaagtg agaagtagga 600attgcaatat gaggaataat aagaaaaact ttgtaaaagc taaattagct gggtatgata 660tagggagaaa tgtgtaaaca ttgtactata tatagtatat acacacgcat tatgtattgc 720attatgcact gaataatacc gcagcatcaa agaaggaatt cgtggtaact tttactcatc 780tcctccaatt atttctgatt tcatgcatgt ttccctacat tctattatga atcgtgttat 840ggtgtataaa cgttgtttca tatctcatct catctattct gattttgatt ctcttgccta 900ctgaatttga ccctactgta atcggtgata aatgtgaatg cttcctcttc ttcttcttct 960tctcagaaat caatttctgt tttgtttttg ttcatctgta gcttgatatc cttctttgat 1020gctgcggtat tattcagtgc ataatgcaat acataatgcg tgtgtatata ctatatatag 1080tacaatgttt acacatttct ccctatatca tacccagcta atttagcttt tacaaagttt 1140ttcttattat tcctcatatt gcaattccta cttctcactt ctcctccaat agctgaaggt 1200gaacatgatg tgatggcttt ggatcacgta taatcataca ggtaacttca tgggaggtat 1260caggtaagtg gtcacagatc tgatacaatg agaatatgat cacatctgtg gtcttctctg 1320aacaacatac aactagaata tgaaagcttt tgattttaat gtttagcaaa tgtcctatca 1380gttttctctt tttgtcgaac ggtaatttag agtttttttt gctatatgga ttttcgtttt 1440tgatgtatgt gacaaccctc gggattgttg atttatttca aaactaagag tttttgctta 1500ttgttctcgt ctattttgga tatcaatctt agttttatat cttttctagt tctctacgtg 1560ttaaatgttc aacacactag caatttggct gcagcgtatg gattatggaa ctatcaagtc 1620tgtgggatcg ataaatatgc ttctcaggaa tttgagattt tacagtcttt atgctcattg 1680
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223人工序列的描述與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40019ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caacaagtgg 420taacttttac tcatctcctc caattatttc tgatttcatg catgtttccc tacattctat 480tatgaatcgt gttatggtgt ataaacgttg tttcatatct catctcatct attctgattt 540tgattctctt gcctactgaa tttgacccta ctgtaatcgg tgataaatgt gaatgcttcc 600tcttcttctt cttcttctca gaaatcaatt tctgttttgt ttttgttcat ctgtagcttg 660gtagattccc ctttttgtag accacacatc acggatcctc atattctagt tgtatgttgt 720tcagagaaga ccacagatgt gatcatattc tcattgtatc agatctgtga ccacttacct 780gatacctccc atgaagttac ctgtatgatt atacgtgatc caaagccatc acatcatgtt 840caccttcagc tattggagga gaagtgagaa gtaggaattg caatatgagg aataataaga 900aaaactttgt aaaagctaaa ttagctgggt atgatatagg gagaaatgtg taaacattgt 960actatatata gtatatacac acgcattatg tattgcatta tgcactgaat aataccgcag 1020catcaaagaa ggaattcaag gttagaaatc ttctctattt ttggtttttg tctgtttaga 1080ttctcgaatt agctaatcag gtgctgttat agcccttaat tttgagtttt ttttcggttg 1140ttttgatgga aaaggcctaa aatttgagtt tttttacgtt ggtttgatgg aaaaggccta 1200caattggagt tttccccgtt gttttgatga aaaagcccct agtttgagat tttttttctg 1260tcgattcgat tctaaaggtt taaaattaga gtttttacat ttgtttgatg aaaaaggcct 1320taaatttgag tttttccggt tgatttgatg aaaaagccct agaatttgtg ttttttcgtc 1380ggtttgattc tgaaggccta aaatttgagt ttctccggct gttttgatga aaaagcccta 1440aatttgagtt tctccggctg ttttgatgaa aaagccctaa atttgagttt tttccccgtg 1500ttttagattg tttggtttta attctcgaat cagctaatca gggagtgtga aaagccctaa 1560aatttgagtt tttttcgttg ttctgattgt tgtttttatg aatttgcaga tggatatcct 1620tctttgatgc tgcggtatta ttcagtgcat aatgcaatac ataatgcgtg tgtatatact 1680atatatagta caatgtttac acatttctcc ctatatcata cccagctaat ttagctttta 1740caaagttttt cttattattc ctcatattgc aattcctact tctcacttct cctccaatag 1800ctgaaggtga acatgatgtg atggctttgg atcacgtata atcatacagg taacttcatg 1860ggaggtatca ggtaagtggt cacagatctg atacaatgag aatatgatca catctgtggt 1920
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223人工序列的描述與R1基因相連的尾隨區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40020ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360caaataaggc aggcacctcc tcattctcac actcactcac tcacacagct caagaaggat 420cctcatattc tagttgtatg ttgttcagag aagaccacag atgtgatcat attctcattg 480tatcagatct gtgaccactt acctgatacc tcccatgaag ttacctgtat gattatacgt 540gatccaaagc catcacatca tgttcacctt cagctattgg aggagaagtg agaagtagga 600attgcaatat gaggaataat aagaaaaact ttgtaaaagc taaattagct gggtatgata 660tagggagaaa tgtgtaaaca ttgtactata tatagtatat acacacgcat tatgtattgc 720attatgcact gaataatacc gcagcatcaa agaaggaatt cgtggtaact tttactcatc 780tcctccaatt atttctgatt tcatgcatgt ttccctacat tctattatga atcgtgttat 840ggtgtataaa cgttgtttca tatctcatct catctattct gattttgatt ctcttgccta 900ctgaatttga ccctactgta atcggtgata aatgtgaatg cttcctcttc ttcttcttct 960tctcagaaat caatttctgt tttgtttttg ttcatctgta gcttgatatc cttctttgat 1020gctgcggtat tattcagtgc ataatgcaat acataatgcg tgtgtatata ctatatatag 1080tacaatgttt acacatttct ccctatatca tacccagcta atttagcttt tacaaagttt 1140ttcttattat tcctcatatt gcaattccta cttctcactt ctcctccaat agctgaaggt 1200gaacatgatg tgatggcttt ggatcacgta taatcataca ggtaacttca tgggaggtat 1260caggtaagtg gtcacagatc tgatacaatg agaatatgat cacatctgtg gtcttctctg 1320aacaacatac aactagaata tgaaagcttt tgattttaat gtttagcaaa tgtcctatca 1380gttttctctt tttgtcgaac ggtaatttag agtttttttt gctatatgga ttttcgtttt 1440tgatgtatgt gacaaccctc gggattgttg atttatttca aaactaagag tttttgctta 1500ttgttctcgt ctattttgga tatcaatctt agttttatat cttttctagt tctctacgtg 1560
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223人工序列的描述與L葡聚糖磷酸化酶基因相連的前導區的有義和反義拷貝的替換性表達盒40026ggtaccgaac catgcatctc aatcttaata ctaaaaaatg caacaaaatt ctagtggagg 60gaccagtacc agtacattag atattatctt ttattactat aataatattt taattaacac 120gagacatagg aatgtcaagt ggtagcggta ggagggagtt ggttcagttt tttagatact 180aggagacaga accggagggg cccattgcaa ggcccaagtt gaagtccagc cgtgaatcaa 240caaagagagg gcccataata ctgtcgatga gcatttccct ataatacagt gtccacagtt 300gccttccgct aagggatagc cacccgctat tctcttgaca cgtgtcactg aaacctgcta 360
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223人工序列的描述ω-突變的virD2基因的表達盒40036ccgcggtttt ctctccatcg cgtcagaggc cggttttcgt cggcatcgaa gagggccact 60cgtttaccgt catttgccaa agcagcgcaa aggcccatga gtgcggtggt tttgccagca 120ccccctttga aagagcaaaa cgtcaaaagt tgcatattct gatcccgcct gtcctgtgaa 180
acggagtgca tttgtatttt tgttcgtata aatgtttttg tgattatcga tgagtaaaag 240cgttgttaca ctatttttta tttcaaattc gttataatta aattgcaatt gtagcaatta 300tattcggttt ttcctgtaaa tatactgttg atttcatatc gagtagggct agactttaat 360ctgtctaccc gggcacattt cgtgctggag tattcagacc ttccgctttt tttggaggaa 420gctatgtcaa aacacaccag agtcacgtcg agtgagactg ccatcaacca gcatcgatcc 480ctgaacgttg aagggtttaa ggtcgtgagt gcccgtctgc gatcggccga gtatgaaacc 540ttttcctatc aagcgcgcct gctgggactt tcggatagta tggcaattcg cgttgcggtg 600cgtcgcatcg ggggctttct cgaaatagat gcacacaccc gagaaaagat ggaagccata 660cttcagtcca tcggaatact ctcaagtaat gtatccatgc ttctatctgc ctacgccgaa 720gaccctcgat cggatctgga ggctgtgcga gatgaacgta ttgcttttgg tgaggctttc 780gccgccctcg atggcctact ccgctccatt ttgtccgtat cccggcgacg gatcgacggt 840tgctcgctat tgaaaggtgc cttgtagcac ttgaccacgc acctgacggg agaaaattgg 900atgcccgatc gcgctcaagt aatcattcgc attgtgccag gaggtggaac caagaccctt 960cagcagataa tcaatcagtt ggagtacctg tcccgtaagg gaaagctgga actgcagcgt 1020tcagcccggc atctcgatat tcccgttccg ccggatcaaa tccgtgagct tgcccaaagc 1080tgggttacgg aggccgggat ttatgacgaa agtcagtcag acgatgatag gcaacaagac 1140ttaacaacac acattattgt aagcttcccc gcaggtaccg accaaaccgc agcttatgaa 1200gccagccggg aatgggcagc cgagatgttt gggtcaggat acgggggtgg ccgctataac 1260tatctgacag cctaccacgt cgaccgcgat catccacatt tacatgtcgt ggtcaatcgt 1320cgggaacttc tggggcacgg gtggctgaaa atatccaggc gccatcccca gctgaattat 1380gacggcttac ggaaaaagat ggcagagatt tcacttcgtc acggcatagt cctggatgcg 1440acttcgcgag cagaaagggg aatagcagag cgaccaatca catatgctga acatcgccgc 1500cttgagcgga tgcaggctca aaagattcaa ttcgaagata cagattttga tgagacctcg 1560cctgaggaag atcgtcggga cctcagtcaa tcgttcgatc catttcgatc ggacccatct 1620accggcgaac cggaccgtgc aacccgacat gacaaacaac cgcttgaaca gcacgcccgt 1680ttccaggagt ccgccggctc cagcatcaaa gccgacgcac ggatccgcgt atcattggag 1740agcgagcgga gtgcccaacc atccgcgtcc aaaatccctg taattgggca tttcgggatt 1800gagacttcct atgtcgctga agccagcgtg cgcaaacgaa gcggcatttt cggtacttct 1860cgcccggtga ctgacgttgc catgcacaca gtcaagcgcc agcagcgatc aaaacgacgt 1920aatgacgagg aggcaggtcc gagcggagca aaccgtaaag gattgaaggc tgcgcaagtt 1980gattccgagg caaatgtcgg tgagcaagac actcgcgatg acagcaacaa ggcggctgat 2040ccggtgtctg cttccatcgg taccgagcaa ccggaagctt ctccaaagcg tccgcgtgac 2100cgtcacgatg gagaattggg tggacgcaaa cgtgcaagag gtaatcgtcg ctcgagctcg 2160agcgggggga cctagagaca ggaaggaccg aataatggcc gcgg 2204210372111621212DNA213Solanum tuberosum40037atggcttctg tgctggcttc tctgtttcca aaactgggct ctttgggtac ttcagatcat 60gcttctgttg tatccatcaa cctctttgtg gcactccttt gtgcttgcat catcattggt 120
catctcttgg aggagaaccg ctgggttaat gagtccatta ctgccctcat aattggtttg 180tgtacaggag tggttatctt gctcgtaagt ggtggaaaga gctcacacct tctggttttc 240agtgaagatc tctttttcat atatgtactt cctccaatca tatttaatgc agggtttcag 300gtaaaaaaga agcaattttt cgtaaacttc attactataa tgatgttcgg agccattggt 360accctggtct catgtgccat tatatcatta ggtgccattc aaactttcaa gaagttggac 420attgaatttc tagatattgg ggattatctt gcaattggag caatatttgc tgccacagat 480tccgtctgca cattgcaggt cctacatcag gatgagacac ccctccttta cagtcttgta 540tttggagaag gagttgtaaa tgatgctaca tcggtggtgc ttttcaatgc tattcaaaac 600ttcgacctta cgagcatgaa tcccagtata gccctcagtt tccttggcaa cttcttctat 660ctgttccttg ctagcacttt actgggagca ggaactggtc ttcttagtgc ttacattatc 720aagaagctat attttggcag gcactccaca gatcgtgagg ttgcccttat gatgctcatg 780gcttacttat catacttgct ggccgaatta ttctatttga gtgggattct caccgtcttt 840ttctgtggta ttgtaatgtc tcactacact tggcacaatg tgaccgagag ttcaagagtc 900actacaaggc acacttttgc aactttgtca tttcttgcag agactttcct cttcctctat 960gtcggcatgg atgctttgga tatcgagaag tggaaatttg ttggtgacag gcctggatta 1020tcaatttccg tgagttcaat actgatggga ctaatcttgc ttgggagagc tgcctttgtt 1080tttccattat cattcttatc caacttaatg aagaaatcct cggagcaaaa aattaccttt 1140aggcagcaag tgataatatg gtgggcaggt ttgatgagag gcgcagtgtc catggcactg 1200gcatataata agttcactcg tgggggacac actcaactgc aggacaatgc aataatgatt 1260accagcacga taaccattgt tctattcagc acaatggtat tcggtttaat gacaaaaccc 1320cttataagtc tcctgctgcc accacagagg caattgagta cagtgtcatc aggcgcaaat 1380actccaaagt ctctaacagc cccactccta ggcagtcgag aggactctga agttgattta 1440aatgttccag atcttcctca cccaccaagt ttgaggatgc tacttaccgc accaagtcat 1500aaagtgcatc ggtactggcg caagtttgac gatgcattca tgcgccctat gtttggtggt 1560cggggatttg ctcctcctgc ccctggttct ccaacggaac agggtccatg aggtaccaat 1620c 1621210382111620212DNA213Solanum tuberosum40038atggcttctg tgctggcttc tctgtttcca aaactgggct ctttgggtac ttcagatcat 60gcttctgttg tatccatcaa cctctttgtg gcactccttt gtgcttgcat catcattggt 120catctcttgg aggagaaccg ctgggttaat gagtccatta ctgccctcat aattggtttg 180tgtacaggag tggttatctt gctcgtaagt ggtggaaaga actcacacct tctggttttc 240agtgaagatc tctttttcat atatgtactt cctccaatca tatttaatgc agggtttcag 300gtaaaaaaga agcaattttt cgtgaacttc attactataa tgatgttcgg agccattggt 360accctggtct catgtgccat tatatcatta ggtgcaattc aaactttcaa gaagttggac 420attgaatttc tagatattgg ggattatctt gcaattggag caatatttgc tgccacagat 480tccgtctgca cattgcaggt cctacatcag gatgagacac ccctccttta cagtcttgta 540tttggagaag gagttgtaaa tgatgctaca tcggtggtgc ttttcaatgc tattcaaaac 600
tttgacctta cgagcgtgaa tcccagtata gccctcagtt tccttggcaa cttcttctat 660ctgttccttg ctagcacttt actgggagca ggaactggtc ttcttagtgc ttacattatc 720aagaagctgt attttggcag gcactccaca gatcgtgagg ttgcccttat gatgctcatg 780gcttacttat catacatgct ggctgaacta ttctatttga gtgggattct cactgtattt 840ttctgtggta ttgtaatgtc tcattacact tggcacaatg tgaccgagag ttcaagagtc 900actacaaggc acgcttttgc aactttgtca tttcttgcag agactttcct cttcctctat 960gtcggcatgg atgctttgga tatcgagaag tggaaatttg ttggtgacag gcctggatta 1020tcaatttccg tgagttcaat actgatggga ttaatcttgc tggggagagc tgcctttgtt 1080tttccattat cattcttctc caacttaatg aagaaatcct cggagcaaaa aattaccttt 1140aggcagcaag tgataatatg gtgggcaggt ttgatgagag gcgcagtgtc catggcactg 1200gcatataata agttcactcg tgggggacac actcaactgc aggacaatgc aataatgatt 1260accagcacga taaccattgt tctattcagc acaatggtat tcggtttaat gacaaaaccc 1320cttataagtc tcctgctgcc accacagagg caattgagta cagtgtcatc aggtgcaaat 1380actccaaagt ctctaacagc cccactccta ggcagtcgag aggactctga agttgattta 1440aatgttccag atcttcctca cccaccaagt ttgaggatgc tacttaccgc accaagtcat 1500aaagtgcatc ggtactggcg caagtttgac gatgcattca tgcgccctat gtttggtggt 1560cggggatttg ctcctcctgc ccctggttct ccaacggaac agggtccatg aggtacaatc 162021039211747212DNA213Solanum tuberosum40039atggaaaatt cggtacccag gactgtagaa gaagtattca acgatttcaa aggtcgtaga 60gctggtttaa tcaaagcact aactacagat gtcgagaagt tttatcaatc gtgtgatcct 120gaaaaggaga acttgtgtct ctatgggctt cctaatgaaa catgggaagt aaacctccct 180gtagaggagg tgcctccaga acttccggag ccagcattgg gcataaactt cgcacgtgat 240ggaatgcaag agaaagactg gttatcactt gttgctgttc acagtgattc atggctgctt 300tctgttgcat tttactttgg tgcaaggttt gggttcggca agagtgaaag gaagaggctt 360ttccaaatga taaatgatct cccaacagtg tttgaagttg ttaccggagc tgctaaacag 420acacgtgatc cccctcacaa caatagcaac aaaagcaaat caagtggaaa gcctcgacag 480ccagagtccc aactcaaggc agtaaaggtg tctccaccta aaatggagaa cgacagtggg 540gaggaggaag aagaagaaga ggatgaacaa ggagcaactc tctgtggagc ttgtggtgat 600aattatgcca ctgatgaatt ctggatttgc tgtgatattt gtgagagatg gttccatggc 660aaatgtgtga agattacccc agcaaaagct gagcatatca agcagtacaa gtgtcctagt 720tgcagtagca agagagctag agtttaa 74721040211741212DNA213Solanum tuberosum
40040tgacatctgc caataaagcc aagaataatt ggcattaaca tgaccaaaaa aatggtttgg 60cagcattaag tcaaataaaa aagctacttt aatataaaat aatattaaaa tgcttaataa 120ccaacagttt ataagaaggt taatgttaac atggatgagg aatgaccaaa aggggaatta 180tatattaacc tttaaatcaa tctaattctc tctttttgtt tctagctata tttactcgat 240agataaactc tcttacttga cgaatttttt gatacaagaa gacatatttc atcatgattt 300taattcgtcg tgtcaaattt attaaatagt ttaattttaa tcgtaaattt agatatgaaa 360tttaaaaaaa aataaatata tacatatttg aagaatacat aaaaagtaca tataaatcac 420aaatatttaa taattcaaga tattaaaaca catagaaaaa taattactta caaagaaatt 480cttatttgaa tcctctaaat tcgagaagtg caacacaaac tgagacgaag aaaatgaata 540atatttgata agaaatttat tataattgaa tgaccattta agtaattacg ggtaataaca 600acacaataag gaactgtagt catttttaat acatggcaag gaatatgaga gtgtgatgag 660tctataaata gaaggcttca ttagtgtaga ggagtcacaa acaagcaata cacaaataaa 720attagtagct taaacaagat g 7412104121125212DNA213Agrobacterium sp.
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220
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223人工序列的描述引物220
221修改的鹼基222(2)223a，t，c或g220
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221修改的鹼基222(10)..(15)223a，t，c或g40093angatntatn nnnnngt172109421125212DNA213Triticum sp.
40094tggcaggata tatgagtgtg taaac 252109521126212DNA213Triticum sp.
40095ttggcaggat atatccctct gtaaac 2621096211244212DNA213Solanum tuberosum40096gtccatgatg tcttcagggt ggtagcattg actgattgca tcatagtttt tttttttttt 60ttaagtattt cctctatgca tattattagt atccaataaa tttactggtt gttgtacata 120gaaaaagtgc atttgcatgt atgtgtttct ctgaaatttt ccccagtttt tggtgctttg 180cctttggagc caagtctcta tatgtaataa gaaaactaag aacaatcaca tatatcaaat 240atta 244
21097211239212DNA213Solanum tuberosum40097acgaacttgt gatcgcgttg aaagatttga acgctacttg gtcatccaca tagagcttct 60tgacgtatct ggcaatattg catcagtctt ggcggaattt catgtgacaa aaggtttgca 120attctttcca ctattagtag tgcaacgata tacgcagaga tgaagtgctg aacaaacata 180tgtaaaatcg atgaatttat gtcgaatgct gggacgggct tcagcaggtt ttgcttagt 23921098211416212DNA213Solanum tuberosum40098gtttacatta ccatatatcc tgtcagaggt atagaggcat gactggcatg atcactaaat 60tgatgcccac agaggagact tataacctac aggggcacgt agttctagga cttgaaagtg 120actgaccgta gtccaactcg gtataaagcc tactcccaac taaatatatg aaatttatag 180cataactgca gatgagctcg attctagagt aggtaccgag ctcgaattcc ttactcctcc 240acaaagccgt aactgaagcg acttctattt ttctcaacct tcggacctga cgatcaagaa 300tctcaatagg tagttcttca taagtgagac tatccttcat agctacactt tctaaaggta 360cgatagattt tggatcaacc acacacactt cgtttacatc ggtatatatc ctgcca41621099211181212PRT213Solanum tuberosum40099Met Arg Asn Leu Phe Pro Ile Leu Met Leu Ile Thr Asn Leu Ala Leu1 5 10 15Asn Asn Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Tyr Asn Leu20 25 30Ile His Ala Thr Cys Arg Glu Thr Pro Tyr Tyr Ser Leu Cys Leu Thr35 40 45Thr Leu Gln Ser Gly Pro Arg Ser Asn Glu Val Glu Gly Gly Asp Ala50 55 60
Ile Thr Thr Leu Gly Leu Ile Met Val Asp Ala Val Lys Ser Lys Ser65 70 75 80Ile Glu Ile Met Glu Lys Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Pro Glu85 90 95Trp Arg Ala Pro Leu Ser Gln Cys Tyr Val Ala Tyr Asn Ala Val Leu100 105 110Arg Ala Asp Val Thr Val Ala Val Glu Ala Leu Lys Lys Gly Ala Pro115 120 125Lys Phe Ala Glu Asp Gly Met Asp Asp Val Val Ala Glu Ala Gln Thr130 135 140Cys Glu Tyr Ser Phe Asn Tyr Tyr Asn Lys Leu Asp Phe Pro Ile Ser145 150 155 160Asn Leu Ser Arg Glu Ile Ile Glu Leu Ser Lys Val Ala Lys Ser Ile165 170 175Ile Arg Met Leu Leu180210100211172212PRT213Nicotiana tabacum400100Met Arg Asn Leu Phe Pro Ile Phe Met Leu Ile Thr Asn Leu Ala Phe1 5 10 15Asn Asp Asn Asn Asn Ser Asn Asn Ile Ile Asn Thr Thr Cys Arg Ala20 25 30Thr Thr Asn Tyr Pro Leu Cys Leu Thr Thr Leu His Ser Asp Pro Arg35 40 45Thr Ser Glu Ala Glu Gly Ala Asp Leu Thr Thr Leu Gly Leu Val Met50 55 60
Val Asp Ala Val Lys Leu Lys Ser Ile Glu Ile Met Lys Ser Ile Lys65 70 75 80Lys Leu Glu Lys Ser Asn Pro Glu Leu Arg Leu Pro Leu Ser Gln Cys85 90 95Tyr Ile Val Tyr Tyr Ala Val Leu His Ala Asp Val Thr Val Ala Val100 105 110Glu Ala Leu Lys Arg Gly Val Pro Lys Phe Ala Glu Asn Gly Met Val115 120 125Asp Val Ala Val Glu Ala Glu Thr Cys Glu Phe Ser Phe Lys Tyr Asn130 135 140Gly Leu Val Ser Pro Val Ser Asp Met Asn Lys Glu Ile Ile Glu Leu145 150 155 160Ser Ser Val Ala Lys Ser Ile Ile Arg Met Leu Leu165 170210101211166212PRT213Nicotiana tabacum400101Met Lys Asn Leu Ile Phe Leu Thr Met Phe Leu Thr Ile Leu Leu Gln1 5 10 15Thr Asn Ala Asn Asn Leu Val Glu Thr Thr Cys Lys Asn Thr Pro Asn20 25 30Tyr Gln Leu Cys Leu Lys Thr Leu Leu Ser Asp Lys Arg Ser Ala Thr35 40 45Gly Asp Ile Thr Thr Leu Ala Leu Ile Met Val Asp Ala Ile Lys Ala50 55 60Lys Ala Asn Gln Ala Ala Val Thr Ile Ser Lys Leu Arg His Ser Asn65 70 75 80Pro Pro Ala Ala Trp Lys Gly Pro Leu Lys Asn Cys Ala Phe Ser Tyr
85 90 95Lys Val Ile Leu Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Ile Glu Ala Leu Thr100 105 110Lys Gly Asp Pro Lys Phe Ala Glu Asp Gly Met Val Gly Ser Ser Gly115 120 125Asp Ala Gln Glu Cys Glu Glu Tyr Phe Lys Gly Ser Lys Ser Pro Phe130 135 140Ser Ala Leu Asn Ile Ala Val His Glu Leu Ser Asp Val Gly Arg Ala145 150 155 160Ile Val Arg Asn Leu Leu165210102211277212DNA213Solanum tuberosum400102ctggcgataa cggaactgtt ggaggatatt ggtttggaag atgaagatac tattgcggtg 60actctggtgc caaagagagg tggtgaaggt atctccattg aaagtgcgac gatcagtctt 120gcagattgtt aattagtctc tattgaatct gctgagatta cactttgatg gatgatgctc 180tgtttttgtt ttcttgttct gttttttcct ctgttgaaat cagctttgtt gcttgatttc 240attgaagttg ttattcaaga ataaatcagt tacaatt 277210103211300212DNA213Solanum tuberosum400103ctggcgataa cggaactgtt ggaggatatt ggattggaag atgaagatac tattgcggta 60actttggttc caaaagtagg tggtgaaggt gtatccattg aaagtgtgga gatcaagctt 120gaggattgtt aagtcctcat gagttggtgg ctacggtacc aaattttatg tttaattagt 180attaatgtgt gtatgtgttt gattatgttt cggttaaaat gtatcagctg gatagctgat 240tactagcctt gccagttgtt aatgctatgt atgaaataaa taaataaatg gttgtcttct 300
210104211296212DNA213Solanum tuberosum220
221修改的鹼基222(54)223a，t，c或g220
221修改的鹼基222(166)223a，t，c或g220
221修改的鹼基222(223)223a，t，c或g400104ctggcgataa cggaactgtt ggaggataat ggattggaag atgaaggtac tatngcggta 60actttggttc caaaagttgg tggtgaaggt gtatccattg aaagtgcgga gatcaagctt 120gaggattgtt aagtcctcat gagttggtgg ctatggtacc aaattntatg tttaattagt 180attaatgtgt gtgtttgatt atgtttcggt taaaatgtat canctggata gctgattact 240agccttccca gttgttaatg ctatgtatga aatacataaa taaatggttg tcttcc 29621010521113212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400105ygrcaggata tat1321010621122212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述引物220
221修改的鹼基222(11)..(15)223a，t，c或g400106caggatatat nnnnnkgtaa ac 2221010721125212DNA213Arabidopsis thaliana400107tggtaggata cattctgatg tagat 2521010821125212DNA213Arabidopsis thaliana400108tgacaggata tatcgtgatg tcaac 2521010921125212DNA213Arabidopsis thaliana400109tggtaggata cattctgatg tagta 2521011021125212DNA213Oryza sp.
400110tggcaggata tcttggcatt taaac 2521011121125212DNA213Oryza sp.
400111tgtcaggata tatatcgata tgaac 2521011221125212DNA213Oryza sp.
400112tgtcaggata tatatcgata tgaac 2521011321125212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物220
221修改的鹼基222(14)..(18)223a，t，c或g400113ygrcaggata tatnnnnnkg taaac 2521011421118212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述引物400114gaccacaccc gtcctgtg1821011521113212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400115ygrcaggata tat 1321011621112212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400116atggcgacca ca 1221011721122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物220
221修改的鹼基222(11)..(15)223a，t，c或g
400117caggatatat nnnnnkgtaa ac 2221011821122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400118gtccaacttg cacaggaaag ac 2221011921122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400119catggatgaa atactcctga gc 2221012021124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物400120gttcagacaa gaccacagat gtga2421012121174212PRT
213Solanum tuberosum400121Met Ser Ser Thr Ser Asn Val Gly Gln Asp Cys Leu Ala Glu Val Thr1 5 10 15Ile Ser Tyr Gln Trp Val Gly Arg Val Ile Asn Tyr Asn Phe Phe Leu20 25 30Leu Ile His Trp Tyr Thr Val Val Glu Ala Ser Thr Gly Ile Thr Phe35 40 45Gln Ile Phe Pro Ile Gly Ile Arg Ser Glu Asp Asp Arg Ser Phe Tyr50 55 60Glu Lys Ala Asp Arg Phe Ala Trp Val Thr65 7021012221151212PRT213Solanum tuberosum400122Met Ser Ser Glu Ser Thr Phe Ser Lys Thr Pro Asn Gly Arg Ala Thr1 5 10 15Asp Val Gly Ile Pro Thr Glu Glu Gly Thr Phe Pro Phe Arg Tyr Ala20 25 30Ile Leu Arg Asp Leu Ala Pro Thr Ile Ser Leu Val Asn Ser Ser Ala35 40 45Asp Ile Ala5021012321176212PRT213Solanum tuberosum400123
Met Ser Glu Gly Val Gly Phe Lys Ser Lys Ile Leu Pro Ser Phe Ala1 5 10 15Trp Arg Ser Ala Asn Ile Leu Gly Ser Lys His Val Ala Lys Gln Thr20 25 30Phe Pro Phe Leu Ala Arg Thr Glu Thr Cys Glu Arg Thr Ser Gly Met35 40 45Ser Gly Val Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ser Gly Ile Ser Ser Ser Pro50 55 60Leu Thr Asp Phe Ala Thr Lys Ile Val Gly Phe Ser65 70 7521012421162212PRT213Solanum tuberosum400124Val Cys Ser Pro Ala Leu Lys Ala Asp Lys Ser Lys Ser Ala Asp Gly15 10 15Thr Cys Val Asp His Ser Arg Arg Leu Ile Val Val Leu Val Leu Tyr20 25 30Pro Gly Met Gly Thr Ser Tyr Ala Thr Ala Phe Ile Ser Ser Pro Pro35 40 45Ile Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Asp Pro Val Glu Thr Phe Pro50 55 6021012521150212PRT213Solanum tuberosum400125Met Leu Gly Ser Leu Val Leu Pro Lys Ser Pro Glu Asn Arg Lys Gln15 10 15
Ala Val Pro Asn Pro His Phe Gln Glu Gln His Leu Val Pro Glu Lys20 25 30Pro His Phe Leu Asp Cys Gly Gln Gly Phe Ser Lys Leu Pro Gln Met35 40 45His Gln5021012621165212PRT213Solanum tuberosum400126Met Val Asn Phe Leu Thr Gln Gly Ile Val Asp Met Glu Thr Ala Phe1 5 10 15Gly Ser Pro Lys Met Gly Gly Phe Gly Lys Glu Gln Phe Gly Ala Cys20 25 30Val Ser Arg Ser Glu Met Asp Glu Ser Gly Ile Gly Ala Val Met Val35 40 45Glu Gln Val Cys Ser Ile Cys Ser Arg His Phe Val Leu Ser Met Gln50 55 60Ile6521012721177212PRT213Solanum tuberosum400127Met Leu Glu Gly Ser Met Trp Pro Trp Asn Gln Glu Ser Met Lys Arg1 5 10 15Ala Phe Leu Asn His His Phe Leu Met Leu His Leu Phe Pro Ala Gln20 25 30
Arg Pro Pro Gln Ala Ala Asp Pro Val Cys Leu Lys His Gln His Met35 40 45His Cys Gly Cys Leu Ser Phe Gln Leu His Leu Ser Lys Leu Ala Pro50 55 60Gly Asp Thr Pro Leu Ile Ser Ser Met Phe Ala Leu Asp65 70 7521012821149212PRT213Solanum tuberosum400128Met Lys Leu Cys Ser Ser Ile Ile Leu Ser Ile Ile Lys Gln Lys Gln1 5 10 15Val Glu Ile Leu Arg Ala Cys Phe Gly Phe Pro Glu Thr Lys Thr Ile20 25 30Ser Val Phe Ser Ser Val Ser Trp Asn Trp His Ile Ile Cys Lys Ser35 40 45Leu21012921164212PRT213Solanum tuberosum400129Met Thr Lys Lys Pro Asp Arg Lys Asp Asn Ile Met Pro Tyr Asn Phe1 5 10 15Pro Gly Thr Lys Phe Leu Gln Pro Ile Phe Arg Asn Phe Phe Leu Pro20 25 30Ser Leu Cys Asp Lys Leu Leu Lys Lys Ser Ile Ser Val Pro Gln Ala35 40 45
Ile Thr Pro Cys Trp Lys Val Gln Cys Gly His Gly Ile Lys Lys Ala50 55 60210130211115212PRT213Solanum tuberosum400130Thr Ile Leu Lys Leu Asp Leu His Thr Phe Asn Gly His Phe Phe Thr1 5 10 15Ala Ser Phe Trp Asn Gln Ser His Arg Asn Ser Ile Phe Ile Phe Gln20 25 30Ser Asn Ile Leu Gln Gln Phe Ser Tyr Arg Gln Leu Glu Ser Asn Thr35 40 45Gly Asn Met Ile Ser Ile Thr Ser Met Asn Met Arg Gln Ala Ser Ile50 55 60Thr Pro Cys Lys Leu Arg Leu Ile Lys Leu Ile Cys Ile His Ser Leu65 70 75 80Val His Val Gln Lys His Ile Glu Pro Tyr Ile Val Pro Ile Ile Ile85 90 95Arg Tyr Phe Ile Glu Cys Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Phe Leu Leu100 105 110Cys Cys Pro115210131211122212PRT213Solanum tuberosum400131Met Lys Gly Lys Glu Lys Pro Arg Glu Met Asn Leu Gln Phe Phe Thr1 5 10 15
Thr Asn Phe Val Ser Thr Val Ala Ile Ser Thr Met Asn Ile Ser Leu20 25 30Leu Phe Lys Ala Lys Arg Val Lys Gly Val Phe Ile Lys Phe Pro His35 40 45Ser Thr Arg Ser Gln Leu Ile Leu Gly Tyr Val Leu Leu Ile Arg Arg50 55 60Met Ser Arg Gly Ala Asp Ala Glu Phe Ser His Arg Arg Glu Leu Val65 70 75 80Val Arg Asn Thr Ile Asp Leu Ile Gly Tyr Arg Arg Ala Thr Thr Val85 90 95Tyr Tyr Ile Asn Thr Phe Phe Tyr Met Gly Ser Thr Thr Arg Leu Glu100 105 110Ile Arg Arg Trp Tyr Arg Cys Ser Ser Arg115 120210132211104212PRT213Solanum tuberosum400132Met Glu Trp Ala Leu Ala Arg Asn Arg Ile Pro Phe Phe Tyr Cys Pro1 5 10 15Asn Ser Leu Arg Thr Ser His Gly Lys Gly Tyr Asp Phe His Arg Arg20 25 30Lys Arg Ile Gln Ser Ser Thr Asn Leu Tyr Leu Leu Asn Pro Phe Phe35 40 45Ser Arg Gln Leu Ile Ser Ile His Ser Thr Ser Cys Pro His Trp His50 55 60Gly Gly Ser Lys Lys Ser Asp Leu Asn Arg Val Ser Arg Asn Tyr Pro65 70 75 80
Cys Leu His Arg Phe Phe Asp Glu Val Cys His Arg Ser Arg Cys Glu85 90 95Pro Glu Tyr Glu Gly Cys Phe Gln10021013321192212PRT213Solanum tuberosum400133Met Asn Asn Ile Thr His Ser Pro Ile Leu Ile Pro Phe Leu Glu Gln1 5 10 15Leu Asn Pro Phe Ile Ser Asn Cys His Met Gln Pro Ile Val Lys Ala20 25 30Asn Thr Pro Ile Leu Asn Gly Asn Thr Lys Cys Arg His Ser Ala Asn35 40 45Ile Phe Thr Asn Gly Asn Cys Ile Trp Glu Lys Pro Met Asn Lys Ile50 55 60Val Asp Gln His Gln Ile His Asn Ser Ile His Ile Ser Cys Glu Ser65 70 75 80Lys Val Phe Leu Val Val Pro Ser Glu Ser His Arg85 9021013421157212PRT213Solanum tuberosum400134Met Lys Phe Arg Tyr Pro Ser Pro Pro Asn Pro Ile Val Thr Ser Leu1 5 10 15Ile Ile Leu Cys Asn Ala Ile Pro Arg Ser Ile Asn Asp Val Asp Gly20 25 30
Leu Ser Arg Ala Ile Lys Ser Tyr Ile Ser Leu Ser Ile Ser Gln Asn35 40 45Ala Ile Val Leu Ser Pro Thr Arg Ala50 5521013521170212PRT213Solanum tuberosum400135Met Val Asn Ile Met Thr Ser Ser Ser Met Ala Thr Lys Phe Pro Ser1 5 10 15Ile Thr Val Gln Cys Asn Ser Val Leu Pro Trp Gln Val Thr Ser Asn20 25 30Phe Ile Pro Phe Val Cys Val Leu Trp Val Glu Val Glu Tyr Lys Tyr35 40 45Gln Val Thr Thr Phe Lys His Asn Asn Leu Ile Ile Ile Ile His Ala50 55 60Ala Tyr Tyr Leu Phe Ser65 7021013621151212PRT213Solanum tuberosum400136Met Ala Lys Leu Val Thr His Glu Ile Glu Val Pro Leu Ser Ser Gln1 5 10 15Gly His Cys Glu Lys Met Asp His Leu Val Lys Arg Asn Ser Ser Ile20 25 30Asn Asn Arg Arg Ser Ile Cys Gln Ala Arg His Ala Arg Ile His Leu35 40 45
Phe Val His5021013721172212PRT213Solanum tuberosum400137Met Phe Glu Thr Lys Leu Asn Ser Gly Val Val Trp Asn Asp Trp Leu1 5 10 15Thr Val Asn Ile Arg Asn Ser Asn Thr Pro Asn Thr Lys Leu Val Leu20 25 30Leu His His Val Val Arg Thr Val Pro Ser Ile Glu Ile Ala Asn Asn35 40 45Phe Val Phe Leu Ser Ser Arg Ser Pro Phe Thr Ile Asp Tyr Ala Thr50 55 60Ile Phe Pro Val Glu Ser Lys Phe65 7021013821166212PRT213Solanum tuberosum400138Met Leu Tyr Thr Ser Leu Tyr Ile Ser Tyr Leu Ser Asn Ser Met Leu1 5 10 15Leu Pro Ser Trp Thr Asn Leu His His Ser Tyr Ser Leu Asn Asn Leu20 25 30Ser Thr Tyr Leu Gly Leu Pro Leu Pro Gly Gly Asn Gln Asn Gln Phe35 40 45Leu Pro Gln Lys Gln Ala Gly Gln Gly Pro Ala Tyr Gln Lys His Leu50 55 60
Arg Gln6521013921125212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物220
221修改的鹼基222(8)223a，t，c或g220
221修改的鹼基222(10)223a，t，c或g220
221修改的鹼基222(12)223a，t，c或g400139gtttacanhn bnatatatcc tgyca 2權利要求
1.一種分離包含T-DNA邊界樣序列的植物多核苷酸的方法，包括(i)片段化植物基因組；(ii)將已知序列的多核苷酸連接到植物DNA片段以產生連接的DNA；(iii)從所述連接的DNA產生PCR產物，所述PCR產物包含(a)與T-DNA邊界序列的一部分同源的序列，(b)來自所述植物基因組的DNA序列，和(c)來自所述已知序列的多核苷酸的序列，其中所述(a)和(b)的序列是連接的；(iv)對所述PCR產物測序；(v)根據來自所述植物基因組的所述DNA序列設計至少一個PCR引物；(vi)在植物基因組DNA的反向PCR中使用(v)的所述PCR引物，來鑑定來自所述植物基因組DNA的、是T-DNA邊界樣序列的序列。
2.權利要求1的方法，其中步驟(iii)的所述PCR產物是通過引物對產生的，在引物對中，一個引物具有包含5′-YGR CAG GAT ATAT-3或5′-CAG GAT ATA TNN NNN KGT AAA C-3′的序列。
3.一種產生不含有T-DNA的修改的植物的方法，包括(1)用(i)包含P-DNA中的期望的多核苷酸的土壤桿菌轉化載體，和(ii)包含T-DNA中的選擇性標記的土壤桿菌轉化載體轉化植物細胞；(2)從所述轉化的植物細胞獲得轉化的植物，所述植物在其基因組中包含所述P-DNA的至少一個拷貝和所述T-DNA的至少一個拷貝；(3)使所述轉化的植物自交或雜交來產生分離了T-DNA和P-DNA的子代植物；和(4)篩選所述子代植物來鑑定不包含所述T-DNA但包含所述P-DNA的修改的植物。
4.一種修改的塊莖，與所述修改的塊莖的物種相同物種的野生型塊莖通常相關的丙烯醯胺水平相比，包含至少更低約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％的丙烯醯胺水平。
5.權利要求4的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖是成熟塊莖。
6.權利要求4的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖至少是12周齡。
7.權利要求4的修改的塊莖，其中所述塊莖選自由ahipa、apio、秘魯胡蘿蔔、慈茹、竹芋、baddo、苦樹薯、巴西竹芋、木薯、中國薊、荸薺、椰子、cocoyam、芋、芋根、象耳、菊芋、goo、日本薊、日本馬鈴薯、耶路撒冷薊、豆薯、百合根、ling gaw、mandioca、manioc、墨西哥馬鈴薯、墨西哥豆薯、old cocoyam、馬鈴薯、saa got、sato-imo、seegoo、sunchoke、sunroot、甜樹薯、甘薯、tanier、tannia、tannier、木薯塊根、topinambour、蓮藕、豆薯、薯蕷、和yautia構成的組。
8.權利要求7的修改的塊莖，其中所述馬鈴薯是Russet馬鈴薯、Round White馬鈴薯、Long White馬鈴薯、Round Red馬鈴薯、YellowFlesh馬鈴薯或Blue和Purple馬鈴薯。
9.一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖的直鏈澱粉水平相比，包含至少更高約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％的直鏈澱粉水平。
10.一種修改的、成熟的塊莖，包含與相同物種的野生型塊莖的直鏈澱粉水平相比，約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍的直鏈澱粉水平。
11.權利要求9的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖是成熟塊莖。
12.權利要求9的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖至少是12周齡。
13.一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的葡萄糖水平相比，包含至少更低約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％的冷誘導的葡萄糖水平。
14.權利要求13的修改的塊莖，其中在所述修改的塊莖中的葡萄糖水平比相同物種的野生型塊莖中的葡萄糖水平低約40％。
15.一種修改的、成熟的塊莖，與相同物種的野生型塊莖中的丙烯醯胺水平相比，其包含降低4倍的丙烯醯胺水平。
16.權利要求13的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖是成熟塊莖。
17.權利要求13的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖至少是12周齡。
18.一種修改的塊莖，其與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的磷酸鹽水平相比，包含至少更低約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％的磷酸鹽水平。
19.權利要求18的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖是成熟塊莖。
20.權利要求18的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖至少是12周齡。
21.一種修改的塊莖，與所述修改的塊莖的物種相同物種的野生型塊莖相關的多酚氧化酶活性水平相比，包含至少更低約99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％的多酚氧化酶活性水平。
22.一種修改的塊莖，包含過量表達無活性的多酚氧化酶基因的至少一個細胞，其中，與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的多酚氧化酶活性水平相比，在所述修改的塊莖中多酚氧化酶活性的水平降低了99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％。
23.權利要求22的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖是成熟塊莖。
24.權利要求22的修改的塊莖，其中所述修改的塊莖至少是12周齡。
25.權利要求22的修改的塊莖，其中在所述修改的塊莖中多酚氧化酶活性水平降低了50％-90％。
26.權利要求23的修改的塊莖，其中在所述修改的塊莖中多酚氧化酶活性水平降低了50％-90％。
27.權利要求23的修改的塊莖，其中，與所述修改的塊莖相同物種的野生型塊莖中的多酚氧化酶活性水平相比，在所述修改的塊莖中多酚氧化酶活性的水平降低了99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，84％，83％，82％，81％，80％，79％，78％，77％，76％，75％，74％，73％，72％，71％，70％，69％，68％，67％，66％，65％，64％，63％，62％，61％，60％，59％，58％，57％，56％，55％，54％，53％，52％，51％，50％，49％，48％，47％，46％，45％，44％，43％，42％，41％，40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％。
28.一種產生不含有T-DNA的轉基因植物的方法，包括用P-DNA載體和T-DNA載體共轉化植物組織；通過在培養基上孵化所述植物組織從所述轉化的植物組織培植植物苗，所述培養基含有破壞不含所述P-DNA載體或所述T-DNA載體的細胞的物質；選擇含有所述P-DNA或所述T-DNA之一、或兩者的植物苗；將所述植物苗培植到性成熟，使所述性成熟的植物與未轉化的植物雜交；和將細胞僅含有P-DNA的子代植物與含有T-DNA的子代植物分離。
29.權利要求28的方法，其中所述P-DNA載體基本上類似於pSIM340。
30.權利要求28的方法，其中所述T-DNA載體基本上類似於pSIM363。
31.權利要求28的方法，其中培養基中的物質是timentine。
32.權利要求28的方法，其中培養基中的物質是卡那黴素。
33.一種產生不含有T-DNA的轉基因植物的方法，包括用P-DNA載體和T-DNA載體共轉化植物組織；通過在培養基上孵化所述植物組織從所述轉化的植物組織培植植物苗，所述培養基含有破壞不含所述P-DNA載體或所述T-DNA載體的細胞的物質；選擇含有所述P-DNA或所述T-DNA之一、或兩者的植物苗；將所述植物苗培植到性成熟，然後使所述性成熟的植物自交；和將細胞僅含有P-DNA的子代植物與含有T-DNA的子代植物分離。
34.權利要求33的方法，其中所述P-DNA載體基本上類似於pSIM340。
35.權利要求33的方法，其中所述T-DNA載體基本上類似於pSIM363。
36.權利要求33的方法，其中培養基中的物質是timentine。
37.權利要求33的方法，其中培養基中的物質是卡那黴素。
38.權利要求28或33的方法，其中所述T-DNA包含選擇性標記基因。
39.一種產生不含有T-DNA的轉基因植物的方法，包括用第一P-DNA載體和第P-DNA載體共轉化植物組織，其中所述第一P-DNA載體包含目標多核苷酸，和其中所述第二P-DNA載體包含選擇性標記基因；通過在培養基上孵化所述植物組織從所述轉化的植物組織培植植物苗，所述培養基含有破壞不含任何一個所述P-DNA載體的細胞的物質；選擇含有所述P-DNA載體之一、或兩者的植物苗；將所述植物苗培植到性成熟，使所述性成熟的植物與未轉化的植物雜交、或使所述性成熟的植物自交；和將細胞僅包含來自所述第一P-DNA載體的P-DNA的子代植物，與在它們基因組中含有來自所述第二P-DNA載體的P-DNA的子代植物分離。
40.一種核酸，包含SEQ ID NO.96中描述的序列，其能將一種多核苷酸轉移到另一種多核苷酸中。
41.一種核酸，包含與SEQ ID NO.96中描述的序列具有90％的序列同一性的序列。
42.一種核酸，包含SEQ ID NO.97中描述的序列，其能將一種多核苷酸轉移到另一種多核苷酸中。
43.一種核酸，包含與SEQ ID NO.97中描述的序列具有90％的序列同一性的序列。
全文摘要
本發明涉及一種方法，用於鑑定和分離可起到T－DNA或T－DNA邊界樣序列作用的天然植物核酸序列，用於實現一種多核苷酸轉移到另一種多核苷酸中。本發明還提供了一種修改的塊莖，例如遺傳修改的成熟塊莖，其包含至少一種性狀，所述性狀不被相同物種的未修改的塊莖展現。
文檔編號C12N9/02GK1842593SQ200480024557
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月25日 優先權日2003年6月27日
發明者C·羅門斯, J·葉, J·梅嫩德斯－烏馬拉, H·彥, K·斯沃爾茲 申請人:J.R.西姆普羅特公司