一種魚類轉基因育種的方法
2023-05-28 19:47:36 4
專利名稱：一種魚類轉基因育種的方法
技術領域：
一種魚類轉基因育種的方法，屬於分子生物學魚類育種技術領域。本發明
主要將某種魚類本身的基因組DNA經過預處理，獲得有別於原基因組DNA的 DNA重排片斷，用轉基因的方法將DNA重排片斷導入原種魚類的卵細胞中， 和原種魚類的基因組發生作用，形成變異的基因，並產生外形突變的個體，從 中可以篩選優良的個體，進行進一步選育。並用目標區域擴增多態性(TRAP) 方法判斷DNA重排片斷是否進入基因組，用兩步擴增法獲得變異的基因。為以 後進行功能基因組5開究提供一個基礎，同時獲得獨特的分子標記。
背景技術：
將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由於導入基因的表達， 引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術。由於生物組 織的複雜性，導入的基因序列會遇到很多問題，如整合，表達，基因沉默等， 更重要的是這些基因在生物體中到底有什麼功能，以及它們的調控機制很難完 全搞明白，因此很難得到預期的結果。也就是說儘管導入的是已知序列的基因 也難預知結果如何。
異源總DNA導入動植物以獲得具有新性狀的品系是一種在實踐上很有效的 方法。通過該方法獲得新的品系的種類最近幾年在中國有報導的在植物方面有 小麥，玉米，水稻，馬鈴薯等。在動物方面也有一定的應用，如中科院水生 所劉漢勤等人採用精子載體的方法將鯽魚肝總DNA轉入紅鯉體內，後代中有 0.69%的個體體色中產生了鯽魚黑色素。1997年章懷雲等人將草魚精子與紅鯉 魚肝臟總DNA共培養，獲得了體形、體色變異的個體。
和轉特定基因相比，異源總DNA導入動植物可以獲得大量形態各異的突變 體，可供研究者進行下一步選育。而且由於大部分真核生物的基因組有大量的 非編碼序列，這些序列的功能如何我們並不知道，而異源總DNA導入法對這些 非編碼區域的序列也進行了篩選。但前提就是要知道哪些序列進入了基因組。 通過RAPD和Southem雜交人們找到一些區別於宿主的條帶，但是都沒有進一步 的研究報導，很難讓人相信這些條帶是否一定是導入的外源序列，因此這個方 法受到廣泛的質疑。
關於該異源總DNA導入方法的理論基礎，1974年周光宇提出了染色體水平 以下的DNA片段雜交假說，認為異源總DNA導入導致的外型變化是在母本染色 體基礎上添加了交換的遠緣DNA片段的結果。這一假設為高粱稻及其親本的同工酶酶譜分析及DNA雜交的復性動力學初步證實。但是由於沒有合適的技術跟 蹤這些外源DNA，所以以上假設沒有最直接的證明。
異源總DNA導入魚類最難解決的問題就是如何跟蹤進入細胞核的外源序 列。由於大部分外源DNA片斷進入基因組最終是被降解的，但具體過程並沒有 深入研究的報導。所以我們必須找到一個方法可以降低導入外源DNA的降解。 根據這幾年轉基因研究的結論，越接近宿主序列的基因越傾向於保留。所以我 們設想如果將魚類本身的基因組片斷改變次序再導入原種魚類的卵細胞，研究 其是否能被保留，並對原基因組產生影響，產生突變型。
發明內容
本發明目的在於提供一個新的方法和思路，利用魚類本身的基因組DNA， 經過預處理，形成新的DNA片斷(DNA重排序列)，同時利用設計好的接頭作為 跟蹤序列，利用轉基因的方法導入原種魚類，對基因組進行幹擾，形成變異基 因和外形上的變化，同時設計兩步擴增法獲得DNA重排序列，以解決以往外源 總DNA導入法所無法了解的哪些序列進入宿主導致突變型的產生。
本發明還涉及一種簡單的獲得魚類突變體的方法。
本發明還涉及魚類育種中獲得新選育突變個體的方法。
本發明還涉及很多功能序列的尋找。
本發明還涉及獲得的魚類新品系的相關分子標記的獲得。
本發明的技術方案 一種魚類轉基因育種的方法，將某種魚類本身的基因 組DNA經過預處理，成為一種有別於原基因組DNA的DNA重排片斷，用轉 基因的方法將DNA重排片斷導入原種魚類的卵細胞中，和原種魚類的基因組發 生作用，形成變異的基因，並產生外形突變的個體，從中篩選生產性狀優良的 個體，進行進一步選育；
通過設計好的擴增固定引物gmprimer 2對這些突變個體基因組進行擴增， 用目標區域擴增多態性TRAP方法判斷DNA重排片斷是否進入突變個體的基因 組，設計兩個引物gmprimerl和gmprimerl+l:用兩步擴增法獲得變異的基因， 作為鑑定這些突變個體的分子標記；
所述某種魚類本身的基因組DNA預處理方法
提取某種魚類的基因組DNA，先用限制性內切酶^fe^I酶切反應，反應完 成後用反應體系2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，重新連接， 連接反應結束後用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，再用限制 性內切酶五co及I酶切，用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後， 加入跟蹤接頭序列gmadaptorl連接，用2倍體積的乙醇沉澱，保存。
基因組DNA預處理方法，跟蹤接頭序列為gmadaptorl: cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgct。TRAP的擴增固定引物為gmprimer2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct。 為得到用兩步擴增法獲得變異的基因所設計的兩個引物為 gmprimer 1: actcatgatc etcgtagact gcgtacc; gmprimer 1+h atcctcgtag actgcgtacc aattn 。
魚類本身的基因組DNA預處理方法，其他識別位點為四個鹼基的限制性內 切酶都能代替限制性內切酶I用於酶切反應。
本發明的有益效果目前， 一般採用的魚類轉基因育種方法為異源總DNA 導入法，但無法跟蹤導入序列，本發明採用將一種魚類本身的基因組用一種限 制性內切酶切斷，重新連接，再換一種限制性內切酶酶切，得到的新片斷完全 來自該種魚類，可以在該種魚類的基因組中找到同源序列，但由於二次連接後 次序被打亂，又不完全是該種魚類原來的序列。研究證明這樣的序列更容易被 保留，並對該種魚類的基因組產生影響，產生突變型。經過幾年的試驗，證明 本方法可行。通過對鯉魚的研究發現本方法可以獲得很多表型發生變化的個體， 圖1表示經隨機擴增多態性RAPD檢測獲得不同基因型的個體，同時通過二次 擴增獲得導致這些表型變化的序列；圖2表示兩條體型較小的個體的變異基因 擴增結果。
圖1. RAPD引物S68擴增圖。1 10是轉基因鯉魚的擴增圖譜，11~19是普 通鯉魚的擴增圖譜，所有普通鯉魚有的基因型，轉基因鯉魚都有，但個體4和 10沒有擴增產物，是普通鯉魚沒有的基因型，說明導入序列在宿主基因組發生 作用，形成了新基因型。
圖2.用設計好的引物Gmprimer 1 + 1第二步擴增電泳圖，control沒有擴增 產物，1、 2是轉基因小魚的擴增產物，說明用導入的跟蹤序列設計的引物可以 獲得導入宿主的序列，測序後可獲得特異分子標記。
具體實施例方式
1、基因組DNA提取和DNA重排片斷的構建
取鯉魚(肌肉或者血液)提取基因組DNA (—般是蛋白酶K法提取)。 提取的DNA先用一種限制性內切酶#M I酶切(反應體系150 nL反應總 體積中含l-10ng模板DNA、 2U酶、15 nL10xTango buffer; 37'C酶切16h)， 反應完成後用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，用30pL體積 重新連接(反應體系為2.5UT4連接酶、2 pL10xlinkagese buffer; 16'C連接 過夜)，反應結束後用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，再用 第二種限制性內切酶&oi I酶切(反應體系為50pL反應總體積中含4U酶、 5 ^L10xTango buffer; 37。C酶切16h)，用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心， 吹乾乙醇後，加人10pL的連接混合物(2nL5xlinkagesebuffer、 50pmol設計好的跟蹤接頭gmadaptor 1和2.5 UT4連接酶)，16'C連接過夜，即得到所稱的DNA重排片斷，用0.8%的瓊脂糖凝膠進行檢測後，最後用2倍體積的乙醇沉澱，保存。
2、 將得到的DNA重排片斷用精子攜帶法導入鯉魚卵中，孵化後獲得大量形態變異的個體，如個體大小，長短，顏色，鱗片等。選擇一些個體提取基因組DNA。
3、 TRAP (目標區域擴增多態性)檢測DNA重排片斷是否進入基因組根據跟蹤接頭序列設計引物gmprimer2作為TRAP (目標區域擴增多態性)
的擴增固定引物，TRAP隨機引物共三個Ga5-800 (ggaaccaaacacatgaaga);Ga3誦800(tcateteaaaccatatacac); Odd26誦700 (ctatctctcgggaccaaac)。擴增反應總體積為25^iL，包括1.0nL步驟2中得到的基因組DNA溶液，2.5 10xPCR buffer,5pmo1 TRAP隨機引物，5pmo1 gmprimer 2， 1.5 |iLdNTPs (2.5 mmol/L)， 2 U 72^酶，加水至25pL。擴增反應的程序為首先進行94'C變性2min;然後94。C變性30 s， 38。C復性45s, 72。C延伸2min，反應進行5個循環；然後94。C變性30s，55'C復性45s， 72'C延伸2min,反應進行30個循環；最後72"C延伸10 min。在1.0°/0的瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物。
同時用沒有導入DNA重排片斷的鯉魚個體數條作為對照，當對照鯉魚沒有擴增產物或擴增產物不明顯，而導入DNA重排片斷的變異個體有明顯擴增產物，說明DNA重排片斷已經進入變異個體基因組。
4、 RAPD (隨機擴增多態性)檢測基因組CCGG區域的變異，由於我們採用限制性內切酶il^p I酶作為進行第一次酶切，其識別位點為基因組CCGG區域，獲得的DNA重排片斷髮生變化的位點是基因組CCGG區域，所以檢測基因組ccgg區域就知道是否有變異基因出現。
引物採用具有ccgg或ggcc的RAPD引物(大部分生物公司均有現成的引物出售)。擴增反應總體積為25 pL，包括1.0pL步驟2中得到的基因組DNA溶液，2.5 pL10xPCR buffer, 5pmolRAPD引物，1.5 pLdNTPs (2.5腿ol/L)， 2UTaq酶，加水至25pL。擴增反應的程序為首先進行94'C變性2min;然後94'C變性30s， 36"C復性45s, 72'C延伸lmin30s，反應進行30個循環；最後72'C延伸10min。在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物。
用普通鯉魚數條作為對照，如果在導入DNA重排片斷的變異個體中發現普通鯉魚中沒有出^L的擴增結果，說明變異個體中有變異基因的存在。
5、 DNA重排片斷的獲得，由於基因組DNA經預處理後獲得的DNA重排片斷是變異基因的所在位置，所以獲得DNA重排片斷就找到變異基因。
選擇用步驟2育種方法得到的發生體型變小的個體，按提取基因組DNA作為模板。DNA重排片斷的擴增用兩步法得到。第一步:擴增反應總體積為25 ^L,包括1.0nL模板，2.5pL 10xPCR buffer, 5pmol gmprimerl (設計好的第一步擴增引物)，1.5pLdNTPs(2.5mmol/L)， 2UTaq酶，加水至25 pL。擴增反應的程序為首先進行94'C變性2min;然後94'C變性30 s， 55-65X:復性45 s， 72'C延伸2min，反應進行30個循環，最後72'C延伸10 min。第二步擴增反應總體積為25 nL，包括1.0 nL模板，2.5 pL 10xPCR buffer, 5pmo1 gmprimer 1+1(設計好的第二步擴增引物)，1.5 ^LdNTPs(2.5mmol/L)， 2UTaq酶，加水至25pL。擴增反應的程序為首先進行94'C變性2min;然後94'C變性30 s， 55-65。C復性30-150 s， 72'C延伸2min，反應進行30個循環；最後72'C延伸10 min。用1.0 %的瓊脂糖電泳(EB染色)檢測擴增產物的量；然後特異片段直接從凝膠上切下來，用膠回收試劑盒回收，克隆進pMD-18-T載體，送上海生物工程公司測序。
6、 DNA重排片斷的分析
本試驗我們在兩個轉基因變異的小魚中獲得幾個DNA重排片斷，這些片斷就是變異基因所在位置，對這些片斷進行了分析，發現它們不編碼任何蛋白，和已知的調控序列也沒有任何相似性，通過NCBI網站比對我們也未找到任何相近的序列。轉基因魚中得到DNA重排片斷為SEQIDNO: 1，下劃線處是發生重排的位點。序
列
表
SEQIDNO:l
909
DNA
鯉魚總DNA
1
cttgcatgcctgcaggtcgacgattatcctcgtagactgcgtaccaattgcctcagtaac60
gcatctaatttaaaaaatgctctatatactcatagacgacgcttttccctctcctattat120
ctaaatctatct^gtttgaaactgtctggccgtctaaattttcagtctaaatctgtct180
ggcttttgaaactgaaaacatttgaattacgaaaaaggcccagatttcatgacacggcct240
caccctgccaacataaeicagcagccttcagcacctagccagtctcaagactgtcaatgca300
cgtstaataagaccgaattaagtetatttaacattagccteiaatctcttttggtatcaacaa360
taettgatgataettaaatacatttatagtatataggctaagtctttagatagtacgatagt420
attccagtagcctatttaattctccatatagcctatctttttcttttttt480
ttttttttttttgtataaacgtttttttaacatcttcttcgagatcttttccattttctg540
cttagtcttttgtatttc犯cagcctctctgtggctttcc鄉C3gtggCatagtgcacc600
accctccttattatcataaggiccaBcggtttaaatcactc660
aaac aac aatcaagatctcacatacctgatggcaatatcctgttgagattgtggacagca720
gtgggttattccatcaagtctgcttccatccgccgtcttcttcctcacccagctgtttta780
ttttttcctataggctctcagcctctccct￡LgCtC￡lgC3Ccaacaatgcaggtggagccc840
cccctggcaagaccattcagactg鄉gagtctggtUtgcagcaattggtacgca,gtcta900
cgaggataa909
gmadaptor 1-
cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgctgmprimer2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct
gmprimerl- actcatgatc ctcgtagact gcgtaccgmprimerl+1- atcctcgtag actgcgtacc aattn
權利要求
1、一種魚類轉基因育種的方法，其特徵是將某種魚類本身的基因組DNA經過預處理，成為一種有別於原基因組DNA的DNA重排片斷，用轉基因的方法將DNA重排片斷導入原種魚類的卵細胞中，和原種魚類的基因組發生作用，形成變異的基因，並產生外形突變的個體，從中篩選生產性狀優良的個體，進行進一步選育；通過設計好的擴增固定引物gmprimer 2對這些突變個體基因組進行擴增，用目標區域擴增多態性TRAP方法判斷DNA重排片斷是否進入突變個體的基因組，設計兩個引物gmprimer 1和gmprimer 1+1用兩步擴增法獲得變異的基因，作為鑑定這些突變個體的分子標記；所述某種魚類本身的基因組DNA預處理方法提取某種魚類的基因組DNA，先用限制性內切酶Msp I酶切反應，反應完成後用反應體系2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，重新連接，連接反應結束後用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，再用限制性內切酶EcoR I酶切，用2倍體積的乙醇沉澱，12000轉離心，吹乾乙醇後，加入跟蹤接頭序列gmadaptor 1連接，用2倍體積的乙醇沉澱，保存。
2、 根據權利要求1所述的一種魚類轉基因育種的方法，其特徵是魚類本身 的基因組DNA預處理方法，跟蹤接頭序列為gmadaptor 1:cgagcaggac tcatgatcct cgtagactgc gtacc; aattggtacg cagtctacga ggatcatgag tcctgct。
3、 根據權利要求1所述的一種魚類轉基因育種的方法，其特徵是， TRAP的擴增固定引物為gmprimer 2: cagtctacga ggatcatgag tcctgct。
4、 根據權利要求1所述的一種魚類轉基因育種的方法，其特徵是，為得到 用兩步擴增法獲得變異的基因所設計的兩個引物為gmprimer 1 - actcatgatc ctcgtagact gcgtacc-gmprimer 1+1: atcctcgtag actgcgtacc aattn。
5、 根據權利要求1所述的一種魚類轉基因育種的方法，其特徵是，魚類本 身的基因組DNA預處理方法，其他識別位點為四個鹼基的限制性內切酶都能代 替限制性內切 酶I用於酶切反應。
全文摘要
一種魚類轉基因育種的方法，屬於分子生物學魚類育種技術領域。本發明主要將某種魚類本身的基因組DNA經過預處理，獲得有別於原基因組DNA的DNA重排片斷，用轉基因的方法將DNA重排片斷導入原種魚類的卵細胞中，和原種魚類的基因組發生作用，形成變異的基因，並產生外形突變的個體，從中可以篩選生產性狀優良的個體，進行進一步選育。並用目標區域擴增多態性(TRAP)方法判斷DNA重排片斷是否進入原種魚類的基因組，並用兩步擴增法獲得變異的基因，為以後進行功能基因組研究提供一個基礎，同時獲得獨特的分子標記。本發明方法簡單，可廣泛應用於魚類以及其他動植物等育種和相關功能基因組的研究中。
文檔編號C12N15/87GK101633936SQ200910183768
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月7日 優先權日2009年8月7日
發明者丁煒東, 曹哲明, 健 楊 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心