用於抗微生物應用的肽序列、其分枝形式以及其用途的製作方法
2023-06-11 06:11:41
專利名稱：用於抗微生物應用的肽序列、其分枝形式以及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及有效的抗微生物肽序列的鑑定，特別是抗蛋白酶活性並因此非常適合於在體內使用的抗微生物肽序列的鑑定，特別是當以四分枝MAP形式合成時。本發明的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3, RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4)來源於以前報導的以穀氨醯胺作為第一個氨基末端殘基的肽M6。 去除穀氨醯胺給予了肽穩定性和批次與批次之間均一性預料之外的且令人驚奇的改善，並因此提供了肽合成的可靠方法，其對於M6肽是特別困難的。
背景技術：
多藥物抗性細菌的不斷出現是全球關注的事情，這些國家中的大部分都將抗生素廣泛地使用於臨床。許多病原體如金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、一些腸球菌(enterococci),銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和許多其他革蘭氏陰性細菌都已經產生了對大多數常規抗生素以及對那些新一代抗生素的抗性(Wenzel和Edmond 2000)。因此，研發新的抗生素變得越來越重要。這種需求促使研究團體和藥物公司考慮新的抗微生物劑。抗微生物肽被認為是對通常引起抗性細菌選擇的常規抗生素的最佳替代物之一(Hancock和Sahl 2006)。大多數抗微細菌是動物包括人類、植物和真菌的天然免疫組分(ZasloffdOO》。它們通常由 6-50個胺基酸殘基組成，並具有淨正電荷。陽離子肽選擇性地與陰離子細菌膜和與其他負電荷結構例如LPS和DNA相互作用。真核細胞的膜的外層通常比細菌的膜的外層帶更少的負電荷，並且與細菌的膜不同，它們也通過膽固醇分子穩定化。這些差異是陽離子肽的特異性的基礎。因此，陽離子抗微生物肽的作用機制歸因於它們與細菌膜的特異結合，其引起細胞通透，並且在某些情況下引起代謝途徑抑制。因而，許多研究旨在通過研究它們的作用機制、當局部地或者全身地施用時它們對真核細胞的毒性和它們的治療有效性來鑑定和表徵抗微生物肽序列。遺憾地是，迄今為止，兩個主要的問題阻礙了抗微生物肽藥物的研發。第一個問題是用於細菌的天然抗微生物肽的選擇性通常太低並且它們對真核細胞特別是紅細胞有劇毒，產生了高水平的溶血。 第二個問題與肽在體內普遍的短半衰期有關。這是過去10年僅有很少的陽離子肽進入市場的主要原因(多粘菌素和達託黴素是兩個成功的例子)。幾年前，研究者開始致力於鑑定在實驗室中通過合理設計或者組合文庫的篩選而選擇的非天然來源的新肽序列。目的是根據一般毒性和對細菌的特異性以及改進的半衰期為藥物研發發現具有更好的生物學特性的肽。在本發明人的實驗室中，鑑定了非天然肽序列，其特別地顯示出對革蘭氏陰性細菌強的抗微生物活性(Pini等，200幻。通過合理地修飾鑑定自組合文庫的序列獲得了肽 (QKKIRVRLSA，SEQ ID No. 5，稱為M6)，其以MAP四分枝形式合成，其中4個相同的肽序列通過賴氨酸核心連接到一起。這種分子顯示出對蛋白酶和肽酶高的抗性，因而克服了短半衰期的問題(Bracci等，2003 ；Falciani等，2007)。已經在以下方面對分枝狀的抗微生物肽M6進行了表徵其對許多細菌包括幾種多藥物抗性臨床分離物的生物學活性，其與DNA的相互作用，其對幾種真核細胞系的體外毒性，以及其溶血活性，其免疫原性，當腹膜內或靜脈內注射時其在體內的毒性(Pini等，2007)。在M6的表徵中進行的所有實驗期間，我們注意到具有非均一的活性的M6產生的肽的不同合成(批次與批次之間不同)(
圖1A)。質譜分析顯示，M6的第一個胺基酸，即穀氨醯胺，轉變成了焦穀氨酸(圖1B)。含有焦穀氨酸而非穀氨醯胺的不同的肽的存在以不可預測的百分率隨批次而改變。事實上，完全去除這種副產物是不可能的，首先，因為在HPLC 純化期間由於其與主要產物具有類似的保留時間而不容易除去它，第二，因為當在溶液中時，它會持續從親代肽中產生。由於焦穀氨酸類似物相對於穀氨醯胺類似物顯示出明顯降低的抗微生物活性，所以混合物的整體活性因批次而異(圖1A)。為了最小化批次與批次之間的不同，在用於臨床前實驗和可能地用於工業生產的大規模肽生產方面，我們從M6中去除了第一個穀氨醯胺殘基並也用精氨酸替換了前兩個賴氨酸或者用賴氨酸和精氨酸更換了這前兩個殘基。這產生了缺失M6序列中存在的第一個穀氨醯胺的下列9聚體序列KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，稱為M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，稱為 M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，稱為 M35, RKIRVRLSA, SEQID No. 4，稱為 M36。這些序列是本申請的主題。將新肽進行描述於下文實施例中中的幾種表徵。事實上，去除M6肽序列N末端的單一胺基酸殘基和可能地更換前兩個位置中的賴氨酸和精氨酸產生了更好的抗微生物活性，並且不造成毒副作用和作用機制方面的任何不同行為。實際上，它導致合成可靠性的有力改善，使得肽M33、M34、M35和M36的序列相對於M6更適合於工業研發。由於改善的穩定性和批次與批次之間的均一性，M33、M34、M35和 M36序列是用於抗微生物藥物研發的理想候選物。發明描述本發明的目的是以單體結構或者樹狀聚體結構，優選地以多抗原肽(MAP)形式合成的肽序歹Ij KKIRVRLSA, SEQ ID No. 1，M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，M35, RKIRVRLSA, SEQ ID No. 4，M36，所述多抗原肽(MAP)形式具有通式
權利要求
1.抗菌肽，其具有選自KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA，SEQ ID No. 2，KRIRVRLSA， SEQ ID No. 3，RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4的從氨基末端到羧基末端的胺基酸序列或其功能性衍生物，其中一個胺基酸殘基由丙氨酸殘基取代或者其中一個帶正電荷的胺基酸由另一個帶正電荷的胺基酸取代。
2.根據權利要求1所述的肽，其是線性形式。
3.根據權利要求2所述的肽，其在聚丙烯醯胺骨架上、在葡聚糖單位骨架上或者在乙二醇單位骨架上多聚化。
4.根據權利要求1所述的肽，其是多抗原肽(MAP)形式，具有下列通式其中，R是如在權利要求1中所要求保護的肽；X是三功能性分子；m = 0或1 ;n = 0或 1 ；當m和η是0時，所述肽是二聚體；當m = 1且η = 0時，所述肽是四聚體，當m = 1且η =1時，所述肽是八聚體。
5.根據權利要求4所述的MAP肽，其中X是三功能性單位。
6.根據權利要求5所述的MAP肽，其中所述三功能性單位包含至少兩個功能性氨基基團。
7.根據權利要求6所述的MAP肽，其中X是賴氨酸、鳥氨酸、降賴氨酸或者氨基丙氨酸。
8.根據權利要求4所述的MAP肽，其中X是天冬氨酸或者穀氨酸。
9.根據權利要求4所述的MAP肽，其中X是丙二醇、丁二酸、二異氰酸酯或者二胺衍生物。
10.根據前述權利要求中任一項所述的肽，用於藥物用途。
11.根據前述權利要求中任一項所述的肽，作為抗菌藥物。
12.藥物組合物，其包含藥學上可接受的且有效量的根據權利要求10或者11的肽。
13.根據權利要求12所述的藥物組合物，其以溶液劑形式在個體中注射用於全身使用。
14.根據權利要求12所述的藥物組合物，其以溶液劑形式作為解毒劑注射用於LPS中和。
15.根據權利要求12所述的藥物組合物，其以洗眼劑、漱口劑、軟膏劑或者溶液劑形式用於局部使用。
16.具有抗菌活性的消毒劑和/或洗滌劑製劑，其包含根據權利要求1至11的肽。
17.根據權利要求1至11所述的肽的用途，用作防腐劑用於製備食物產品和/或美容產品和/或順勢療法產品。
全文摘要
本發明涉及具有選自KKlRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKlRVRLSA，SEQ ID No.4的從氨基末端到羧基末端的胺基酸序列的抗菌肽或其衍生物及其用途。
文檔編號C07K7/06GK102170899SQ200980139093
公開日2011年8月31日 申請日期2009年10月5日 優先權日2008年10月5日
發明者A·皮尼, C·法爾恰尼, L·布拉奇 申請人:錫耶納大學