用於檢測沙眼衣原體的檢驗的製作方法

2023-10-23 12:44:12 1

專利名稱：用於檢測沙眼衣原體的檢驗的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢驗產品、用途和方法，特別是與聚合酶鏈式反應(PCR)有關的那些。更具體而言，本發明涉及對沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的檢驗以及改進的PCR對照。
背景技術：
沙眼衣原體是專性的人類細胞內病原體。衣原體感 染是普遍的性傳播疾病，該細菌可以在男性和女性中引起多種病狀。臨床症狀包括尿道炎、直腸炎、沙眼、不孕不育、前列腺炎、附睪炎、子宮頸炎、盆腔炎症性疾病(PID)以及宮外孕。它還是能夠引起眼睛和肺部感染的新生兒病原體。沙眼衣原體感染是世界範圍最普遍的性傳播疾病之一。據估計，美國有2-3百萬個體感染有衣原體。在英國，據估計，25歲以下的性活躍年輕人中有十分之一感染有衣原體。利用抗生素(例如，諸如強力黴素之類的四環素，或者諸如阿奇黴素之類的大環內脂類抗生素)能夠成功地治療沙眼衣原體感染。為了確保及時地提供恰當的治療，需要準確的診斷沙眼衣原體感染。在諸如英國等一些國家，已經啟動了篩查衣原體的國家計劃。沙眼衣原體的感染單位為原體(EB)。EB作為「孢狀」體,其目的是允許衣原體在宿主細胞外的非支持性環境下的存活。EB被認為是代謝惰性的，直到其粘附到並且被易感宿主細胞吞噬。可以利用核酸擴增的方法來檢測沙眼衣原體，例如，基於聚合酶鏈式反應(PCR)的方法。PCR有可能擴增來自被感染細胞以及EB中的核酸。沙眼衣原體在其染色體和質粒中均含有遺傳物質，每個EB中染色體以單拷貝存在，質粒以6至I O個拷貝存在。通常，由於質粒在每個EB中為多拷貝，並且由於推測通過檢測基於質粒的靶標能夠獲得更高的靈敏度，質粒被用作核酸擴增試驗的優選靶標。然而，在發現沙眼衣原體瑞典變種之後，質粒核酸擴增試驗檢測體系的適用性已成為問題。瑞典變種在質粒中包含377個鹼基對的缺失，因此當遇到沙眼衣原體瑞典變種時，以缺失區域為靶標的檢測體系將會提供假陰性結果。本發明基於實現這樣的檢驗，其檢測可能更加穩定地存在於沙眼衣原體染色體中的序列，因為染色體基因通常突變較少，並且在某種情況下質粒可能會完全丟失。可以預想以染色體中的基因作為靶標是不利的，因為在每個細胞中染色體靶標僅以單拷貝的形式存在。然而，本發明的發明人驚奇地發現，染色體靶標可以提供與質粒靶標相當的檢測限(LOD)0核酸擴增試駘(NAAT)有大量適合本發明使用的核酸擴增試驗(NAAT)法。它們包括公知的PCR、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、重組酶-聚合酶擴增(RPA)、轉錄介導的擴增、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、解旋酶依賴性擴增以及環介導等溫擴增。NAAT法很大程度上取代了沙眼衣原體的培養檢測法，這不僅是因為培養法需要使用哺乳動物細胞或組織培養，從而增加了複雜性。NAAT法以高靈敏度序列特異性的方式，利用酶來擴增一種或多種靶序列，從而進行核酸檢測。關於NAATs進一步的細節，讀者可以參閱以下參考文獻，這裡以引用的方式將其內容併入本文核酸序列依賴性擴增(NASBA)-Compton J. Nucleic acid sequence-based amplificationNature 1991:350(6313) :91-2轉錄介導的擴增
-Wroblewski J.等，Comparison of Transcription MediatedAmplification and PCR Assay Results from Various GenitalSpecimen Types for Detection of Mycoplasma genitalium. J. Clin.Microbiol. 2006:44(9):3306-3312連接酶鏈式反應-Wiedmann M.等，Ligase chain reaction (LCR)overview and Applications. PCRMethods and Applications 19943 (4) S51-64 環介導的等溫 DNA 擴增-Notomi等,Loop-Mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids.Res. 200023(12) :E63解旋酶依賴性擴增-Vincent M.等，Helicase-dependent isothermal DNA Amplification EMBORep.20045(8)795-800鏈置換擴增-Strand displacement amp I i fi cat i on-an isothermal in vitroAmplification technique. Walker 等，Nucleic Acids Res. 1992. 20(7) 1691-1696重組酶聚合酶擴增(RPA)-DNA Amplification and Detection Made Simple(Relatively). Hoff. M. PublicLibr. Sic. 2006:4(7) :e222 ;以及美國專利 US7270981。聚合酶鏈式反應(PCR)PCR是以高敏感度序列特異性的方式，利用熱穩定聚合酶並且循環進行反應的溫度條件來檢測核酸的方法。最簡單形式的PCR反應經過三個階段的循環i)在大約90-100°C的溫度下進行的變性階段。在此高溫下，雙鏈DNA變性或「解鏈」以形成單鏈DNA，ii)在50-65°C的典型溫度下進行引物退火。此步驟中，正向引物和反向引物與存在於溶液中的任意靶標的互補區域雜交，以及iii)通常在50-80°C下進行的延伸階段，在此過程中，聚合酶鏈式反應利用溶液中的三磷酸脫氧核苷酸來延伸引物的3'端。通常，該循環進行25-45次。根據某些PCR方案，退火步驟和延伸步驟可以合併，從而使樣品經過90°C至100°C區間，之後50°C至80°C區間的兩步程序。理論計算顯示，30個循環的PCR反應可以將單個靶分子擴增268，435，456倍。因為擴增反應的效率低，實際的擴增可能比這少，但儘管如此，PCR反應通常仍然可以將單個或者極少數的靶分子擴增數百萬倍，從而使靶分子更加容易被檢測。PCR反應依賴於熱穩定DNA聚合酶,例如,分離自嗜熱菌屬水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的Taq聚合酶。其它的熱穩定DNA聚合酶可以取代Taq,例如分離自激烈熱火球古菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu聚合酶，其具有Taq聚合酶所沒有的校對活性，因此是保真度更高的酶。在大部分分子生物學教科書中都能找到聚合酶鏈式反應的綜述，參見(例如)以引用方式併入本文的《基因操作原理-基因工程導論》(Old和Primrose著，BlackwellScience公司)。有大量不同的「PCR程式(PCR format)」。作為基本要求，PCR反應需要被設計為與靶序列的各一側分別雜交的正向引物和反向引物。擴增反應針對兩個引物之間的插入序列進行。可以用非特異的方式來檢測擴增的PCR產物，所述方式只檢測雙鏈核酸的存在(例如，使用插入雙鏈DNA的染料，例如溴化乙錠或SYBR-green)。可選的是，可以通過(例如)在檢測之前先對反應產物進行電泳來分析產物的近似分子量，從而對產物進行半特異性檢測。可選的是，有大量的序列特異性檢測方法，其通常使序列特異性核酸探針與擴增區域雜交，或者使用核酸聚合酶的核酸外切酶活性，並且測量伴隨靶序列的擴增而發生的探針的降解。與通常需要培養和孵育很多天的更傳統的方法相比，基於PCR法的病原體檢測通常具有更快得出結果的優點。PCR的結果可以在幾個小時或更短的時間內得到
發明內容
根據本發明的第一個方面，提供了一種在樣品中檢測來源沙眼衣原體的遺傳物質的方法，該方法包括核酸序列的序列特異性檢測，所述核酸序列包含SEQ ID NO: I或其互補序列中的至少10個連續的核苷酸殘基；SEQ ID NO: I atgaattcaa atatagaata taggcaatat cgtatagatatactgagctgttttatctgc ttgctaatga tggtttggac actagtcagcatcaagctag gagattctct aggaggcatcattcctggat gcttaggatacttactggct aaaaggaagc atcgccgtcc tgtccgctggttcttccttacttttttctt tggcattgcc tctggaatct tccttgtcgt tcttcatcctaagcaaaagt
BB ;其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。根據本發明的第二個方面，提供了一種包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 15中的個數介於17個至34個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t_cactagtcagcatcaagctaggagatt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。可供選擇的是，如果採取提高引物退火溫度的措施，則來自SEQ ID NO: 15的序列可以更短(長度優選介於12個至22個殘基之間，或者19個至29個殘基之間)。根據本發明的第三個方面，提供了一種包含這樣的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於15個至31個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。可供選擇的是，如果採取提高引物退火溫度的措施，則來自SEQ ID N0:16的序列可以更短(長度優選介於10個至20個殘基之間，或者16個至26個殘基之間)。根據本發明的第四個方面，提供了一種包含這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基;SEQ ID NO:4 :ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。可供選擇的是，如果採取提高探針退火溫度的措施，則來自於SEQ ID NO: 4的探針序列可以更短(長度優選介於13個殘基至23個殘基之間)。根據本發明的第五個方面，提供了一種PCR組分，其包含根據本發明的正向PCR弓丨物和根據本發明的反向PCR引物。根據本發明的第六個方面，提供了一種試劑盒，其包括根據本發明的PCR組分，以及進行根據本發明的方法的說明書。 根據本發明的第七個方面，提供了一種在樣品中檢測來源於黑腐堅固桿菌(Pectobacterium atrosepticum)的遺傳物質的方法,該方法包括對包含在黑腐堅固桿菌的染色體中的核酸序列進行序列特異性檢測。分別根據本發明的第八個、第九個和第十個方面，其分別提供了在本發明的第五個方面中定義為「第二正向PCR引物」的正向PCR引物；在本發明的第五個方面中定義為「第二反向PCR引物」的反向PCR引物；以及在本發明的第五個方面中定義為「第二 PCR探針」的PCR探針。本發明還提供了包含本發明第八個、第九個或第十個方面所述的任意一種或多種正向PCR引物、反向PCR引物、或者PCR探針的PCR組分，與PCR反應的一種或多種其它組
分結合。


圖Ia至Ic示出了對實施例所述的質粒靶標擴增子3、5和7進行檢測限(LOD)測定實驗的結果。圖2a至2c示出了對實施例所述的染色體靶標擴增子9、17和18進行檢測限(LOD)測定實驗的結果。圖2d示出了對實施例所述的染色體擴增子17[Mg2+]優化實驗的結果。圖3示出了實施例8所述的染色體擴增子17的實驗結果。圖4示出了內對照引物和內對照DNA對採用雙重PCR產生的沙眼衣原體擴增子的電化學檢測的影響(實施例9)。誤差棒(error bar)表示標準偏差(SD) (n=3)。各個四柱組中的每個誤差棒的圖例與圖5中的相同。圖例「ME17引物+20pg IC DNA」對應於每個四柱組中第一個柱。圖例「ME17引物，無IC DNA」對應於每個四柱組中第二個柱。圖例「ME17和IC引物+200 μ gIC DNA」對應於每個四柱組中第三個柱。圖例「ME17和IC引物，無ICDNA」對應於每個四柱組中第四個柱。圖6a示出了沙眼衣原體擴增產物的電泳凝膠，沒有設置內對照引物組。電泳條帶I=IOObp ladder ；電泳條帶2至4=10，000IFU反應；電泳條帶5至7=1，000IFU反應；電泳條帶8至10=100IFU反應；電泳條帶11至13=10IFU反應；電泳條帶14至16=1IFU反應。圖6b與圖6a相同，但電泳條帶I=IOObp ladder,電泳條帶2至4=無IFU反應。圖7a和圖7b與圖6a和圖6b相同，但反應包含內對照引物組。圖8示出了使用沙眼衣原體(CT，每對的第一個柱)弓丨物SEQ ID NOs 17和19以及內對照(1C，每對的第二個柱)引物組進行雙重擴增的樣品的電化學檢測結果。所有情況都加入了 200pg內對照DNA。誤差棒表示標準偏差(n=3)。圖9示出了實施例10所述的比較雙重實驗的結果。
具體實施方式

定義聚合酶鏈式反應(PCR)如背景技術部分所述，PCR是在分子生物學中廣泛使用的技術，其通過體外酶複製來擴增DNA片段。關於反應過程，早期複製所產生的DNA用作後期複製的模板。這開始了這樣的鏈式反應，其中DNA模板以指數或近似指數的方式擴增。通過PCR，可以將核酸的單個或者極少數的拷貝擴增幾個數量級，從而產生更容易被檢測到的數以百萬計或更多的拷貝。最基本的PCR設置需要以下組分；i)待擴增的DNA模板或者靶標；ii) 一對引物；與靶區域Y末端的DNA區域互補的正向引物，以及與靶區域:V末端的DNA區域互補的反向引物；iii)熱穩定的DNA聚合酶,例如Taq聚合酶；iv)脫氧核苷三磷酸(dNTPs)。這些被用作DNA聚合酶用以合成新的DNA鏈的基本物質；v)適當的緩衝溶液；vi)鎂離子或其它合適的陽離子；vii) —價鉀離子或其它合適的陽離子。存在很多PCR變化形式，例如，多重PCR涉及在單個樣品容器中同時擴增一種以上的靶標。多重PCR包括雙重和三重PCR反應，其涉及多達一打的獨立地發揮作用的引物組。巢式PCR是能夠提高PCR擴增反應的特異性的技術。兩組引物用於兩輪連續的反應。在第一輪反應中，使用一對引物以非完全特異的方式產生DNA產物。然而，第一輪反應增加了靶序列實物。第二輪反應更加特異，其擴增嵌入第一組引物之間的序列。定量PCR(QPCR)用於測量或估計樣品中靶DNA的具體數量。在一些情況下，普通的PCR過程可以被近似的定量，但真正的定量PCR的目的是，只在產物數量真正以指數式增長的階段進行擴增反應或者考察擴增反應的結果，由此避開了後來的擴增平臺期。擴增指數階段的產物數量與靶標的起始數量更加成比例。已經開發出了可以監控擴增時的產物數量的熱循環儀。目前所採用的一種方法是實時定量PCR，其使用螢光染料(例如SYBR-green)或包含螢光基團的DNA探針(例如有專利的TaqMan 體系)在擴增過程中測量擴增產物的數量。熱啟動PCR避免了一個可能發生的問題，在低溫時，引物會和非特異性位點相結合，甚至引物間互相結合。熱啟動PCR是基於這樣的原理，只有當反應溫度足夠高的時候，用於雜交的引物才會釋放，由此來防止或者減少非特異性的引物結合。這項技術可以在加入聚合酶或者在加入引物之前，手動地將反應組分加熱到變性溫度，例如94°C。可供選擇的是，已經開發出專用的體系，其通過(例如)結合一種或多種通過升溫才得以釋放的非活性形式的組分，從而抑制反應直到溫度得到升高。反轉錄PCR (RT-PCR)是用於擴增RNA的方法，其中在PCR反應之前利用反轉錄酶將RNA轉化為cDNA。這兩個反應有足夠的相容性，從而它們能在同一個管中進行，並且能在同一個熱循環設備中進行。甲基化特異性PCR (或MSP)涉及使用亞硫酸氫鈉對靶DNA進行預處理，將未甲基化的胞嘧啶單元轉化為尿嘧啶，該尿嘧啶被DNA引物識別為胸腺嘧啶。使用引物組對經修飾的DNA進行兩種擴增，所述引物組能夠區分經修飾的模板和未經修飾的模板。一組引物組識別具有胞嘧啶的DNA，並且擴增之前未甲基化的DNA ;另一組引物識別具有尿嘧啶或胸腺嘧啶的DNA，從而擴增甲基化的靶標。兩種擴增的相對比例可以用於獲得有關甲基化程度的信息。衣原體靶序列的選擇沙眼衣原體在染色體和質粒中都含有遺傳信息。沙眼衣原體的質粒包含8個開放閱讀框，而且因為它以多個拷貝數存在，其是現有的NAAT檢測法的受人青睞的靶標。然而，發明人發現那些開放閱讀框中的許多都具有很大的變異性。至少在開放閱讀框2、4、7、8中檢測到單核苷酸多態性(SNPs)。開放閱讀框I和3顯示含有插入和缺失。因此決定本發明的核酸檢測的靶序列應當來自於沙眼衣原體的染色體序列。SEQ ID N0:1中被鑑定的假定基因在此被稱為染色體序列17，並且發現其存在於沙眼衣原體的染色體上，發現該假定基因最適合應用於本發明所述的方法中，因為它在沙眼衣原體分離株之間具有低變異性，與 非沙眼衣原體分離株具有低水平的同源性，並且儘管它是單一拷貝，但仍然能通過PCR檢驗令人驚奇地被檢測到，並且有好的檢測限(L0D)，該檢測限至少與質粒靶標一樣好。實施例中提供了選擇用於本發明的優選方面的PCR引物的進一步詳細說明。染色體序列17被認為是假定的膜結合蛋白，但是還沒有得到官方的命名。它在機體中的功能並不重要，但應關注其已經被證實的用於本發明的適用性。根據本發明的第一個方面，提供了一種在樣品中檢測來源於沙眼衣原體的遺傳物質的方法，包括核酸序列的序列特異性檢測，所述核酸序列包含SEQ ID NO: I或其互補序列中的至少10個連續的核酸殘基；SEQ ID NO: I atgaattcaa atatagaata taggcaatat cgtatagatatactgagctgttttatctgc ttgctaatga tggtttggac actagtcagcatcaagctag gagattctct aggaggcatcattcctggat gcttaggatacttactggct aaaaggaagc atcgccgtcc tgtccgctggttcttccttacttttttctt tggcattgcc tctggaatct tccttgtcgt tcttcatcctaagcaaaagt
BB ;其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。根據一些實施方案，優選的是，核酸序列包含SEQ ID NO: I中的至少15個連續的
核酸殘基。根據一些優選的實施方案，可以有1、2、3、或4個殘基的缺失、替換或添加。根據一些優選的實施方案，殘基的替換優選於殘基的缺失和殘基的增加。根據一些優選的實施方案，沒有殘基的替換、缺失或增加。有關進一步突變的相似優選特徵適用於本發明的其他方面。優選的是，所述序列特異性缺失包括進行核酸雜交的步驟。優選的是，所述序列特異性缺失包括進行核酸雜交的步驟，之後進行核酸雜交檢測的步驟。核酸雜交的檢測檢測核酸雜交的方法包括以非序列特異性方式檢測核酸雜交的方法。這些方法包括使用插入核酸的染料，例如，溴化乙錠或SYBR-Green。當這些染料結合到雙鏈核酸上時，它們的螢光信號會增強，從而可以通過標準螢光探測系統檢測到。根據可供選擇的實施方案，檢測核酸雜交的方法可以是序列特異性方法，例如，標記探針。一種或多種標記探針能夠以序列特異性方式與靶序列雜交，或者靶序列可以通過與固定化的互補序列(例如，在DNA陣列或「晶片」上)雜交而被檢測到。核酸探針可以是螢光標記的、放射標記的、酶標記的，或者根據本發明的一些優選實施方案，可以是電化學標記的。特別優選這樣的電化學標記法，其使用本文所公開的電化學標記物。根據一些優選實施方案，在樣品中檢測來源於沙眼衣原體的遺傳物質的方法包括，使來源於沙眼衣原體的遺傳物質與核酸序列雜交，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中的至少15個連續的核酸殘基；
SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。根據一些實施方案，有1、2、3、或4個殘基的添加、缺失或者替換。根據一些優選實施方案，所述方法包括使來源於沙眼衣原體的遺傳物質與這樣的核酸序列雜交，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互補序列中的序列；SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act ；其中所述核酸序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。根據一些優選的實施方案，進一步的突變如上所述。根據一些優選的實施方案，利用PCR、轉錄介導的擴增、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、解旋酶依賴性擴增、重組酶聚合酶擴增、鏈置換擴增、或環介導等溫擴增進行所述核酸的擴增，然後進行序列特異性檢測。通過使用其中序列特異性檢測是基於擴增待測核酸的檢測方法，該檢測方法可以獲得較高的敏感度和特異性。優選的是，序列特異性檢測方法基於對待測核酸進行擴增，該擴增利用PCR進行。聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物。根據本發明第一個方面的一些優選實施方案，所述聚合酶鏈式反應涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，其中a)所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 15中的個數介於17個至34個之間(例如個數介於24個至34個之間)的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t_cactagtcagcatcaagctaggagatt ；並且b)所述反向PCR引物包含這樣核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於15個至31個之間(例如個數介於21個至31個之間)的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ；或者其中所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分b)中所限定的反向弓I物的互補序列，並且所述反向PCR弓丨物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分a)中所限定的正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添力口、缺失或替換而發生進一步突變。例如，所述聚合酶鏈式反應可以涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，其中；a)所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:2中的個數介於17個至27個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:2 ttggacacta gtcagcatca agctaggaga tt ；並且b)所述反向PCR引物包含這樣核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:3中的個數介於15個至25個之間的連續核苷酸殘基；a)SEQ ID NO:3 :gaagattcca gaggcaatgc caaagaaaaa ；或者其中所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分b)中所限定的反向弓I物的互補序列，並且所述反向PCR弓丨物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分a)中所限定的正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添
進一步的突變可以如上文所述。在一些實施方案中，正向PCR引物可以如本發明的第二個方面所限定的那樣，反向PCR引物可以如本發明的第三個方面所限定的那樣。根據一些優選的實施方案，正向PCR引物包含具有在SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18或SEQ ID N0:6中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:6 cactagtcag catcaagcta gg ；SEQ ID NO:17 caaacctcac tagtcagcat caagctagg ；SEQ ID NO:18 gtttggacac tagtcagcat caagctagg ；並且反向PCR引物包含具有在SEQ ID N0:19或SEQ ID N0:7中所提供的序列的
核酸；SEQ ID NO:7 ttccagaggc aatgccaaag ；SEQ ID NO:19 agattccaga ggcaatgcca aagaaa。根據一些實施方案，PCR引物中的一者或者兩者可以被標記，從而幫助雜交的檢測。標記物可以是螢光標記物、放射性標記物、酶活性標記物或者電化學活性標記物。可以這樣設置引物和標記物，使其檢測信號在雜交之後或在降解之後增強，所述降解通過PCR反應中所使用的DNA聚合酶的外切酶活性進行。例如，標記物可以被應用到PCR引物中，該引物上還添加了淬滅基團。PCR引物的降解會導致淬滅基團與標記物彼此分離，並且標記物上的淬滅劑的淬滅活性會降低。核酸探針Mt核酸探針可以用於以序列特異性方式檢測PCR反應的產物。通常，這種探針被設計為在引物退火的位置之間的位置與靶序列退火。可以標記探針來幫助檢測，例如，螢光基團、放射性標記物、電化學活性標記物或者酶標記物。標記物可以直接或者通過連接基團與核酸連接。本發明所述探針特別適合TaqMan PCR程式。TaqMan是可購自LifeTechnologies公司的實時定量PCR方法。在TaqMan程式中，對擴增實驗階段的PCR產物的積聚進行實時測量。這是為了確定臨界循環次數，即檢測到達信號臨界水平處的PCR循環數。Taqman程式中的PCR探針是被螢光標記的，並且與DNA模板在兩個引物之間的大約20個至60個核苷酸的片段互補。適用於Taqman體系的突光標記物包括6_羧基突光素(FAM)或四氯突光素(TET)。Taqman探針通常標記有上述突光基團，並且還標記有淬滅分子,例如四甲基羅丹明(TAMRA)。螢光基團和淬滅劑的緊密接近會抑制螢光染料的螢光。然而在PCR反應的引物延伸階段，Taq聚合酶也表現出5'至3'核酸外切酶活性，其可以降解已經與模板退火的探針部分。探針降解從而釋放出螢光染料。螢光染料不再與淬滅劑緊密接近，於是淬滅效果降低，螢光染料所釋放出的螢光型號增強，由此可以被檢測到。根據本發明的一些實施方案，聚合酶鏈式反應涉及使用包含這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基；SEQ ID N0:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ；其中所述序列可以通過上述至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
根據一些實施方案，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4中所提供的個數介於19個至27個之間的核酸殘基，更優選個數介於20個至26個之間的核酸殘基，進一步優選個數介於21個至25個之間的核酸殘基，更進一步優選個數介於22個至24個之間的核酸殘基，最優選為23個核酸殘基。優選的是，核酸探針包含SEQ ID NO: 5中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act。根據一些實施方案，核酸探針可以帶有(例如)螢光標記物、放射性標記物、酶標記物、或更加優選為電化學活性標記物。特別優選為本文所公開的電化學活性標記物。根據本發明的第二個方面，提供了包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 15中的個數介於17個至34個之間(例如24個至34個之間)的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t_cactagtc agcatcaagctaggagatt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。根據一些實施方案，提供了包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:2中的個數介於17個至27個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:2 ttggacacta gtcagcatca agctaggaga tt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。 根據一些實施方案，提供了包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:20中的個數介於24個至34個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:20 tgatgcaaac ctcactagtc agcatcaagc taggagatt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。根據一些實施方案，提供了包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID N0:21中的個數介於24個至24個之間的連續核苷酸殘基。SEQ ID NO:21 tgatggtttg gacactagtc agcatcaagc tagg agatt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。
根據一些實施方案，所述核酸序列包含個數介於18個至26個之間、19個至25個之間、20個至24個之間、21個至23個之間的殘基，最優選為22個殘基(或者個數介於25個至33個之間、26個至32個之間、27個至31個之間、28個至30個之間的殘基)，最優選為29個殘基。根據一些優選的實施方案，正向引物包含具有SEQID NO: 17, SEQ ID N0:18或SEQ IDNO: 6中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:6 cactagtcag catcaagcta gg ；SEQ ID NO:17 caaacctcac tagtcagcat caagctagg ；SEQ ID NO:18 gtttggacac tagtcagcat caagctagg。
根據本發明的第三個方面，提供了包含這樣的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於15個至31個之間(例如21個至31個之間)的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。根據一些實施方案，提供了包含這樣的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:3中的個數介於15個至25個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:3 gaagattcca gaggcaatgc caaagaaaaa ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，所述進一步突變如上文所述是任選的。根據一些實施方案，核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於22個至30個之間的連續核苷酸殘基。更加優選個數介於23個至29個之間，更優選個數介於24個至28個之間，更加優選個數介於25個至27個之間的殘基，最優選為26個殘基。根據一些實施方案，核酸序列包含選自SEQ ID NO: 3中的個數介於16個至24個之間的連續核苷酸殘基。更加優選介於17個至23個之間，更優選介於18個至22個之間，更加優選介於19個至21個之間的殘基，最優選為20個殘基。根據一些實施方案，殘基的添加、缺失、替換的數量和類型可以參照上文正向PCR引物中所述的那樣。根據一些優選的實施方案，反向PCR引物包含SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 7中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:7 ttccagaggc aatgccaaag ；SEQ ID NO:19 agattccaga ggcaatgcca aagaaa。根據本發明的第四個方面，提供了包含這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基；SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。殘基的添加、缺失、替換的數量和類型可以參照上文本發明的引物中所述的那樣。根據一些優選的實施方案，所述核酸探針包含來自SEQ ID N0:4中的個數介於18個至27個之間，19個至26個之間，20個至25個之間，21個至24個之間，22個至23個之間的殘基，最優選為23個殘基。
根據一些優選的實施方案，本發明的核酸探針包含SEQ ID N0:5中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act。根據本發明的第五個方面，提供了一種PCR組分，其包含本發明的正向PCR弓丨物和反向PCR引物。根據一些優選的實施方案，PCR組分還包含本發明所述的核酸探針。內對照通常PCR檢驗或相似檢驗的內對照由單鏈DNA寡核苷酸組成。這些內對照可以簡單的製備並固定到樣品載體上，或加入PCR反應組分中。但是，在本發明的方法之前，可以進行樣品製備步驟，其可以包括純化原體或純化臨床上獲得的含衣原體的材料，以及純化它們的基因組DNA。許多市售可得的DNA純化方法和試劑盒都是可用的，例如Promega Wizard體系。這些細菌裂解和DNA純化體系涉及使用含離液鹽的溶液，使DNA與膜(例如，矽基膜)結合，之後去除其餘的裂解物，並清洗以除去雜質。之後從膜上回收純化的細菌基因組DNA，從而用於下遊的檢測檢驗，例如根據本發明的第一個方面所述的檢驗。這種純化方法不大可能共純化基於短的單鏈DNA寡核苷酸的內對照序列。例如,Promega Wizard試劑盒聲明它們的純化方案的截留量為50kb大小。因此發明人認識到，提供可以與樣品中的衣原體基因組DNA共純化的內對照是有利的。可能的解決方案是，使用來自與另一細菌物種的基因組DNA作為內對照，該基因組DNA是在分離衣原體的基因組DNA所需的分離條件下，使用相同的裂解液而得到。出於安全考慮，理想的是內對照的來源應該來自非致病菌。此外，其應當通常不容易在人體中發現，並且容易在實驗室中培養。本發明涉及使用來源於黑腐堅固桿菌(Pectobacterium atrosepticum)的基因組DNA作為內對照。這是因為黑腐堅固桿菌是可培養的、廣泛可得的，並且從其分離出的DNA易於與來自於衣原體的DNA進行共純化。它只有一條染色體並且具有許多在該物種中獨有的基因。此外，沒有關於人類感染此物種(該物種是植物病原體，可以導致溫帶馬鈴薯的軟腐病(soft rot)和黑胚病(black leg))的報導案例,這意味著不大可能在解剖部位或臨床樣品中發現該物種。為了避免疑慮，應當指出，黑腐堅固桿菌以前被稱為胡蘿蔔軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種(Erwinia carotovora subsp. Atroseptica)。根據一些優選的實施方案,根據本發明的第五個方面，PCR組分還包含作為陽性內對照的來自黑腐堅固桿菌的基因組DNA。優選的是，其為菌株ATCCBAA-672。本發明的PCR組分優選包含第二正向PCR引物和第二反向PCR引物，其中所述引物被設計為與存在於SEQ ID N0:8或其互補的核酸序列中的核酸序列雜交；SEQ ID NO:8 :ctaccgtgta gggtcatagg cattgacctc atggctccacggaatcgtgcgatcgtcaac tgcgacgtgc cattcacagt gcgtaagagcaccgcgaatc tcggataaac actggcaccagtgctgtacg ccaatccagattgcttcttc ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccggagagcacgatccctttcctaa agacgttacc gattttcaca ttgagggcga aatcaaaggattcccagttcaggcctgtac ccgtcgtcag atatttctca atttggtcattaacagaatg gcgttggacg atctccttcacggcagatat ctctttctggctcagggatt ttttacgtcg agcggtgtaa tagagcgaaa ttgccac ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，其數量和類型如上文本發明的第一個和第二個方面的PCR引物中所述的那樣。第二正向PCR引物優選包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO:9中的個數介於13個至23個之間的連續核酸殘基；SEQ ID NO:9 ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg ；第二反向PCR引物優選包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ IDNO: 10中的個數介於15個至25個之間的連續核酸殘基；
SEQ ID NO:10 acaggcctga actgggaatc ctttgatttc ；可供選擇的是，所述第二正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述反向引物的互補序列，並且所述第二反向PCR弓丨物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，其數量和類型如上文本發明的第一個和第二個方面的PCR引物中所述的那樣。第二正向PCR引物優選包含選自SEQ ID N0:9中的個數介於14個至22個之間的連續核酸殘基，更優選介於15個至21個之間，更加優選介於16個至20個之間，更加優選介於17個至19個之間，最優選為選自SEQ ID NO:9中的18個連續的核酸殘基。第二反向PCR引物優選包含選自SEQ ID NO: 10中的個數介於16個至24個之間的連續的核酸殘基，更優選介於17個至23個之間，更加優選介於18個至22個之間，更加優選介於19個至21個之間，最優選為選自SEQ ID NO: 10中的20個連續的核酸殘基。根據一些優選的實施方案，第二正向PCR引物包含SEQ ID N0:11中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:11 tgtcgggaag tttggttg ；並且，第二反向PCR引物包含具有SEQ ID NO: 12中所提供的序列的核酸。SEQ ID NO:12 cctgaactgg gaatcctttg。根據一些實施方案，PCR組分包含具有這樣的核酸序列的第二核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 13或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基，更加優選介於19個至27個之間，更加優選介於20個至26個之間，更加優選為介於21個至25個之間，更加優選介於22個和24個之間，最優選為23個核酸殘基；SEQ ID NO:13 ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc ；其中所述核酸序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，其類型和數量如上文本發明的第三個方面所述的第一核酸探針中所述的那樣。根據一些優選的實施方案，核苷酸探針包含SEQ ID NO: 14中所提供的核酸序列；SEQ ID NO: 14 gcacgatccc tttcctaaag acg。在當檢測沙眼衣原體的產物和方法不在的情況下，本發明還涉及關於包含黑腐堅固桿菌的內對照的產物和方法(即用作檢測來源於沙眼衣原體以外的核酸的內對照)。具體而言，本發明涉及正向PCR引物，還涉及第二 PCR引物，其中所述引物被設計為與黑腐堅固桿菌基因組DNA中所發現的靶核酸序列雜交。優選的是，引物被設計為與核酸序列SEQ IDN0:8或其互補序列中所發現的靶核酸序列雜交；SEQ ID NO:8 ctaccgtgta gggtcatagg cattgacctc atggctccacggaatcgtgcgatcgtcaac tgcgacgtgc cattcacagt gcgtaagagcaccgcgaatc tcggataaac actggcaccagtgctgtacg ccaatccagattgcttcttc ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccggagagcacgatccctttcctaa agacgttacc gattttcaca ttgagggcga aatcaaaggattcccagttcaggcctgtac ccgtcgtcag atatttctca atttggtcattaacagaatg gcgttggacg atctccttcacggcagatat ctctttctggctcagggatt ttttacgtcg agcggtgtaa tagagcgaaa ttgccac ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，添力口、缺少或替換的類型和數目如本說明書其它地方所述的那樣。第二正向PCR引物和第二反向PCR引物的進一步的特徵可以優選如本發明其它方面中所定義的那樣。本發明還設計了一種用於檢測黑腐堅固桿菌陽性內對照的核酸探針，該核酸探針具有本發明其它方面所定義的特徵。本發明還設計了一種檢測來自包含黑腐堅固桿菌的陽性內對照的信號的方法，包括使用黑腐堅固桿菌引物、任選的探針，並且結合本文所公開的其它方法的任意特徵。優選在檢測來自包含黑腐堅固桿菌的陽性內對照的信號的方法之前，進行這樣的方法利用上文所述的離液鹽和任選的矽基膜，從含有完整的黑腐堅固桿菌細菌細胞裂解物中獲得基因組DNA。
試劑盒根據本發明的第六個方面，提供了一種試劑盒，該試劑盒包含根據本發明第五個方面所述的PCR組分，或根據本發明第八個、第九個或第十個方面所述PCR引物或探針，以及進行本發明第一個方面所述方法的說明書。試劑盒可以含有進一步的組分，例如樣品容器、包裝、PCR酶、擴增前體、樣品管或者檢測工具。陽性內對照根據一些優選的實施方案，本發明的第五個方面所述PCR組分還包含用作陽性內對照的來源於黑腐堅固桿菌的基因組DNA。檢測方法可以如本發明其它方面所述，或者可以涉及使用本發明其它方面所述的化合物或產物。根據本發明的第七個方面，提供了一種在樣品中檢測來自於黑腐堅固桿菌的遺傳物質的方法，包括對包含在黑腐堅固桿菌的染色體中的核酸序列進行序列特異性檢測。所述方法可以包括本發明其它方面所公開的任意特徵，並且可以任選地進一步包括從樣品中提取基因組DNA，所述基因組DNA為黑腐堅固桿菌的基因組DNA (任選地引入樣品中作為內對照)。所述提取可以伴隨從第二目標生物體(例如病原菌)中提取基因組DNA。分別根據本發明的第八個、第九個和第十個方面，分別各自提供了正向PCR引物，該正向PCR引物根據本發明的第五個方面被定義為「第二正向PCR引物」；反向PCR引物，該反向PCR引物根據本發明的第五個方面被定義為「第二反向PCR引物」;PCR探針，該PCR探針根據本發明的第五個方面被定義為「第二 PCR探針」。本發明還提供了 PCR組分，其包含根據本發明的第八個、第九個、或第十個方面所述的任意一種或多種正向PCR引物、反向PCR引物或PCR探針，以及PCR反應的一種或多種其它組分。本發明的第一個至第六個方面所述的優選或任選特徵可以任選地併入本發明的第七個至第十個方面以及其它方面。標記物可以將探針和/或引物連接到標記物上，從而幫助它們的檢測。標記物可以是放射性的、酶活性的、螢光活性的或電化學活性的。根據以下實施方案，其中具有用於檢測來源於沙眼衣原體的核酸的組分，也具有用於檢測來源於陽性內對照的核酸的組分的實施方案，或者其中具有同時檢測兩種核酸的方法的實施方案，所述標記物用於幫助檢測陽性內對照和檢測來自於沙眼衣原體的核酸，該標記物優選能夠彼此區分開，例如，它們可以是不同的螢光染料，或者它們可以是不同的電化學活性劑或能夠提供電化學可區分活性的電化學活性標記物。本發明特別適合使用電化學標記的探針和/或引物。特別地，電化學標記物可以包括含有金屬-碳環η配合物的那些，它們為帶有部分或全部離域η電子的有機配合物。合適的標記物包括包含夾層化合物(其中兩個碳環平行)、以及包含彎曲夾層化合物(角狀化合物)(bent sandwiches (angular compounds))和單環戍二烯的那些。優選的是，電化學活性標記物為金屬茂基標記物。更加優選為二茂鐵基標記物。用於本發明的探針的二茂鐵基和金屬茂基可以有利地為N-取代的二茂鐵甲醯胺或金屬茂甲醯胺。構成標記部分的二茂鐵環或金屬茂環可以是未被取代的。如果需要，二茂鐵環或金屬茂環可以被一個或多個取代基取代，選擇所述取代基的性質和位點從而按所需的方式來影響二茂鐵或金屬茂部分的氧化還原特性。二茂鐵環或金屬茂環可以額外地被任意環狀取代基取代，或作為替代的方式被任意環狀取代基取代，這些取代基不會顯著降低標記物的電化學敏感性。二茂鐵甲醯胺或金屬茂甲醯胺部分可以通過氨甲醯氮與核苷酸或寡核苷酸連接。優選通過核苷酸的磷酸基團或鹼基來與核苷酸或寡核苷酸連接。兩種連 接方法均允許通過寡核苷酸的長度方向上的任意核苷酸而連接標記物。然而，如果通過磷酸基團進行連接，則可有利地通過3'或5'末端的磷酸基團進行連接，從而將該連接在空間上阻礙寡核苷酸的沃森-克裡克(Watson-Crick)雜交或影響核酸酶活性的可能性降到最低。預計通過不參與沃森-克裡克鹼基配對的鹼基區域進行連接幾乎不會對所述鹼基配對造成破壞。因此通過鹼基進行的連接可能更適合在非末端寡核苷酸位點進行標記。標記寡核苷酸可以在寡核苷酸和標記部分之間具有接頭部分。優選地，被標記的寡核苷酸具有二茂鐵基標記部分，其通過接頭部分連接到寡核苷酸上。可以使用任意合適的接頭部分。合適的接頭部分可以包含脂肪鏈，所述脂肪鏈可以是直鏈或支鏈的，飽和的或非飽和的。有利的是，接頭部分是具有4至20個碳原子的直鏈或支鏈脂肪鏈，優選具有6至16個碳原子，特別優選具有8至14個碳原子，更加特別優選為12個碳原子。亞烷基鏈可以被任意取代基取代，或者可以被任意原子或基團中斷，這些任意的取代基、原子或基團不會顯著降低標記物的電化學敏感性。本發明可以使用的二茂鐵基標記物的示例為式I至III中所示的那些。式Ia至IIIa的分子是被相應的二茂鐵基標記物所標記的寡核苷酸。式IV示出了可以通過核苷酸鹼基連接的二茂鐵基標記物，為了示例的目的，式IV中包含氨基修飾的胸腺嘧啶鹼基。
權利要求
1.一種在樣品中檢測來源於沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的遺傳物質的方法，該方法包括對核酸序列進行序列特異性檢測，所述核酸序列包含SEQ ID NO: I或其互補序列中的至少10個連續的核苷酸殘基；SEQ ID NO: I atgaattcaa atatagaata taggcaatat cgtatagatatactgagctg ttttatctgc ttgctaatga tggtttggac actagtcagcatcaagctag gagattctct aggaggcatc attcctggat gcttaggatacttactggct aaaaggaagc atcgccgtcc tgtccgctgg ttcttccttacttttttctt tggcattgcc tctggaatct tccttgtcgt tcttcatcctaagcaaaagt aa ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述序列特異性檢測包括進行核酸雜交步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述序列特異性檢測包括進行核酸雜交步驟，之後進行核酸雜交檢測步驟。
4.根據權利要求2或3所述的方法，所述核酸序列包含SEQID NO: I中的至少15個連續的核苷酸殘基。
5.根據權利要求4所述的方法，該方法包括使來源於沙眼衣原體的遺傳物質與這樣的核酸序列雜交，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中的至少15個連續的核苷酸殘基;SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
6.根據權利要求5所述的方法，該方法包括使來源於沙眼衣原體的遺傳物質與這樣的核酸序列雜交，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 5或其互補序列中的序列；SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
7.根據權利要求2或3所述的方法，該方法包括使來源於沙眼衣原體的遺傳物質與這樣的核酸探針雜交，所述核酸探針包含SEQ ID N0:4或其互補序列中的至少10個連續的核苷酸殘基；SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，並且其中所述核酸探針包含小溝結合部分或其中所述核酸探針為鎖核酸(LNA)。
8.根據權利要求I至7中任意一項所述的方法，其中對所述待測核酸進行擴增後進行所述序列特異性檢測方法，利用聚合酶鏈式反應、轉錄介導的擴增、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、解旋酶依賴性擴增、重組酶聚合酶擴增、鏈置換擴增、或環介導等溫擴增對所述待測核酸進行擴增。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述序列特異性檢測方法包括聚合酶鏈式反應。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述聚合酶鏈式反應涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，並且其中 a)所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID N0:15中的個數介於17個至34個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t_cactagtcagcatcaagctaggagatt ； 並且 b)所述反向PCR引物包含這樣核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQ ID N0:16中的個數介於15個至31個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ； 或者其中所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分b)中所限定的反向引物的互補序列，並且所述反向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分a)中所限定的正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述正向PCR引物包含具有在SEQID NO: 17、 SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:6中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:6 cactagtcag catcaagcta gg ；SEQ ID NO:17 caaacctcac tagtcagcat caagctagg ；SEQ ID NO:18 gtttggacac tagtcagcat caagctagg ； 並且其中所述反向PCR引物包含具有在SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:7中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:7 ttccagaggc aatgccaaag ；SEQ ID NO: 19 agattccaga ggcaatgcca aagaaa。
12.根據權利要求9或11所述的方法，其中所述聚合酶鏈式反應涉及使用具有這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基；SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述核酸探針包含SEQID NO:5中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act。
14.根據權利要求9所述的方法，其中所述聚合酶鏈式反應涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，並且其中 a)所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQID NO: 15中的個數介於12個至29個之間或19個至29個之間的連續核苷酸殘基； SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t-cactagtcagcatcaagctaggagatt ； 並且 b)所述反向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQID NO:16中的個數介於16個至26個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ； 或者其中所述正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分b)中所限定的反向引物的互補序列，並且所述反向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分a)中所限定的正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，並且其中所述引物包含小溝結合部分或其中所述引物為鎖核酸(LNA)。
15.一種包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 15中的個數介於17個至34個之間的連續核苷酸殘基； SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t-cactagtcagcatcaagctaggagatt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
16.根據權利要求15所述的正向PCR引物，其包含SEQID NO: 17,SEQ ID N0:18或SEQID NO:6中所提供的核酸；SEQ ID NO:6 cactagtcag catcaagcta gg ；SEQ ID NO:17 caaacctcac tagtcagcat caagctagg ；SEQ ID NO:18 gtttggacac tagtcagcat caagctagg。
17.—種包含這樣的核酸序列的反向PCR引物,所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於15個至31個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
18.根據權利要求15所述的反向PCR引物，其包含SEQID NO: 19或SEQ ID NO: 7中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:7 ttccagaggc aatgccaaag ；SEQ ID NO:19 agattccaga ggcaatgcca aagaaa。
19.一種包含這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基；SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
20.根據權利要求19所述的核酸探針，其包含SEQID NO:5中所提供的核酸序列； SEQ ID NO:5 ctgtccgctg gttcttcctt act。
21.一種包含這樣的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 15中的個數介於19個至29個之間的連續核苷酸殘基 SEQ ID NO:15 :tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t_cactagtcagcatcaagctaggagatt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變； 或者一種包含這樣的核酸序列的反向PCR引物,所述核酸序列包含選自SEQ ID NO: 16中的個數介於16個至26個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 16 aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變； 或者一種包含這樣的核酸序列的核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID N0:4或其互補序列中所提供的個數介於13個至23個之間的核酸殘基；SEQ ID NO:4 ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt ；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變； 並且其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物和所述核酸探針包含小溝結合部分，或者其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物和所述核酸探針為鎖核酸(LNA)。
22.根據權利要求15、16或21所述的正向PCR引物，根據權利要求17、18或21所述的反向PCR引物，或者根據權利要求19、20或21所述的核酸探針，其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物或所述核酸探針與電化學活性標記物結合。
23.—種PCR組分，其包含權利要求15、16或21中所限定的正向PCR引物，以及權利要求17、18或21中所限定的反向PCR引物。
24.根據權利要求23所述的PCR組分，其還包含權利要求19、20或21中所限定的核酸探針。
25.根據權利要求23或24所述的PCR組分，其還包含用作陽性內對照的來源於黑腐堅固桿菌(Pectobacterium atrosepticum)的基因組 DNA。
26.根據權利要求25所述的PCR組分，其中所述黑腐堅固桿菌為ATCCBAA-672菌株。
27.根據權利要求23至26中的任意一項所述的PCR組分，其還包含第二正向PCR引物和第二反向PCR引物，其中所述引物被設計為與包含於SEQ ID N0:8或其互補的核酸序列中的靶核酸序列雜交；SEQ ID NO:8 ctaccgtgta gggtcatagg cattgacctc atggctccacggaatcgtgc gatcgtcaac tgcgacgtgc cattcacagt gcgtaagagcaccgcgaatc tcggataaac actggcacca gtgctgtacg ccaatccagattgcttcttc ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccgga gagcacgatccctttcctaa agacgttacc gattttcaca ttgagggcga aatcaaaggattcccagttc aggcctgtac ccgtcgtcag atatttctca atttggtcattaacagaatg gcgttggacg atctccttca cggcagatat ctctttctggctcagggatt ttttacgtcg agcggtgtaa tagagcgaaa ttgccac ； 其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
28.根據權利要求27所述的PCR組分，其中 a.所述第二正向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQID NO:9中的個數介於13個至23個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID N0:9 ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg ； 並且 b.所述第二反向PCR引物包含這樣的核酸序列，所述核酸序列包含選自SEQID NO: 10中的個數介於15個至25個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 10 acaggcctga actgggaatc ctttgatttc ； 或者其中所述第二正向PCR引物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分b)中所限定的反向弓I物的互補序列，並且所述第二反向PCR弓丨物包含這樣的核酸序列，該核酸序列為上述部分a)中所限定的正向引物的互補序列；其中所述序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
29.根據權利要求28所述的PCR組分，其中所述第二正向PCR引物包含具有SEQIDNO: 11中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:11 tgtcgggaag tttggttg ； 並且其中所述第二反向PCR引物包含具有SEQ ID N0:7中所提供的序列的核酸；SEQ ID NO:12 cctgaactgg gaatcctttg。
30.根據權利要求27所述的PCR組分，其中下述未限定的所述第二正向PCR引物或所述反向PCR引物如權利要求29所限定的那樣，但其中所述引物中的至少一種為 a)包含這樣的核酸序列的第二正向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQID NO:9中的個數介於8個至18個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO:9 ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg ； 並且 b)包含這樣的核酸序列的所述第二反向PCR引物，所述核酸序列包含選自SEQIDNO: 10中的個數介於10個至20個之間的連續核苷酸殘基；SEQ ID NO: 10 acaggcctga actgggaatc ctttgatttc ； 其中所述核酸序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，並且其中所述引物包含小溝結合部分，或者其中所述引物為鎖核酸(LNA)。
31.根據權利要求25至30中任意一項所述的PCR組分，其中所述聚合酶鏈式反應涉及使用包含這樣的核酸序列的第二核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 13或其互補序列中所提供的個數介於18個至28個之間的核酸殘基；SEQ ID NO: 13 ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc ； 其中所述核酸序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變。
32.根據權利要求31所述的PCR組分，其中所述核酸探針包含SEQID NO: 14中所提供的核酸序列；SEQ ID NO:14 gcacgatccc tttcctaaag acg。
33.根據權利要求25至30中任意一項所述的PCR組分，其中所述聚合酶鏈式反應涉及使用包含這樣的核酸序列的第二核酸探針，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 13或其互補序列中所提供的個數介於13個至23個之間的核酸殘基；SEQ ID NO: 13 ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc ； 其中所述核酸序列可以通過至多5個殘基的添加、缺失或替換而發生進一步突變，並且其中所述核酸探針包含小溝結合部分，或者其中所述核酸探針為鎖核酸。
34.一種包含權利要求23至33中的任意一項所述PCR組分的試劑盒以及進行權利要求i至14中的一者所述方法的說明書。
35.一種在樣品中檢測來源於黑腐堅固桿菌的遺傳物質的方法，該方法包括對黑腐堅固桿菌的染色體中所包含的核酸序列進行序列特異性檢測。
全文摘要
本發明涉及一種檢測來源於沙眼衣原體的遺傳物質的方法，該方法包括檢測特定的核酸序列，所述方法任選地使用特異性引物和探針，並且任選地結合對來源於黑腐堅固桿菌的遺傳物質進行檢測，該遺傳物質作為內對照；本發明還涉及相關的產品和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102985559SQ201080063997
公開日2013年3月20日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者大衛·皮爾斯, 馬克·恩賴特 申請人:阿特萊斯遺傳學有限公司