旋轉式組織應力培養系統及方法
2023-10-10 19:00:19
專利名稱：旋轉式組織應力培養系統及方法
技術領域：
本發明涉及生物組織工程，尤其涉及一種旋轉式旋轉式組織應力培養系統及方 法，該系統設有一個培養室，可用於培養三維組織。
背景技術：
近年來，旋轉生物反應器系統(RCCS)已經成為應用微載體技術進行細胞大規模擴 增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基於美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設 計的一種生物反應器。RCCS既可以用於微載體大規模細胞培養，又能在其內培育細胞與支 架形成的三維空間複合體。至今，近百種組織細胞均在該系統內成功進行了大規模擴增。RCCS具有一定局限性。首先，RCCS的結構設計和工作原理決定了其培養對象只 能是各相同性的組織和器官，如軟骨、肝、肺及腫瘤等，且所培養的組織體積有限制。其次， RCCS可以選擇的支架材料有限，只能選擇一些質地較輕的物質，如聚合物、膠原等，較重的 支架材料，如羥基磷灰石、鈦合金等不能用於該系統的培養。最後，用RCCS進行較長時間的 工程化組織和器官培養，其中細胞能否長期保證其表型和分化特徵，以及培養「成熟」的組 織和器官植入體內的營養、血供等問題都有待解決，並且RCCS中培養的組織是不能形成血 管的。
發明內容
本發明的目的是提供旋轉式組織應力培養系統，該系統對於各相異性的組織和器 官的培養提供了一個微重力環境，幾乎任何材料都可以作為RTSCS的支架材料，可以建立 一個血管網絡，作為組織培養的營養供給，它可以模仿真正的血管，並可以將不同的種子細 胞種植到血管網絡的不同位置。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種旋轉式組織應力培養系統，包 括支架，支架上安裝有培養液瓶、多岐接頭、氧交換器、去泡器、恆流泵、培養液壓力室、多通 道旋轉接頭、轉瓶機、蠕動泵、廢液瓶、轉瓶液壓室、單通道旋轉接頭、控制單元，所述多岐接 頭有三個閥門稱為第一閥門、第二閥門和第三閥門，所述第二閥門的進口連接第三閥門的 進口，所述第二閥門的出口連接第一閥門的出口並且同時連接到所述氧交換器，所述第一 閥門的進口連接所述培養液瓶，所述第三閥門的出口連接所述廢液瓶，所述氧交換器通過 底部管路從去泡器的頂部接入去泡器，所述去泡器的底部通過恆流泵與培養液壓力室連 接；所述多通道旋轉接頭內部設有多條通路，每條通路在多通道旋轉接頭的一個端面和側 壁上設有對應的連接口，其中，所述多通道旋轉接頭側壁上的兩個連接口接出兩條管路，第 一條管路通過電子壓力表連接到多岐接頭的第二閥門的進口上，第二條管路通過另一個電子壓力表、電磁閥與培養液壓力室下端連接，在第二條管路上設有種子細胞注入口 ；所述轉 瓶機兩端分別設有頂蓋和底蓋，轉瓶機頂蓋與多通道旋轉接頭連接，所述轉瓶機底蓋與單 通道旋轉接頭連接，轉瓶機內為一個空腔，空腔內設置有培養室，所述培養室通過密封環與 多通道旋轉接頭主通路連接；所述轉瓶液壓室與單通道旋轉接頭連接，所述控制單元控制 信號分別與轉瓶機、蠕動泵、恆流泵、電磁閥連接。所述支架包括一塊平板，在平板一邊折彎形成90度形成一塊豎直的平板，所述支 架平板上設有吊臂。所述多通道旋轉接頭側壁上另有兩個連接口連接一個管路，所述管路置入蠕動 泵，所述管路上設有種子細胞注入口。所述氧交換器的頂部設有風扇，所述氧交換器的底部為漏鬥形。所述去泡器頂部設有密封蓋，所述密封蓋設有兩個開口，一個開口為與氧交換器 連接導管的入口，所述導管底部橫向彎折；另一個開口與一個閥門連接，所述閥門連接一個 濾膜；所述去泡器上標有刻度，所述去泡器的底部為漏鬥形。所述培養液壓力室內壁為光滑圓柱形，頂部設有密封蓋，所述密封蓋下部連接一 根彈簧，彈簧底部連接一個活塞，培養液壓力室的底部為漏鬥形。所述轉瓶液壓室頂部設有設有排氣口，排氣口上設有一個頂部閥門，所述頂部閥 門為排氣閥門；在轉瓶液壓室側面設有高低兩處開口，兩個開口上分別設有閥門，所述高處 開口為轉瓶液輸入端，所述低處開口與單通道旋轉接頭連接；所述轉瓶液壓室內部設有一 個活塞，所述活塞與螺杆連接，所述螺杆套有可旋轉的螺母，所述螺母設置在液壓室底部。一種旋轉式組織應力培養方法包括將一個製作好的培養室放入轉瓶機；將膠原 加殼聚糖、膠原加粘多糖膠支架原材料灌注到培養室內；轉瓶機開始轉動，將種子細胞從種 子細胞注入口注入；開啟蠕動泵；其特徵在於；所述方法還包括從轉瓶液壓力室通過單通 道旋轉接頭向轉瓶機的空腔內中注入轉瓶液，轉瓶液將培養室託住，使培養室處於懸浮狀 態。本發明與已有技術相比具有如下優點
1、本發明對於各相異性的組織和器官的培養提供了一個微重力環境。2、本發明對支架材料的選擇不受材料比重的限制，幾乎任何材料都可以作為 RTSCS的支架材料。3、本發明可以建立一個血管網絡，作為組織培養的營養供給，它可以模仿真正的 血管，並可以將不同的種子細胞種植到血管網絡的不同位置。下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細的描述。
圖1為本發明實施例一的結構示意圖； 圖2為本發明實施例一的轉瓶機底座右視圖； 圖3為本發明實施例一的培養室結構意圖4為本發明實施例一的多通道旋轉接頭端部視圖。
具體實施例方式實施例1
一種旋轉式組織應力培養系統(RTSCS)的實施例，參見圖1和圖2，包括支架1，支架 上安裝有培養液瓶2、多岐接頭3、氧交換器4、去泡器5、恆流泵6、培養液壓力室7、多通道 旋轉接頭8、轉瓶機9、蠕動泵10、廢液瓶11、轉瓶液壓室12、單通道旋轉接頭13、控制單元 14，所述多岐接頭有三個閥門稱為第一閥門301、第二閥門302和第三閥門303，所述第二閥 門的進口連接第三閥門的進口，所述第二閥門的出口連接第一閥門的出口並且同時連接到 所述氧交換器，所述第一閥門的進口連接所述培養液瓶，所述第三閥門的出口連接所述廢 液瓶，所述氧交換器通過底部管路從去泡器的頂部接入去泡器，所述去泡器的底部通過恆 流泵與培養液壓力室連接，所述氧交換器通過底部管路從去泡器的頂部接入去泡器，所述 去泡器的底部通過恆流泵與培養液壓力室連接；所述多通道旋轉接頭內部設有多條通路， 每條通路在多通道旋轉接頭的一個端面和側壁上設有對應的連接口，其中，所述多通道旋 轉接頭側壁上的兩個連接口接出兩條管路，第一條管路802通過電子壓力表16連接到多岐 接頭的第二閥門的進口上，第二條管路801通過另一個電子壓力表、電磁閥17與培養液壓 力室下端連接，在第二條管路上設有種子細胞注入口 8011 ；所述轉瓶機兩端分別設有頂蓋 901和底蓋902，轉瓶機頂蓋與多通道旋轉接頭螺接，所述轉瓶機底蓋與單通道旋轉接頭螺 接，轉瓶機內為一個空腔，空腔內設置有培養室15，所述培養室通過密封環18與多通道旋 轉接頭主通路連接；所述轉瓶液壓室與單通道旋轉接頭連接，所述控制單元控制信號分別 與轉瓶機、蠕動泵、恆流泵、電磁閥連接，所述蠕動泵、恆流泵、電磁閥、電子壓力表、多岐接 頭均為公知技術，在這裡不在贅述。所述支架包括一塊平板101，在平板一邊折彎形成90度形成一塊豎直的平板102， 轉瓶機安裝在豎直的平板上，支架可以耐受滅菌條件。所述支架平板上設有吊臂103，所述 吊臂用於吊起轉瓶機。通過打開第一閥門301、第三閥門303，關閉第二閥門302，即可加入培養液和排出 廢液。關閉301、303，打開302，即可進行自我循環。系統的閥門應可以在正壓和負壓下依 然具有良好的密閉性。所述培養液瓶頂部設有密封蓋201，所述密封蓋上設有兩個連接口 202，一個連接 口用於向培養液瓶中加入液體，另一個連接口用於在加入液體時排氣，所述兩個連接口分 別連接濾膜19，所述連接濾膜的通道嵌有一個卡鉗20，卡鉗為一長條形鐵片製成，可以固 定濾膜，防止濾膜脫落。所述密封蓋上設有導管插口 203，所述導管插口下端連接伸入到瓶 底的不鏽鋼管204。圖中示意的上部的濾膜用於向培養液瓶中加入液體過濾，下部的濾膜用 於在加入液體時排氣過濾，因為此時閥門301、303是關閉的。所述氧交換器的頂部設有風扇401，在清洗或對氧交換器進行滅菌時可取下。氧交 換器是薄壁矽管筒，由於在培養液流通時，會使氧交換器內的壓力小於外部的大氣壓，所以 氧交換器要能夠承受一定的壓力差，不能因外部壓力大於內部壓力而塌陷，同時又不能讓 外部氣泡進入內部。氧交換器入口位於氧交換器上部，氧交換器底部為漏鬥形，出口位於漏 鬥的底部，這樣可以使進入的細胞隨培養液流出，而不至於沉入死角。所述去泡器頂部設有密封蓋501，所述密封蓋設有兩個開口，一個開口為導管的入口 502，所述導管底部橫向彎折，並伸入液面以下，有利於氣泡和細胞的分離；另一個開口 503與一個閥門504連接，所述閥門連接一個濾膜。種子細胞注入的體積會使去泡器的液面 升高，升高的液面使氣體在此排出；所述去泡器上標有刻度；所述去泡器的底部為漏鬥形， 去泡器可180°旋轉；去泡器出口位於漏鬥的底部，這樣可以使進入的細胞隨培養液流出， 而不至於沉入死角。由於RTSCS的脈動流系統流速非常大，可能會接近器官的血流量，所以 去泡器的深度要足夠分離氣體。去泡器內部可能會小於大氣壓，去泡器需要可以承受一定 的壓力。在這裡值得說明的是，在將去泡器頂部閥門關閉的過程中，由於恆流泵造成的去 泡器和氧交換器內部壓力小於大氣壓，如果這個壓力差過大的話，就會使氣體從氧交換器 的薄壁矽管中進入循環通路中，並進入去泡器。在進行液體更換時，會關閉去泡器頂部的閥 門，所以要注意恆流泵的速率。在進行自我循環時，也可以關閉去泡器頂部的閥門，當一定 量氣體由氧交換器進入後，會進入去泡器上部，這樣就減小了氧交換器內部與外部的氣壓 差，直到停止氣體進入。這種情況是不利於系統脈動流模擬的穩定性的，所以對氧交換器的 要求是要耐受負壓。所述培養液壓力室內壁為光滑圓柱形，頂部設有密封蓋701，密封蓋旋緊就可以密 封，以防止汙染原進入。所述密封蓋下部連接一根彈簧702，彈簧底部連接一個活塞703，活 塞上部是空氣，活塞下部是流通的培養液。當彈簧被活塞壓縮到一定位置的時候，就可以達 到實驗需要的培養液的壓力。彈簧應選擇行程較長，勁度係數較小的彈簧，當彈簧被壓縮到 一半行程時可以達到理想壓力即可。彈簧的進度係數和壓力室的內徑要精確，以便計算造 成彈簧彈性形變的培養液體積。培養液壓力室的底部為漏鬥形，入口 704位於漏鬥的頂部， 出口 705位於漏鬥的底部，這樣可以使進入的細胞隨培養液流出壓力室，而不至於沉入死 角。所述培養液壓力室可180°旋轉。所述多通道旋轉接頭一端設有吊環805，所述多通道旋轉接頭側壁上另有兩個連 接口 803、804連接一個管路，所述管路置入蠕動泵，所述管路上設有種子細胞注入口 25。所 述多通道旋轉接頭為現有產品，其原理在這裡就不在贅述。所述轉瓶機頂蓋901中央與多通道旋轉接頭連接並設有密封墊圈，所述轉瓶機底 蓋902中央與單通道旋轉接頭連接並設有密封墊圈，所述轉瓶機壁與轉瓶機頂、底蓋螺接 並設有密封墊圈，所述轉瓶機頂蓋上設有排氣螺絲903，所述轉瓶機內壁上設有與轉軸平行 的長條凸起904 ；所述單通道旋轉接頭上設有轉瓶機齒輪905，所述轉瓶機底蓋內部設有驅 動電機，所述驅動電機906與轉瓶機齒輪連接，控制單元控制信號通過控制轉瓶機的驅動 電機驅動轉瓶機工作。所述轉瓶機底座24為兩端高出的底座，參見圖3，所述轉瓶機底座高出的兩端中 央設有凹槽2401，所述凹槽的中央設有小凹槽2402 ；所述轉瓶機底座上對應所述轉瓶機頂 蓋、底蓋的位置分別設有兩個滾輪凹槽2403，所述滾輪凹槽處均設有滾輪2404，所述滾輪 承受轉瓶的重量，這樣可以減少旋轉接頭的磨損。所述滾輪與滾輪凹槽底部有空隙，防止異 物掉入將滾輪卡死。實際尺寸的轉瓶機的內部空間為一個半徑10釐米，高20釐米的圓柱空 腔，那麼它的容積為6280毫升，重量至少為6千克。滾輪外部為橡膠，內部可以為滾針軸承， 阻力和震動非常小，不會影響轉瓶的轉動。所述轉瓶機底座內部中央設有測水平器2405，所 述轉瓶機通過轉瓶機底座安裝在支架上。
所述轉瓶液壓室頂部設有設有排氣口，排氣口上設有一個頂部閥門1201，所述頂 部閥門為排氣閥門；在轉瓶液壓室側面設有高低兩個開口 1202和1203，兩個開口上分別設 有閥門，所述高處開口為轉瓶液輸入端，在本實施例中輸入端連接漏鬥1207，所述低處開口 與單通道旋轉接頭連接；所述單通道旋轉接頭內部設計既可以使連接部分轉動，又可以形 成通道，使培養液能在容器轉動時出入容器，進行循環。所述轉瓶液壓室內部設有一個活塞 1204，所述活塞與螺杆1205連接，所述螺杆套有可旋轉的螺母1206，所述螺母鉚定在液壓 室底部，旋轉此螺母可以將活塞拉出和推入，以通過液體對轉瓶施加壓力。而螺杆不旋轉， 可以減小活塞的磨損。所述廢液瓶頂部設有密封蓋1101，所述密封蓋設有導管插口 1102和濾膜接口 1103，所述廢液瓶底部設有排液閥門1104，所述濾膜結構與同去泡器上的濾膜結構相同，在 這裡不在贅述。實施例中的培養液瓶2、多岐接頭3、氧交換器4、去泡器5、恆流泵6、培養液壓力室 7、多通道旋轉接頭8、轉瓶機9、蠕動泵10、廢液瓶11、轉瓶液壓室12、單通道旋轉接頭13都 是實驗室的標準設備，而通過本實施例的組合連接形成了一種性能極佳的組織培養營養供 給的旋轉式組織應力培養系統。在試驗過程中，所述培養室外部設有紙支架21，所述培養室內部設有支架材料 22，所述培養室口徑處設有多通道旋轉接頭8，所述培養室口徑處與多通道旋轉接頭通過密 封環連接。所述培養室內部設有管網狀的支架材料，所述培養室的內壁設有鉚定結構，所述 鉚定結構的俯視圖為圓形，所述支架材料可鉚定於內壁，這些管網狀的支架材料為細胞接 種提供一個特定的三維空間。培養室將內部培養組織與轉瓶液隔離。所述支架由四部分拼合而成兩個近似半圓形底部、左半部分、右半部分。它們通 過連接處設計的凹凸結構來牢固連接。所述多通道旋轉接頭的內部主通路上設有若干通道在多通道旋轉接頭內部形成 管網狀結構。培養室頂部插入多通道旋轉接頭中，培養室底部連有管網狀支架材料。外部套有 培養室。多通道旋轉接頭的每一個通道都有數字標記，便於查找。另外多通道旋轉接頭通 道的排列也不是完全對稱的，這便於對通道序號的查找。用注射器將種子細胞由細胞接種管25注入。每一個循環通路都可以有多個細胞 接種管，細胞接種管通過一個閥門與連接導管相通。實驗員根據需要，在系統組裝時配置一 定數量的細胞接種管。所述蠕動泵使用轉臂上的滑輪來壓迫導管，轉臂由電機驅動，當轉臂旋轉時，導管 的壓迫處會移動並推動導管中的液體。滑輪與導管之間只有滾動摩擦，不發生相對摩擦。控 制臺可以對蠕動泵進行轉速調節，保證培養液能正常循環。所述恆流泵是支架材料管內循環通路的動力來源，它將培養液注入培養液壓力 室，維持培養液壓力室內部一定的壓力。恆流泵下遊與培養液壓力室的壓力相同，上遊為大 氣壓。培養液壓力室內培養液的增減會被去泡器內的培養液所補償，以保證流動慣量容積。 由於RTSCS的脈動流系統流速非常大，可能會接近器官的血流量，所以需要一個大功率恆 流泵來維持培養液壓力室的壓力。
在這裡值得說明的是，在將去泡器頂部閥門關閉的過程中，由於恆流泵造成的去 泡器和氧交換器內部壓力小於大氣壓，如果這個壓力差過大的話，就會使氣體從氧交換器 的薄壁矽管中進入循環通路中，並進入去泡器。所以在進行液體更換時，要注意恆流泵的速 率。系統使用兩個恆流泵，如果其中一個停止工作，那麼控制臺會識別到其轉速為0，立即開 啟警示燈並按相同的速率啟動另一個恆流泵。所述控制單元包括UPS電源，控制的項目有轉瓶機轉速、蠕動泵轉速、恆流泵轉 速、電磁閥開閉頻率。在系統部件運轉不正常的條件下，控制臺會自動啟用備用部件並發出 警示燈和聲音。控制臺不能放入C02培養箱內，與系統支架連接的扁形電纜可很輕易地穿 過C02培養箱的密封條。UPS電源可以防止意外斷電的發生，由於電機消耗的功率不會很 大，所以UPS電源可以在停電的情況下保持系統運轉至少30小時。本實施例旋轉式組織應力培養系統的工作原理是
1、順次連接系統各裝置，將一個製作好的培養室放入轉瓶機；
2、將膠原加殼聚糖、膠原加粘多糖膠支架原材料灌注到培養室內；
3、將多通道旋轉轉接頭放入培養室口徑，並用密封環密封，將一個紙支架套在培養室
外；
4、將多通道旋轉接頭固定在轉瓶機頂蓋上，並將頂蓋固定在轉瓶機上，此時排氣螺絲 尚未拉上；
5、用吊臂吊起多通道旋轉接頭的吊環，使轉瓶機傾斜一定的角度，從轉瓶液壓力室的 漏鬥中通過單通道旋轉接頭向轉瓶機的空腔內中注入轉瓶液，注意轉瓶液不要溢出，轉瓶 液將培養室託住，使培養室處於懸浮狀態；
6、通過培養液頂部的濾膜加入培養液，使培養液壓力室、去泡器、氧交換器的底部朝 上，將第一閥門301、第三閥門303開啟，第二閥門302關閉，電磁閥一直處於打開狀態，開啟 恆流泵，培養液會最先注滿氧交換器，這時輕彈氧交換器，使氣泡上升，去泡器不能填滿，當 液體充滿去泡器體積3分之2時，將去泡器倒過來，培養液壓力室的做法與氧交換器相同， 待水從801流入轉瓶內時，關閉恆流泵，將倒置的部件正過來；
7、待紙支架泡軟後，將轉瓶機直立放在轉瓶機直立放置底座上，卸下轉瓶機頂蓋，用鑷 子取出紙支架，在將轉瓶機頂蓋固定在轉瓶機上，將轉瓶機放置在傾斜放置在轉瓶機底座 上，待轉瓶液注滿後，擰緊排氣螺絲，將轉瓶機水平放置；
8、開啟電磁閥，轉瓶機開始轉動，將種子細胞從種子細胞注入口注入，同時開啟蠕動
泵；
9、待組織培養結束後，取出培養室中的組織，進行檢測。具體步驟如下
步驟一、設計培養室的形狀和結構、培養室的支架材料鉚定槽和轉接頭 培養室是由耐低溫矽橡膠製成的透明的培養室，在外面可觀察到內部培養情況。培養 室與轉瓶同步旋轉，該培養室的外形和體積不會影響到其在轉瓶中的旋轉。培養室可看做 由三部分組成，即喇叭狀開口部、桶狀的連接部和袋狀的部分。前二者長度和口徑是不變 的，後者根據所培養組織的形狀而做相應的設計。培養室的連接部為圓桶狀，其長度應為多通道旋轉接頭插入轉接頭後，從轉接頭 底部到套在多通道旋轉接頭上的密封環的距離。其內徑應為多通道旋轉接頭的外徑，所述
9多通道旋轉接頭和轉接頭的外徑相同。通過在相應位置套兩個「螺口式密封環」並旋緊螺 絲將接口處密封，使培養室內部完全與轉瓶機內的液體隔絕，杜絕了來自轉瓶液的汙染。如果觀察到兩個密封環之間的這段培養室膨脹或收縮，說明轉接頭與多通道旋轉 接頭的連接已經不能完全密封。不過，根據培養的要求，連接處的壓力差可能不會很大，幾 乎為0，所以無需更換，並且不會對培養過程造成任何影響。如果即將脹破，則整個實驗需要 重新開始。所以轉接頭和多通道旋轉接頭的連接一定要精密。無論是用於器官構建，還是單純地培養血管，都首先要利用培養室作為模具來制 作一整塊血管支架材料，所製作的支架材料將與培養室內壁和轉接頭底部牢固接合。下一 步，支架材料會被雕刻成管網狀空間結構，類似生物體的血管網絡，這個空間結構的99%由 管結構連接而成，並保留有一些必要的，起連接作用的材料。它們互相支持，同一通路的管 路內部相通。進而可以在支架材料內、外有計劃地種植不同類型的細胞。培養室的另一重要作用就是傳遞應力。轉瓶液壓室可對轉瓶機內的轉瓶液進行吸 取和加入，即對轉瓶機造成負壓和正壓。由於培養室具有彈性且其內部為恆定的大氣壓，所 以在負壓下培養室膨脹，正壓下培養室收縮。而其外形和結構上特殊的設計將會影響到其 在轉瓶機內正、負壓下不同部位的伸縮率，從而影響應力傳遞的方向性和分布。1、培養室內壁和接口處設計
培養室內壁應被設計成一定的鉚定結構，其目的就是將經過冷凍乾燥法製備的支架材 料鉚定在培養室內壁，轉瓶機內的負壓會保持培養室一定的形狀，從而撐起支架材料，使支 架材料保持一定的形狀而不致塌陷。這種鉚定結構可以為丁字形突起。鉚定結構的設計首要考慮的就是連接的牢固性，要能夠承受一定強度的拉力，在 製作工藝上應該不會有什麼問題。至於培養器官上皮的形成和培養室的剝離在培養後期將 是可以做到的事情。鉚定在培養室內壁上的支架材料有一定厚度，到了培養後期，這一厚度 將一直變薄，直到細胞與培養室接觸。而矽橡膠這類物質會促進細胞分泌物質，形成包膜。 所以在設計培養室的鉚定結構的厚度時，應考慮到其降解速率。開口處的一段桶形培養室無需凹陷。喇叭形的開口的長度2釐米即可，直徑為桶 形培養室直徑的1. 5倍，其在組裝系統時有排除氣泡的作用。2、轉接頭設計
轉接頭的作用不容忽視(1)牢固地拉住支架管網絡，防止與轉接頭相連的支架材料 發生脫落；(2)在製作工藝和系統組裝上提供極大便利；(3)在轉瓶機轉速發生變化時提供 一定的扭力；(4)培養液灌注和種子細胞灌注的通道。當轉接頭插入多通道旋轉接頭即可以密封，使管道中的培養液不會洩露，管外的 液體也不會進入造成汙染。轉接頭的上部的一段是實心的。當外部套有培養室時，在實心處需要套一個密封 環以達到密封作用，密封環由螺絲鎖緊，實心可以防止密封環的壓力而變形。與血管支架材料連接端的設計非常關鍵，一定要可以牢固地拉住血管支架材料。 培養後形成的血管是套在此接口處的，血管具有彈性，而流動的培養液具有一定壓力，很容 易造成血管脫落。所以要設計一定的鉚定結構，防止脫落髮生。參見圖4，其結構為，連接通 道包圍有一圈外壁，這圈外壁與連接通道有一定間隔。這圈外壁上有許多穿孔，穿孔將支架 材料鉚定於轉接頭內，不會脫落。在灌注支架材料後，需要將氣體用離心機甩出去，孔2301就是個排氣孔。還有一點就是對轉接頭材料的性能要求，其需要可以耐受-40度低溫，即凍幹成 形製備過程中的最低溫度。3、用於培養血管的培養室設計
其培養室可以被設計成白熾燈泡狀，內部可容納單條或多條血管的折返迴路。與RCCS不同之處是，RTSCS的灌流入口與出口被設計在同一側，這是考慮到生物 某些器官的動脈與靜脈相互靠近，而不是在兩端。在目前的血管組織工程培養中，血管是直 的。而通過RTSCS培養出的血管既可以是任意弧度的。並且血管的弧度不會顯著地增加脈 動流的阻力，只要將轉彎處的血管支架材料口徑增大即可。前種方法與培養器官的支架材 料設計理念不同，後者是模仿真實的器官，設大量的毛細血管和血竇，從而減小循環阻力， 好比為了防洪而將大河引出分支河流。4、用於培養器官的培養室設計
如果所培養的器官用於移植，那麼它的形狀最好與生物體自身的器官相同。首先根據 原器官外形來設計培養室的形狀，這將決定培養出的器官的形狀。由於培養室使用彈性材 料，在轉瓶機負壓下會發生一定膨脹，而由培養室培養出的器官體積不能超過原始器官的 體積。所以培養室的外形應與原始器官相同，而體積應為原始器官的五分之四。比例稍小的 移植物一般不會影響到功能的發揮，此外，器官在受體內會進行自我增生來進行功能補償。培養室的整體形狀應與原始器官外形相同，如果是部分器官移植就應與部分器官 外形相同。在這裡，最好的辦法就是通過對原始器官進行斷層掃描，計算機建模分析，對於 器官的大小、組成部分、血管分布等情況有明確的了解。而開發相應的軟體也是必須的，它 將在支架材料的管網絡設計和數控超聲聚焦刀切割中發揮作用。對於應力培養的特殊要求，首先要決定應力的方向和作用範圍。如果是整體應力， 那麼培養室的厚度就是均勻的。如果需要局部的、特定方向的應力，則可以對培養室的不同 部位的材料厚度和成分進行調整，以使其在不同負壓或正壓下，不同部位的伸縮率有差異， 這將造成局部應力增加，增加的局部應力會傳給內部培養的組織。例如需要對一段韌帶沿 縱軸方向施加張應力，那麼可以將培養室設計成杆形，使杆兩端的厚度相對變薄，當轉瓶機 內負壓增大時，杆兩端便會牽拉內部的韌帶做伸長運動，矽橡膠的彈性極好。選擇好培養室的形狀後，就需要選定與桶狀接口的連接位置，這需要注意的是，排 氣口必須位於培養室的最高點，以便離心可以將氣體擠出。步驟二、培養室製備和培養室的紙支架製做 1、培養室製作
在確定培養室的三維模型後，製造商會根據提供的三維模型來設計模具，一般通過模 壓工藝製成。為滿足冷凍乾燥法製備血管支架材料的低溫(-40度甚至更低)需求以及觀察 需要，培養室的材料採用無細胞毒性的透明的耐低溫矽橡膠。例如美國道康寧公司的矽彈 性體透明度可達94%，而成都森發橡塑有限公司的耐低溫矽橡膠性能也可滿足實驗要求。普 通種類的矽橡膠已經被實驗證明無細胞毒性。矽橡膠所需性能低溫、高透明度，應力分布均勻。2、紙支架製作 要求如下(1)在整個實驗中需要一個紙做的支架來保持培養室的形狀，其內部的空間與培養室 相同。這個紙支架可以對摺，可以很容易地取出和放入培養室。其底部是平的，可以獨立放 在桌子上。(2)在紙支架的內部空間中，應留有兩個密封環的凹槽，可以將密封環的方位固 定。並留有孔隙可以伸入螺絲刀。此凹槽的位置應正好在多通道旋轉接頭和轉接頭固定密 封環的相應位置，以方便實驗操作。(3)紙支架由四部分拼合而成兩個近似半圓形底部、左半部分、右半部分。它們 通過連接處設計的凹凸結構來牢固連接。(4)另外，紙支架要做得儘可能薄，在浸入水中後應變得稍軟。其至少可以耐受10 分鐘的水浸，但不能使紙支架中的汙物溶解到水中，或是紙支架在水中分解。(5)紙支架的外直徑要小於轉瓶機的內徑，保證紙支架可放入轉瓶機內。(6)紙支架要高於轉瓶3釐米，這是為了在轉接頭插入多通道旋轉接頭後擰緊密 封環，這需要將紙支架的兩個近似半圓形的底部加厚。(7)紙支架的開口應與培養室的開口齊平，並且很容易被彎下。以上要求在紙支架的使用和系統組裝的過程中是必須的。紙這種材料可以滿足實 驗的所有要求，經濟且易成形。紙對超聲焦點刀的影響要比其他材料小，且紙可以耐低溫和 輻射，支架材料的滅菌用鈷60照射12小時。步驟三、用培養室做模具灌注支架材料原料、離心法去除培養室內的氣體
1、一種支架材料的製作方法稱為「模具澆鑄凍幹成形技術」。目前血管組織工程製備血 管支架採用「夾心法」，即用一隻管子套住另一支管子，在兩個管壁的中間灌注支架原材料， 然後凍幹成形。這樣一次只能做一段血管且血管壁較厚(2毫米)。本方法依然採用「夾心 法」，不同之處是成形後的支架材料不是管狀的，而是一個與培養室形狀相同的塊狀支架材 料，就是說還不能用於細胞接種。它需要在計算機控制下，利用超聲焦點刀將模塊切割成復 雜的血管網絡方可用於細胞接種。( 1)對製成的培養室用乙醇進行漂洗以去除有害物質，乾燥備用。(2)配製一定體積的膠原加殼聚糖、膠原加粘多糖膠凍狀支架原材料。(3)先將培養室套上兩個密封環，再放入紙支架中，將每個密封環與紙支架的密封 環凹槽處對齊，使密封環的螺絲對準紙支架的螺絲刀插入孔。然後將配好的支架原材料倒 入培養室中，直到沒過轉接頭的安裝位置即可(離心後支架材料的液面會下降)。放入離心 機時，應使出氣孔置於內側。(4)置於離心機中離心，低速離心即可將氣體擠出。打開培養室的紙支架，透過透 明的培養室觀察氣體是否被排出。如果沒有排出，則再一次離心。(5)再按上述方法添加一次支架原材料，離心，使離心後支架原材料的液面沒過轉 接頭的接口位置。(6)在插入轉接頭之前，先標記轉接頭的方位，可以在紙支架上標記兩個通道的序 號。以便在轉接頭和多通道旋轉接頭連接的時候對齊。在使用超聲聚焦刀對支架材料進行 雕刻前，方位的確定也是必須的。(7)用完全滅菌的鑷子按照標記的方位將轉接頭插入，使其底部到達培養室柱形 通道的底部，密封環固定。在這裡，當轉接頭插到柱形通道的底部時會被丁字形突起的內壁鉚定結構阻擋，而不能繼續伸入。這時的支架原材料應被轉接頭擠出，液面應沒過轉接頭的 通道。(8)進行離心。(9)離心後，一定要使支架原材料的液面沒過轉接頭的通道，這可以證明內部充滿 了支架原材料，沒有氣體。同時，要用目測。(10)填充完畢，置於-20度冰箱中，均勻冷凍24小時。步驟四、將支架材料置於序列凍幹機中冷凍
冷凍乾燥技術是醫藥和食品工業中常用的製備方法。通過冷凍乾燥的過程可以製備具 有高互穿性的開放多微孔結構。其基本原理為將聚合物溶液或凝膠在低溫下進行冷凍，溶劑結晶形成冰晶，在低 於冰點的溫度下抽真空，溶劑升華後形成多孔結構。水在這裡起到制孔劑的作用，形成的冰 晶成為多孔結構的形狀模板。支架的多孔狀結構主要由所形成的冰晶的形狀和大小決定， 而冷凍的溫度對冰晶的大小和形狀起到決定性的作用。通過降低冷凍的溫度，提高冷凍的 速度可以得到孔徑較小的支架。耐低溫矽橡膠最低可以耐受-70度，可以選擇不同性能的 矽橡膠製作培養室。凍幹成形的實驗方法各有差異，在這裡只舉一例
1、將紙支架從-20度冰箱取出，置於真空序列凍幹機中凍幹。2、程序設定為-40 度 24h，-20 度 24h，0 度 24h，20 度 24h。步驟五、將培養液通過離心法注回培養室內，使其充滿支架材料，再插入密封塞 在使用超聲聚焦刀對支架材料整體模塊進行切割時，需要一個水環境。水可以導熱，防
止材料被產生的高溫燒焦。交聯在一起的支架材料在超聲作用下下會解交聯，成為單分子， 水本身又是這些單分子的良好溶劑。1、注水的實驗步驟與「步驟三」類似，依然要求培養室內不能存有氣體，由於培養 室內部空間充滿了支架材料，水只能倒在出口處。先將培養液到至培養室喇叭形開口以下， 然後用手持紙支架的中部，手臂伸直，做鐘擺樣擺動，利用動作產生的離心力使水進入培養 室內。重複操作，直至水不能再被甩進。2、用上述方法將水灌入培養室後，就可以用離心方法將氣泡排除。此步驟需要重 復多次才可以將培養室完全填滿水。也要注意離心轉速不能太大，否則支架材料會被離心 力撕裂。3、添水結束後，用密封蓋塞住接口處。首先將水填滿開口處，用完全滅菌的鑷子將 密封蓋傾斜地浸入開口的水中，排除密封蓋下部的氣泡，伸入到一定位置。密封環固定。步驟六、使用數控超聲聚焦刀將支架材料模塊切割成適於細胞貼附的管網絡 超聲波具有如下特性(1)超聲波可在氣體、液體、固體、固熔體等介質中有效傳播。
(2)超聲波可傳遞很強的能量。(3)超聲波會產生反射、幹涉、疊加和共振現象。(4)超聲波 在液體介質中傳播時，可在界面上產生強烈的衝擊和空化現象。經過凍幹成型技術製作的支架材料主要是由膠原單分子經過非共價交聯聚合而 成。而這種交聯在超聲作用下可發生解交聯。超聲波具有四大效應機械效應(剪切大分 子)、空化作用、熱效應、化學效應。空化作用是當超聲波在液體中傳播時，由於液體微粒的 劇烈振動，會在液體內部產生小空洞，這些小空洞迅速脹大和閉合，會使液體微粒之間發生猛烈的撞擊作用(機械效應)，從而產生幾千到上萬個大氣壓的壓強。微粒間這種劇烈的相 互作用，會使液體的溫度驟然升高(熱效應)，高溫起到了很好的攪拌作用，從而使兩種不相 溶的液體(如水和油)發生乳化，並加速溶質的溶解，加速化學反應(化學效應)。超聲聚焦刀就是把許多束效應微弱的超聲波相交到一個點，在這個點的超聲效應 非常強，從而達到切割支架材料模塊的作用。對超聲聚焦刀和數控設備的要求是1)精度高，最好可以達到微米級。2)焦點小， 利於高精度和高質量雕刻。3)具有可以實時定位支架材料內部結構的功能，可以是超聲定 位。這可以防止由於支架材料自身的位置變動，和因外界的位置變動造成的雕刻不準確。4) 可以長時間工作。5)可以根據計算機建立的模型來進行雕刻。幾種提高雕刻速度的方法1)在高壓下雕刻，這樣可以提高水的沸點，升高超聲焦 點的溫度。2)可以在「步驟五」中灌入的水中加入促進解交聯的試劑。3)可以通過蛋白質 工程，製造出某種高熱不穩定的膠原，但這可能會影響到細胞的貼附和降解速率。實驗概要
1、在雕刻過程中要注意對培養室的降溫，以防止支架材料發生不必要的高溫分解。2、切割會使培養室失去內部支架材料的支撐，從而變形。密封蓋可以防止水溢出， 在紙支架的協助下，培養室仍可以保持一定的形狀，便於切割。3、將包著紙支架的培養室放在數控超聲聚焦刀的工作檯上或者通過密封蓋上的 把手懸空，利用設計好的軟體對其進行自動切割。超聲聚焦刀帶有超聲定位功能，可以探測 所切割物體的內部結構，已達到切割相對位置的精確。4、按照設計好的程序對支架材料進行切割。首先確定轉接頭的方位，然後按照設計好的程序進行切割。切割應由下至上，因為 切割會產生小的支架材料碎削，向下沉，由下向上切割不會受到這些碎削的幹擾；溫度較高 的液體處於切割面，溫度較低的液體處於下方，防止了對流造成的支架材料的擾動，影響切 割精度。此外，由於培養室內部密閉著水，水就可以起到內壓的作用，以抵消培養室失去支 架材料支撐所產生的塌陷。步驟七、器官管網絡的計算機建模與處理
對於形成毛細血管和血竇位置應設計特別的空間。對於將來誘導腺上皮特別的，利於 誘導因子到達位置的管路。對於需要細胞複合不同次序接種的，應留有空間。1、構建器官的血管三維網絡模型。一般通過高解析度斷層掃描，再合成三維圖像， 然後提取血管網絡和所有其他的管路網絡，如腺腔網絡、血竇網絡、微結構網絡。2、對提取的血管網絡進行逐級簡化處理。包括減小血管網絡分布密度，以適應切 割條件、培養條件和培養方案。在簡化處理過程中就會發現，越來越多的管狀支架材料將失去支持而在一定空間 內擺動。為了保證切割後血管網絡中每條管路相對位置的穩定性，在簡化過程中，應保證簡 化後的血管網絡的管路之間仍可以互相支持，自身維持空間上的穩定。並可以對某些管路 進行管壁厚度口徑的調整。必要時可以留有用於連接的非管狀支架材料，但它們不易過多， 培養室內的任何地方都會成為種子細胞的貼附位點，所以培養室內部空間的所有貼附位點 都應該是有用的，並有利於組織結構的形成。一定要避免無用的貼附位點的設計。3、對簡化後真實的血管網絡進形管壁厚度和管徑的調整，以適應血管的培養。對需要促使某些結構發生的地方應增加特別的空間，以適應細胞接種、組織培養和細胞自發 形成一定結構，比如毛細血管和血竇。4、管路設計的核心思想就是，在血管網絡形成後，血管網絡內的培養液不再滲透 到管外的空間，所以接種到管外空間的細胞完全依靠緊貼的血管組織汲取養分以生存和增 殖。所以在管路設計中，要利於接種到管外的細胞貼附到微血管和血竇處，以汲取養分；也 要利於所培養組織自動形成新的血管和血竇。5、靠近轉接頭處的管路設計此處應僅僅雕刻出供培養液出入的管內腔，而保留 原始的支架材料模塊，以增加此處的強度。並保證細胞不會很早地侵入到轉接頭的鉚定結 構，並降解那裡的支架材料；否則，此處支架材料的連接將容易脫落。6、培養血管網絡需要將不同類型細胞接種於支架材料的內壁、外壁及外壁之間的 空間。多通道旋轉接頭提供了多灌注通道，即可進行管網絡的管內循環和管網絡的管外循 環，這就為接種創造了條件。而在支架材料的切割設計時，應考慮到外部循環的循環方向問 題，使外部循環儘可能全面。所以外部循環中，種子細胞的進入端不能單一，可以添加一個 通到培養室底部的支架管路，使其到達培養室最深部，並帶有噴泉狀分支，這樣利於細胞分 布。7、在構建複雜組織過程中，需要多條灌注通路將不同種的細胞按不同的時間和空 間順序接種。例如，需要將血管內皮細胞接種到管腔內而將血管平滑肌細胞和肌細胞接種 到管腔外。為滿足此需求，需設計雙灌注通路，以創造不同的循環路徑，使種子細胞可以分 布到支架管網絡的管內空間和管外空間。參見圖2，為典型雙灌注通路，其中一條為封閉循環，種子細胞由801注入，從管進 入支架管網絡中的管腔內，貼附於支架管路的內壁；而802為流出管，其中可能含有未貼附 的種子細胞，進行重複循環。而另一條為開放循環，種子細胞由803進入管網絡中，由於此 灌注通路開放與培養室內部空間，種子細胞可以在此空間中擴散，並貼附在血管支架材料 的外壁。未貼附的種子細胞進入804管，重複循環。8、在簡化處理後的模型上添加額外的管路，為的是建立新的灌注通道，以接種特 殊的種子細胞。如建立生成腺腔的管路，需要通路的末端是封閉的。9、如果以上方案不能解決細胞接種的時間和空間順序問題，RTSCS還可以添加額 外的通路，並據此對管網絡模型進行修改。根據實驗要求，還可將上述方案簡化。10、支架管網絡的設計是一件頗有挑戰性的工作，它涉及到局部解剖學、流體力 學、生物力學、血液動力學等許多知識，沒有缺陷的設計將決定器官培養的成敗。優良的設計可以具有如下優點1)使灌入的種子細胞均勻擴散到支架管網絡中， 並很好地貼附在支架材料上。2)使如此大的組織可以很好的養分供給，可比真正的血管網 絡。3)促進自發形成微結構，如毛細血管和血竇。4)防止血栓的形成等等。11、鉚定在培養室上的支架材料厚度與降解。這一層支架材料應一直保持到培養末期才被完全降解，就是說它的降解時間要可 以持續幾個月甚至更長時間，細胞通常會先降解與其相接觸的支架材料。所以這一層材料 的厚度很重要。細胞會一直貼附在這一層材料上，並通過這層材料的支撐維持一個應力均 勻分布的環境。12、在管網絡中起支撐作用的支架材料的厚度與降解。
這類結構從靠近培養室的那層支架材料起始，猶如血管網絡布滿培養室內部空間 一樣，這類支撐材料也要連接所有的血管網絡，以維持血管網絡在空間的相對位置保持不 變。這類支撐材料同時也為管外循環的細胞提供了附著空間，會隨著貼附細胞的增多而被 逐漸降解，所以其降解時間非常重要，如果提早降解，則可能造成支架管網絡內部空間上的 混亂，從而影響循環和下一步細胞接種。如果細胞已經填充滿這些支撐材料，而支撐材料還 遠不能被徹底降解，這將會影響到細胞分泌自身的ECM (細胞外基質)，並影響到細胞自發形 成微結構，包括血管，血竇，結締組織等。13、血管管網絡的管徑、管壁厚度和降解。血管支架材料對於細胞貼附，促進血管成形是必不可少的，但人工的血管支架材 料與細胞自身分泌的ECM (細胞外基質)有很大差異，這會造成血管性能的下降。而在數字 控制下採用超聲聚焦雕刻出的血管支架材料厚度遠遠小於毫米級，而常規血管組織工程實 驗中，夾心法製作出的血管支架材料的厚度為2毫米，支架材料管壁厚度的減小將加速其 降解並促進局細胞合成的自身ECM，極大影響到血管的生物力學性質和管徑的大小。所以通 過超聲聚焦雕刻出的血管支架，培養出的血管，有望突破組織工程血管直徑的瓶頸。步驟八、系統的清洗與滅菌、培養室和支架材料的滅菌
1、培養室和內部的支架材料不能高壓蒸汽滅菌，將培養室連同紙支架放入無菌袋中， 鈷60照射12h滅菌，移入超淨臺，應防止無菌袋外表面汙染。2、系統拆解。拆解前請注意原先的安裝順序，以便以後重裝。對於可消毒的進行清 洗，對於不可消毒的更換。電器部件不能夠清洗，需用醫用酒精來消毒。儘可能地將每個部 件拆卸，某些部件內部不能拆卸。將拆卸的部件投入裝有中性的熱肥皂水的超聲清洗機中。 對於不能拆卸的部件，要用注射器將其內部注滿中性的熱肥皂水，再放入超聲清洗機中。3、清洗。用中性熱肥皂水超聲清洗後，將部件的肥皂水倒去，用去離子水來漂洗四 次。每次漂洗前，用注射器將去離子水注入氧交換器和去泡器。4、組裝被拆解的部件。清洗結束後，組裝被拆解的部件。所有要滅菌的部件的閥 門打開，螺絲旋鬆一圈，用鋁箔紙包裹(將導管和連接的部件包裹在一起)，並且用蒸汽滅菌 用袋封住。對於一次性注射膠管包裹說明連在閥門上的注射膠管長6釐米，首先中部180度 彎折，然後套一個2mL EP管。將膠管的閥門開啟以備滅菌，再用新的卷狀紗布將EP管、三 通、開關一起包裹至少6層，然後用白紙包裹紗布，用皮套固定。5、滅菌。120degC高壓蒸汽滅菌20分鐘。不建議升高溫度滅菌，可以延長滅菌時 間。6、滅菌後，把所有已滅菌的部件拿到層流的生物安全櫃中。組裝所有部件。組裝 時使培養液壓力室、去泡器、氧交換器顛倒180度，為的是在灌注時排除氣體。步驟九、培養室連結到系統
1、將培養液瓶裝入培養液。確保培養液壓力室、去泡器、氧交換器處於倒置180度狀 態。將第一閥門301、第三閥門303開啟，第二閥門302關閉。使電磁閥處於一直打開狀態， 開啟恆流泵。水會最先注滿氧交換器，這時輕彈氧交換器，使氣泡上升。去泡器不能填滿， 當液體充滿去泡器體積3分之2時，將去泡器倒過來。培養液壓力室的做法與氧交換器相 同，待水從801孔流入轉瓶機內時，關閉恆流泵，將倒置的部件正過來。
2、將轉瓶機直立放置底座置於一個滅菌解剖盤中，解剖盤是用於盛接從轉瓶溢出 的水。將轉瓶機從轉瓶底機座取下，底蓋向下，直立於底座上。將吊臂抬到最高處，擰緊吊 臂螺絲。卸下頂蓋。將吊環掛在吊臂上。將轉瓶中的水倒掉。3、在頂蓋的下部查找多通道旋轉接頭的803和805通道位置，應記住它們的方位。 在排氣泡的步驟中，需要將此方位抬高，以避免溢出的氣泡被吸入。(通道的序號選擇是根 據圖示的連接方式)由於記號筆可能存在汙染，所以在系統組裝時應儘量避免接觸任何汙 染原。繼續查找(步驟三_6)中標記在紙支架上的兩個通道，記住方位。這是為了在轉接 頭和多通道旋轉接頭連接時，使通道一一對應。4、將紙支架的無菌袋取下，將紙支架插入直立放置的轉瓶中。在這裡需注意的是， 不要汙染培養室的開口處和其他無菌物品。5、用螺絲刀鬆開密封蓋處的密封環，用完全滅菌的鑷子將密封蓋傾斜地取出。此 時轉接頭的接口應該位於液面以下。6、將直立的轉瓶置於懸吊著的頂蓋下方，將培養室的開口對準多通道旋轉接頭的 出水口處，降低吊臂，使出水口伸入培養室喇叭狀開口。7、再次開啟恆流泵，讓恆流泵一直開著。這時水會從多通道旋轉接頭的801通道 出口流出，讓水輕輕流入培養室接口，待水即將從喇叭狀開口溢出時，將頂蓋傾斜，放出壓 在多通道旋轉接頭出水口處的氣泡。8、這時調整頂蓋的傾斜，使多通道旋轉接頭下方的805通道高於806號通道。9、以低轉速開啟此通路的蠕動泵，可見有氣泡冒出，待氣泡不再冒出時，確認此 通路已被水灌滿，關閉蠕動泵。10、用相同的辦法灌滿其他通路。11、在排淨系統循環通路中的氣體後，便可以將轉接頭與多通道旋轉接頭連接。連 接時，按標記的通道序號調整二者的方位，使通道一一對應。然後，一隻手掐住紙支架的轉 接頭處，另一隻手持住多通道旋轉接頭，向下拉(吊臂會跟著移動)，雙手共用力將其插入連 接。旋緊密封環。這時，由於恆流泵一直開著，水會從多通道旋轉接頭802通道流出。12、待水從廢液瓶口流出時，關閉恆流泵。關閉第一閥門301、第三閥門303，開啟 第二閥門302。關閉去泡器頂端的閥門，並用彩色貼條標記去泡器內液面的高度，此頁面高 度可以顯示培養室的受力情況。當去泡器頂端的閥門開啟時，如果培養室被轉瓶液擠壓，培 養室減小的體積會造成去泡器內液面的升高；如果培養室受到負壓而膨脹，去泡器內的液 面就降低，去泡器內減小的體積進入培養室。13、去泡器液面的降低。在灌注液體時，去泡器的液面不能到達頂部，這樣在後面 步驟就無法看出液面的升高。如果去泡器液面太高，可以關閉第一閥門301，開啟去泡器頂 部閥門，開啟第三閥門303，慢速開啟恆流泵，這樣去泡器液面就會下降。待液面下降至2分 之3時，關閉恆流泵。14、到這一步，無菌循環通路已經完成。其他汙染原可能是通過培養瓶蓋上的濾膜 加入的衝洗液和培養液或接種的細胞。步驟十、紙支架的拆解、添加轉瓶液、調試轉瓶液的壓力和轉瓶轉速 轉瓶機中如果存留有氣體，可能擾亂轉瓶內液體與轉瓶的同步旋轉。
1、配製一定密度的轉瓶液
溶質食鹽等經濟的溶質。密度算法一根據開始培養時培養室內的整體密度(培養液+支架材料+培養室) 和培養結束時培養室內的整體密度(培養液+支架材料+培養室+細胞)，取一個中間值。然 後通過調整轉速來保持培養室的懸浮狀態，其轉速設置大致是剛開始培養時，培養室的密 度小於轉瓶液，為防止培養室上浮，使用較大的轉速；培養結束時，培養室的密度大於轉瓶 液，仍需增加轉速來補償增加的沉降係數。所以整個培養過程的轉速調節是由快到慢，再 由慢到快。據此原理，通過計算就可以得出，培養後期，一定轉速對應著組織的培養密度狀 態。當然組織中有血管分布，這是不確定因素，但可以通過統計學來估算。從邏輯上講，只 要培養液的營養組成和營養含量接近生物的血液，那麼所培養的組織的血管與組織的比例 就應該接近生物的真實的組織，因為血管的功能就是輸送營養物質。密度算法二 對於較輕的培養物，也可採用與培養液等密度的溶液。根據算好的密度，配置轉瓶液。2、將頂蓋連同紙支架推入一側，確定去泡器上的閥門和第一閥門301、第三閥門 303關閉，用彩色貼條標記去泡器液面的位置。向轉瓶內添加轉瓶液，直至即將填滿轉瓶，不 要讓轉瓶液溢出。3、在水中用兩個長夾子拆解紙支架，並取出。如果紙支架太硬或體積太大無法取 出，就等其泡軟後取出。4、將頂蓋與轉瓶級接合，不要使排氣螺絲與轉瓶機內壁的突起相對以影響排氣。 擰緊螺絲。將安裝好的轉瓶固定於轉瓶支架上。注意轉瓶齒輪與驅動電機齒輪的咬合，注 意轉接頭的突出插入轉瓶支架的鉚定凹槽內。5、向漏鬥中加入轉瓶液，將轉瓶液壓室的活塞旋到中部，用廢液缸接住排出的轉 瓶液。將漏鬥閥門和排氣閥門打開。這時水會注滿液壓室，輕彈液壓室，使附於液壓室壁上 的氣泡上升。轉瓶液注滿液壓室後，關閉排氣閥門。需要注意的是，漏鬥可能被設計得很小，所以需要及時添加轉瓶液以維持漏鬥中 液面的高度，防止氣體進入導管。一旦漏鬥中體液即將流光時，可以先關閉漏鬥閥門，再添 加轉瓶液。建議選用一個大漏鬥，使用結束後再卸下。6、將系統支架的左側墊高，轉動轉瓶機，使頂蓋上的排氣螺絲處於最高位置。在下 方墊一塊吸水布，旋開排氣螺絲。由於轉瓶液不斷由漏鬥添加，轉瓶內液面繼續升高，而上 部的氣體會從此孔排出。排氣過程可以輕彈轉瓶以加速氣泡的移動。排氣結束後，關閉漏 鬥閥門，旋緊排氣螺絲。7、用彩色貼條標記去泡器液面位置，打開去泡器頂部閥門。這時去泡器液面高度 可能會有所改變，轉動液壓裝置底部的把手，使去泡器的液面回到標記的高度。開啟旋轉裝 置，設定轉速，使培養室旋轉於轉瓶中部。去泡器通過一個濾膜與大氣相通，所以培養室內部的壓力為大氣壓。移動轉瓶液 壓室，抽出轉瓶機中的轉瓶液，這時培養室就會膨脹，且膨脹的體積等於抽出轉瓶液的體 積。培養前，培養室的密度小於轉瓶液，而培養室膨脹將會使其密度更小，這時需要增加轉 速才能是保持培養室處於轉瓶機中部轉動。在培養後期，培養室的密度要大於轉瓶液，而培養液的密度小於轉瓶液，培養室膨脹依然會使培養室的密度減小，這時就需要減小轉速來 保持培養室在轉瓶中部轉動。所以整個培養過程的轉速調節是由快到慢，再由慢到快。8、轉瓶將保持旋轉，直到培養結束。步驟十一、衝洗支架材料、接種前處理和潤洗
支架模塊經過雕刻後，會產生無用的膠原殘片，這些殘片會影響細胞貼附，所以需要將 這些膠原殘片衝洗出培養室。另外，在支架原材料組分中，可能根據性能要求添加某些試 劑，這些試劑可能具有細胞毒性，需要在衝洗後再進行處理，一般處理液呈酸性或鹼性，使 這些試劑很容易溶於處理液。1、在培養瓶蓋上的較高的濾膜上再插入一個濾膜，並防止兩個濾膜的接口處掙 裂，向培養瓶中泵入培養液，泵入的水最好不含有氣體，待液面遠離底部時再開始清洗，防 止氣泡被吸入。2、開啟第一閥門301、第三閥門303，關閉第二閥門302和去泡器的閥門。開啟恆 流泵、蠕動泵、反向開啟(此通路為盲端通路)蠕動泵，即同時衝洗支架管網絡的管路內部和 外部。根據管網狀支架材料結構的複雜性選擇相對應體積的水。衝洗的效率實際上，與接種細胞的效率相似，如果支架材料管路的設計非常有利 於細胞分布的話，就意味著衝洗液可以很好的分布，而清洗就很全面。3、清洗廢液會填滿廢液瓶，廢液瓶底部安裝了一個開關，以放出廢液，廢液面不應 低於開關，以防止外界汙染源進入廢液瓶。4、處理。衝洗後可能要對支架材料進行處理，其處理液與支架材料的具體成分相 關。處理方法可以與衝洗相同，也可與培養液潤洗的方法相同。5、再次清洗以去除處理液，清洗方法與衝洗方法相同。6、培養液潤洗。將一定體積的培養液泵入循環通路中(體積應與循環通路中液體 體積相同)。先關恆流泵，另兩個蠕動泵可以開著，再關閉第一閥門301、第三閥門303，開啟 第二閥門302，保持去泡器的閥門關閉，再開啟恆流泵。待自我循環一定時間後，再重複操 作。應至少潤洗六次，最後的潤洗液就是培養液。7、潤洗結束，保持恆流泵開啟並設定一定流速，關閉所有蠕動泵，關閉第一閥門 301、第三閥門303，保持去泡器閥門關閉，保持轉瓶旋轉，開啟第二閥門302。步驟十二、種子細胞的注入
在各個循環通路，設計有細胞接種管，使用注射器將種子細胞由此注入，進入管網絡支
^K o1、細胞接種密度。依據細胞接種在培養室內部空間位置的不同和此空間表面積， 實驗員自己決定接種密度。在接種時應考慮到細胞損失的因素。另外，在接種細胞(如血管 內皮)進入管網狀支架管內空間時，沒有立即貼附的細胞會二次循環，此過程要經過氧交換 器、去泡器和壓力室，這必然會損失一些細胞，所以在接種時應考慮到這些因素而增加細胞 接種的數量。2、打開去泡器頂部的閥門。打開種子細胞注入通路的相應的蠕動泵，設定一定速 率。主通路的恆流泵是一直開啟的，如果向主通路中注射細胞，則僅僅需調整速率，以利於 細胞貼附。3、首先打開包裝，拔下2mL EP管。將注射器由折彎處扎入管內，先拉動注射器，使管內產生負壓。開啟閥門，培養液就會由於負壓而進入注射膠管內。4、使進入膠管的培養液沒入注射器針尖(如果沒有沒入針尖，則將注射器扎深一 點)，繼續拉動針頭，以使吸入的培養液趕走針頭內的氣體。當針頭內的氣體都跑出來後，待 其上升到針頭上部，便可推動注射器，注入種子細胞。當注射器注射時，針尖最好靠近閥門，這樣浪費的種子細胞較少。操作中重要的是 不能將氣泡帶入通路中。5、接種後，首先將膠管閥門關閉，再拔出針頭。將用過的注射膠管，按滅菌時的方 法包裹，打上標記。6、關閉去泡器頂部的閥門。7、由於去泡器頂部的閥門是開啟的，所以注射器注入液體的體積會造成去泡器內 液面的升高。如果去泡器液面太高的話，注射時就有可能使液體從去泡器頂部冒出，冒出的 培養液可能使病原菌生長。降低去泡器液面的方法很簡單，只要保持去泡器頂部的閥門開 啟，保持恆流泵的流動，開啟第三閥門303 (無需動其他閥門，這時第一閥門301關閉，第二 閥門302開啟)，液體就會流進廢液瓶而去泡器液面降低，再關閉第三閥門303。步驟十三、脈動流模擬的設置
在培養初期沒必要採用脈動流培養，當細胞貼附到血管支架材料的內外表面後，就可 以進行脈動流模擬培養，以使人工血管的各種性質更接近生物體。正壓是由培養液壓力室 產生，而負壓是由去泡器上方的空氣產生，產生這兩個壓力的動力就是培養液壓力室和去 泡器之間的恆流泵。對正壓的調節會影響到負壓，對負壓的調節會影響到正壓。用下面的 方法可以一次調節成功。另外，隨著實驗進程，動脈壓力表和靜脈壓力表的讀數可能會發生 自動變化，這還需要稍微的調節。在培養室上遊的為動脈壓力表，在培養室下遊的為靜脈壓 力表。1、設實驗設計的動脈壓力表讀數為Pi，靜脈壓力表讀數為P2。根據已知彈簧的進 度係數k和培養液壓力室的內半徑巧。則當壓力表讀數為Pi時，彈簧被壓縮了(Pi/k)，那麼 為達到動脈壓力表的讀數，需要向培養液壓力室泵入的體積為？ V={> (ri)2x( Pi/k)}。由 上面的公式，Pi是實驗員自定的，而其它量都已知，就可以求出？ V。下面就利用查理方程， 利用？ V求如何在達到Pi的同時達到P2。假設去泡器中的體積為X，而這個體積正好可以 使兩個表同時到達試驗設定的讀數。初始狀態下，靜脈壓力表為大氣壓Po，由查理方程得 xP0=P2 (x+ V)，可求得x。那麼就可以通過一定方式，使去泡器上部的氣體體積為x，以使 兩表的讀數同時達到要求。這應該是最簡單的實驗步驟，但實際上，由於系統的部件具有彈 性，會造成誤差，實驗員根據實際，在對x進行增減。2、首先求出X，根據去泡器上的刻度，如果去泡器上部氣體小於X，則1)先將去泡 器頂部閥門打開，再緩慢開啟廢液瓶第三閥門303。2)待去泡器液面下降，上部氣體增加到 x時，關閉第三閥門303，關閉去泡器閥門。此時應留意廢液瓶連接管是否有液體倒流現象， 如果有，則需要關閉第二閥門302，在系統的組裝方案中，特意把廢液瓶連接管安裝成下凸 形，防止液體倒流。如果去泡器上部氣體大於X，只能通過去泡器頂部的濾膜抽出一定的氣體。1)首 先在去泡器頂部的濾膜上輕輕插入一個注射器，先開啟去泡器閥門，開啟培養液瓶閥門第 一閥門301。2)立即緩慢拉動注射器，待去泡器上部氣體減小為x時，先關閉培養液閥門第一 301，關閉去泡器閥門。3、開啟電磁閥，設置頻率。4、逐漸增加恆流泵的轉速，直到動脈壓力表的讀數到達實驗所設計的數值P2。此時，1)如果靜脈壓力表的數值也到達(或在誤差範圍內)P2，那麼設置結束。2) 如果靜脈壓力表的數值(負壓)小於P2 (更大的負壓)，就需要增大x。3)反之，減小X。5、將恆流泵轉速降低到初始的轉速，關閉電磁閥，按上述方法重新調整去泡器上 部氣體體積。6、關於流速的調整。當兩表讀數到達實驗設定時，可以利用設備來測定的流速1) 如果流速過高可以將靜脈壓力表下遊的連接導管折成一定弧度或任意形狀，用膠帶固定， 這樣就可以增加循環阻力，從而降低流速。2)如果流速過低，則需要更換更大口徑的連接導 管。3)重新調整壓力。7、關於培養室內部的循環阻力。在未接種細胞前，循環阻力很小，大部分液體可以 由入口端進入，透過支架材料，由出口端流出培養室，循環阻力很小。從細胞接種開始，培養 室內的管網絡的管內部分逐漸被血管內皮細胞貼附，這會使管網絡由開放式循環逐漸轉變 為封閉式循環，這樣就增大了循環阻力。如果組織自發生成血管，就會減小循環阻力。步驟十四、血管網絡的培養、管路設計與阻塞的討論 1、血管網絡的培養
系統多灌注通道的硬體設計和培養室管網絡切割的軟體設計，為在培養室內部的不同 空間接種創造了條件。RCCS是通過注射器將種子細胞注入到轉瓶內；而在RTSCS中，種子 細胞首先進入某一循環通路，隨循環液體進入培養室，並分布於空間，逐漸貼附到支架材料 上。脈動流模擬裝置只與支架管網絡的管內循環路徑相通，以模擬血液動力學，這對培養的 血管性能是必要的。對支架管網絡材料接種的時間和空間順序與單血管培養類似，試驗室可以根據自 己的培養方案進行培養。關於組織和血管同步構建方法。這樣的方法尤其適合本系統，因為本系統管網絡 支架材料結構複雜，完全適合大批量高密度複合接種，選擇更合理的接種方法將會縮短實 驗時間，優化培養組織的結構。2、脈動流管路設計
脈動流系統可以模擬血液動力學特性，已是血管組織工程必不可少的儀器。RTSCS的主 循環通路就是由脈動流系統組成的，並且，此循環通路中的培養液是整個培養過程的營養 來源，從培養初期到結束需要一直保持流通，否則組織就會因缺氧和缺乏營養而死。而其它 管路只在接種細胞時開啟，接種後就關閉。脈動流使營養液產生了強弱變化的灌注動力，這種培養方式在影響血管細胞自身 生化特性的同時，會使培養液以波的方式灌注，這種波動的能量可以擴張血管，從而減小局 部區域的循環阻力，最後流經最細小的血管。例如，一部分毛細血管處於彈回狀態時，另一 部分正處於液壓造成的膨脹狀態，這對於培養組織的微循環的暢通尤為重要。這種波動式 的灌注也會使整個循環通路網絡發生簡諧震動，就好比在水中上升的一個氣泡，自身在做 簡諧震動。3、適於誘導腺腔的管路設計腺腔由腺上皮組成，為內部封閉的開口於器官外的管狀結構。設計也將支架材料做成 內部封閉的管狀。細胞的注入方法同上，在開啟蠕動泵後，蠕動泵將液體推向管腔內，腺腔 管狀支架內液體將透過支架管路的孔隙，而細胞被攔截在管腔內，如此進行短暫的循環來 接種細胞。為了使接種覆蓋整個管腔，應放慢蠕動泵的轉速，這樣利於液體從阻力較小處流 出，同時承載細胞貼附於流出處。阻塞的討論血管網絡中，管內細胞為血管內皮細胞，而其它類型的細胞可進入管 內循環通路中，並可在流速最慢處貼附到血管內壁。這裡的營養可以滿足其生長。增殖的 細胞會阻塞血管，也可能長成瘤狀結構，至於這個瘤狀結構能否自發血管生成，還需要解剖 觀察。阻塞血管就意味著營養的匱乏，細胞將停止增殖，除非誘導自發生成血管，對於阻塞 的預防值得在試驗中總結經驗並對管路設計和培養方案進行修改。步驟十五、完整的器官培養
1、器官組織培養——RTSCS包含著一個簡單的培養器官的思路——通過在建立的血管 網絡上，接種不同種類的細胞，來模擬器官發育中的微環境，在種子細胞自身的互相識別和 人工幹預的條件下，促成器官結構及功能的形成。包括神經組織的形成，神經調節在器官行 駛正常功能上發揮著重要的作用。而所形成的組織的營養來源是依靠血管網絡而不是培養 液，這是一種間接地獲取營養的方式，它更接近於生物體，但對培養條件要求也更苛刻。2、腺上皮誘導方案——RTSCS的多通道旋轉接頭可以提供多條獨立的灌注通道， 也可以是一條盲端(一般腺體都是盲端)。在支架材料管網絡設計時，可以根據器官的建模， 分析其中分泌腺腔及管道的布局，然後在支架材料雕刻的過程中完成獨立的管腔設計。與 血管管腔不同，一般腺腔是盲端，所以當通過蠕動泵將細胞推進盲端管腔後，即需要關閉蠕 動泵，否則會對推入的細胞造成壓力。而誘導因子注入後可以通過擴散進入盲端管腔內。器官外表皮的形成——與培養室相連的支架材料有一定厚度，這一層支架材料會 被貼附的細胞緩慢降解。按照實驗設計，在培養即將結束時，這層支架材料將被降解完全， 使細胞於矽橡膠接觸，這種接觸將有可能促使細胞形成上皮結構。步驟十六、培養組織的取出、保存、培養室的剝離
1、將電磁閥和恆流泵關閉，將轉瓶底蓋向下，直立於特製的底座上。將吊臂掛在多通道 旋轉接頭上。2、卸下頂蓋，慢慢提起吊臂，使兩個密封環高於轉瓶壁5釐米。3、不要旋開密封環，將轉接頭從多通道旋轉接頭拔出。將兩個密封環之間的培養 室拉長一小段，旋轉下面的密封環，使這一小段培養室扭成很細的麻花狀。用結實的繩子在 此處纏幾圈，打結。4、在確定打結結實後，提升吊臂，把培養室吊出轉瓶機。用吸水布擦乾培養室表面 的水，套上一個新的，剪短的紙支架。5、用剪刀，在打結的上方將培養室剪斷。6、低溫保存。7、在需要將培養室剝離時，先卸下密封環，將培養室防止解剖盤中(用於接水)。用鈍頭的解剖剪刀將培養室由打結處處向底部剪開。注意，可能會有液體從剪口 噴出。步驟十七、組織檢測通過生化、免疫組織化學、局部解剖學等手段對器官的功能和組成進行檢驗，以及血小 板粘附實驗、抗血栓檢測等檢驗。
權利要求
一種旋轉式組織應力培養系統，包括支架，支架上安裝有培養液瓶、多岐接頭、氧交換器、去泡器、恆流泵、培養液壓力室、多通道旋轉接頭、轉瓶機、蠕動泵、廢液瓶、轉瓶液壓室、單通道旋轉接頭、控制單元，其特徵在於，所述多岐接頭有三個閥門稱為第一閥門、第二閥門和第三閥門，所述第二閥門的進口連接第三閥門的進口，所述第二閥門的出口連接第一閥門的出口並且同時連接到所述氧交換器，所述第一閥門的進口連接所述培養液瓶，所述第三閥門的出口連接所述廢液瓶，所述氧交換器通過底部管路從去泡器的頂部接入去泡器，所述去泡器的底部通過恆流泵與培養液壓力室連接；所述多通道旋轉接頭內部設有多條通路，每條通路在多通道旋轉接頭的一個端面和側壁上設有對應的連接口，其中，所述多通道旋轉接頭側壁上的兩個連接口接出兩條管路，第一條管路通過電子壓力表連接到多岐接頭的第二閥門的進口上，第二條管路通過另一個電子壓力表、電磁閥與培養液壓力室下端連接，在第二條管路上設有種子細胞注入口；所述轉瓶機兩端分別設有頂蓋和底蓋，轉瓶機頂蓋與多通道旋轉接頭連接，所述轉瓶機底蓋與單通道旋轉接頭連接，轉瓶機內為一個空腔，空腔內設置有培養室，所述培養室通過密封環與多通道旋轉接頭主通路連接；所述轉瓶液壓室與單通道旋轉接頭連接，所述控制單元控制信號分別與轉瓶機、蠕動泵、恆流泵、電磁閥連接。
2.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述支架包括一塊 平板，在平板一邊折彎形成90度形成一塊豎直的平板，所述支架平板上設有吊臂。
3.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述多通道旋轉接 頭側壁上另有兩個連接口連接一個管路，所述管路置入蠕動泵，所述管路上設有種子細胞 注入口。
4.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述氧交換器的頂 部設有風扇，所述氧交換器的底部為漏鬥形。
5.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述去泡器頂部設 有密封蓋，所述密封蓋設有兩個開口，一個開口為與氧交換器連接導管的入口，所述導管底 部橫向彎折；另一個開口與一個閥門連接，所述閥門連接一個濾膜；所述去泡器上標有刻 度，所述去泡器的底部為漏鬥形。
6.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述培養液壓力室 內壁為光滑圓柱形，頂部設有密封蓋，所述密封蓋下部連接一根彈簧，彈簧底部連接一個活 塞，培養液壓力室的底部為漏鬥形。
7.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述轉瓶液壓室頂 部設有設有排氣口，排氣口上設有一個頂部閥門，所述頂部閥門為排氣閥門；在轉瓶液壓室 側面設有高低兩處開口，兩個開口上分別設有閥門，所述高處開口為轉瓶液輸入端，所述低 處開口與單通道旋轉接頭連接；所述轉瓶液壓室內部設有一個活塞，所述活塞與螺杆連接， 所述螺杆套有可旋轉的螺母，所述螺母設置在液壓室底部。
8.根據權利要求1所述的旋轉式組織應力培養系統，其特徵在於，所述轉接頭內部為 管網狀結構。
9.一種旋轉式組織應力培養方法包括將一個製作好的培養室放入轉瓶機；將膠原加 殼聚糖、膠原加粘多糖膠支架原材料灌注到培養室內；轉瓶機開始轉動，將種子細胞從種子 細胞注入口注入；開啟蠕動泵；其特徵在於；所述方法還包括從轉瓶液壓力室通過單通道旋轉接頭向轉瓶機的空腔內中注入轉瓶液，轉瓶液將培養室託住，使培養室處於懸浮狀態。
全文摘要
一種旋轉式組織應力培養系統及方法，包括支架，支架上安裝有培養液瓶、多岐接頭、氧交換器、去泡器、恆流泵、培養液壓力室、多通道旋轉接頭、轉瓶機、蠕動泵、廢液瓶、轉瓶液壓室、單通道旋轉接頭、控制單元，多岐接頭分別連接培養液瓶、氧交換器和廢液瓶，多通道旋轉接頭內部設有多條通路，多通道旋轉接頭側壁上的兩個連接口接出兩條管路，第一條管路連接多岐接頭第二閥門進口，第二條管路與培養液壓力室下端連接，第二條管路上設有種子細胞注入口；轉瓶機兩端分別設有頂蓋和底蓋，轉瓶機頂蓋與多通道旋轉接頭連接，轉瓶機底蓋與單通道旋轉接頭連接，轉瓶液壓室與單通道旋轉接頭連接，控制單元控制信號分別與轉瓶機、蠕動泵、恆流泵、電磁閥連接。
文檔編號C12M3/00GK101880629SQ20101023387
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者康陽揚 申請人:康陽揚