衣殼蛋白的抗病毒抑制的製作方法

2023-10-20 15:35:42

專利名稱：衣殼蛋白的抗病毒抑制的製作方法
技術領域：
本發明涉及獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的治療。具體而言，本發明涉及通過1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣殼蛋白的抑制治療AIDS。
背景技術：
病毒是只能在適當宿主細胞中複製的非細胞傳染物。病毒一般比細菌小，能夠感染動物、植物或細菌細胞。許多病毒是重要的病原體。傳染性顆粒(病毒體)由核酸核心以及有時還有的外包膜組成，該核心圍繞著蛋白質衣殼。
逆轉錄病毒是感染動物的有包膜單鏈RNA病毒。該家族由以三組組成泡沫病毒，如人泡沫病毒；慢病毒，如1型和2型人免疫缺陷病毒，以及綿羊髓鞘脫落病毒；和腫瘤病毒。
逆轉錄病毒顆粒由兩個相同的RNA分子組成。每個基因組都是正義、單鏈RNA分子，其5』端加帽，3』尾處聚腺苷酸化。原型C型腫瘤病毒RNA基因組含有三個開放閱讀框，稱為gag、pol和env，其邊界為含有病毒基因表達必需的信號之區域。gag區編碼病毒衣殼的結構蛋白。pol區編碼病毒蛋白酶以及用來加工基因組的蛋白質，包括逆轉錄酶、核糖核酸酶H和內切核酸酶酶活性。env區確定病毒包膜的糖蛋白。除了這三個開放閱讀框之外，慢病毒和泡沫病毒的更複雜的基因組還攜帶其它一些開放閱讀框，它們編碼與基因組表達控制有關的調節蛋白。
病毒與逆轉錄病毒的衣殼蛋白之間有實質上的同源性。本領域技術人員通過搜索任何標準生物技術搜尋引擎，能夠容易地確定這些同源性。
AIDS是一種逆轉錄病毒疾病，其特徵在於導致機會性感染、繼發腫瘤和神經表現的深度免疫抑制。這種現代瘟疫的嚴重性確實是驚人的。在美國，AIDS是25-44歲男性死亡的首要原因，是該年齡組女性死亡的第三位原因。儘管最早在美國發現並報導，但是現在全世界超過193個國家已經有報導。在非洲和亞洲，HIV感染人群龐大且快速增長。在有利於交換含有病毒或病毒感染細胞的血液或體液的條件下發生HIV的傳播。因此，三個主要的傳播途徑是性接觸、腸胃外接種和感染的母親將病毒傳給她們的嬰兒。由於AIDS具有幾乎相同的致死後果，因此尋找對該疾病的有效治療仍然是一個嚴重的醫學問題。
幾乎不用懷疑AIDS是由HIV引起的，HIV是一種非轉化人逆轉錄病毒，屬於慢病毒家族。O′Brien等人，HIV導致AIDS遵循柯赫氏法則，Curr Opin Immunol 8613(1996)。已經從AIDS患者中分離出兩種遺傳學不同但是相關的HIV形式，稱為HIV-1和HIV-2。HIV-1是美國、歐洲和中非最常見的與AIDS有關的類型，而HIV-2主要在西非引起類似的疾病。
與大多數逆轉錄病毒類似，HIV-1病毒體呈球形，含有一個電子緻密的圓錐形核心，其圍繞著由宿主細胞膜衍生的脂質包膜。病毒核心含有(1)主要衣殼蛋白p24(CA)，(2)核殼蛋白p7/p9，(3)兩個拷貝的基因組RNA，和(4)三種病毒酶(蛋白酶(PR)、逆轉錄酶(RT)和整合酶)。病毒核心圍繞著一種被稱為p17的基質蛋白，該蛋白位於病毒體包膜之下。散布於病毒包膜上的是兩種病毒糖蛋白，gp 120和gp 41，它們對於細胞感染HIV至關重要。
對於其它逆轉錄病毒，HIV原病毒基因組含有gag、pol和env基因，它們編碼不同的病毒蛋白質。gag和pol基因的產物最初被翻譯為大的前體蛋白，該蛋白質必須被病毒蛋白酶切割，產生成熟蛋白質。
CA最早合成，作為55kDa Gag前體多蛋白內的一個結構域。約4,000個拷貝的Gag在質膜處裝配，芽生形成不成熟的病毒顆粒。芽生後，Gag的蛋白水解切割釋放CA，觸發可促進衣殼顆粒裝配的構象改變。Gitti等人，HIV-1衣殼蛋白的氨基端核心結構域的結構，Science，273231-35(1996)；von Schwedler等人，HIV-1衣殼蛋白氨基端的蛋白水解摺疊促進病毒核心裝配，EMBO J.，171555-68(1998)；Gross等人，人免疫缺陷病毒衣殼蛋白的N端延伸將體外裝配表型由管形轉變為球形顆粒，J.Virol.，724798-4810(1998)。兩個拷貝的病毒基因組和傳染性所需的酶被包裝於成熟病毒體的中心圓錐形衣殼中。
最近的幾項研究表明，適當的衣殼裝配對於病毒的傳染性至關重要。抑制裝配的CA突變是致死性的，改變衣殼穩定性的突變可嚴重削弱複製，使CA成為一個有吸引力的潛在抗病毒靶標。Tang等人，顯示異常核心形態學的1型人免疫缺陷病毒N端衣殼突變體在感染細胞中逆轉錄開始時即被阻斷，J.Virol.759357-66(2001)；Reicin等人，Gag在1型人免疫缺陷病毒病毒體形態發生和病毒生命周期早期階段中的作用，J.Virol.，708645-52(1996)；和Forshey等人，具有最佳穩定性的1型人免疫缺陷病毒核心的形成對於病毒複製至關重要，J.Virol.765667-5677(2002)。
儘管已經開發了可與微小RNA病毒的衣殼蛋白結合併且通過抑制衣殼的解裝配抑制傳染性的抗病毒劑，Smith等人，人鼻病毒14對於抑制脫殼的抗病毒劑的附著位點，Science，2331286-93(1986)，但是HIV衣殼裝配或解裝配的抑制劑尚未鑑定。當前可用的治療HIV感染的藥物集中於RT和PR酶，它們是病毒基因組編碼的15種蛋白質中的兩種。當這些藥物獨立施用時，由於在不完全病毒抑制條件下選擇的抗性株迅速出現，這些藥物基本無效。Richman，D.D.，HIV的化學治療，Nature410995-1001(2001)。儘管在以適當組合使用抑制劑時病毒載量持續減少(非常有效的抗逆轉錄病毒治療，HAART)，Richman，D.D.，HIV的化學治療，Nature 410995-1001(2001)；Pillay等人，對批准的抗逆轉錄病毒藥物的耐藥性的發生率和影響，Rev Med Virol，10231-53(2000)，但是順應性較差、耐藥性以及與其它藥物或飲食相互作用所致的不充分抑制是限制HAART治療對許多患者的有效性的一個重要問題，能夠導致耐藥株的擴散。Mansky等人，藥物與耐藥性逆轉錄酶的組合使1型人免疫缺陷病毒突變體頻率倍增，J.Virol.，769253-59(2002)；Coffin，J.，體內HIV群體動力學基因變異、發病機理和治療的意義，Science，267483-89(1995)；Kuritzkes，D.R.，耐藥性在HIV-1感染中的臨床意義，AIDS，10S27-33(1996)。
儘管可以採用HAART治療，但是與AIDS有關的死亡率和發病率仍然很嚴重，並且現有的治療不能解決。這就需要能夠減少或改善不利事件並且改善AIDS臨床後果(包括，例如降低死亡率，改善罹患該疾病的患者的生活質量)的新的治療化合物和方法。
發明概述本發明提供評價待測化合物的抗病毒活性的新方法。該方法包括(a)使一種待測化合物接觸Gag283或其片段，(b)檢測待測化合物結合於靠近衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙的能力，和(c)評價待測化合物的抗病毒作用。衣殼蛋白可以是病毒衣殼蛋白或逆轉錄病毒衣殼蛋白。逆轉錄病毒衣殼蛋白包括但不限於HIV-1和HIV-2。衣殼蛋白可以是未成熟的或成熟的。另外，抗病毒作用包括但不限於病毒成熟過程中衣殼裝配的抑制和傳染過程中解裝配的抑制。
本發明還提供一種降低與AIDS有關的死亡率的方法。該方法包括對AIDS患者施用治療有效量的化合物，該化合物能夠結合於靠近HIV衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。本發明的化合物包括但不限於N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
本發明還提供一種治療AIDS患者的方法。該方法包括以有效減少與AIDS有關的發病數量和嚴重性的量施用化合物，其能夠結合於靠近HIV衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。本發明的化合物包括但不限於N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
本發明還提供一種評價待測化合物抑制Gag283形成β-髮夾的能力的方法。該方法包括(a)使一種待測化合物接觸Gag283或其片段，和(b)檢測該化合物幹擾Gag283的β-髮夾形成的能力。
本發明還提供一種根據抑制Gag283的β-髮夾形成的能力篩選待測化合物的方法。該方法包括(a)使待測化合物接觸Gag283或其片段，和(b)檢測該化合物幹擾Gag283的β-髮夾形成的能力。
本發明還提供一種根據抑制Gag283的β-髮夾形成的能力鑑定待測化合物的方法。該方法包括(a)利用Gag283分子坐標產生Gag283的3D計算機模型，和(b)利用該模型鑑定可與Gag283結合的待測化合物。
本發明還提供一種方法，用於鑑定可結合於靠近衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙的待測化合物。該方法包括(a)利用Gag283分子坐標產生Gag283的3D計算機模型，和(b)利用該模型鑑定可結合頂端裂隙的待測化合物。該衣殼蛋白可以是病毒衣殼蛋白或逆轉錄病毒衣殼蛋白。逆轉錄病毒衣殼蛋白包括但不限於HIV-1和HIV-2。
本發明還提供具有以下所述通式I的CAP-1、CAP-2、CAP-3、CAP-4、CAP-5、CAP-6或CAP-7的任何衍生物或藥學可接受的鹽，它是一種抗病毒化合物，能夠結合於靠近HIV-1衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙，並抑制核心顆粒的適當裝配。具體而言，本發明提供CAP-1或其相關分子的衍生物或藥學可接受的鹽，其含有脲基，它在一個氮上含有取代的芳香取代基，在另一個氮上含有與第二個芳基連接的柔性鏈(tether)。
附圖簡述

圖1顯示獨立測定的Gag283的MA和CAN域的擴散張量。Dzz是指軸對稱的擴散張量的主要分量。
圖2是迄今為止測定的HIV-1衣殼蛋白CAN域的X射線和NMR結構的比較。
圖3顯示在HIV-1衣殼蛋白的頂端裂隙中停靠的CAP-1。
圖4顯示與CAP-1結合HIV-1衣殼蛋白的頂端裂隙有關的近程相互作用。
圖5顯示2H，15N-標記的Gag283樣品獲得的解析度提高的1H-15N HSQC譜。
圖6顯示確定結構區和遷移率的NMR弛豫和化學位移數據。
圖7列表顯示20種最低能量Gag283構象異構體的結構統計學。
圖8顯示對於既不顯示顯著內部遷移率也不顯示構象交換的殘基，測定的骨架15N R2/R1值。
圖9是測定的CAN與Gag283的NMR結構的比較，顯示與螺旋6有關的構象差異。
圖10顯示螺旋6的位移和CypA結合環位置的同時改變。
圖11顯示對於未成熟和成熟的CAN域的骨架原子，所見的化學位移差異。
圖12顯示用CAP-1滴定後獲得的HIV-1衣殼蛋白N端結構域的2D1H-15N HSQC譜覆蓋圖。
圖13顯示用CAP-1、CAP-2、CAP-3和CAP-4滴定後獲得的HIV-1衣殼蛋白N端結構域的2D1H-15N HSQC譜覆蓋圖。
圖14顯示用CAP-5、CAP-6和CAP-7滴定後獲得的HIV-1衣殼蛋白N端結構域的2D1H-15N HSQC譜覆蓋圖。
圖15顯示殘基Ser 33(方形)、Val 59(菱形)和Gly 60(星形)的15N NMR化學位移滴定數據，與1∶1結合等溫線擬合(Kd＝0.82±0.18mM)。
圖16是濁度測定結果的圖示，顯示CA結合化合物對體外衣殼裝配的影響。
圖17是潛伏感染的U1培養物隨添加的CAP-1改變的病毒傳染性(菱形)、細胞生存力(正方形)和病毒產量(三角形)的圖示。
圖18是在感染的U1和MAGI細胞與100μM CAP-1溫育72小時後獲得的細胞生存力、與病毒顆粒有關的RT和CA水平和傳染單位的圖示。
圖19顯示衣殼蛋白Western印跡測定，顯示游離的、Gag多蛋白和部分加工狀態的細胞內和細胞外病毒CA隨加入的CAP-1而改變的相對濃度。
發明詳述成熟HIV-1的CA含有一個N末端β-髮夾，後者是衣殼核心顆粒形成所必需的。在病毒成熟過程中，Gag前體多蛋白的蛋白水解切割產生CA。迄今為止，高解析度的結構研究集中於成熟病毒的蛋白質。成熟的HIV-1 CA蛋白由N末端核心(CAN)和C末端二聚體(CAC)結構域組成，它們獨立摺疊並且通過一個柔性接頭連接。CAN核心域含有一個13殘基的N末端β-髮夾，該髮夾被Pro1的末端NH2+基與Asp51的側鏈羧基之間的鹽橋部分穩定。這些殘基高度保守，除了泡沫病毒之外，可能其它所有逆轉錄病毒都含有類似的N末端β-髮夾。誘變研究表明，β-髮夾是形成HIV-1衣殼核心顆粒所需的，它可能通過直接參與分子間CA-CA相互作用起作用。
Gag的CA域也負責包裝約200個拷貝的宿主蛋白質CypA(它是一種脯氨醯異構酶)和HIV-1感染性必需的一種侶伴蛋白質。儘管CypA的確切功能還不清楚，但是懷疑該蛋白質有利於感染過程中衣殼核心的解裝配。
冷凍-電子顯微鏡(EM)法已經用來研究未成熟病毒體和病毒樣顆粒中Gag多蛋白的結構。在低解析度下，裝配的Gag蛋白表現為與病毒膜結合的電子緻密層。最近的許多研究表明，該電子緻密層實際上由幾個球形密度殼組成，包括對應於Gag蛋白MA域的直接與脂雙層結合的外殼，對應於CAN和CAC域的兩個殼，和對應於Gag的NC域和結合的RNA基因組的最內層的第四個殼。MA和CAN殼的厚度嚴格對應於摺疊的結構域的長度(從N端到C端測量)(圖1)。令人感興趣的是，MA與CAN殼的間距只有40，即使本發明人曾表明，在Gag283的展開形式中，這些結構域能夠相距80以上。如果MA的柔性C端螺旋度部分展開，這種間距可能更大。這表明，除柔性接頭長度之外的其它因素決定了未成熟顆粒中殼的間距，證實MA和CA域形成具有明確的蛋白質-蛋白質相互作用的有序殼。
在蛋白水解成熟後，未成熟病毒體的球形CA殼濃縮形成特有的圓錐形衣殼核心顆粒。N端β-髮夾是形成衣殼核心顆粒所需的。用來抑制體內β-髮夾形成的突變，包括Pro 133突變為Leu和Asp 183突變為Ala，導致形成不能形成正常衣殼核心並且無傳染性的病毒顆粒。另外，天然CA分子也能夠裝配為具有類似於天然衣殼核心的某些特徵的管形，而在CA的N端添加殘基，或者Asp 183突變為Ala，導致形成一種不均勻的結構混合物，這些結構通常呈球形，類似於未成熟病毒體的衣殼。β-髮夾使得在與抗體片段結合的完整CA蛋白和與CypA結合的CAN域的晶體結構中存在廣泛的晶格接觸，提示β-髮夾通過直接參與分子間CA-CA相互作用促進衣殼裝配。
β-髮夾在未成熟的蛋白質中是未摺疊的，在Gag的蛋白水解切割之後發生β-髮夾的形成，觸發衣殼裝配。隨後能夠在Pro133-NH2+與保守Asp 183的COO-側鏈之間形成的鹽橋，以及在未成熟蛋白質中不存在的大量其它相互作用，能夠穩定髮夾的形成。所述其它的相互作用不僅包括β-鏈間的氫鍵鍵合和包裝，而且包括髮夾與CAN域其餘部分之間的相互作用，包括Ile 134的骨架NH與Gly 178的羰基之間的新氫鍵，以及Ile 134(β-髮夾)與Thr 180(螺旋3)和Ile 247與Met 250(螺旋6)的側鏈之間的疏水包裝。因此，衣殼裝配機制與通過絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族進行酶激活所用的機制具有極其類似的特徵，其中無活性酶原的蛋白水解切割產生一個新的N端NH3+基，它與埋藏的羧基形成鹽橋，並且激活該酶。
脫殼過程依賴於CypA的存在，HIV-1包裝CypA對於傳染性至關重要。含有使CypA不能結合的CA突變的病毒體能夠裝配並成熟，在冷凍-EM圖像中顯示正常。然而，儘管這些顆粒能夠融合併穿入靶細胞，但是它們不能逆轉錄它們的基因組，表明在對於最可能在病毒成熟和膜融合後發生的複製循環的早期事件中CypA是必需的。令人感興趣的是，不能有效包裝CypA的突變病毒體在含有異常內在高濃度CypA的細胞系中具有傳染性，在環孢黴素類似物存在下自發產生的回覆突變體的傳染性取決於這些CypA抑制劑。總之，這些發現表明，衣殼裝配和解裝配過程被精細調節，細胞條件中相對較小的突變或改變能夠影響衣殼核心的穩定性。
以下所述的NMR數據表明，β-髮夾的形成誘導螺旋-6約2的位移和CypA結合位點的同時位移。鑑於以下事實(i)β-髮夾對於衣殼裝配顯然至關重要，和(ii)CypA可能參與解裝配，這些位點之間的構象偶聯與CypA介導的脫殼相關事件有關。因此，CypA與暴露環的結合移動了螺旋-6的位置，導致β-髮夾以去穩定衣殼及促進脫殼的方式去穩定或復位。NMR化學位移作圖實驗表明，在CypA與成熟CAN域結合後，螺旋6的骨架醯胺信號大大位移。儘管成熟CAN的β-髮夾相對是可移動的，但是其位置在自由結構域的NMR結構中確定。
相反，在CypA-CAN二聚體的X射線晶體結構中，兩個β-髮夾中只有一個觀察到確定的電子密度。X射線結構中丟失的電子密度可能因此至少部分是由於CypA的結合。此外，迄今為止檢測的HIV-1 CAN域的5種X射線和NMR結構的比較也表明，根據結構研究使用的條件不同，螺旋-6的位置也可能不同(圖2)。在成熟CANCypA複合物的高解析度X射線結構(2.36)中，螺旋-6的骨架原子報告的溫度因素通常高於其它螺旋。總之，這些數據表明，螺旋-6是相對可移動的，其位置對於CypA的結合和β-髮夾的形成敏感。最後，CypA對Gag的親和力比它對成熟衣殼蛋白的親和力大1000倍。通過β-髮夾與CypA結合位點的構象偶聯能夠解釋親和力的這些差異。
利用下列常用方法檢測HIV-1 Gag多蛋白的N端一半(殘基2-283)的三維結構。利用聚合酶鏈反應(PCR)由pNL4-3質粒擴增編碼HIV-1 Gag前體蛋白的N端283個殘基和附加的C端His6尾的DNA。用攜帶Gag283的質粒轉化BL21 codon plus RIL細胞系(Stratagene，La Jolla，CA)。轉化的細胞在M9基本培養基上生長，該培養基含有溶於H2O或99％2H2O(Martek，Columbia，MD)的15NH4Cl和/或UL-[13C]葡萄糖(CambridgeIsotope Laboratories，Andover，MA)作為唯一氮源和/或碳源。蛋白質利用鈷親和樹脂(Clontech，Palo Alto，CA)一步純化。一般而言，一升生長培養基產生20mg Gag283。其分子量通過ESI-MS證實。
用1mM蛋白質樣品採集NMR數據，該樣品中含有50mM pH 5.0的乙酸鈉緩衝液、100mM NaCl、5mM β-巰基乙醇和1×蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem，San Diego，CA)。所有NMR研究都用裝備xyz-梯度三共振探頭的600 MHZ Bruker AVANCE DRX分光計進行；T＝30℃，骨架歸屬使用2D15N HSQC、3D恆時HNHA、HN(CO)CA、HNCO和4D15N/15N-編輯的NOESY(4DNN)數據。U-2H/15N標記的樣品獲得4DNN數據；Tmix＝200ms。對U-13C/15N標記的樣品採集的其它NOE數據包括4D13C/15N-編輯的NOESY(Tmix＝120ms)和4D13C/13C-編輯的NOESY(Tmix＝100ms，在2H2O中記錄)。NMR數據用NMRPipe處理，用NMRView分析。信號用標準歸屬策略歸屬。
NOE交叉峰根據量值分類為強、中、弱，分別用來歸屬2.7、3.2和5.0的距離上限。分別增加0.5、0.8、2.3、1.5補償亮氨酸或纈氨酸的甲基、簡併germinal亞甲基、簡併芳基質子和非立體特異性歸屬的甲基的距離。根據特徵性NOE模式和化學位移指數實施骨架氫鍵約束(H-O距離為1.8-2.7，N-O距離為2.4-3.2)，補充典型二級結構。
利用程序TALOS，通過13Cα、13Cβ、1Hα、13C和15N化學位移的分析獲得骨架二面角約束。用DYANA進行的結構計算最初只用由NOE數據得出的距離約束進行。隨後加入氫鍵和二面角約束，進一步使目標函數最小化。用Procheck-NMR評價產生的結構的質量。用Chimera和MolScript獲得並用Raster 3D提供圖像。
15N弛豫數據是在上述條件下製備的U-2H/15N標記的Gag283樣品的數據。骨架15N核的{1H}-15N穩態異核NOE(XNOE)用反向檢測的水flip-back脈衝序列測定。通過以交錯模式和不同的延遲採集8個二維譜，確定縱向弛豫率R1和橫向弛豫率R2。15N T1(＝1/R1)的8個延遲是10.04、120.49、512.09、763.12、1004.11、1506.16、2008.21、2510.26ms，15N T2(＝1/R2)的延遲是21.10、36.70、52.30、67.89、83.49、99.09、114.69、130.29ms；回復延遲為4s。
由質子飽和下(I)與沒有質子飽和下(I0)的15N/1H相關峰的強度比(I/I0)得出指定殘基的XNOE值。由基線噪聲估計誤差。使用商業軟體Orgin 6.0(microcal，Northampton，MA)，通過將8個譜的峰強度與兩參數(R2)或三參數指數(R1)衰減相擬合，獲得每個良好解析的峰的弛豫率。在弛豫數據的填充過程中計算報告的誤差。根據旋轉擴散計算排除了顯示ps-ns級顯著內部運動(XNOE＜0.70)或μs-ms級化學交換的NH基(R2顯著提高，而R1不提高)，其餘的弛豫數據用Quadric Diffusion1.12(A.G.Palmer，Columbia University)分析。
Gag283的NMR化學位移歸屬已經被BioMagResBank(http//bmrb.wisc.edu)保藏，保藏號為5316。具有最低目標函數的20種構象異構體的坐標，和有關的約束列表，保藏於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(http//www.rcsb.org/pdb)，保藏號為1L6N。成熟CAN域的優化結構的約束列表和坐標也已經保藏，保藏號為(1GWP)。
HIV-1 Gag多蛋白的N端一半(殘基2-283)的三維結構顯示，有一個表面裂隙暴露於未成熟蛋白質的CA域上，但是在蛋白水解成熟後被CA蛋白的N端β-髮夾的殘基填充。與β-髮夾裂隙結合的化合物抑制病毒的成熟並且具有抗病毒活性。
進一步的研究揭示，靠近CA的N端結構域的C端有另外一個結合位點(頂端裂隙)。與β-髮夾口袋不同，該頂端裂隙在CA的N端結構域的成熟和未成熟形式上均存在。可結合該頂端裂隙的化合物抑制衣殼裝配，並且具有抗病毒特性。其骨架醯胺信號被抑制劑結合頂端裂隙最明顯地幹擾的CA的殘基在HIV序列概要的93個基因組序列中嚴格保守(Glu 35，Val 36，Val 59，Gly 60，His 62，Gln 63，Ala 65，Tyr 145)或者極少且保守地置換(括號中為發生數E29D(2)，K30R(1)，A31G(16)，A31N(1)，F32L(1)，SeeN(13)，G61E(1)，M144T(1))。大多數保守殘基都暴露於N端結構域的表面上，提示具有可能的大分子相互作用功能。N端結構域的頂端裂隙的殘基參與體外衣殼形成後的分子間CA(N末端結構域)-CA(C末端結構域)界面。這與此處所述的其它公開內容一起，提供了抑制劑化合物通過抑制適當衣殼裝配所需的分子間CA-CA相互作用機械作用的有力證據。
殘基Trp 23和Val 59在抑制劑配體結合後顯示顯著的化學位移改變，但是事實是它們埋藏於CA單體的螺旋1、2、3之間。因此，裝配抑制劑可能改變衣殼蛋白的局部結構，從而可能競爭性抑制CA-CA相互作用，或者促進結構扭曲的衣殼的形成。
衣殼裝配的抑制不需要具有極高CA親和力的配體。這可能是由於裝配的病毒體中局部高濃度的Gag分子(14mM)，這有利於被具有適度親和力的配體結合，例如N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。因此保守地假設，芽生病毒和細胞中胞質藥物濃度相等(100μM)，與CA結合的病毒CAP-1分子的百分比可以通過標準質量作用計算來估計，獲得結合的CAP-1([CACAP-1])的濃度值為94μM。這表明在未成熟的病毒體中有94％的CAP-1分子(100μM劑量)與Gag結合，少到與每個病毒體約25個分子結合即足以抑制病毒成熟過程中的核心裝配。
圖3顯示停靠在衣殼蛋白結構中的小分子配體CAP-1。利用實驗測定的衣殼蛋白的NMR結構產生Connoly表面。該配體的網架(wireframe)模型用綠色表示。配體結構用適當的從頭開始的方法最小化。衣殼結構用顏色顯示疏水性(藍色，疏水性最強；紅色，親水性最強；白色，中度疏水性)。
圖4顯示了實驗確定的重要的相互作用。值得注意的是Tyr 145的芳環與CAP-1的呋喃間的相互作用；CAP-1的芳環的氯與Ile 37的疏水側鏈間的相互作用；該分子的二硫成分中的硫與Ser 146的羥基的相互作用；Ser 33的羥基側鏈與CAP1呋喃5-位點上的二甲基氨甲基取代基的氮之間的相互作用。
其它一些脲，包括本發明描述的所有脲，通過實驗確定具有功能上極其類似的與衣殼蛋白的相互作用。根據以下圖13-14所示的二維NMR數據，這是顯而易見的。
在配體CAP-1及其結構同源物的存在下通過檢查衣殼蛋白的多維NMR譜獲得的數據證實存在可能高親和力的配體結合位點。意外地發現了多種特異性且選擇性的相互作用，這不僅證明了這個位點的存在，而且有助於建議如何為該位點設計極高親和力的配體。
發現配體需要有幾個結構特徵。在分子的一側含有取代的苯基或另一個芳基是必要的，其含有相對較大的取代基。在這種情況下，氯原子可用於此目的。然而，實驗數據與模型擬合結合起來，提示使用Br原子或I原子可以提高結合親和力。該芳環上的其它取代基未清楚地指出其位置，但是按照我們的觀點，在滷素的鄰位含有取代基，如氰基或二烷基氨基，將對結合位點模型有積極作用。3，4-二氯苯基或3-氯-4-溴苯基部分也能夠起作用。
CAP-1中硫原子的相對位置非常重要。在該體系中使用不同氧化態的硫可能不會產生活性。碸或磺胺是這樣。呋喃能夠被側鏈上含有不同取代基的多種雜環基團同樣地替換。除了二甲基氨甲基之外，該基團被替換為如胍、N-氰基胍、N-硝基胍等的基團可能產生活性化合物。
對胞質Gag有較高親和力的化合物在裝配的病毒中濃縮，對CA有較高親和力的化合物是更強的體外裝配抑制劑。因此，能夠合理地設計效能提高的藥物作為HIV-1衣殼裝配的抗病毒抑制劑。
也公開了CAP-1、CAP-2、CAP-3、CAP-4、CAP-5、CAP-6或CAP-7的衍生物，它們是抗病毒化合物，可以結合HIV-1衣殼蛋白N端結構域的頂端部位，並且抑制核心顆粒的適當裝配。具體而言，本發明提供CAP-1或其相關分子的衍生物，它們含有脲基，在一個氮上含有一個取代的芳族取代基，在另一個氮上含有與第二個芳基連接的柔性鏈。例如，這些衍生物是通式I的化合物或藥學可接受的鹽 其中(a)R1代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(b)R2代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(c)R3代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(d)R4代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(e)R5代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(f)滷素只限於氟、氯、溴和碘；(g)R8和R9獨立地是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環丙基甲基、環丙基乙基、環丁基甲基、環丁基乙基、環戊基甲基、環己基甲基或環己基乙基；(h)字母n、m和p獨立地代表1-6中的任何一個整數；(i)R6和R7獨立地選自氫或烴基，該烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多6個碳原子；(j)X選自O或S；(k)Y是雜環、碳環或任選取代的苯基；(l)雜環選自任何穩定的5、6或7元單環或雙環或7、8、9或10元雙環雜環，它是飽和的、部分不飽和的或不飽和的(芳族)，由碳原子和1、2、3或4個獨立選自N、NH、O和S的雜原子組成，包括任何雙環基團，其中上述任何雜環都與苯環稠合。氮和硫雜原子任選地可以被氧化。雜環可以在任何雜原子或碳原子處以產生穩定的結構的方式與其側基連接。如果獲得的化合物穩定，此處所述的雜環可以在碳或氮原子上被取代。如果特別指出，雜環中的氮任選地可以被季銨化。優選地，當雜環中S和O原子的總數超過1時，這些雜原子不彼此相鄰。此處所用的術語「芳族雜環系統」是指一種穩定的5-7元單環或雙環或7-10元雙環雜環芳環，它由碳原子和1-4個獨立選自N、O、S的雜原子組成。雜環的例子包括但不限於1H-吲唑、2-吡咯烷基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯並咪唑基、苯並呋喃基、苯並硫代呋喃基、苯並苯硫基、苯並噁唑基、苯並噻唑基、苯並三唑基、苯並四唑基、苯並異噁唑基、苯並異噻唑基、benzimidazalonyl、咔唑基、4aH-咔唑基、β-咔啉基、苯並二氫吡喃基、苯並吡喃基、噌啉基、十氫喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氫呋喃[2，3-b]四氫呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氫吲哚基、中氮茚基、吲哚基、異苯並呋喃基、異苯並二氫吡喃基、異吲唑基、異二氫吲哚基、異吲哚基、異喹啉基(苯並咪唑基)、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、1，5-二氮雜萘基、八氫異喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩噁嗪基、2，3二氮雜萘基、哌嗪基、哌啶基、喋啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶噁唑、吡啶咪唑、吡啶並噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹噁啉基、奎寧環基、咔啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩並噻唑基、噻吩並噁唑基、噻吩並咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基和呫噸基。優選的雜環包括但不限於吡啶基、苯硫基、呋喃基、吲唑基、苯並噻唑基、苯並咪唑基、苯並苯硫基、苯並呋喃基、苯並噁唑基、苯並異噁唑基、喹啉基、異喹啉基、咪唑基、吲哚基、異吲哚基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡唑基(pyrrazolyl)、1，2，4-三唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、吡嗪基和嘧啶基，和含有上述雜環的稠環和螺環化合物；(m)碳環是指任何穩定的3、4、5、6或7元單環或雙環或7、8、9、10、11、12或13元雙環或三環，它們均可以是飽和的、部分不飽和的或芳族的。這些碳環的例子包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、金剛烷基、環辛基；[3.3.0]雙環辛烷、[4.3.0]雙環壬烷、[4.4.0]雙環癸烷(萘烷)、[2.2.2]雙環辛烷、芴基、苯基、萘基、2，3-二氫化茚基、金剛烷基或四氫萘基(四氫化萘)；(n)通式II定義的取代的苯基 其中(o)R10代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(p)R11獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(q)R12獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(r)R13獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(s)R14獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(t)R8和R9獨立地是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環丙基甲基、環丙基乙基、環丁基甲基、環丁基乙基、環戊基甲基、環己甲基或環己基乙基；(u)滷素只限於氟、氯、溴和碘。
含有可結合HIV-1衣殼蛋白頂端裂隙的化合物的治療組合物可以全身或局部施用。全身施用途徑包括口服、靜脈內、肌肉內或皮下注射(包括在長效製劑(depot)內長期釋放)、眼內和眼球後、鞘內、腹膜內(例如腹膜內灌洗)、使用霧化或噴霧藥物的肺內或經皮途徑。局部途徑包括以油膏劑、滴眼劑、滴耳劑、灌洗液(例如用於傷口灌洗)或含藥洗髮劑的形式施用。對於含有可結合HIV-1衣殼蛋白頂端裂隙的化合物的治療組合物，本領域技術人員根據良好的醫療實踐和個體患者的臨床條件，能夠容易地優化其有效劑量和施用方案。
可結合HIV-1衣殼蛋白頂端裂隙的化合物的施用優選地用藥物組合物實現，該組合物含有這種化合物和藥學可接受的稀釋劑、佐劑或載體。該化合物施用時可以不含或者含有已知的表面活性劑、其它化療劑或已知的其它抗病毒劑。
在參看下列說明性實施例後將理解本發明的其它方面和優點。實施例1描述Gag283的總體結構和動力學。實施例2描述Gag283的MA域的結構。實施例3描述Gag283的CAN域的結構。實施例4描述CA的N端結構域上配體結合位點的鑑定。實施例5描述可結合HIV-1衣殼蛋白頂端裂隙的化合物對衣殼裝配的體外抑制。實施例6描述可結合HIV-1衣殼蛋白頂端裂隙的化合物對病毒傳染性的抑制。實施例7描述衣殼裝配的體內抑制。
實施例1Gag283的總體結構和動力學克隆並製備對應於HIV-1pNL4-3的283個N端殘基(加一個C端六組氨酸尾)的一種32.2kD重組多肽(Gag283)進行NMR研究(Mrcalc＝32216.6道爾頓，Mrexp＝32216.1±0.8道爾頓。獲得高質量的NMR譜(圖5)，能夠進行幾乎全部的1H，15N和13C NMR信號歸屬。骨架原子的NMR化學位移表明它是一種高度螺旋的結構(圖6)。
殘基Gly 2-Ser 6、Gly 123-Val 143和Pro279-Leu 283顯示相對較低的{1H}-15N異核NOE(XNOE)和T2弛豫值(圖6)，以及極少或者沒有中間範圍的1H-1H NOE，表明這些殘基的構象是不穩定的。相對穩定的殘基Val 7-Thr 122和His 144-Ser 278使用總共2376個通過實驗獲得的約束(2046個距離約束和332個扭轉角約束，相當於每個約束的殘基17.7個約束)。用DYANA產生20種優化結構，其具有1.50±0.242的目標函數和良好的結構統計學(圖7)。MA的殘基VAL 7-Thr 122和CAN的His 144-Ser 278顯示良好的收斂性，這兩個螺旋的骨架重原子的配對RMS偏差分別為0.41±0.09和0.72±0.14。由於連接摺疊結構域的移動殘基(Gly 123-Val 143)不使用約束，在這些結構域之間未見NOE，MA和CAN域的相對方向沒有確定。計算表明，當殘基Gly 123-Val143完全展開時，兩個結構域能夠分開可達80。
獲得的骨架NH基的T1/T2比表明，MA和CAN域以不同的旋轉相關時間翻滾(tumble)。對於這兩個結構域，不同螺旋的殘基的T1/T2(＝R2/R1)比通常聚簇，表明各向異性旋轉擴散(圖8)。與CAN域的T1/T2比有關的誤差略微大於MA域，因為CAN信號的譜線寬度較大(相應的信噪比較低)(圖6)。對於CAN域的某些螺旋(特別是螺旋7)可見相對較少的聚簇，這可能是由於存在弱CAN-CAN分子間相互作用。實際上，當樣品濃度由1.0mM降至0.25mM時，指定螺旋的T1/T2比的分散減少，但是平均T1/T2比基本不受影響。MA和CAN域的旋轉擴散特性獨立計算。用長軸對稱擴散模型獲得最佳統計學擬合，這使得MA和CAN域的旋轉相關時間分別為10.0±0.1ns和13.2±0.2ns。擴散張量的主軸(即它周圍的旋轉擴散最快的軸)幾乎與連接摺疊結構域的N端與C端殘基的載體一致(圖1)。
實施例2Gag283的MA域的結構Gag283的MA域的結構與分離的成熟蛋白質基本相同。成熟和未成熟的MA NMR結構的剛性殘基的骨架重原子的重疊使得配對RMS偏差為1.27±0.005。由於在當前的NMR研究中使用更現代的方法學(即基於化學位移的約束和使用4D NMR數據)，該結構與成熟MA三聚體的X射線結構非常一致(1.14±0.09)。當從X射線結構擬合中除去三聚化後構象改變的310螺旋(Pro 66-Gly 71)後，擬合提高為0.90±0.11。1H-1HNOE數據表明，C端螺旋延伸到該結構域的球形部分以外，到達殘基Thr122。然而，對於殘基Ile 104-Gln 117，Cα化學位移指數逐漸從螺旋值降低為無規捲曲值，而弛豫數據同時表明逐漸從α-螺旋佔優勢向無規捲曲構象佔優勢轉換(圖4)。這一發現與報告的成熟MA三聚體的X射線結構數據一致，其中這些殘基的電子密度在6個不同晶胞分子之間大大不同。
實施例3Gag283的CAN域的結構Gag283的CAN域的總體結構非常類似於成熟CAN域。為了便於比較，成熟結構域也使用未成熟CAN的胺基酸編號方案(即Pro 133是成熟CAN的N端殘基)。殘基Ser 148-Lys 162、Ser 165-Ser 176、Thr 180-Val191、His 194-His 216、Arg 232-Ala 237、Thr 242-Thr 251、Val 258-Ser278形成7個α-螺旋(分別是螺旋1-7)，它們以扁平的三角形包裝在一起，殘基Pro 217-Pro 231(包含CypA結合位點)形成一個構象靈活的環。CANNMR結構的成熟和未成熟形式的螺旋殘基骨架重原子的重疊使得配對RMS偏差為1.32±0.13。
相反，Gag283的殘基Pro 133-Val 143的構象與成熟CAN蛋白所見大大不同。這些殘基未見遠程1H-1H NOE的中間值，化學位移指數數據表明它們以無規捲曲構象存在(圖6)。這些殘基的15N NMR弛豫特性也表明高度的構象靈活性(圖6)。在成熟CAN域中，殘基Pro 133-Asn 137與殘基Gln 141-Gln 145配對，形成正對螺旋-6包裝的β-髮夾的反平行鏈，Pro 133的骨架NH2+基與Asp 183的部分埋藏的側鏈形成一個鹽橋。另外，儘管在未成熟和成熟結構中殘基His 144-Ile 147與CAN域的球形部分相互作用，但是NOE數據的差異表明存在精細但是重要的結構差異。例如，在成熟CAN域中，His 144-Hβ質子顯示中等密度NOE，含有Ile247的側鏈甲基質子(螺旋6)，而在成熟結構域中這些基團產生極弱的NOE。
另外，螺旋6相對於它在成熟蛋白質中的位置位移約2(圖10和11)。在未成熟結構域中，為螺旋3加帽的Thr 180的側鏈包裝於螺旋6的Leu 243、Ile 247和Met 250的側鏈形成的疏水簇內(圖9)，在Thr 180與Ile 247甲基之間觀察到極強的1H-1H NOE。然而，在成熟蛋白質中，Ile 134的側鏈插入這個疏水口袋中，使Thr 180與Ile 247側鏈分離約2，結合的殘基間NOE的強度大大降低。
此外，Leu 243側鏈的χ2-角有大約90度旋轉的不同，Met 250的甲基在未成熟結構域中重新定向，使其部分填充成熟結構域的Ile 134側鏈佔據的空間(圖9)。螺旋6也與CypA結合環接觸。儘管該環是柔性的，但是NMR結構的兩個總體的定性比較表明，可與CypA的活性位點結合的Pro 222相對於它在成熟CAN域中的位置移動幾埃(圖10)。對於殘基Pro 133-Ile 147觀察到顯著的1H，15N和13C化學位移差異，它們在未成熟蛋白質中展開，但是在成熟結構域中形成一個β-髮夾(圖11)。對於可與成熟CAN域中的β-摺疊相互作用的Ala 179、Thr 180、Ile 243、Ile 247、Met 250和Leu 243，也觀察到顯著的位移。這些位移差異與上述結構變化完全一致。
最後，對於Glu 177和Gly 178的骨架醯胺，觀察到信號倍增和R2交換展寬(圖5和圖6)。在可能引起這些效應的這些殘基附近沒有大芳族側鏈。而是，信號倍增是由於與Glu 177-Gly 178-Ala 179肽鍵有關的ψ和φ扭轉角的不均一性。對於成熟蛋白質中的這些殘基，未見信號倍增，其中Gly 178的羰基與β-髮夾的Ile 134骨架NH形成一個氫鍵。
實施例4CA的N端結構域的配體結合位點的鑑定從HIV-1cDNA質粒pNL-4-3中擴增編碼CA的N端結構域的DNA(殘基1-151)，向該基因上添加編碼C端六組氨酸尾的寡核苷酸。該DNA插入plla表達載體(Novagen，Madison，WI)中，蛋白質產物通過鈷親和層析(Clontech，Palo Alto，CA)純化；MWcalc＝17523.0道爾頓，MWobs＝17523.10±0.44道爾頓(電噴霧質譜法)。全長天然衣殼蛋白的質粒由Dr.W.I.Sundquist(University of Utah，Salt Lake City，UT)惠贈，蛋白質如上所述純化。NMR譜用常規三共振法歸屬。1H-15N NMR HSQC滴定實驗獲得的結合等溫線用ORIGIN 7.0軟體(MicroCal，Northampton，MA)計算。
為了鑑定抑制衣殼蛋白功能的化合物，為了可能結合衣殼蛋白表面上的裂隙的化合物篩查公開的結構域化學文庫，並且利用NMR滴定光譜法檢測其結合。篩查實驗主要集中於一個β-髮夾裂隙，該裂隙暴露於未成熟衣殼蛋白的N端結構域的表面，但是被Gag蛋白水解切割後形成的β-髮夾的殘基所佔據。來自公開結構域化學文庫的化合物用DOCK-4.0篩查，通過實驗檢測40種具有良好理論結合特性(結合能＜-26kCal/mol，接觸得分＜-40)的化合物與完整CA蛋白、CA的N端結構域和未成熟Gag多蛋白的283殘基片段(Gag283)的結合。鑑定了在對於衣殼裝配似乎至關重要的一個位點與衣殼蛋白結合的幾種化合物。代表性化合物包括但不限於N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。一種化合物，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，在細胞培養中尤其良好地耐受，能夠用來進行以下所述的體內抗病毒和機械研究。
成熟的N端結構域用N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)滴定。用CAP-1滴定成熟NTD後獲得的代表性1H-15N HSQC NMR數據在圖12中顯示。儘管大多數信號不受滴定的影響，但是有一個亞組的信號隨CAP-1濃度的增加而位移，表明存在位點特異性結合。
類似地，滴定可結合HIV-1衣殼蛋白N端結構域頂端裂隙的其它化合物。在圖13中列出了CAP-1、CAP-2、CAP-3和CAP-4滴定後獲得的1H-15N HSQC NMR數據與HIV-1衣殼NTD的重疊。化合物CAP-1和CAP-2與蛋白質的頂端位點結合，隨添加的化合物而改變的特異性化學位移改變證實了這一點。在添加CAP-3和CAP-4後觀察到的輕微幹擾和信號展寬表明結合極弱。圖14顯示了在存在及不存在衣殼結合化合物CAP-5、CAP-6和CAP-7的情況下獲得的1H-15N HSQC NMR數據與HIV-1衣殼NTD的重疊。結合幹擾的信號用圓形表示。為了比較，圖14也顯示用不與衣殼蛋白結合的兩種結構相關的化合物獲得的結果。
化學位移改變與1∶1結合等溫線擬合，在35℃下平衡解離常數(Kd)為0.182±0.18mM(圖15)。對於第二種化合物，1-(4-(N-乙醯胺基)苯基)-3-(4-甲基-3-硝基苯基)脲(CAP-2)，觀察到顯著更緊密的結合，Kd＝52±27μM。在這兩種情況下，被結合幹擾的CA殘基(1HNΔδ＞0.1ppm；15NΔδ＞0.5ppm；Glu 29、Lys 30、Ala 31、Phe 32、Ser 33、Glu 35、Val 36、Val 59、Gly 60、Gly 61、His 62、Gln 63、Ala 65、Met 144和Tyr 145)位於或靠近螺旋束(螺旋1、2、3、4和7)的頂端。用Gag283和完整的CA滴定獲得基本相同的結果，表明在含有天然N端基質(MA)和C端衣殼(CTD)域的Gag樣構建體中，結合位點仍然可及，結合對於蛋白質的成熟狀態不敏感。
實施例5衣殼裝配的體外抑制濁度測定在21℃下進行，使用在350nm波長下操作的BeckmanDU650分光光度計。向含有衣殼蛋白的250μl水溶液([CA]＝60μM；[NaH2PO4]＝50mM；pH 8.0)中加入在DMSO(0.2μl)中濃縮的配體。離心除去顆粒，加入濃縮的NaCl溶液(5M，250μl)啟動衣殼裝配。在經過一個較短的初始延遲使樣品平衡後，每10秒進行一次光譜測定。根據吸光度對時間作圖的初始斜率估計相對裝配率。
在不含其它病毒成分時，HIV-1CA能夠裝配為管狀，其結構特徵類似於成熟核心。管狀的形成導致樣品濁度升高，這能夠用分光光度計監測，利用該測定探查CAP化合物對體外衣殼裝配的可能的抑制作用。如圖17所示，天然HIV-1CA溶解於裝配緩衝液(50mM磷酸緩衝液，pH 8.0，2.5M NaCl，0.04％v/v DMSO)中使吸光度以204±36mOD/min的初始速度提高(根據初始斜率確定，報告為三次實驗的平均值±標準差)。如預期的，不與CA結合的待測化合物不影響裝配速度。然而，CAP-1和CAP-2使裝配速度以劑量依賴的方式降低，更緊密結合的CAP-2具有更大的作用。如圖16所示，在CAP-1存在下，當CAP-1∶CA比為1∶1和2∶1時，初始裝配速度分別降至93±3和67±16mOD/min。為了比較，在更緊密結合的CAP-2存在下，當CAP-2∶CA比為0.5∶1和1∶1時，裝配速度分別降至81±2和39±11mOD/min。這些數據證實，可與CA結合的化合物能夠抑制體外衣殼裝配，裝配抑制的相對效能取決於配體對CA蛋白的親和力。
實施例6病毒傳染性的抑制為了激活HIV病毒體的產生，U1細胞(5×105細胞/ml)與TNF-α(10ng/ml，Sigma)混合，並用不同濃度的CAP-1處理。處理72小時後收穫培養物。利用MTS細胞增殖測定(CellTiter 96 Aqueous One SolutionCell Proliferation Assay，Promega，Madison，WI)檢測細胞的生存力。收集上清液，通過低速離心除去細胞碎片，通過微量離心沉澱上清液中的顆粒。與顆粒結合的感染單位如下所述檢測Kimpton等人，使用敏感細胞系根據整合β-半乳糖苷酶基因的激活檢測複製型和假型HIV，J.Virol.662232-39，1992，不同之處在於利用Tropix Gal-篩選檢測器系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)測定β-gal活性。與顆粒結合的RT活性如下所述測定Huang等人，p6Gag是表達蛋白酶的全長1型人免疫缺陷病毒分子克隆產生顆粒所需的，J.Virol.，966810-18，1995。利用AIDS患者的血清(AIDS Research andReference Regent Program，NIAID，NIH)，對細胞裂解物和沉澱的顆粒進行SDS-PAGE分析。用HIV-1 p24抗原捕獲ELISA試劑盒(AIDS疫苗計劃，FCRDC/SAIC/NCI，Frederick，MD)進行定量p24(CA)測定。在病毒吸附(HIV-1RF)後用PBS洗滌MAGI細胞，添加不同濃度的含有CAP-1的新鮮培養基。感染72小時後，收穫培養上清液，預先澄清。通過微量離心收集上清液中存在的病毒顆粒，隨後測定顆粒結合的RT活性和傳染性。
利用產生HIV-1的潛伏期感染的U1細胞檢測CAP化合物的毒性和抗病毒活性。該測定允許估計對晚期複製事件的抗病毒作用。對於體內評價而言CAP-2毒性太強，但是在使用的條件下CAP-1無毒，其應用使上清液傳染性劑量依賴地降低，圖17。在100μMCAP-1時，U1細胞完全存活，但是傳染性相對於未處理的樣品降低約95％，圖18和19。
為了確定CAP-1是否影響病毒基因表達和顆粒產生，測定沉澱並除去細胞後的上清液的逆轉錄酶(RT)活性和CA(p24)水平。如圖18所示，CA水平和RT活性都不受CAP-1影響，表明抗病毒活性不是由於病毒產生的抑制。另外，在處理的和未處理的樣品獲得的Western數據中，發現p24(CA)水平非常相似，圖19，表明CAP-1不顯著影響Gag的蛋白水解加工。與這一發現一致，CAP-1不影響體外蛋白酶活性。p24 Western數據也表明Gag(p55)細胞內水平隨著CAP-1水平升高而降低，而Gag切割產物p24和p41的水平仍然相對地未受影響。這些發現證實，CAP-1促進全長Gag多蛋白的細胞內降解。使用抗gp120抗體也獲得上清液的gp120的定量。在處理的與未處理的樣品之間未見差異，表明CAP-1不抑制包膜糖蛋白的合成或病毒摻入。
也在第二次細胞測定中使用MAGI細胞培養物檢測抗病毒活性。如U1測定所見，用CAP-1處理感染的產生病毒的MAGI細胞使病毒顆粒傳染性劑量依賴地降低，在100μM CAP-1時傳染單位下降接近2個對數單位，降至不到未處理水平的2％，圖18。病毒RT活性未見降低，這進一步證實抗病毒活性不是由於病毒產生的抑制。MAGI細胞或病毒顆粒與CAP-1預溫育也不影響病毒的產生，表明CAP-1不是殺病毒的，不能直接抑制早期事件。這些數據綜合起來表明，CAP-1的抗病毒活性是由於晚期病毒事件的抑制，晚期事件不同於當前研究的或臨床使用的其它抗HIV藥物所針對的事件。
實施例7衣殼裝配的體內抑制沉澱處理的(CAP-1)和未處理的產生病毒的U1細胞，用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，重懸浮於至少10倍細胞沉澱體積的固定劑(100mM二甲胂酸鈉，pH 7.2，2.5％戊二醛，1.6％低聚甲醛，0.5％苦味酸)中。細胞固定24-48小時，之後除去固定劑，用PBS洗滌細胞兩次，在eppendorf離心管中沉澱。洗滌的細胞沉澱在溶於100mM二甲胂酸鈉，pH 7.2的1％四氧化鋨+0.8％鐵氰化鉀中後固定1小時。用水充分漂洗後，細胞在4％乙酸雙氧鈾中預染色1小時，充分漂洗，脫水，在1∶1丙酮Epon 812中浸潤過夜，用100％Epon 812樹脂浸潤1小時，包埋於樹脂中。聚合後，用Reichertuntra切片機切成60-80nm厚的切片，在檸檬酸鉛中染色5分鐘，漂洗，在乙酸雙氧鈾中後染色30分鐘，漂洗，乾燥。在裝備有1024×1024 Gatan多掃描CCD的Philips CM120/Biotwin上以60kV進行EM，在25,880×-36,960×的原始放大倍數下獲取圖像，相應的t解析度分別為8.9和6.5/像素。每個樣品觀察4個不同的EM網格，至少收集47個，對應於35μm2的最小總面積。
由於CAP-1不抑制病毒產生，因此能夠通過EM檢查處理的細胞產生的病毒體的形態缺陷。成熟病毒體的衣殼通常呈現中心圓錐形(顆粒的約30％)或球形(約40％)結構，這取決於薄切片樣品製備過程中圓錐體的方向，EM製品中約30％的病毒體一般顯示一種不成熟的表型，其特徵在於缺乏中心電子密度。來自未處理的U1細胞培養物的病毒體產生這些典型結果。然而，處理的細胞產生的顆粒顯示較大的大小不均一性，這表明Gag裝配缺陷。另外，來自處理的細胞的顆粒中只有35％含有緻密的、位於中心的核心，與之相比，未處理的細胞有70％。最顯著的是，來自處理的細胞的顆粒均不顯示HIV的標誌——圓錐形核心，表明CAP-1抑制成熟核心的裝配。對於用來破壞分子間CA-CA相互作用的CA突變產生的病毒體，以前觀察到它們有基本相同的表型。因此，該EM數據表明，CAP-1抑制病毒成熟過程中的衣殼裝配，並且一定程度地幹擾未成熟顆粒裝配過程中正常的Gag-Gag相互作用。
本領域技術人員應當了解上述發明的大量修飾和改變。因此，只應當設置權利要求書所述的限制。
權利要求
1.一種評價待測化合物的抗病毒活性的方法，包括a)使該待測化合物接觸Gag283或其片段，b)檢測待測化合物結合至靠近衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙的能力，和c)評價該化合物的抗病毒作用。
2.權利要求1的方法，其中所述衣殼蛋白選自病毒衣殼蛋白和逆轉錄病毒衣殼蛋白。
3.權利要求2的方法，其中所述逆轉錄病毒衣殼蛋白是HIV-1。
4.權利要求1的方法，其中所述衣殼蛋白是成熟的。
5.權利要求1的方法，其中所述衣殼蛋白是不成熟的。
6.權利要求3的方法，其中所述HIV-1衣殼蛋白是成熟的。
7.權利要求3的方法，其中所述HIV-1衣殼蛋白是不成熟的。
8.權利要求1的方法，其中所述抗病毒活性選自病毒成熟過程中衣殼裝配的抑制和傳染過程中解裝配的抑制。
9.一種降低與AIDS相關的死亡率的方法，包括對AIDS患者施用治療有效量的一種化合物的步驟，該化合物能夠結合至靠近HIV衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。
10.權利要求9的方法，其中所述衣殼蛋白是HIV-1衣殼蛋白。
11.權利要求9的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
12.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。
13.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)。
14.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)。
15.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)。
16.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)。
17.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)。
18.權利要求11的方法，其中所述化合物是N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
19.一種治療AIDS患者的方法，包括以有效減少發病數量和嚴重性的量施用能夠結合靠近HIV衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙之化合物的步驟。
20.權利要求19的方法，其中所述HIV衣殼蛋白是一種HIV-1衣殼蛋白。
21.權利要求19的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
22.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)。
23.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)。
24.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)。
25.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)。
26.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)。
27.權利要求2 1的方法，其中所述化合物是N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)。
28.權利要求21的方法，其中所述化合物是N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
29.一種評價化合物抑制Gag283β-髮夾形成的能力的方法，包括a)使該化合物接觸Gag283或其片段，和b)檢測該化合物幹擾Gag283的β-髮夾形成的能力。
30.一種篩選候選化合物之抑制Gag283的β-髮夾形成的能力的方法，包括a)使該化合物接觸Gag283或其片段，和b)檢測該化合物幹擾Gag283的β-髮夾形成的能力。
31.一種鑑定化合物之抑制Gag283的β-髮夾形成的能力的方法，包括a)利用Gag283分子坐標產生Gag283的3D計算機模型，和b)利用該模型鑑定可與Gag283結合的化合物。
32.一種鑑定能夠結合至靠近病毒衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙的化合物的方法，包括a)利用Gag283分子坐標產生Gag283的3D計算機模型，和b)利用該模型鑑定可與頂端裂隙結合的化合物。
33.權利要求32的方法，其中所述衣殼蛋白是HIV-1衣殼蛋白。
34.一種用化合物抑制衣殼裝配的方法，該化合物可以結合至靠近衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。
35.權利要求34的方法，其中所述衣殼蛋白選自病毒衣殼蛋白和逆轉錄病毒衣殼蛋白。
36.權利要求35的方法，其中所述衣殼蛋白是HIV-1衣殼蛋白。
37.權利要求34的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
38.權利要求36的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
39.一種用化合物抑制感染過程中衣殼解裝配的方法，該化合物可以結合至靠近衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。
40.權利要求39的方法，其中所述衣殼蛋白選自病毒衣殼蛋白和逆轉錄病毒衣殼蛋白。
41.權利要求39的方法，其中所述衣殼蛋白是HIV-1衣殼蛋白。
42.權利要求39的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
43.權利要求41的方法，其中所述化合物選自N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-[2-硫乙基-2′-[5-(二甲基氨甲基)]-2-甲基呋喃]脲(CAP-1)，N-(4-N-乙醯胺基苯基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-2)，N-(2-丙基)-N′-(3-硝基-4-甲基苯基)脲(CAP-3)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N′-(4-氰苯基)脲(CAP-4)，N-(3-氯-4-甲基苯基)-N』-[4-(1，1，1-三氯甲基)苯基]脲(CAP-5)，N-(3-硝基-4-氟苯基)-N′-[3-(1，1，1-三氟甲基)苯基]脲(CAP-6)，N-[(3-氯-4-甲基苯基)-N′，N′-丙基]脲(CAP-7)。
44.一種化合物或其藥學可接受的鹽，其具有通式I 其中(a)R1代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(b)R2代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(c)R3代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(d)R4代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(e)R5代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NHCHR8COOH、-NHCR8R9COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(f)滷素只限於氟、氯、溴和碘；(g)R8和R9獨立地是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環丙基甲基、環丙基乙基、環丁基甲基、環丁基乙基、環戊基甲基、環己基甲基或環己基乙基；(h)字母n、m和p獨立地代表1-6中的任何-個整數；(i)R6和R7獨立地選自氫或烴基，該烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多6個碳原子；(j)X選自O或S；(k)Y是雜環、碳環或任選取代的苯基；(l)雜環選自任何穩定的5、6或7元單環或雙環或7、8、9或10元雙環雜環，它是飽和的、部分不飽和的或不飽和的(芳族)，由碳原子和1、2、3或4個獨立選自N、NH、O和S的雜原子組成，包括任何雙環基團，其中上述任何雜環都與苯環稠合。氮和硫雜原子任選地可以被氧化。雜環可以在任何雜原子或碳原子處與其側基以產生穩定的結構的方式連接。如果獲得的化合物穩定，此處所述的雜環可以在碳或氮原子上被取代。如果特別指出，雜環中的氮任選地可以被季銨化。優選地，當雜環中S和O原子的總數超過1時，這些雜原子不彼此相鄰。此處所用的術語「芳族雜環系統」是指一種穩定的5-7元單環或雙環或7-10元雙環雜環芳環，它由碳原子和1-4個獨立選自N、O、S的雜原子組成。雜環的例子包括但不限於1H-吲唑、2-吡咯烷基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯並咪唑基、苯並呋喃基、苯並硫代呋喃基、苯並苯硫基、苯並噁唑基、苯並噻唑基、苯並三唑基、苯並四唑基、苯並異噁唑基、苯並異噻唑基、苯並咪唑酮基(benzimidazalonyl)、咔唑基、4aH-咔唑基、β-咔啉基、苯並二氫吡喃基、苯並吡喃基、噌啉基、十氫喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氫呋喃[2，3-b]四氫呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氫吲哚基、中氮茚基、吲哚基、異苯並呋喃基、異苯並二氫吡喃基、異吲唑基、異二氫吲哚基、異吲哚基、異喹啉基(苯並咪唑基)、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、1，5-二氮雜萘基、八氫異喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩噁嗪基、2，3二氮雜萘基、哌嗪基、哌啶基、喋啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶並噁唑、吡啶並咪唑、吡啶並噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹噁啉基、奎寧環基、咔啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩並噻唑基、噻吩並噁唑基、噻吩並咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基和呫噸基。優選的雜環包括但不限於吡啶基、苯硫基、呋喃基、吲唑基、苯並噻唑基、苯並咪唑基、苯並苯硫基、苯並呋喃基、苯並噁唑基、苯並異噁唑基、喹啉基、異喹啉基、咪唑基、吲哚基、異吲哚基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡唑基(pyrrazolyl)、1，2，4-三唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、吡嗪基和嘧啶基，和含有上述雜環的稠環和螺環化合物；(m)碳環是指任何穩定的3、4、5、6或7元單環或雙環或7、8、9、10、11、12或13元雙環或三環，它們均可以是飽和的、部分不飽和的或芳族的。這些碳環的例子包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、金剛烷基(adamantyl)、環辛基；[3.3.0]雙環辛烷、[4.3.0]雙環壬烷、[4.4.0]雙環癸烷(萘烷)、[2.2.2]雙環辛烷、芴基、苯基、萘基、2，3-二氫化茚基、金剛烷基或四氫萘基(四氫化萘)；(n)結構II定義的取代的苯基 其中(o)R10代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(p)R11獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(q)R12獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基含有直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(r)R13獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(s)R14獨立地代表氫、滷素、氰基、三氟甲基、三氯甲基、硝基、-OR8、-SR8、-NHR8、-NR8R9、-NHCOOH、-NHCH2COOH、-NR8COOR9、-COOR8或烴基，所述烴基包括直鏈、支鏈或環形基團，每個基團含有至多9個碳原子；(t)R8和R9獨立地是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、新戊基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環丙基甲基、環丙基乙基、環丁基甲基、環丁基乙基、環戊基甲基、環己基甲基或環己基乙基；(u)滷素只限於氟、氯、溴和碘。
全文摘要
提供了評價待測化合物的抗病毒活性的方法。這些方法的其它方面涉及HIV－1的逆轉錄病毒衣殼蛋白。另一方面，提供了用一種化合物降低與AIDS相關的死亡率的方法，該化合物能夠結合靠近HIV－1衣殼蛋白N端結構域之C端的頂端裂隙。描述了CAP－1、CAP－2、CAP－3、CAP－4、CAP－5、CAP－6和CAP－7的衍生物，它們能夠結合至HIV－1衣殼蛋白N端結構域的頂端裂隙，並抑制核心顆粒的適當裝配。
文檔編號G06F19/00GK1656237SQ03812124
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月22日 優先權日2002年4月22日
發明者M·F·薩莫斯, C·唐, M·黃 申請人:馬裡蘭大學,巴爾的摩縣