可用作治療劑的單價抗體片段的製作方法
2023-10-05 00:35:54 5
專利名稱：可用作治療劑的單價抗體片段的製作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及分子生物學和抗體治療學領域。更具體的說，本發明涉及具有用作治療劑的獨特特徵的新型單價抗體片段以及所述抗體片段的用途。
背景技術：
近年來發現，在多種紊亂和疾病中使用抗體作為診斷和治療劑的前途越來越大。大體上，已經做出了大量努力，研究在天然抗體中發現的抗體序列和結構，並對其進行修飾以獲取期望特徵，這反映了抗體對於診斷、研究和治療目的的重要性。
普遍的觀點是，理想的治療性抗體應具有某些最低限度特徵，包括施用於受試患者後的靶特異性、生物穩定性和生物利用度，以及足以將治療效果最大化的靶結合親和力。不幸的是，生成具有所有這些最低限度特徵或甚至其中大多數所述最低限度特性的抗體治療劑的努力所獲得的成就是有限的。例如，全長抗體諸如IgG展示期望的藥動學(如實質性體內半衰期)和優良的靶結合親和力，這是由於一個抗體分子中存在兩個抗原結合臂而衍生的親合效果(avidity effect)。但是，這些全長抗體由於其分子尺寸較大而遭遇生物利用度的問題。另外，全長抗體在有些情況中可能在與靶抗原結合後展示激動劑效果(agonistic effects)(這是不想要的)，即使作為Fab片段時它是拮抗性抗體。參閱如美國專利號6,468,529。在期望的治療作用是拮抗效果(antagonistic effect)時，這種現象是不適宜的。在有些情況中，這種現象可能是由於在與細胞表面受體結合後促進受體二聚化從而導致受體活化的二價抗體的「交聯」效果(「cross-linking」effect)。
儘管認為單價抗體不會具有「交聯」效果，然而由於其結構/構造的某些內在限制，至今未曾希望單價抗體作為治療劑。例如，Fab形式的單價抗體在用作治療劑方面具有低劣的藥效學(如在體內不穩定且在施用後迅速清除)。另外，與它們的多價對應物相比，單價抗體由於缺乏親合結合效應通常具有較低的表觀結合親和力。
一般而言，用作治療劑的抗體形式的選擇是在接受了每種形式都具有不利限制這一事實的前提下做出決定的。儘管如此，顯然全長抗體形式是近幾年所選擇的形式，這很可能是(至少部分)由於其體內生物穩定性。在生物穩定性不像生物利用度那般作為治療功效的關鍵因素時，權衡之後，單價抗體可能是可接受的。例如，部分由於與全長抗體相比更好的組織穿透性，單價Fab抗體可能是將異源分子諸如毒素投遞至靶細胞或組織使得異源分子在其中發揮治療作用的較好載體。參閱如美國專利號5,169,939。開發單價抗體作為治療劑的嘗試的其它實例包括其中單價對於獲得治療效果是至關重要的背景，如在擔心抗體的二價性可能誘導靶細胞進行抗原調節從而可能為靶細胞提供逃避細胞毒劑、效應物和補體的手段時。下列文獻描述了這些抗體的實例Cobbold和Waldmann，1984，Nature，308460-462；EP 0 131 424；Glennie和Stevenson，1982，Nature，295712-714；Nielsen和Routledge，2002，Blood，1004067-4073；Stevenson等人，1989，Anticancer Drug Des.，3(4)219-230；Routledge等人，1995，Transplantation，60847-853；Clark等人，1989，Eur.J.Immunol.，19381-388；Bolt等人，1993，Eur.J.Immunol.，23403-411；Routledge等人，1991，Eur.J.Immunol.，212717-2725；Staerz等人，1985，Nature，314628-631；及美國專利號5,968,509。值得注意的是，這些單價抗體片段含有功能性Fc序列，這是因為治療作用需要它們的效應物功能(諸如補體介導的T細胞裂解)。除了上述情況以外，本領域似乎尚未認識到在作為治療劑使用和/或開發的單價抗體中包含Fc區的需要或效用。獲得這些抗體的實際困難加重了在Fc區不是治療作用所必需時在單價抗體中包含Fc區的不情願。現有的抗體生產技術不能提供有效的方法以較大數量且以充分純化形式獲得包含單個抗原結合構件(即單價)和Fc區的異二聚體。
值得注意的是，為了提高抗體片段的體內穩定性已經做出了一些努力並獲得了不同程度的成功。例如，可以將Fab片段附著到穩定性部分諸如聚乙二醇或其它穩定化分子諸如異源肽上。參閱如Dennis等人，2002，J.Biol.Chem.，27735035-35043；PCT發布號WO 01/45746。
綜上所述，仍然非常需要改良的抗體形式以及生產和使用這些抗體的方法，例如用作治療劑或預防劑。本文描述的發明致力於解決這種需要並提供了其它好處。
完整收錄本文引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)作為參考。
發明公開本發明提供了在其治療效用、功能性和生產方法方面提供多種優勢的抗體形式。一方面，本發明的抗體提供了對於某些非基於免疫應答的治療方案至關重要的單價特徵。例如，在需要拮抗作用的病理條件中和在抗體的二價性導致不利激動作用時，本發明抗體的單價特性導致和/或確保在抗體與靶分子結合後的拮抗作用。另外，與具有相似/基本上相同的抗原結合特徵的Fab形式相比，本發明抗體的特徵有上佳的藥動學屬性(諸如半衰期延長和/或體內清除率減慢)，由此克服了使用常規單價Fab抗體的主要缺點。一方面，本發明的抗體具有少許免疫效應物功能至完全沒有免疫效應物功能，這種特性在治療免疫效應物應答是有害的病理狀況中特別有用。另一方面，本發明抗體的特徵有大大提高產量的改變。另外，與用於生產單價抗體片段的某些常規方法(如酶促消化，在有些情況中繼以化學偶聯)相反，本發明生產方法的重組本質使之有可能獲得具有足夠高度的同質性和/或純度的可作為治療劑開發和/或商品化的抗體群。
因此，一方面，本發明提供了包含單個靶分子結合臂和Fc區(即Fc多肽的複合體)的單價抗體片段，其中所述單價抗體片段在體內比缺乏所述Fc區的對應抗體片段更加穩定。一方面，本發明提供了包含單個抗原結合臂和Fc區的抗體片段，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，所述Fc區提高抗體片段的穩定性(即更加穩定，例如展示更長的體內半衰期)，且所述Fc區包含第一和第二Fc多肽的複合體，其中只有所述一種Fc多肽而不是二種Fc多肽是N端截短的重鏈。在一個實施方案中，N端截短的重鏈由或基本上由鉸鏈序列組成，它與重鏈CH2和/或CH3結構域中的至少一部分連續相連，足以與第一Fc多肽形成複合物，並賦予所述提高的穩定性。在一個實施方案中，N端截短的重鏈由或基本上由鉸鏈序列組成，它與能夠與第一Fc多肽形成複合物的重鏈CH2和/或CH3結構域連續相連，並賦予所述提高的穩定性。在一個實施方案中，N端截短的重鏈的N端序列是部分或整個鉸鏈序列(即截短的重鏈所包含的N端包含部分或整個鉸鏈序列)。在一個實施方案中，N端截短的重鏈是IgG重鏈。在一個實施方案中，Fc區能夠結合FcRn。在一個實施方案中，Fc區不具有FcRn結合以外的免疫效應物功能。通常且優選的是，N端截短的重鏈不特異結合抗原。
正如本文所述，本發明抗體片段的特徵是與其Fab片段對應物相比穩定性顯著增強。在有些實施方案中，本發明的抗體片段展示的體內半衰期是其Fab對應物的至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約350倍、至少約400倍、至少約450倍、至少約500倍。可以通過本領域知道的多種方法來測量體內半衰期，本文描述了其中一些。在一個實施方案中，體內半衰期是通過對合適哺乳動物(諸如小鼠)施用一定量的抗體並測量哺乳動物中所施用抗體數量的降低速率而測量的。
免疫效應物功能在某些臨床背景中是不必要的或甚至有害的。在有些實施方案中，本發明的抗體是未糖基化的。這些抗體不展示依賴Fc區糖基化的實質性免疫效應物功能。通常且優選的是，本發明的未糖基化抗體不展示實質性免疫效應物功能，除了結合FcRn。在有些實施方案中，本發明的抗體片段不具有實質性效應物功能或完全缺乏FcRn結合以外的效應物功能。在一個實施方案中，所述效應物功能指補體裂解。在一個實施方案中，所述效應物功能指抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)。在一個實施方案中，抗體片段結合FcRn。可以通過本領域知道的多種方法生產未糖基化抗體。方便的方法包括在原核宿主細胞諸如大腸桿菌中表達抗體。
在一個實施方案中，本發明的抗體片段是糖基化的。可以通過本領域知道的方法來完成糖基化，如通過在哺乳動物宿主細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中生成抗體。
在有些實施方案中，本發明的抗體片段不靶向免疫應答的成分，因此其治療作用的機制不包括免疫應答的調節和/或參與。例如，在一個實施方案中，本發明的抗體片段具有少許免疫抑制特性至沒有免疫抑制特性。例如，所述免疫抑制特性可以包括直接或間接招致T細胞耗損的能力。在一個實施方案中，所述抗體片段不特異結合T細胞表面抗原，它在有些實施方案中指CD3或CD4。在一個實施方案中，所述T細胞表面抗原指CD3。在另一個實施方案中，抗體片段不特異結合免疫球蛋白多肽，例如它不特異結合表面免疫球蛋白λ鏈上的恆定決定簇或表面免疫球蛋白上的獨特型決定簇。
本發明的抗體片段能夠特異結合目的靶分子。例如，在有些實施方案中，抗體片段特異結合腫瘤抗原。在有些實施方案中，抗體片段特異結合在受體多聚化(如二聚化)後活化的細胞表面受體。在有些實施方案中，本發明抗體與靶分子的結合抑制另一種分子(諸如配體，在靶分子是受體時)與所述靶分子的結合。由此，在一個實施例中，本發明的抗體片段在與靶分子結合後抑制相關結合配偶體結合靶分子。相關結合配偶體可以是配體或是異二聚體或同二聚體。在一個實施方案中，本發明的抗體片段在與靶分子結合後抑制靶分子多聚化。例如，在本發明抗體片段是拮抗物的有些實施方案中，抗體片段與細胞表面受體的結合可能抑制受體與受體另一單位的二聚化，由此抑制受體的活化(至少部分由於缺乏受體二聚化)。本領域知道許多受體分子能夠和/或需要二聚化(或是同二聚化或是異二聚化)來實現其正常功能。這些受體包括酪氨酸激酶受體諸如成纖維細胞生長因子受體和HGF受體c-met。其它蛋白質-蛋白質相互作用包括受體-配體相互作用，諸如與flt、flk等結合的VEGF(血管內皮生長因子)和與c-met結合的肝細胞生長因子(HGF)。在一個實施方案中，本發明的抗體片段能夠與HGF競爭與c-met的結合。在另一個實施方案中，本發明的抗體片段能夠與VEGF競爭與VEGF受體的結合。
一方面，本發明提供了單臂形式(正如本文所定義的)的拮抗劑但以雙臂形式(即其中兩個臂具有相同的抗原結合能力)作為激動劑或具有激動劑活性的抗體片段。
一方面，本發明提供了包含下列各項的抗體片段(i)包含輕鏈可變結構域(且在有些實施方案中還包含輕鏈恆定結構域)的第一多肽；(ii)包含重鏈可變結構域、第一Fc多肽序列(且在有些實施方案中還包含非Fc重鏈恆定結構域序列)的第二多肽；和(iii)包含第二Fc多肽序列的第三多肽。通常，所述第二多肽是包含重鏈可變結構域、重鏈恆定結構域(如整個或部分CH1)、和第一Fc多肽的單鏈多肽。例如，通常通過肽鍵(即不是非肽鍵)將第一Fc多肽序列與重鏈恆定結構域相連。在一個實施方案中，所述第一多肽包含與人輕鏈恆定結構域融合的非人輕鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述第二多肽包含與人重鏈恆定結構域融合的非人重鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重鏈，它在其N端包含至少部分鉸鏈序列。在一個實施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重鏈，它在其N端不包含功能性或野生型鉸鏈序列。在有些實施方案中，本發明抗體片段的兩種Fc多肽共價連接。例如，兩種Fc多肽可以經由分子間二硫鍵例如經由鉸鏈區半胱氨酸殘基之間的分子間二硫鍵連接。
一方面，本發明提供了包含免疫球蛋白群的組合物，其中至少(或至少約)50％、75％、85％、90％、95％的免疫球蛋白是本發明的抗體片段。包含所述免疫球蛋白群的組合物可以是多種形式，包括但不限於宿主細胞裂解物、細胞培養物的培養液、宿主細胞漿、或其半純化或純化形式。純化方法在本領域是眾所周知的，本文描述了其中一些。
一方面，本發明提供了具有至少一項特徵的抗體片段，即在將抗體片段內的Fc序列的同二聚化降至最低的同時促進異二聚化。這些特徵改善了可通過本文所述本發明方法獲得的免疫球蛋白群的產量和/或純度和/或同質性。在一個實施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面處相遇/相互作用。在第一和第二Fc多肽在界面處相遇的有些實施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含的突起(protuberance)可位於第一Fc多肽(序列)的界面的腔(cavity)中。在一個實施方案中，第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼腔或第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼突起或者二者兼之。在一個實施方案中，第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼腔且第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼突起。在一個實施方案中，第二Fc多肽的界面包含的突起可位於第一Fc多肽的界面的腔中，其中所述腔或突起或二者已經分別導入第一和第二Fc多肽的界面。在第一和第二Fc多肽在界面處相互作用的有些實施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含的突起可位於第二Fc多肽(序列)的界面的腔中。在一個實施方案中，第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼腔或第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼突起，或者二者兼之。在一個實施方案中，第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼腔且第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼突起。在一個實施方案中，第一Fc多肽的界面包含的突起可位於第二Fc多肽的界面的腔中，其中所述突起或腔或二者已經分別導入第一種和第二Fc多肽的界面。
在一個實施方案中，突起和腔各自包含天然存在的胺基酸殘基。在一個實施方案中，包含突起的Fc多肽是通過用具有比原始殘基更大側鏈體積的輸入殘基替代來自模板/原始多肽界面的原始殘基而生成的。在一個實施方案中，包含突起的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始殘基更大側鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始殘基的核酸。在一個實施方案中，原始殘基是蘇氨酸。在一個實施方案中，原始殘基是T366。在一個實施方案中，輸入殘基是精氨酸(R)。在一個實施方案中，輸入殘基是苯丙氨酸(F)。在一個實施方案中，輸入殘基是酪氨酸(Y)。在一個實施方案中，輸入殘基是色氨酸(W)。在一個實施方案中，輸入殘基是R、F、Y或W。在一個實施方案中，突起是通過替代模板/原始多肽中的兩個或多個殘基而生成的。在一個實施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，胺基酸編號依照Katat等人(《Sequences of proteins of immunological interest》第5版，第1卷，第688-696頁，1991，NIH，Bethesda，MD)的EU編號方案。
在有些實施方案中，包含腔的Fc多肽是通過用具有比原始殘基更小側鏈體積的輸入殘基替代模板/原始多肽界面中的原始殘基而生成的。例如，可以通過包括如下步驟的方法來生成包含腔的Fc多肽，其中用編碼具有比原始殘基更小側鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始殘基的核酸。在一個實施方案中，原始殘基是蘇氨酸。在一個實施方案中，原始殘基是亮氨酸。在一個實施方案中，原始殘基是酪氨酸。在一個實施方案中，輸入殘基不是半胱氨酸(C)。在一個實施方案中，輸入殘基是丙氨酸(A)。在一個實施方案中，輸入殘基是絲氨酸(S)。在一個實施方案中，輸入殘基是蘇氨酸(T)。在一個實施方案中，輸入殘基是纈氨酸(V)。可以通過替代模板/原始多肽的一個或多個原始殘基來生成腔。例如，在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的原始胺基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸。在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的輸入殘基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。在有些實施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的原始胺基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始胺基酸用選自下組的輸入殘基替代丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。在有些實施方案中，替代的原始胺基酸是T366、L368和/或Y407。在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含絲氨酸替代，胺基酸編號依照Katat等人(見上文)的EU編號方案。在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸處包含丙氨酸替代，胺基酸編號依照Katat等人(見上文)的EU編號方案。在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽在第407位酪氨酸處包含纈氨酸替代，胺基酸編號依照Katat等人(見上文)的EU編號方案。在一個實施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的替代T366S、L368A和Y407V，胺基酸編號依照Katat等人(見上文)的EU編號方案。在這些抗體片段的有些實施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，胺基酸編號依照Katat等人(見上文)的EU編號方案。
一方面，本發明的抗體片段包含Fc區，其存在是相對於包含相同抗原結合臂(序列)的Fab片段提高抗體片段的穩定性所要求的。所述Fc區是經由不同Fc多肽序列的複合(多聚化)而形成的。所述不同Fc多肽序列可以包含或不含相同序列和/或結構域，倘若它們能夠二聚化而形成Fc區(正如本文所定義的)的話。第一Fc多肽通常以一條多肽鏈的形式與免疫球蛋白重鏈一個或多個結構域連續相連，例如與鉸鏈、恆定和/或可變結構域序列相連。在一個實施方案中，第一Fc多肽包含至少部分鉸鏈序列、至少部分CH2結構域和/或至少部分CH3結構域。在一個實施方案中，第一Fc多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和CH2和CH3結構域。在一個實施方案中，第二Fc多肽(即作為N端截短的重鏈的一部分的Fc多肽)包含至少部分鉸鏈序列、至少部分CH2結構域和/或至少部分CH3結構域。在一個實施方案中，第二Fc多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和CH2和CH3結構域。在一個實施方案中，本發明的抗體片段包含第一和第二Fc多肽，它們各自包含至少一個抗體恆定結構域的至少一部分。在一個實施方案中，抗體恆定結構域指CH2和/或CH3結構域。在本發明抗體片段包含恆定結構域的任何實施方案中，抗體恆定結構域可以來自任何免疫球蛋白類型，例如IgG。免疫球蛋白來源可以是任何合適的物種起源(如IgG可以是人IgG1)或是合成形式。
本發明的抗體包含單個抗原結合臂。與一種抗原的結合可能牽涉與一種或多種結合靶(如決定簇/表位)的結合。在一個實施方案中，本發明的抗體是單特異性的。在另一個實施方案中，本發明的抗體是免疫粘附素，它在一個實施方案中是單特異性的。
本發明的抗體片段可以與異源部分綴合。任何異源部分都將是合適的，只要它與抗體的綴合不會實質性的降低抗體的期望功能和/或特徵。例如，在有些實施方案中，免疫偶聯物包含的異源部分是細胞毒劑。在有些實施方案中，所述細胞毒劑選自下組放射性同位素、化療劑和毒素。在有些實施方案中，所述毒素選自下組加利車黴素(calicheamicin，calichemicin)、美登素(maytansine)和單端孢菌素(trichothecene，trichothene)。在有些實施方案中，免疫偶聯物包含的異源部分是可檢測標記物。在有些實施方案中，所述可檢測標記物選自下組放射性同位素、配體-受體對的一個成員、酶-底物對的一個成員和螢光共振能量轉移對的一個成員。
在多種背景中，非常希望獲得包含高度同質的本發明抗體片段群的組合物。這可以通過本領域知道的多種方法來完成。例如，通常重組表達構成本發明抗體片段的多肽(與例如酶促消化全長免疫球蛋白不同)。在有些實施方案中，本發明的組合物包含就結合臂的N端和/或Fc區的C端而言基本上同質的抗體片段。若組合物中所含有的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％的本發明抗體片段在結合臂的N端和/或Fc區的C端具有相同胺基酸殘基，則說它是「本質上同質的」。所述組合物可以是最初生成抗體片段的來源組合物的未純化、半純化或純化形式。
一方面，本發明提供了包含本發明抗體片段和載體的組合物，所述載體在一個實施方案中是製藥學可接受載體。在一個實施方案中，抗體片段與異源部分綴合。
另一方面，本發明提供了包括容器及其中所含有的組合物的產品，其中組合物包含本發明的抗體片段。在有些實施方案中，這些產品還包括使用所述組合物的指示。在一個實施方案中，抗體片段是以治療有效量提供的。
又一方面，本發明提供了編碼本發明抗體片段的多核苷酸。可以由單個多核苷酸或分開的(多種)多核苷酸編碼本發明抗體片段的構件。在一個實施方案中，單個多核苷酸編碼(a)抗原結合臂的輕鏈和重鏈構件，和(b)N端截短的重鏈多肽。在一個實施方案中，單個多核苷酸編碼抗原結合臂的輕鏈和重鏈構件，且另一種多核苷酸編碼N端截短的重鏈多肽。在一個實施方案中，分開的多核苷酸分別編碼抗原結合臂的輕鏈構件、抗原結合臂的重鏈構件和N端截短的重鏈多肽。
一方面，本發明提供了用於表達本發明抗體的重組載體。
一方面，本發明提供了包含本發明多核苷酸或重組載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞，例如大腸桿菌。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
一方面，本發明提供了生成本發明抗體片段的方法，所述方法包括在容許二聚化從而導致抗體片段形成的條件下在合適宿主細胞(如大腸桿菌或CHO)中表達編碼抗體片段的核酸。在一個實施方案中，宿主細胞培養物中所生成的至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的免疫球蛋白多肽是本發明的抗體片段。在一個實施方案中，通過本發明方法生成的抗體片段在一種Fc多肽中包含突起且在另一種Fc多肽中包含腔，正如本文所述。在一個實施方案中，本發明提供了包括在宿主細胞中表達三種多核苷酸的方法，其中第一種多核苷酸編碼抗原結合臂的第一種構件(如重鏈CDR序列或可變結構域(且在有些實施例中還包含非Fc重鏈恆定結構域序列))和第一Fc多肽，第二種多核苷酸編碼抗原結合臂的第二種構件(如輕鏈CDR序列或可變結構域(且在有些實施例中還包含輕鏈恆定結構域))，且第三種多核苷酸編碼包含第二Fc多肽的N端截短的重鏈，其中通過這些多肽的異多聚化形成本發明的抗體片段。在一個實施方案中，該方法包括將所述多核苷酸導入合適的宿主細胞。在一個實施方案中，該方法包括由細胞培養物(如由細胞裂解物或培養物的培養液)回收本發明的抗體片段。
一方面，本發明提供了包括在合適宿主細胞中表達編碼本發明抗體片段構件的核酸的方法，其中編碼一種構件的每個順反子包含與編碼所述構件的核酸序列可操作連接的翻譯起始區(TIR)，且其中調節每個TIR的強度以獲得合適的構件表達水平比率，由此生成期望量的所述抗體片段。在一個實施方案中，TIR具有近似相等的強度。在一個實施方案中，相對TIR強度是1，例如依照Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147。在有些實施方案中，TIR包含原核分泌信號序列或其變體。在有些實施方案中，原核分泌信號序列選自下組STII、OmpA、PhoE、LamB、MBP和PhoA分泌信號序列。
本發明的抗體可在多種背景中找到多種用途。例如，本發明的抗體通常是治療性抗體。本發明的抗體可以通過多種機制來發揮其治療效果。例如，本發明的抗體可以是激動性抗體(agonist antibody)。在另一個實施例中，本發明的抗體可以是拮抗性抗體(antagonistic antibody)。在還有一個實施例中，本發明的抗體可以是阻斷性抗體(blocking antibody)。在另一個實施例中，本發明的抗體可以是中和性抗體(neutralizing antibody)。
一方面，本發明提供了治療或延遲疾病發展的方法，包括對患病的受試者施用有效量的有效治療或延遲疾病發展的本發明抗體片段。在一個實施方案中，疾病指腫瘤或癌症。在一個實施方案中，疾病指免疫學紊亂，如自身免疫病，如類風溼性關節炎、免疫性血小板減少性紫癜、系統性紅斑狼瘡、銀屑病(牛皮癬)、Sjogren氏綜合症、胰島素依賴性糖尿病等。在另一個實施方案中，疾病與異常血管化(諸如血管發生)有關。在又一個實施方案中，疾病與生長因子-受體信號調節異常有關。在一個實施例中，所述生長因子-受體信號與酪氨酸激酶有關。在一個實施例中，所述生長因子-受體信號與HGF-c-met軸有關。
本發明的抗體適用於治療或預防由多種細胞、遺傳和/或生物化學異常引起的多種病理學狀況。例如，本發明的抗體特別適用於治療和/或預防與HGF/c-met信號途徑內的異常有關的病理學狀況。在一個實施方案中，本發明的抗體是c-met拮抗物。在一個實施方案中，抗體是嵌合抗體，例如包含嫁接到異源非人、人、或人源化序列(如框架和/或恆定結構域序列)中的來自非人供體的抗原結合序列的抗體。在一個實施方案中，非人供體是小鼠。在一個實施方案中，抗原結合序列是合成的，如通過誘變(如噬菌體展示篩選等)獲得的。在一個實施方案中，本發明的嵌合抗體具有鼠源V區和人源C區。在一個實施方案中，鼠源輕鏈V區與人源κ輕鏈融合。在一個實施方案中，鼠源重鏈V區與人源IgG1 C區融合。在一個實施方案中，抗原結合序列包含輕鏈和/或重鏈的至少一種、至少兩種或所有三種CDR。在一個實施方案中，抗原結合序列包含重鏈CDR3。在一個實施方案中，抗原結合序列包含由下述雜交瘤細胞系生成的單克隆抗體的部分或所有CDR和/或可變結構域序列，即以美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection)編號ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細胞系。在一個實施方案中，抗原結合序列至少包含由雜交瘤細胞系1A3.3.13或5D5.11.6生成的單克隆抗體的重鏈CDR3。本發明的人源化抗體包括在FR中具有胺基酸替代的抗體和在嫁接的CDR中有變化的親和力成熟變體。CDR和FR中替代的胺基酸不限於供體或受體抗體中存在的胺基酸。在其它實施方案中，本發明的抗體還在Fc區的胺基酸殘基中包含變化，導致效應物功能改善，包括CDC和/或ADCC功能和B細胞殺傷增強。本發明的其它抗體包括具有改善穩定性的特殊變化的抗體。本發明的抗體還包括在體內具有改善的ADCC功能的巖藻糖缺失變體。
在一個實施方案中，本發明抗體片段包含的抗原結合臂所包含的重鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列SYWLH(SEQ IDNO1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO2)和YGSYVSPLDY(SEQID NO3)。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的重鏈CDR-H1具有胺基酸序列SYWLH。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的重鏈CDR-H2具有胺基酸序列MIDPSNSDTRFNPNFKD。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的重鏈CDR-H3具有胺基酸序列YGSYVSPLDY。在一個實施方案中，本發明抗體片段包含的抗原結合臂所包含的輕鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO4)、WASTRES(SEQ ID NO5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO6)。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的輕鏈CDR-L1具有胺基酸序列KSSQSLLYTSSQKNYLA。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的輕鏈CDR-L2具有胺基酸序列WASTRES。在一個實施方案中，抗原結合臂包含的輕鏈CDR-L3具有胺基酸序列QQYYAYPWT。在一個實施方案中，本發明抗體片段包含的抗原結合臂所包含的重鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列SYWLH(SEQ ID NO1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO2)和YGSYVSPLDY(SEQ ID NO3)且輕鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO4)、WASTRES(SEQ ID NO5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO6)。
本發明提供了結合人c-met的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體在體內有效抑制HGF/c-met活性，且在重鏈可變區(VH)中至少包含由以美國典型培養物保藏中心編號ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細胞系生成的單克隆抗體的CDR3序列和基本上人共有序列(如基本上人重鏈亞組III(VHIII)的人共有框架(FR)殘基)。在一個實施方案中，抗體還包含由以美國典型培養物保藏中心編號ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細胞系生成的單克隆抗體的重鏈CDR1序列和/或CDR2序列。在另一個實施方案中，前述抗體包含由以美國典型培養物保藏中心編號ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細胞系生成的單克隆抗體的輕鏈CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列和基本上人輕鏈κ亞組I(VκI)的人共有框架(FR)殘基。
在一個實施方案中，本發明抗體片段包含抗原結合臂，該抗原結合臂包含具有如下序列的重鏈可變結構域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO7)。
在一個實施方案中，本發明抗體片段包含抗原結合臂，該抗原結合臂所包含具有如下序列的輕鏈可變結構域DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO8)。
一方面，本發明提供了本發明抗體片段(例如本發明的c-met拮抗性抗體片段)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療和/或預防的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了本發明核酸(例如編碼本發明c-met拮抗性抗體片段的核酸)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療和/或預防的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了本發明表達載體(例如編碼本發明c-met拮抗性抗體片段的載體)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療和/或預防的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了本發明宿主細胞(例如包含編碼本發明c-met拮抗性抗體片段的載體的宿主細胞)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療和/或預防的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了本發明製品(例如包含本發明c-met拮抗性抗體片段和/或編碼本發明c-met拮抗性抗體片段的核酸的製品)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療性和/或預防性處理的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了本發明試劑盒(例如包含本發明c-met拮抗性抗體片段和/或編碼本發明c-met拮抗性抗體片段的核酸的試劑盒)在製備用於諸如癌症、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發生相關紊亂等疾病的治療性和/或預防性處理的藥物中的用途。
一方面，本發明提供了抑制c-met活化的細胞增殖的方法，所述方法包括使細胞或組織接觸有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制與c-met活化有關的細胞增殖。
一方面，本發明提供了治療受試者中與c-met活化調節異常有關的病理學狀況的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此治療所述病症。
一方面，本發明提供了抑制表達c-met或肝細胞生長因子或二者的細胞生長的方法，所述方法包括使所述細胞接觸本發明的c-met拮抗性抗體片段，由此引起所述細胞的生長抑制。在一個實施方案中，使所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF(如經由旁分泌效應)。
一方面，本發明提供了治療性處理具有癌性腫瘤的哺乳動物的方法，其中腫瘤包含表達c-met或肝細胞生長因子或二者的細胞，所述方法包括對所述哺乳動物施用有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此有效治療所述哺乳動物。在一個實施方案中，使腫瘤接觸由不同細胞表達的HGF(如經由旁分泌效應)。
一方面，本發明提供了用於治療或預防與c-met或肝細胞生長因子或二者表達升高或活性升高有關的細胞增殖性紊亂的方法，所述方法包括對需要這種治療的受試者施用有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此有效治療或預防所述細胞增殖性紊亂。在一個實施方案中，所述增殖性紊亂是癌症。
一方面，本發明提供了用於抑制細胞生長的方法，其中所述細胞的生長至少部分依賴於c-met或肝細胞生長因子或二者的生長加強效應(growthpotentiating effect)，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，使細胞接觸由不同細胞表達的HGF(如經由旁分泌效應)。
一方面，本發明提供了治療性處理哺乳動物中的腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長至少部分依賴於c-met或肝細胞生長因子或二者的生長加強效應，所述方法包括使所述腫瘤接觸有效量的本發明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制所述腫瘤的生長。在一個實施方案中，使腫瘤接觸由不同細胞表達的HGF(如經由旁分泌效應)。
本發明的方法可用於影響任何合適的病理學狀態，例如與HGF/c-met信號途經調節異常有關的細胞和/或組織。在一個實施方案中，本發明方法所靶向的細胞是癌細胞。例如，癌細胞可以是選自下組的細胞乳腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞(如甲狀腺的)、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經系統癌細胞、骨肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭和頸鱗狀細胞癌細胞、黑素瘤細胞、淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞(如多發性骨髓瘤)、神經膠質瘤/成膠質細胞瘤細胞(如多形性星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、多形性少突膠質細胞瘤、多形性少突星形細胞瘤)和白血病細胞。在一個實施方案中，本發明方法所靶向的細胞是過度增殖和/或增生細胞。在一個實施方案中，本發明方法所靶向的細胞是發育異常細胞。在又一個實施方案中，本發明方法所靶向的細胞是轉移細胞。
本發明的方法還可以包括額外的治療步驟。例如，在一個實施方案中，該方法還包括使所靶向的細胞和/或組織(如癌細胞)暴露於放療或化療劑的步驟。
c-met的活化是重要的生物學過程，其調節異常導致多種病理學狀況。因此，在本發明方法的一個實施方案中，所靶向的細胞(如癌細胞)是其中c-met的活化與相同組織起源的正常細胞相比增強的細胞。在一個實施方案中，本發明的方法引起所靶向細胞的死亡。例如，與本發明拮抗性抗體片段的接觸可能導致細胞不能經由c-met途經發信號，繼而導致細胞死亡。
c-met活性(及由此的信號)的調節異常可能是由多種細胞變化引起的，包括例如HGF(c-met相關配體)和/或c-met自身的過度表達。因此，在有些實施方案中，本發明的方法包括靶向這樣的細胞，在所述細胞(如癌細胞)中c-met或肝細胞生長因子或二者的表達與相同組織起源的正常細胞相比更加豐富。表達c-met的細胞可以受到來自多種來源的HGF的調節，即自分泌或旁分泌方式。例如，在本發明方法的一個實施方案中，使所靶向的細胞接觸/結合由不同細胞表達的肝細胞生長因子(如經由旁分泌效應)。所述不同細胞可以是相同或不同的組織起源。在一個實施方案中，使所靶向的細胞接觸/結合由所靶向細胞自身表達的HGF(如經由自分泌效應/環)。在一個實施方案中，所靶向細胞中的c-met活性(或活化)依賴於配體。在一個實施方案中，c-met活性(或活化)不依賴配體。
附圖簡述
圖1顯示了抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)表達的抗Fab Western印跡結果。
圖2顯示了抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)表達的抗Fc Western印跡結果。
圖3顯示了在Fc區中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)的表達的抗Fab Western印跡結果。
圖4顯示了在Fc區中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)的表達的抗Fc Western印跡結果。
圖5顯示了競爭性結合測定法的結果，其中單臂抗c-met抗體阻斷HGF結合c-met。
圖6顯示了在使用或未用HGF和/或抗c-met 5D5單臂抗體處理的U87細胞中進行的KIRA測定法的結果。
圖7顯示了BaF3-hMet細胞在存在不同數量的抗c-met 5D5抗體時的細胞增殖。
圖8顯示了細胞遷移測定法，其中單臂抗c-met抗體阻斷HGF功能。
圖9A-B顯示了單臂抗c-met抗體的藥物動力學分析結果。
圖10A-B顯示了用單臂抗c-met抗體治療腫瘤的結果。在圖10B中，「OA」指示單臂。
執行本發明的模式本發明提供了使用具有獨特特徵的單價抗體片段的方法、組合物、試劑盒和產品，所述特徵使得所述單價抗體片段特別有利於用於治療某些病理狀況。此外，可以容易的以實用產量和期望純度製備所述抗體片段。與現有的單價抗體相比，本發明抗體片段的特徵有上佳的物理化學和/或治療性能。一般而言，本發明的單價片段片段包含單個抗原結合臂和Fc區，其中與包含所述抗原結合臂但缺乏所述Fc區的Fab抗體片段相比，所述抗體片段展示增強的體內穩定性。在有些實施方案中，本發明的抗體片段在每種Fc序列的一個或多個殘基處包含改變，所述Fc序列在構成Fc區的Fc多肽間形成多聚化介面。本發明提供了生產和使用本發明抗體片段的方法。本發明使得本發明新型抗體片段的高效且商業可行性生產成為可能。所述抗體片段可用於治療非常希望和/或需要使用本質是單價且高度穩定的治療性抗體的病理狀況。本文提供了本發明方法、組合物、試劑盒和產品的詳細情況。
通用技術除非另有說明，本發明的實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域技術範圍之內。文獻中充分闡明了這些技術，諸如《Molecular CloningALaboratory Manual》第2版(Sambrook等人，1989)；《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait編著，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney編著，1987)；《Methods in Enzymology》(Academic Press Inc.)；《Current Protocols inMolecular Biology》(F.M.Ausubel等人編著，1987，以及定期更新)；《PCRThe Polymerase Chain Reaction》(Mullis等人編著，1994)；《A Practical Guideto Molecular Cloning》(Perbal Bernard V.，1988)。
定義術語「載體」在用於本文時意圖指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是「質粒」，指其中可以連接額外DNA區段的環狀雙鏈DNA環。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可以將額外DNA區段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導入的宿主細胞中自主複製(如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可以在導入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表達。這些載體在本文中稱為「重組表達載體」(或簡稱「重組載體」)。一般而言，在重組DNA技術中有用的表達載體常常是質粒形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可以互換使用，因為質粒是載體的最常用形式。
「多核苷酸」和「核酸」在本申請中可以交互使用，是指任一長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經過修飾的核苷酸或鹼基、和/或其類似物，或者可以通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括經過修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結構的修飾可以在所述聚合物裝配之前或之後加入。所述核苷酸序列可以被非一核苷酸組分阻斷。多核苷酸還可以在合成後修飾，例如通過與標記物偶聯。其他類型的修飾包括，例如，″帽子″，將一個或多個天然生成核苷酸用類似物取代，核苷酸之間修飾例如，含不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含帶電連接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修飾，含有附加基元，例如，蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-賴氨酸，等)的修飾，帶有嵌入劑(例如，吖啶，補骨脂素，等)的修飾，含有螯合劑(例如，金屬，放射性金屬，硼，氧化的金屬等)的修飾，含有烷化劑(alkylators)的修飾，帶有經修飾連接(例如，α端基異構核酸(anomeric nucleic acid)，等)的修飾，以及未經修飾形式的多核苷酸。另外，通常出現於糖類的任一羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團取代，用常見保護基保護，或者經過活化製備與其他核苷酸間的其他連接，或者可以偶聯至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用長度為1-20個碳原子的胺或有機封端基團(organic capping group)磷酸化或取代。另外還可以將其他羥基衍生至常規的保護基。多核苷酸還可以含有本領域普遍已知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-疊氮基核糖，碳環形的糖類似物，α-端基異構糖，差向立體異構糖例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非環形的類似物以及脫鹼基的核苷類似物例如甲基核糖核苷。可以用其他連接基團替代一個或多個磷酸二酯鍵。這些其他的連接基團包括但不限於這樣的實例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″醯胺基團(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自獨立地為H或者取代或未被取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-O-)鍵、芳香基、鏈烯基、環烷基、環烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。並非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用於所有本申請所述多核苷酸，包括RNA及DNA。
「寡核苷酸」在用於本文時一般指短多核苷酸，通常是單鏈，通常是合成的，長度通常但不是必需小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」和「多核苷酸」並不互相排斥。上文關於多核苷酸的描述平等且完全適用於寡核苷酸。
除非另有明確說明或上下文相關的說明，術語「肝細胞生長因子」或「HGF」在用於本文時指能夠在容許HGF/c-met信號途經發生的條件下激活所述過程的任何天然或變異的(或是天然存在的或是合成的)HGF多肽。術語「野生型HGF」通常指包含天然存在HGF蛋白質的胺基酸序列的多肽。術語「野生型HGF序列」通常指在天然存在HGF中發現的胺基酸序列。
術語「抗體」和「免疫球蛋白」在廣義上可互換使用，且包括單克隆抗體(如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體，只要它們展示期望的生物學活性)和本文描述的抗體片段。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。
「抗體片段」只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優選保留該部分存在於完整抗體中時通常相關的至少一種、優選大多數或所有功能。
短語「抗原結合臂」在用於本文時指有能力與目的分子特異結合的本發明抗體片段的組成部分。一般且優選的是，抗原結合臂是免疫球蛋白多肽序列的複合體，例如免疫球蛋白輕鏈和重鏈的CDR和/或可變結構域序列。
短語「N端截短的重鏈」在用於本文時指包含部分但非整個全長免疫球蛋白重鏈的多肽，其中缺失的部分通常位於重鏈的N端區域。缺失部分可以包括但不限於可變結構域、CH1、和部分或整個鉸鏈序列。通常，如果不存在野生型鉸鏈序列，那麼N端截短的重鏈中的剩餘恆定結構域將包含能夠連接另一種Fc序列(即本文所述「第一」Fc多肽)的構件。例如，所述構件可以是經修飾的殘基或能夠形成二硫鍵的外加半胱氨酸殘基。
術語「單克隆抗體」在用於本文時指由本質上同質的抗體群中獲得的抗體，即組成該抗體群的單個抗體是相同的，只是可能以最小數量存在可能的天然存在突變。單克隆抗體是高度特異的，即針對一種抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。
單克隆抗體在本文中明確包括「嵌合」抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或屬於特定抗體類型或亞型的抗體中的對應序列相同或同源，而該鏈的剩餘部分與衍生自另一種物種或屬於另一種抗體類型或亞型的抗體中的對應序列相同或同源，以及這些抗體的片段，只要它們展示期望的生物學活性(美國專利號4,816,567；及Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。
非人抗體(如鼠源)的「人源化」形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體高變區的殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區的殘基替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含沒有在受體抗體中或在供體抗體中發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步改善抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一種且通常兩種基本上整個可變結構域，其中所有或基本上所有高變環對應非人免疫球蛋白中的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗體還任選包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。更多詳情參閱Jones等人，1986，Nature，321522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332323-329；及Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。還可參閱下列綜述性論文及其引用的參考文獻Vaswani和Hamilton，1998，Ann.Allergy，Asthma Immunol.，1105-115；Harris，1995，Biochem.Soc.Transactions，231035-1038；Hurle和Gross，1994，Curr.Op.Biotech.，5428-433。
「人抗體」指具有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列和/或使用本文所公開的用於製備人抗體的任何技術製備的抗體。人抗體的這種定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
「親和力成熟」的抗體指在一種或多種CDR中具有一處或多處改變從而導致抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的針對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知流程生成。Marks等人，1992，Bio/Technology，10779-783描述了經由VH和VL結構域改組的親和力成熟。下列文獻描述了CDR和/或框架殘基的隨機誘變Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，913809-3813；Schier等人，1995，Gene，169147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.，1551994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.，154(7)3310-9；及Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.，226889-896。
在用於本文時，術語「免疫粘附素」指將異源蛋白(「粘附素」，如受體、配體或酶)的「結合結構域」與免疫球蛋白恆定結構域的效應物構件(effectorcomponent)結合起來的抗體樣分子。在結構上，免疫粘附素包含具有不同於抗體的(即是「異源的」)抗原識別和結合位點(抗原結合位點)的期望結合特異性的粘附素胺基酸序列和免疫球蛋白恆定結構域序列的融合體。免疫粘附素中的免疫球蛋白恆定結構域序列可以由任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。
「異多聚體」、「異多聚複合體」、或「異多聚多肽」指至少包含第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽的胺基酸序列因至少一個胺基酸殘基而與第一多肽不同。異多聚體可以包括由第一和第二多肽形成的「異二聚體」，或者可以形成更高等級的三級結構，其中存在第一種和第二多肽以外的多肽。
在用於本文時，「多肽」通常指具有超過約10個胺基酸的肽和蛋白質。
短語「免疫抑制特性」或其變體在用於本文時指抗體直接或間接導致對一種或多種牽涉免疫系統的正常活性和/或功能(包括但不限於體液和細胞介導的免疫)的抑制的特性。
術語「Fc區」在用於本文時通常指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列的二聚複合體，其中C端多肽序列可通過木瓜蛋白酶消化完整抗體得到。Fc區可以包含天然或變異的Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈Fc序列的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc序列通常限定為由Cys226附近位置或Pro230附近位置的胺基酸殘基至Fc序列羧基末端的區段。免疫球蛋白的Fc序列通常包含兩個恆定結構域，CH2結構域和CH3結構域，且任選包含CH4結構域。「Fc多肽」在本文中指構成Fc區的多肽之一。Fc多肽可以由任何合適免疫球蛋白獲得，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。在有些實施方案中，Fc多肽包含部分或整個野生型鉸鏈序列(通常位於其N端)。在有些實施方案中，Fc多肽不含功能性或野生型鉸鏈序列。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」指細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨後引起靶細胞裂解。
術語「Fc受體」和「FcR」用於描述與抗體Fc區結合的受體。例如，FcR可以是天然序列人FcR。通常，FcR與IgG抗體結合(γ受體)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞型的受體，包括這些受體的等位基因變體和可選剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「激活受體」)和FcγRIIB(「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，且主要在其細胞質結構域中有所不同。其它同種型的免疫球蛋白也可以由某些FcR結合(參閱如Janeway等人，《Immuno Biologythe immune system in health and disease》，Elsevier ScienceLtd.，NY，第4版，1999)。激活受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述見Daron，1997，Annu.Rev.Immunol.，15203-234)。FcR的綜述見Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，425-34；及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126330-41。術語「FcR」在本文中涵蓋其它FcR，包括將來鑑定的FcR。該術語還包括新生兒受體FcRn，它負責將母親的IgG轉移給胎兒(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117587；及Kim等人，1994，J.Immunol.，24249)。
「鉸鏈區」、「鉸鏈序列」及其變體在用於本文時包含本領域知道的含義，下列文獻中有圖解例如Janeway等人，《Immuno Biologythe immune systemin health and disease》，Elsevier Science Ltd.，NY，第4版，1999；Bloom等人，1997，Protein Science，6407-415；Humphreys等人，1997，J.Immunol.Methods，209193-202。
術語「順反子」在用於本文時意圖指與翻譯單元粗略相當的遺傳元件，包含編碼多肽鏈的核苷酸序列和鄰近的控制區。「鄰近的控制區」包括例如翻譯起始區(TIR；如下文定義)和終止區。
「翻譯起始區」或TIR在用於本文時指為目的基因提供翻譯起始功效的核酸區。通常，特定順反子內的TIR涵蓋核糖體結合位點(RBS)及RBS的5』和3』序列。RBS限定為最低限度含有Shine-Dalgamo區和起始密碼子(AUG)。因此，TIR還包括至少部分待翻譯核酸序列。在有些實施方案中，本發明的TIR在順反子內在編碼輕鏈或重鏈的序列的前面包含編碼信號肽的分泌信號序列。TIR變體在TIR區內含有改變TIR特性(諸如其翻譯強度，如下文定義)的序列變異(特別是替代)。優選的是，本發明的TIR變體在分泌信號序列的前2至約14個、優選約4至12個、更優選約6個密碼子內含有序列替代，所述分泌信號序列位於順反子內位於編碼輕鏈或重鏈的序列的前面。
術語「翻譯強度」在用於本文時指分泌多肽在對照系統中的度量，其中將一種或多種TIR變體用於指導多肽的分泌，並將結果與相同培養和測定條件下的野生型TIR或某些其它對照進行比較。不限於任何一種理論，「翻譯強度」在用於本文時包括例如mRNA穩定性、核糖體與核糖體結合位點結合的效率、和穿膜轉運模式的度量。
「分泌信號序列」或「信號序列」指編碼可用於指導新合成的目的蛋白穿過細胞膜(例如原核生物的內膜或內外膜二者)的簡訊號肽的核酸序列。因此，目的蛋白(諸如免疫球蛋白輕鏈或重鏈多肽)可以分泌到原核宿主細胞的周質或進入培養基。由分泌信號序列編碼的信號肽對於宿主細胞可以是內源的，或者它們可以是外源的，包括對於待表達多肽是天然的信號肽。分泌信號序列通常位於待表達多肽的氨基末端，且通常在多肽的生物合成與由細胞質分泌之間酶促切除。由此，成熟的蛋白質產物中通常不存在信號肽。
「封閉性抗體」或「拮抗性(antagonist)」抗體指抑制或降低它所結合的抗原(如c-met和VEGF受體)的生物學活性的抗體。
「激動性抗體(agonist antibody)」在用於本文時指模擬目的多肽(如HGF和VEGF)的至少一種功能性活性的抗體。
「腫瘤抗原」在用於本文時包括本領域知道的含義，包括與正常細胞相比在腫瘤細胞上差異表達的任何分子。在有些實施方案中，所述分子在腫瘤細胞中以可檢測的或者顯著高於或低於正常細胞的水平表達。在有些實施方案中，所述分子在腫瘤細胞中展示可檢測的或者顯著高於或低於正常細胞的水平的生物學活性。在有些實施方案中，已知或認為所述分子有助於腫瘤細胞的致瘤特徵。本領域已知許多腫瘤抗原。還可以依照本領域技術人員熟知的技術和試驗來確定某種分子是否是腫瘤抗原，諸如例如產克隆試驗(clonogenic assays)、轉化試驗、體外或體內腫瘤形成試驗、凝膠遷移試驗、基因敲除分析等。
「紊亂」指將受益於本發明抗體或方法的治療的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動物易患所討論紊亂的病理狀況。本文中待治療紊亂的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤；非白血病性和淋巴樣惡性腫瘤；神經元、神經膠質、星形膠質細胞、下丘腦和其它腺體的、巨噬細胞、上皮、基質和囊胚腔病症；及炎性、免疫學和其它血管發生相關紊亂。
術語「癌症」和「癌症的」指的是或描述哺乳動物中特徵通常為不受調節的細胞生長/增殖的生理狀況。癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌症的更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、腹膜癌症、骨髓瘤(如多發性骨髓瘤)、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤/神經膠質瘤(如多形性星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、多形性少突膠質細胞瘤、多形性少突星形細胞瘤)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌。
「自身免疫病」在本文中指源於且針對個體自身組織的非惡性疾病或紊亂。自身免疫病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或紊亂，尤其排除B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多毛細胞白血病和慢性成髓細胞白血病。自身免疫疾病或紊亂的實例包括但不限於炎性應答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病(牛皮癬)和皮炎(如特應性皮炎)；系統性硬皮病和硬化症；與炎性腸病有關的應答(諸如Crohn氏病和潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫綜合症(包括成人呼吸窘迫綜合症；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如溼疹和哮喘及牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應答的其它狀況；動脈硬化；白細胞粘著缺陷；類風溼性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病和胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化症；Reynaud氏綜合症；自身免疫性甲狀腺炎；特應性腦脊髓炎；Sjorgen氏綜合症；幼髮型糖尿病；通常在肺結核、結節病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎中發現的與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和遲發性超敏反應有關的免疫應答；惡性貧血(Addison氏病)；牽涉白細胞滲出的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性紊亂；多種器官損傷綜合症；溶血性貧血(包括但不限於冷球蛋白血症(cryoglobinemia)或Coombs氏反應陽性貧血(Coombs positive anemia))；重症肌無力；抗原-抗體複合物介導的疾病；抗腎小球基膜病；抗磷脂綜合症；過敏性神經炎；Graves氏病；Lambert-Eaton肌無力綜合症；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內分泌腺病；Reiter氏病；僵體綜合症(stiff-man syndrome)；Behcet氏病；巨細胞動脈炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病；IgM多神經病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少症等。
在用於本文時，「治療」指試圖改變受治療個體或細胞的自然進程的臨床幹預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括防止疾病的發生或復發、緩解症狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態、及免除或改善預後。在有些實施方案中，本發明的抗體用於延遲疾病或紊亂的發展。在一個實施方案中，本發明的抗體和方法實現了腫瘤消退。在一個實施方案中，本發明的抗體和方法實現了對腫瘤/癌生長的抑制。
「有效量」指在必需的劑量和時間上有效達到期望的治療或預防效果的數量。本發明抗體的「治療有效量」可以根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重及抗體在個體中引發期望應答的能力等因素而變化。治療有效量還指抗體的治療有益效果勝過任何有毒或有害後果。「預防有效量」指在必需的劑量和時間上有效達到期望的預防效果的數量。通常而非必然，由於預防劑量是在疾病發作之前或在疾病的早期用於受試者的，因此預防有效量將低於治療有效量。
在用於本文時，短語「不具有實質性的效應物功能」就本發明的抗體片段而言指對本領域技術人員顯而易見的是本發明抗體片段的可檢測效應物功能活性的數量與所述抗體的野生型糖基化對應物所展示的活性數量之間的差異在統計學上是顯著的，其中本發明抗體片段的活性數量低於野生型對應物所展示的活性數量。在一個實施方案中，本發明的抗體片段不展示在統計學上顯著的超過背景水平的效應物功能活性水平(除了FcRn結合以外)。在用於本文時，短語「具有少許免疫抑制特性至沒有免疫抑制特性」就本發明的抗體片段而言指抗體在施用於受試者後不引發生物學有意義的數量的免疫抑制。正如本領域所理解的，可以定量或定性的測定活性的數量，只要能夠在本發明的抗體與參照對應物之間進行比較。可以依照本領域知道的任何試驗或技術來測量或檢測活性，包括如本文所述。可以平行地或分別地測定本發明抗體及其參照對應物的活性的數量。
短語「基本上(本質上)相似的」、「基本上(本質上)同一的」、「基本上(本質上)相同的」及其變化的相應描述在用於本文時指兩個數值(通常一個與本發明的抗體有關而另一個與其參照對應物有關)之間足夠高度的相似性，使得本領域技術人員將認為兩個數值之間的差異在由所述數值測量的生物學、物質或數量特徵的語境內沒有或具有極少生物學意義。所述兩個數值之間的差異優選小於約50％、優選小於約40％、優選小於約30％、優選小於約20％、優選小於約10％，上述百分比為參照對應物數值的函數。
本發明的抗體片段比另一種抗體形式(諸如Fab片段對應物)「更加穩定」或具有「提高的穩定性」及其變體在用於本文時指與參照抗體(諸如Fab片段對應物)相比本發明的抗體片段展示可檢測的/可測量的體內穩定性升高。穩定性可以以半衰期、清除速率和/或本領域看作在將本發明的抗體片段施用於受試者後的特定時間點有多少抗體片段保留在受試者體內的指標的任何其它參數為基礎。測定穩定性參數諸如半衰期和/或清除速率的方法在本領域眾所周知，本文描述了其中一些。
「補體依賴性細胞毒性」和「CDC」指存在補體時目標的裂解。補體激活途經是由補體系統的第一種構件(C1q)結合與相關抗原複合的分子(如抗體)而發起的。
「結合親和力」通常指分子(如抗體)的一個結合位點與其結合配對物(如抗原或FcRn受體)之間非共價相互作用的總和強度。分子X對其配對物Y的親和力通常可以表述為解離常數(Kd)。可以通過本領域知道的通用方法來測量親和力，包括本文所述。低親和力抗體微弱地結合抗原(或FcRn受體)，且傾向易於解離；而高親和力抗體更加緊密的結合抗原(或FcRn受體)，且更久的保持結合。
術語「細胞毒性劑」在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞毀滅的物質。該術語意圖包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物起源的小分子毒素或有酶活性的毒素，包括其片段和/或變體。
「化療劑」指可用於治療癌症的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑，諸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN環磷醯胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫化磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenin(番荔枝內酯)類(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚類(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類(colchicine)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙醯喜樹鹼、東茛菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；鬼臼噻吩苷(teniposide)；隱藻素(cryptophycin)類(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合適類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、異磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、三芥環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素γ1I和加利車黴素ωI1(參閱如Agnew，1994，Chem.Intl.Ed.Engl.，33183-186))；蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新抑癌菌素髮色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素類(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴黴素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素類(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素類(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿黴素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉阿黴素、氰嗎啉阿黴素、2-吡咯啉阿黴素、鹽酸阿黴素脂質體注射液(DOXIL)和脫氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycin)諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素類(olivomycin)、培來黴素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine，GEMZAR)、喃氟啶(tegafur，UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine，XELODA)、埃坡黴素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、曲麥克特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、氮雜胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼託坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid，frolinic acid)；醋葡內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羥嗶咔唑(elliptinium acetate)；環氧甘醚(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine，lonidainine)；美登木素生物鹼類(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)和美坦西醇類(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米託蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達謀(mopidamol，mopidanmol)；nitraerine；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK多糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亞胺(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西作非蘭(裂襉多糖，sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細格孢氮雜酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidin，anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(「Ara-C」)；硫替哌；類紫杉醇類(taxoid)，如紫杉醇(paclitaxel，TAXOL)、紫杉醇的清蛋白改造納米顆粒劑型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel，TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil，chloranbucil)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼(vinblastine，VELBAN)；鉑；鬼臼乙叉苷(etoposide，VP-16)；異磷醯胺(ifosfamide)；米託蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine，ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；亞葉酸(leucovorin，leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine，NAVELBINE)；米託蒽醌(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇類，諸如視黃酸；任何上述試劑的製藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種的組合，諸如CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯合5-FU和亞葉酸(leucovovin)的治療方案的縮寫)。
該定義還包括起調節、降低、阻斷、或抑制能夠促進癌生長的激素髮揮作用的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可能是激素。實例包括抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene，EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲奧昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那斯酮(onapristone)和託瑞米芬(toremifene，FARESTON)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant，FASLODEX)；作用於抑制或關閉卵巢的試劑，例如促黃體生成素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate，LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(醋酸性瑞林，goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin，tripterelin)；其它抗雄激素，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate，MEGASE)、依西美坦(exemestane，AROMASIN)、福美司坦(formestane，formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole，RIVISOR)、來曲唑(letrozole，FEMARA)和阿納託唑(anastrozole，ARIMIDEX)。另外，化療劑的這些定義包括二膦酸鹽，諸如氯屈膦酸二鈉(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鈉(etidronate，DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鈉(zoledronic acid/zoledronate，ZOMETA)、阿倫膦酸鈉(alendronate，FOSAMAX)、帕米膦酸鈉(pamidronate，AREDIA)、替魯膦酸鈉(tiludronate，SKELID)或利塞膦酸鈉(risedronate，ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(如LURTOTECAN)；rmRH(如ABARELIX)；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)；COX-2抑制劑，諸如塞來昔布(celecoxib，CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺醯胺；及任何上述試劑的製藥學可接受鹽、酸或衍生物。
除非文中另有說明，術語「第一種(第一)」多肽和「第二種(第二)」多肽及其變體只是一般稱謂，並非指定具體多肽或本發明的抗體構件。
「突起」指例如由第一多肽的界面突出並因此可位於鄰近界面(即第二多肽的界面)的補償腔中從而穩定異多聚體且由此對同多聚體形成而言有助於形成異多聚體的至少一個胺基酸側鏈。突起可以存在於原始界面中，或者可以人為導入(如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第一多肽的界面的核酸以編碼突起。為此，將編碼第一多肽的界面中的至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸用編碼至少一個比原始胺基酸殘基具有更大側鏈體積的「輸入」胺基酸殘基的核酸替代。可以理解，可以存在超過一個原始殘基和相應的輸入殘基。所替代原始殘基的數目上限是第一多肽的界面中的殘基總數。下表顯示了各種胺基酸殘基的側鏈體積。
表1胺基酸殘基的特性
a胺基酸的分子量減去了水的分子量。數值來自《Handbook of Chemistryand Physics》，第43版，Cleveland，Chemical Rubber Publishing Co.，1961。
b數值來自A.A.Zamyatnin，1972，Prog.Biophys.Mol.Biol.，24107-123。
c數值來自C.Chothia，1975，J.Mol.Biol.，1051-14。可及表面積如該參考文獻的圖6-20定義。
為了形成突起而優選的輸入殘基通常是天然存在胺基酸殘基，且優選選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最優選的是色氨酸和酪氨酸。在一個實施方案中，用於形成突起的原始殘基具有較小側鏈體積，諸如丙氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
「腔」指至少一個胺基酸側鏈陷入第二多肽的界面並因此可容納第一多肽鄰近界面上的相應突起。腔可以存在於天然界面中，或者可以人為導入(如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第二多肽的界面的核酸以編碼腔。為此，將編碼第二多肽的界面中的至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸用編碼至少一個比原始胺基酸殘基具有更小側鏈體積的「輸入」胺基酸殘基的DNA替代。可以理解，可以存在超過一個原始殘基和相應的輸入殘基。所替代原始殘基的數目上限是第二多肽的界面中的殘基總數。上文表1顯示了各種胺基酸殘基的側鏈體積。為了形成腔而優選的輸入殘基通常是天然存在胺基酸殘基，且優選選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)。最優選的是絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。在一個實施方案中，用於形成腔的原始殘基具有較大側鏈體積，諸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
「原始」胺基酸殘基指用比原始殘基具有更小或更大側鏈體積的「輸入」殘基所替代的胺基酸殘基。輸入胺基酸殘基可以是天然存在的或非天然存在的胺基酸殘基，但優選前者。「天然存在的」胺基酸殘基指由遺傳密碼編碼的殘基，正如上文表1所列。「非天然存在的」胺基酸殘基指不是由遺傳密碼編碼的殘基，但是它們能夠與多肽鏈中的鄰近胺基酸殘基共價連接。非天然存在胺基酸殘基的實例有正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它胺基酸殘基類似物，諸如例如Ellman等人，1991，Meth.Enzym.，202301-336中所述。為了生成這些非天然存在胺基酸殘基，可以使用Noren等人，1989，Science，244182和Ellman等人，見上文的流程。簡而言之，這牽涉用非天然存在胺基酸殘基化學活化抑制型tRNA，然後體外轉錄並翻譯RNA。本發明的方法牽涉替代至少一個原始胺基酸殘基，但可以替代超過一個原始殘基。通常，所替代的原始胺基酸殘基不超過第一或第二多肽的界面中的全部殘基。通常，所替代的原始殘基是「掩埋的」。「掩埋的」指溶劑基本上達不到該殘基。通常，輸入殘基不是半胱氨酸以防止可能的氧化或二硫鍵錯配。
突起「可位於」腔中指第一多肽和第二多肽各自界面上的突起和腔的空間位置及突起和腔的大小容許突起可以位於腔中且不會顯著幹擾第一與第二多肽在界面處的正常結合。由於突起(諸如Tyr、Phe和Trp)通常不會由界面的軸垂直伸出且具有優選的構象，因此突起與對應腔的排列取決於以三維結構(諸如通過X射線結晶學或核磁共振(NMR)得到的)為基礎的突起/腔對的建模。這可以使用本領域廣泛接受的技術來完成。
「原始或模板核酸」指編碼目的多肽的核酸，它可以「改變」(即遺傳工程改造或突變)以編碼突起或腔。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含進行了上述改變的核酸(如人源化抗體片段)。「改變」核酸指原始核酸通過插入、刪除或替代至少一個編碼目的胺基酸殘基的密碼子而進行了突變。通常，將編碼原始殘基的密碼子用編碼輸入殘基的密碼子替代。用於以這種方式遺傳修飾DNA的技術的綜述見《Mutagenesisa PracticalApproach》，M.J.McPherson編，IRL Press，Oxford，UK，1991，且包括例如定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)誘變。通過突變原始/模板核酸，由此就相應改變了由原始/模板核酸編碼的原始/模板多肽。
可以通過合成手段將突起或腔「導入」第一或第二多肽的界面，如通過重組技術、體外肽合成、先前所述用於導入非天然存在胺基酸殘基的那些技術、通過肽的酶促或化學偶聯或這些技術的一些組合。因此，「導入」的突起或腔是「非天然存在的」或「非天然的」，這意味著它不存在於天然或原始多肽中(如人源化單克隆抗體)。
通常，用於形成突起的輸入胺基酸殘基具有相對較小數目的「旋轉異構體」(如約3-6種)。「旋轉異構體」指胺基酸側鏈的熱力學有利構象。各種胺基酸殘基的旋轉異構體數目的綜述見Ponders和Richards，1987，J.Mol.Biol.，193775-791。
「分離的」異多聚體指已經由其天然細胞培養物環境的成分鑑定且分開和/或回收的異多聚體。其天然環境的汙染性成分指將會干擾異多聚體的診斷性或治療性用途的物質，可以包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在有些實施方案中，異多聚體純化(1)超過95％(以重量計)的蛋白質(通過Lowry法測定)，或超過99％(以重量計)，(2)達到足以獲得至少15個殘基的N端或內部胺基酸序列(使用轉杯式測序儀)的程度，或(3)根據SDS-PAGE(使用還原或非還原條件，使用考馬斯藍或銀染)達到同質。
本發明的異多聚體通常純化至本質上同質。短語「基本上(本質上)同質的」、「基本上(本質上)同質的形式」和「基本上(本質上)同質」用於指產物本質上不含源自非期望多肽組合體(如同多聚體)的副產物。就表述成純度而言，基本上(本質上)同質意味著副產物的數量不超過10％、或低於5％、或低於1％、或低於0.5％，其中百分數指重量。
表述「控制序列」指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱子序列、核糖體結合位點、可能還有目前了解不多的序列。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。
當一種核酸與另一種核酸序列處於功能性相互關係中時，則它們是「可操作連接的」。例如，若前序列或分泌前導序列的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與編碼序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接」指DNA序列鄰近相連，且在分泌前導序列的情況中指鄰近且以讀碼狀態相連。然而，增強子不必鄰近。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接反應來完成。如果沒有這些位點，那麼使用與常規實踐一致的合成寡核苷酸銜接頭或接頭。
載體、宿主細胞和重組方法為了重組生產本發明的抗體，分離編碼它的核酸，並將其插入可複製載體，用於進一步克隆(DNA擴增)或表達。可以使用常規流程容易的分離編碼抗體的DNA並測序(如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。可以獲得許多載體。載體的選擇部分取決於將要使用的宿主細胞。通常，優選的宿主細胞是原核或真核(通常是哺乳動物)起源。
使用原核宿主細胞生成抗體載體構建可以使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體多肽構件的多核苷酸序列。可以由抗體生成細胞(諸如雜交瘤細胞)分離期望的多核苷酸序列並測序。或者，可以使用核苷酸合成儀或PCR技術合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中複製並表達異源多核苷酸的重組載體。為了本發明，可以使用本領域知道的且可獲得的許多載體。合適載體的選擇主要取決於將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉化的具體宿主細胞。根據其功能(擴增或表達異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細胞的相容性，每種載體都含有多種構件。載體構件通常包括但不限於複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入片段、和轉錄終止序列。
一般而言，與宿主細胞一起使用的質粒載體含有源自與所述宿主相容物種的複製子和控制序列。載體通常攜帶複製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒pBR322轉化大腸桿菌。pBR322含有編碼氨苄青黴素(Amp)和四環素(Tet)抗性的基因，由此提供輕鬆鑑定轉化細胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質粒或噬菌體也可以含有或在修飾後含有能夠被微生物生物體用於表達內源蛋白質的啟動子。Carter等人，美國專利號5,648,237中詳細描述了用於表達特定抗體的pBR322衍生物的實例。
另外，可以將含有與宿主微生物相容的複製子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉化載體。例如，可以使用噬菌體諸如λGEM.TM.-11來構建可用於轉化敏感宿主細胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。
本發明的表達載體可以包含兩種或多種啟動子-順反子對，編碼每一種多肽構件。啟動子是位於順反子上遊(5′)的非翻譯調控序列，它調控順反子的表達。原核啟動子通常分成兩類，誘導型和組成性。誘導型啟動子指應答培養條件的變化(如營養物的存在與否或溫度變化)而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。
眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化清除源DNA中的啟動子並將分離的啟動子序列插入本發明的載體，由此可以將選擇的啟動子與編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可以用於指導靶基因的擴增和/或表達。在有些實施方案中，採用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，它們通常容許所表達靶基因的更高轉錄和更高產量。
適用於原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳糖苷酶啟動子和乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌中有功能的其它啟動子(諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經發表，因此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlist等人，1980，Cell，20269)。
在本發明的一個方面，重組載體內的每個順反子都包含指導所表達多肽穿膜轉運的分泌信號序列構件。一般而言，信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為了本發明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別並加工(即被信號肽酶切除)的信號序列。對於不識別並加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細胞，將信號序列用選自例如下組的原核信號序列替代鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp、或熱穩定的腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發明的一個實施方案中，表達系統的兩個順反子中都使用的信號序列是STII信號序列或其變體。
在另一個方面，依照本發明的免疫球蛋白的生成可以發生在宿主細胞的細胞質中，因此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那點上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細胞質內表達、摺疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成的細胞質條件，從而容許所表達蛋白質亞基的正確摺疊和裝配(Proba和Pluckthun，1995，Gene，159203)。
本發明提供了可以調控所表達多肽構件的數量比率的表達系統，從而將分泌且正確裝配的本發明抗體的產量最大化。這種調控是至少部分通過同時調控多肽構件的翻譯強度而完成的。
Simmons等人，美國專利號5,840,523中公開了用於調控翻譯強度的一種技術。它在順反子內採用翻譯起始區(TIR)的變體。對於指定TIR，可以創建具有一定範圍翻譯強度的一系列胺基酸或核苷酸序列變體，由此提供針對特定鏈的期望表達水平調節此因素的方便手段。可以通過常規誘變技術導致能夠改變胺基酸序列的密碼子變化(儘管優選核苷酸序列中的沉默變化)從而生成TIR變體。TIR中的改變可以包括例如Shine-Dalgarno序列的數目或間距的改變，以及信號序列的改變。用於生成突變型信號序列的一種方法是在編碼序列的開端生成不改變信號序列胺基酸序列的「密碼子庫」(即變化是沉默的)。這可以通過改變每個密碼子的第三個位置核苷酸來完成；另外，有些胺基酸，諸如亮氨酸、絲氨酸、和精氨酸，具有多種第一個和第二個位置核苷酸，這能夠為建庫增加複雜性。Yansura等人，1992，METHODSA Companion to Methods in Enzymol.，4151-158中詳細描述了這種誘變方法。
優選的是，對於載體中的每個順反子，生成具有一定範圍TIR強度的一組載體。這個有限集合提供了每條鏈的表達水平以及期望抗體產物的產量在各種TIR強度組合下的比較。可以通過量化報導基因的表達水平來測定TIR強度，Simmons等人，美國專利號5,840,523中有詳細描述。根據翻譯強度的比較，選擇期望的個別TIR在本發明的表達載體構建物中進行組合。
適於表達本發明抗體的原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)和真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的實例包括埃希氏菌(Escherichia)(如大腸埃希氏菌E.coli)、芽孢桿菌(Bacilli)(如枯草芽孢桿菌B.subtilis)、腸桿菌(Enterobacteria)、假單胞菌(Pseudomonas)物種(如銅綠假單胞菌P.aeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形菌(Proteus)、志賀氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。在一個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，使用大腸桿菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的實例包括菌株W3110(Bachmann，《Cellular and MolecularBiology》，第2卷，Washington，D.C.，美國微生物學學會，1987，第1190-1219頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美國專利號5,639,635)。其它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)也是合適的。這些實例只是例示而非限制。本領域知道用於構建具有指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法，見例如Bass等人，1990，Proteins，8309-314。通常必需考慮複製子在細菌細胞中的可複製性來選擇適當的細菌。例如，在使用眾所周知的質粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌、或沙門氏菌物種可能適於用作宿主。通常，宿主細胞應當分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細胞培養中摻入額外的蛋白酶抑制劑。
抗體生產用上述表達載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規營養培養基中進行培養。
轉化即將DNA導入原核宿主，使得DNA能夠或是作為染色體外元件或是通過染色體成分而複製。根據所用宿主細胞，使用適合這些細胞的標準技術進行轉化。採用氯化鈣的鈣處理通常用於具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉化方法採用聚乙二醇/DMSO。採用的還有一種技術是電穿孔。
在本領域知道的且適於培養選定宿主細胞的培養基中培養用於生產本發明多肽的原核細胞。合適培養基的實例包括添加了必需營養補充物的LB培養基。在有些實施方案中，培養基還含有根據表達載體的構建而選擇的、選擇性容許攜帶表達載體的原核細胞生長的選擇劑。例如，向用於培養表達氨苄青黴素抗性基因的細胞的培養基中添加氨苄青黴素。
除了碳、氮、和無機磷酸鹽來源以外，還可以含有適當濃度的任何必需補充物，或是單獨加入或是作為與另一種補充物或培養基的混合物，諸如複合氮源。任選的是，培養基可以含有一種或多種選自下組的還原劑穀胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。
在合適的溫度培養原核宿主細胞。例如，對於培養大腸桿菌而言，優選的溫度範圍是約20℃至約39℃，更優選約25℃至約37℃，甚至更優選約30℃。主要根據宿主生物體，培養基的pH可以是範圍為約5至約9的任何pH。對於大腸桿菌而言，pH優選約6.8至約7.4，更優選約7.0。
如果本發明的表達載體中所使用的是誘導型啟動子，那麼在適於激活啟動子的條件下誘導蛋白質表達。在本發明的一個方面，使用PhoA啟動子來控制多肽的轉錄。因此，在用於誘導的磷酸鹽限制培養基中培養經轉化宿主細胞。優選的是，磷酸鹽限制培養基是C.R.A.P培養基(參閱如Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)。根據所採用的載體構建物，可以採用多種其它誘導物，正如本領域所知道的。
在一個實施方案中，所表達的本發明多肽分泌到宿主細胞的周質且由此回收。蛋白質回收通常牽涉破壞微生物，通常通過諸如滲壓震擾、超聲處理或裂解等手段。一旦細胞破裂，可以通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞。可以通過例如親和樹脂層析進一步純化蛋白質。或者，蛋白質可能轉運到培養液中且由此分離。可以由培養液清除細胞，並將培養液過濾和濃縮，用於進一步純化所生成蛋白質。可以使用普遍知道的方法諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡分析進一步分離和鑑定所表達蛋白質。
在本發明的一個方面，通過發酵過程大量進行抗體生產。多種大規模補料-分批發酵流程可用於生產重組蛋白。大規模發酵具有至少1000升的容量，優選約1,000至100,000升的容量。這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養分，尤其是葡萄糖(優選的碳源/能源)。小規模發酵通常指在體積容量不超過約100升的發酵罐中進行的發酵，範圍可以是約1升至約100升。
在發酵過程中，通常在細胞在合適條件下生長至期望密度(如OD550約180-220，在此階段細胞處於早期穩定期)後啟動蛋白質表的誘導。根據所採用的載體構建物，可以使用多種誘導物，正如本領域知道的且上文所述的。可以在誘導前將細胞培養更短的時間。通常將細胞誘導約12-50小時，但是可以使用更長或更短的誘導時間。
為了改善本發明多肽的產量和質量，可以修改多個發酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和摺疊，可以使用過度表達伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的一種肽基脯氨醯-順式，反式-異構酶)的額外載體共轉化宿主原核細胞。已經證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生成的異源蛋白的正確摺疊和溶解性(Chen等人，1999，J.Biol.Chem.，27419601-19605；Georgiou等人，美國專利號6,083,715；Georgiou等人，美國專利號6,027,888；Bothmann和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，27517100-17105；Ramm和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，27517106-17113；Arie等人，2001，Mol.Microbiol.，39199-210)。
為了將所表達異源蛋白(尤其是對蛋白水解敏感的蛋白質)的蛋白水解降至最低，可以將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用於本發明。例如，可以修飾宿主細胞菌株，在編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。可以獲得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參閱例如Joly等人，1998，見上文；Georgiou等人，美國專利號5,264,365；Georgiou等人，美國專利號5,508,192；Hara等人，1996，Microbial Drug Resistance，263-72。
在一個實施方案中，在本發明的表達系統中使用蛋白水解酶缺陷且經過度表達一種或多種伴侶蛋白的質粒轉化的大腸桿菌菌株作為宿主細胞。
抗體純化在一個實施方案中，進一步純化此處生成的抗體蛋白以獲得基本上(本質上)同質的製劑，用於進一步的測定和使用。可以採用本領域知道的標準蛋白質純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示在免疫親和或離子交換柱上分餾、乙醇沉澱、反相HPLC、在矽土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱、和使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾。
在一個方面，將固定在固相上的蛋白A用於本發明全長抗體產物的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細胞壁蛋白質，它以高親和力結合抗體Fc區(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，621-13)。蛋白A固定其上的固相優選具有玻璃或石英表面的柱子，更優選可控孔徑玻璃柱或矽酸柱。在有些應用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止汙染物的非特異粘附。
作為純化的第一步，將衍生自如上所述細胞培養物的製備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異結合蛋白A。然後清洗固相以清除與固相非特異結合的汙染物。最後通過洗脫由固相回收目的抗體。
使用真核宿主細胞生成抗體載體構件通常包括但不限於下列一種或多種信號序列、複製起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。
(i)信號序列構件用於真核宿主細胞的載體還可以在目的成熟蛋白質或多肽的N端含有信號序列或具有特異切割位點的其它多肽。優選受到宿主細胞識別並加工(即受到信號肽酶切割)的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導例如單純皰疹病毒gD信號。
將這些前體區的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。
(ii)複製起點通常，哺乳動物表達載體不需要複製起點構件。例如，SV40起點通常可能只因含有早期啟動子才使用。
(iii)選擇基因構件表達和克隆載體可以含有選擇基因，也稱為選擇標記。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，如氨苄青黴素、新黴素、甲氨蝶呤或四環素；(b)補足相應的營養缺陷；或(c)提供不能由複合培養基獲得的關鍵營養物。
選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而倖免於選擇方案。這些顯性選擇的實例使用藥物新黴素、黴酚酸和潮黴素。
適於哺乳動物細胞的選擇標記的另一個實例是能夠鑑定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標記，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II優選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種競爭性拮抗劑)的培養基中進行培養來鑑定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在採用野生型DHFR時，合適的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可以通過在含有針對選擇標記的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素如卡那黴素、新黴素或G418的培養基中培養細胞來選擇經編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標記諸如氨基糖苷3′-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是含有內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利號4,965,199。
(iv)啟動子構件表達和克隆載體通常含有受到宿主生物體識別的啟動子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，位於起始轉錄的位點上遊約25至30個鹼基處。在許多基因的轉錄起點上遊70至80個鹼基處發現的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體中。
在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體多肽受到例如由病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨化病毒、逆轉錄病毒、B肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)的、來自熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若這些啟動子與宿主細胞系統相容的話。
方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還含有SV40病毒複製起點。方便地以HindIII E限制性片段的形式獲得人細胞巨化病毒的立即早期啟動子。美國專利號4,419,446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利號4,601,978中描述了該系統的一種修改。關於在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人β-幹擾素cDNA還可參閱Reyes等人，1982，Nature，297598-601。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。
(v)增強子元件構件常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核細胞對編碼本發明抗體多肽的DNA的轉錄。已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括SV40複製起點晚期側的增強子(bp 100-270)、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒複製起點晚期側的增強子、和腺病毒增強子。關於激活真核啟動子的增強元件還可參閱Yaniv，1982，Nature，29717-18。增強子可以剪接到載體中，位於抗體多肽編碼序列的5′或3′位置，但是優選位於啟動子的5′位點。
(vi)轉錄終止構件用於真核宿主細胞的表達載體通常還含有終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。這些序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5′端和偶爾的3′端獲得。這些區域含有在編碼抗體的mRNA的非翻譯區中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參閱WO94/11026及其中公開的表達載體。
(vii)宿主細胞的選擇和轉化適於克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括本文描述的高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中的繁殖已經成為常規流程。有用哺乳動物宿主細胞系的實例有經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚腎系(293細胞或為懸浮培養而亞克隆的293細胞，Graham等人，1977，J.Gen.virol.，3659)、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216)、小鼠塞託利(Sertoli)細胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.，23243-251)、猴腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝細胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI細胞(Mather等人，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68)、MRC 5細胞、FS4細胞和人肝細胞瘤系(Hep G2)。
為了生產抗體，用上文所述表達或克隆載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規培養基中進行培養。
(viii)宿主細胞的培養可以在多種培養基中培養用於生產本發明抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)適於培養宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中描述的任何培養基作為宿主細胞的培養基Ham等人，1979，Meth.Enz.，5844；Barnes等人，1980，Anal.Biochem.，102255；美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利再審號(U.S.Patent Re.)30,985。任何這些培養基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適當濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養條件諸如溫度、pH等即為表達而選擇的宿主細胞先前所用的，這對於普通技術人員而言是顯然的。
(ix)抗體的純化在使用重組技術時，可以在細胞內生成抗體，或者直接分泌到培養基中。如果在細胞內生成抗體，那麼首先需要通過例如離心或超濾清除宿主細胞或裂解片段的微粒碎片。如果將抗體分泌到培養基中，那麼通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自這些表達系統的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來汙染物的生長。
可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優選的純化技術是親和層析)來純化由細胞製備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類和同種型。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2、或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，621-13)。蛋白G推薦用於所有小鼠同種型和人γ3(Guss等人，1986，EMBO J.，51567-1575)。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。對於包含CH3結構域的抗體而言，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進行純化。根據待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分餾、乙醇沉澱、反相HPLC、矽土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱。
在任何初步純化步驟之後，可以將包含目的抗體和汙染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，使用pH約2.5-4.5的洗脫緩衝液，優選在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽)進行。
活性測定法可以通過本領域知道的多種測定法對本發明的抗體鑑定它們的物理/化學特性和生物學功能。
可以通過一系列測定法進一步鑑定純化的免疫球蛋白，包括但不限於N端測序、胺基酸分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。
在本發明的某些實施方案中，對本文生產的免疫球蛋白分析它們的生物學活性。在有些實施方案中，對本發明的免疫球蛋白測試它們的抗原結合活性。本領域知道的且可用於本文的抗原結合測定法包括但不限於使用諸如Western印跡、放射免疫測定法、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、「三明治」免疫測定法、免疫沉澱測定法、螢光免疫測定法和蛋白A免疫測定法等技術的任何直接或競爭性結合測定法。下文在實施例部分中提供了例示性的抗原結合測定法。
在一個實施方案中，本發明涵蓋具有一些但非所有效應物功能的改良抗體，這使得它在抗體體內半衰期是重要的但某些效應物功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的許多應用中成為期望的候選物。在某些實施方案中，測量所生產免疫球蛋白的Fc活性以確保只保留了期望的特性。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定法來確認CDC和/或ADCC活性的降低/耗損。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法來確保抗體缺乏FcγR結合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9457-92第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。美國專利號5,500,362或5,821,337中描述了用於評估目的分子的ADCC活性的體外測定法的實例。這些測定法的有用效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可以在體內評估目的分子的ADCC活性，如在動物模型中，諸如Clynes等人，199g，PNAS(USA)，95652-656中所公開的。還可以進行C1q結合測定法來確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。為了評估補體激活，可以如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods，202163中所述進行CDC測定法。還可以使用本領域知道的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定，如實施例部分中所描述的。
人源化抗體本發明涵蓋人源化抗體。本領域知道用於人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可以具有一個或多個由非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱為「輸入」殘基，它們通常來自「輸入」可變結構域。基本上可以遵循Winter及其同事的方法進行人源化(Jones等人，1986，Nature，321522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332323-327；Verhoeyen等人，1988，Science，2391534-1536)，即用非人高變區序列替代人抗體的對應序列。因此，這些「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中完整人可變結構域的很少一部分用非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中有些高變區殘基和可能的有些FR殘基用來自嚙齒類抗體的類似位點的殘基替代。
用於製備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變結構域的選擇對於降低抗原性是非常重要的。根據所謂的「最適(best-fit)」方法，用嚙齒類抗體的可變結構域序列對已知人可變結構域序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Sims等人，1993，J.Immunol.，1512296；Chothia等人，1987，J.Mol.Biol.，196901)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用於幾種不同的人源化抗體(Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等人，1993，J.Immunol.，1512623)。
更重要的是，抗體在人源化後保留對抗原的高親合力和其它有利的生物學特性。為了達到此目的，根據一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的過程來製備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領域技術人員所熟悉的。還可以獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。通過檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。通過這種方法，可以由受體和輸入序列中選出FR殘基並組合，從而得到期望的抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區殘基直接且最實質的牽涉對抗原結合的影響。
抗體變體一方面，本發明提供了在構成Fc區的Fc多肽界面中包含修飾的抗體片段，其中該修飾推動和/促進異多聚化。這些修飾包括將突起導入第一Fc多肽和將腔導入第二Fc多肽，其中突起可位於腔中，從而促進第一和第二Fc多肽的複合。本領域知道生成含有這些修飾的抗體的方法，如美國專利號5,731,168中所述。
在有些實施方案中，涵蓋本文所述抗體的胺基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。通過將合適的核苷酸變化導入抗體核酸或通過肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。這些修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基刪除和/或插入和/或替代。進行任何刪除、插入和替代組合以達到最終的構建物，倘若最終的構建物具有期望的特徵。可以在製備序列時將胺基酸改變導入抗體胺基酸序列。
可用於鑑定抗體中作為優選誘變位置的特定殘基或區域的方法有Cunningham和Wells，1989，Science，2441081-1085描述的所謂「丙氨酸掃描誘變」。這裡，鑑定一個殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和穀氨酸)並用中性或帶負電荷的胺基酸(最優選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，從而影響抗原內胺基酸的相互作用。然後通過在或對替代位點導入更多或其它變體，推敲對替代展示功能敏感性的胺基酸位置。由此，儘管用於導入胺基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身的本質不必預先決定。例如，為了分析在指定位點處的突變的後果，在靶密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，並對所表達的免疫球蛋白篩選預期的活性。
胺基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合(長度範圍由一個殘基至含有100個或更多殘基的多肽)，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N端甲硫氨醯殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(如ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。
另一類變體是胺基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個胺基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進行替代誘變的位點包括高變區，但是也涵蓋FR改變。表2中「優選替代」欄顯示了保守替代。如果這些替代導致生物學活性變化，那麼可以導入表2中稱為「例示替代」的較實質性變化，或下文參照胺基酸分類進一步所述，並篩選產物。
表2
對抗體的生物學特性的實質性修飾可通過選擇在維持(a)替代區域多肽主鏈的結構，例如(摺疊)片或螺旋構象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積這幾方面的效果中有顯著差異的替代來完成。天然存在的殘基可根據共有的側鏈特性分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性的cys、ser、thr；(3)酸性的asp、glu；(4)鹼性的asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基gly、pro；和(6)芳香族的trp、tyr、phe。
非保守替代將限定為用上述某一類的成員替代另一類。
一類替代變體牽涉替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步開發的所得變體相對於其來源的親本抗體將具有改善的生物學特性。生成這些替代變體的方便方法牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡單的說，將高變區的數個位點(如6-7個位點)突變，從而在每一個位點生成所有可能的胺基酸替代。將由此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個顆粒內包裝的M13基因III產物的融合體。然後對噬菌體展示變體篩選它們的生物學活性(如結合親和力)，正如本文所公開的。為了鑑定候選高變區修飾位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑑定對抗原結合具有重要貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以確定抗體與抗原之間的接觸點可能也是有利的。這些接觸殘基及鄰近殘基是根據本文詳述技術進行替代的候選位點。一旦生成這些變體，如本文所述對這組變體進行篩選，可以選擇在一種或多種相關測定法中具有上佳特性的抗體用於進一步開發。
通過本領域知道的多種方法製備編碼抗體胺基酸序列變體的核酸。這些方法包括但不限於由天然來源分離(在天然存在胺基酸序列變體的情況中)，或是由較早製備的抗體的變體或非變體形式通過寡核苷酸誘導的(或定點)誘變、PCR誘變、和盒式誘變製備。
可能希望在本發明免疫球蛋白多肽的Fc區中導入一個或多個胺基酸修飾，由此生成Fc區變體。Fc區變體可以包括在一個或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含胺基酸修飾(如替代)的人Fc區序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
依照此描述和本領域的教導，預料在有些實施方案中，本發明方法中所用的抗體與野生型對應抗體相比可以在如Fc區中包含一處或多處改變。與它們的野生型對應物相比，這些抗體仍將基本上(本質上)保留治療功效所需要的相同特徵。例如，認為可以在Fc區中進行導致Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(即或是增強或是削弱)的某些改變，例如WO99/51642中所述。還可參閱關注Fc區變體其它實施例的Duncan和Winter，1988，Nature，322738-40；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；及WO94/29351。
免疫偶聯物本發明還關於包含與細胞毒劑偶聯的抗體的免疫偶聯物或抗體-藥物偶聯物(ADC)，細胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶聯物)。
抗體-藥物偶聯物在癌症治療中用於局部投遞毒害細胞或抑制細胞試劑(即用於殺死或抑制腫瘤細胞的藥物)的用途(Syrigos和Epenetos，1999，Anticancer Research，19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer，1997，Adv.Drg.Del.Rev.，26151-172；美國專利號4,975,278)理論上容許藥物部分靶向投遞至腫瘤，並在那兒進行細胞內積累，而系統施用這些未綴合的藥物試劑在試圖消除腫瘤細胞的同時可能導致不可接受的對正常細胞的毒性水平(Baldwin等人，1986年5月15日，Lancet，603-05；Thorpe，1985，「AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review」，在《MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體二者都有報導可用於這些策略(Rowland等人，1986，Cancer Immunol.Immunother.，21183-87)。這些方法中所用的藥物包括道諾黴素、阿黴素、甲氨蝶呤和長春地辛(Rowland等人，1986，見上文)。抗體-毒素偶聯物中所用的毒素包括細菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒素、小分子毒素諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人，2000，Jour.of the Nat.CancerInst.，92(19)1573-1581；Mandler等人，2000，Bioorganic Med.Chem.Letters，101025-1028；Mandler等人，2002，Bioconjugate Chem.，13786-791)、美登木素生物鹼類(EP 1391213；Liu等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938618-8623)、和加利車黴素(Lode等人，1998，Cancer Res.，582928；Hinman等人，1993，Cancer Res.，533336-3342)。毒素可以通過包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制在內的機制發揮其毒害細胞和抑制細胞的效果。有些細胞毒劑在與大的抗體或蛋白質受體配體綴合時趨於失活或活性降低。
ZEVALIN(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由針對在正常和惡性B淋巴細胞表面上發現的CD20抗原的鼠IgG1 κ單克隆抗體與由硫脲接頭-螯合劑結合的111In或90Y放射性同位素構成的抗體-放射性同位素偶聯物(Wiseman等人，2000，Eur.Jour.Nucl.Med.，27(7)766-77；Wiseman等人，2002，Blood，99(12)4336-42；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(10)2453-63；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(15)3262-69)。儘管ZEVALIN具有針對B細胞非Hodgkin氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數患者中導致嚴重且長時間的血球減少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車黴素連接而構成的抗體-藥物偶聯物，在2000年批准用於經注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future，2000，25(7)686；美國專利號4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen公司)，即由huC242抗體經二硫化物接頭SPP與美登木素生物鹼藥物部分DM1連接而構成的抗體-藥物偶聯物，正在進行用於治療表達CanAg的癌症諸如結腸、胰腺、胃和其它癌的II期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特異膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物鹼藥物部分DM1連接而構成的抗體-藥物偶聯物，正在進行用於前列腺癌潛在治療的開發。將多拉司他汀(auristatin)的合成類似物多拉司他肽、多拉司他E(AE)和單甲基多拉司他(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對癌上的Lewis Y特異)和cAC10(對惡性血液腫瘤上的CD30特異)綴合(Doronina等人，2003，NatureBiotechnology，21(7)778-784)，且正在進行治療性開發。
上文已經描述了可用於生成這些免疫偶聯物的化療劑。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈(abrin A chain)、蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴黴素(alpha-sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)蛋白質、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)。還可參閱如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用於生成放射性綴合抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗體和細胞毒劑的偶聯物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑來製備，雙功能蛋白偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二醯亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，2381098中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參閱WO94/11026。
本文還涵蓋抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車黴素(calicheamicin)、美登木素生物鹼類(maytansinoids)、單端孢黴素和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯物。
美登素和美登木素生物鹼類在一個實施方案中，本發明的抗體(全長或片段)與一個或多個美登木素生物鹼分子綴合。
美登木素生物鹼是通過抑制微管蛋白多聚化來發揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初由東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國專利號3,896,111)。隨後發現某些微生物也生成美登木素生物鹼類，諸如美登木醇和C-3美登木醇酯(美國專利號4,151,042)。例如下列專利公開了合成美登木醇及其衍生物和類似物美國專利號4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，其公開內容收入本文作為參考。
美登木素生物鹼-抗體偶聯物在改進其治療指數的嘗試中，已經將美登素和美登木素生物鹼類與特異結合腫瘤細胞抗原的抗體綴合。例如下列專利公開了含有美登木素生物鹼類的免疫偶聯物及其用途美國專利號5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0425 235 B1，將其內容收入本文作為參考。Liu等人，2996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938618-8623描述了包含與針對人結腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物鹼的免疫偶聯物。發現該偶聯物具有針對培養的結腸癌細胞的高度細胞毒性，而且在體內腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131描述了美登木素生物鹼經二硫化物接頭與結合人結腸癌細胞系上抗原的鼠抗體A7或結合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1綴合的免疫偶聯物。在體外在人乳癌細胞系SK-BR-3上測試了TA.1-美登木素生物鹼偶聯物的細胞毒性，該細胞系每個細胞表達3×105個HER-2表面抗原。藥物偶聯物達到了與游離美登木素生物鹼藥物相似的一定程度的細胞毒性，這可以通過增加每個抗體分子綴合的美登木素生物鹼分子數目來提高。A7-美登木素生物鹼偶聯物在小鼠中顯示低的系統性細胞毒性。
抗體-美登木素生物鹼偶聯物(免疫偶聯物)抗體-美登木素生物鹼偶聯物是通過將抗體與美登木素生物鹼分子化學連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物鹼分子的生物學活性而製備的。每個抗體分子綴合平均3-4個美登木素生物鹼分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效，且對抗體的功能或溶解度沒有負面影響，儘管預計甚至一個毒素分子/抗體也將相對於裸露抗體的使用增強細胞毒性。美登木素生物鹼類在本領域是眾所周知的，而且可以通過已知技術合成或由天然來源分離。例如美國專利號5,208,020和上文提及的其它專利及非專利發表物中描述了合適的美登木素生物鹼類。優選的美登木素生物鹼類是美登木醇和美登木醇分子的芳香環或其它位置經過修飾的美登木醇類似物，諸如各種美登木醇酯。
本領域知道許多連接基團可用於製備抗體-美登木素生物鹼偶聯物，包括例如美國專利號5,208,020或歐洲專利0 425 235 B1及Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131中所公開的。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團、或酯酶不穩定基團，正如上文所述專利中所公開的，優選二硫化物和硫醚基團。
可以使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備抗體和美登木素生物鹼的偶聯物，雙功能蛋白質偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二醯亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特別優選的偶聯劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，1978，Biochem.J.，173723-737)和N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵。
可以將接頭附著在美登木素生物鹼分子上，根據連接的類型可以在多個位置處。例如，可以使用常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯鍵。反應可以發生在具有羥基的C-3位置、經羥甲基修飾的C-14位置、經羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置。在一個優選的實施方案中，在美登木醇或美登木醇類似物的C-3位置形成鍵。
加利車黴素另一種感興趣的免疫偶聯物包含與一個或多個加利車黴素分子綴合的抗體。加利車黴素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關於加利車黴素家族偶聯物的製備參閱美國專利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(都授予美國Cyanamid公司)。可以使用的加利車黴素結構類似物包括但不限於γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，1993，Cancer Research，533336-3342；Lode等人，1998，Cancer Research，582925-2928；及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)。可以與抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車黴素和QFA二者都具有胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些試劑經由抗體介導的內在化的細胞攝取大大增強了它們的毒害細胞效果。
其它細胞毒性劑可以與本發明抗體綴合的其它抗腫瘤試劑包括BCNU、鏈脲菌素(streptozoicin)、長春新鹼、5-氟尿嘧啶、美國專利5,053,394、5,770,710中描述的統稱為LL-E33288複合物的試劑家族、及埃斯波黴素類(esperamicins)(美國專利5,877,296)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴黴素、油桐蛋白質、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白質(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、白樹毒蛋白、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素、酚黴素、依諾黴素和單端孢菌素。參閱例如1993年10月28日公布的WO93/21232。
本發明還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯物。
為了選擇性破壞腫瘤，抗體可以包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用於生成放射性綴合抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在將偶聯物用於檢測時，可以包含放射性原子用於閃爍照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋標記物用於核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以以已知方式將放射性或其它標記物摻入偶聯物。例如，可以生物合成肽，或是通過化學胺基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19取代氫的合適胺基酸前體。可以經肽中的半胱氨酸殘基來附著標記物，諸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以經賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Fraker等人，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.，8049-57)可用於摻入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress，1989)詳細描述了其它方法。
可以使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備抗體和細胞毒劑的偶聯物，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)還己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二醯亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，2381098中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參閱WO94/11026。接頭可以是便於在細胞中釋放毒害細胞藥物的「可切割接頭」。例如，可以使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131；美國專利號5,208,020)。
本發明的化合物明確涵蓋但不限於用下列交聯試劑製備的ADC商品化(如購自Pierce Biotechnology公司，Rockford，IL，美國)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。見2003-2004年度應用手冊和產品目錄(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498頁。
抗體-藥物偶聯物的製備在本發明的抗體-藥物偶聯物(ADC)中，將抗體(Ab)經接頭(L)與一個或多個藥物基元(moity)(D)綴合，如每個抗體約1個至約20個藥物基元。可以採用本領域技術人員知道的有機化學反應、條件和試劑通過數種路徑製備通式I的ADC，包括(1)抗體的親核基團經共價鍵與二價接頭試劑反應，形成Ab-L，隨後與藥物基元D反應；和(2)藥物基元的親和基團經共價鍵與二價接頭試劑反應，形成D-L，隨後與抗體的親和基團反應。
Ab-(L-D)pI抗體的親核基團包括但不限於(i)N末端氨基；(ii)側鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側鏈巰基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、巰基、和羥基是親核的，能夠與接頭分子上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、滷代甲酸酯、和酸性滷化物；(ii)烷基和苯甲基滷化物，諸如滷代乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來醯亞胺基團。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋。可以通過還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應活性。由此，每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應活性硫醇親核體。可以經由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應，導致胺轉變為硫醇，從而將額外親核基團導入抗體。
還可以通過修飾抗體來生成本發明的抗體-藥物偶聯物，即導入能夠與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應的親電子部分。可以用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可以與接頭試劑或藥物基元的胺基反應的醛或酮基。由此生成的亞胺Schiff鹼基可以形成穩定的鍵，或者可以被例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺鍵。在一個實施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可以在蛋白質中生成羰(醛和酮)基，它能夠與藥物上的合適基團反應(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一個實施方案中，含有N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質能夠與偏高碘酸鈉反應，導致在第一個胺基酸處生成醛(Geoghegan和Stroh，1992，Bioconjugate Chem.，3138-146；US 5362852)。這些醛能夠與藥物基元或接頭親核體反應。
同樣，藥物基元上的親核基團包括但不限於胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，它們能夠與接頭分子上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、滷代甲酸酯、和酸性滷化物；(ii)烷基和苯甲基滷化物，諸如滷代乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來醯亞胺基團。
或者，可以通過例如重組技術或肽合成來製備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含編碼偶聯物兩個部分的各自區域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，該接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。
在又一個實施方案中，可以將抗體與「受體」(諸如鏈黴親和素)綴合從而用於腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由循環中清除未結合的偶聯物，然後施用與細胞毒劑(如放射性核苷酸)綴合的「配體」(如生物素)。
抗體衍生物可以進一步修飾本發明的抗體以包含本領域知道的且易於獲得的額外非蛋白質性質成分。具體而言，適於抗體衍生的成分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)、右旋糖苷(重複)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由於其在水中的穩定性，聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合物，那麼它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根據如下考慮來確定用於衍生的聚合物的數目和/或類型，包括但不限於待改進抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療等。
抗體特異性本發明適用於具有任何合適抗原結合特異性的抗體。優選的是，本發明方法中所使用的抗體對這樣的抗原特異，即生物學重要的多肽。更優選的是，本發明的抗體可用於哺乳動物中疾病或紊亂的治療或診斷。本發明的抗體包括但不限於阻斷性抗體、激動性抗體、中和性抗體、或抗體偶聯物。治療性抗體的非限制性實例包括抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗CD40、抗組織因子(TF)、抗HER2和抗TrkC抗體。還涵蓋針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關糖脂抗原)的抗體。
當抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(如受體)或配體諸如生長因子。例示性抗原包括諸如以下分子腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；卵泡刺激激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)、和von Willebrand因子；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(由正常T細胞表達和分泌的、在激活時受調節的因子，regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制物質；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質(microbial protein)，諸如β-內醯胺酶；DNA酶；IgE；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風溼因子；神經營養因子，諸如骨衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神經生長因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD40；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；幹擾素，諸如幹擾素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如HIV包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關抗原，諸如HER2、HER3或HER4受體；以及任何上文所列多肽的片段。
本發明一個實施方案所涵蓋的抗體的抗原包括CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、和CD46；ErbB受體家族成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞粘附分子，諸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整聯蛋白、和αv/β3整聯蛋白，包括其α或β亞基(如抗CD11a、抗CD18、或抗CD11b抗體)；生長因子，諸如VEGF；組織因子(TF)；TGF-β；α-幹擾素(α-IFN)；白介素，諸如IL-8；IgE；血型抗原Apo2，死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。在有些實施方案中，此處的靶是VEGF、TF、CD19、CD20、CD40、TGF-β、CD11a、CD18、Apo2和C24。
在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與腫瘤抗原特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與腫瘤抗原特異結合，其中該腫瘤抗原不是簇分化因子(cluster differentiation factor)(即CD蛋白)。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD蛋白特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD3或CD4以外的CD蛋白特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD19或CD20以外的CD蛋白特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD40以外的CD蛋白特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD19或CD20特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD40特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與CD11特異結合。在一個實施方案中，本發明的抗體結合在免疫細胞中不表達的抗原。在一個實施方案中，本發明的抗體結合在T細胞中不表達的抗原。在一個實施方案中，本發明的抗體結合在B細胞中不表達的抗原。
在一個實施方案中，本發明的抗體能夠與細胞存活調節因子特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與細胞增殖調節因子特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與牽涉細胞周期調節的分子特異結合。在其它實施方案中，本發明的抗體能夠與牽涉組織發育或細胞分化的分子特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠與細胞表面分子特異結合。在有些實施方案中，本發明的抗體能夠結合不是細胞表面受體多肽的腫瘤抗原。
在一個實施方案中，本發明的抗體能夠與淋巴因子特異結合。在另一個實施方案中，本發明的抗體能夠與細胞因子特異結合。
在一個實施方案中，本發明的抗體能夠與牽涉脈管發生(vasculogenesis)的分子特異結合。在另一個實施方案中，本發明的抗體能夠與牽涉血管形成(angiogenesis)的分子特異結合。
可溶性抗原或其片段，任選與其它分子綴合的，可以作為免疫原用於生成抗體。對於跨膜分子，諸如受體，這些分子的片段(如受體的胞外結構域)可以用作免疫原。或者，表達跨膜分子的細胞可以用作免疫原。這些細胞可以衍生自天然來源(如癌細胞系)，或者可以是經重組技術轉化而表達跨膜分子的細胞。可用於製備抗體的其它抗原及其形式對於本領域技術人員是顯而易見的。
藥物製劑可以通過將具有期望純度的抗體與任選的生理學可接受載體、賦形劑或穩定劑混合來製備包含本發明抗體的治療用配劑，其形式是水溶液、凍幹或其它乾燥配劑(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第16版，Osol，A.編，1980)。可接受載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度對受者沒有毒性，而且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨；苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、巖藻糖、或山梨醇；成鹽反離子，諸如鈉；金屬複合物(如鋅-蛋白質複合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此處的配劑還可以含有超過一種所治療具體適應症所必需的活性化合物，優選活性互補且彼此沒有不利影響的那些。合適的是，這些分子以對於預定目的有效的量組合存在。
例如在膠態藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中或在粗滴乳狀液中，活性成分還可以包裹在通過例如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這些技術公開於《Remington′s PharmaceuticalSciences》第16版，Osol，A.編，1980。
用於體內施用的配劑必需是無菌的。這可以通過使用無菌濾膜過濾而容易實現。
可以製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有本發明免疫球蛋白的固體疏水聚合物半透基質，該基質採取定型產品的形式，如膜或微膠囊。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-穀氨酸和L-穀氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)、以及聚D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠持續釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當膠囊化抗體在體內長時間維持時，它們可能由於暴露在37℃的潮溼環境中而變性或聚集，導致生物活性損失且免疫原性可能改變。可以根據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如，如果發現聚集機制是經由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那麼可以通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍幹、控制溼度、採用合適添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
用途本發明的免疫球蛋白可用於例如體外、離體和體內治療方法。本發明提供了以使用與常規單價抗體相比具有上佳特性的單價抗體片段為基礎的多種方法。在某些病理學狀況中，必須和/或希望利用單價抗體。同樣，在有些情況中，治療性抗體可以實現其治療作用但不牽涉免疫系統介導的活性，諸如效應物功能ADCC、吞噬和CDC。在這些情況中，希望生成這些活性實質性降低或消除的抗體形式。如果抗體是能夠高效製備且具有高產量的形式，那麼這也是有利的。本發明提供了這些抗體，它們可用於多種目的，例如治療劑、預防劑和診斷劑。例如，本發明提供了治療疾病的方法，所述方法包括對需要治療的受試者施用高度穩定的包含單個抗原結合臂的抗體片段，由此治療疾病。本文描述的任何本發明抗體片段可用於本文描述的治療(或預防或診斷)方法。
本發明的抗體可用作拮抗劑，從而在體外、離體和/或體內部分或完全阻斷特異抗原活性。此外，至少有些本發明抗體能夠中和來自其它物種的抗原活性。因此，本發明的抗體可用於抑制特異抗原活性，例如在含有抗原的細胞培養物中、在人受試者中或在具有本發明抗體與之交叉反應的抗原的哺乳動物受試者(如黑猩猩、狒狒、狨猴、獼猴和恆河猴、豬或小鼠)中。在一個實施方案中，本發明的抗體可用於抑制抗原活性，即通過使抗體接觸抗原從而抑制抗原活性。優選的是，抗原是人蛋白質分子。
在一個實施方案中，本發明的抗體可用於在患有某種紊亂的受試者中抑制抗原的方法，在所述紊亂中抗原活性是有害的，包括對受試者施用本發明的抗體，從而抑制受試者中的抗原活性。優選的是，抗原是人蛋白質分子且受試者是人受試者。或者，受試者可以是表達本發明抗體所結合的抗原的哺乳動物。又或者，受試者可以是其中導入了抗原(如通過施用抗原或通過表達抗原轉基因)的哺乳動物。可以出於治療目的將本發明的抗體施用於人受試者。此外，可以出於獸醫目的將本發明的抗體施用於表達免疫球蛋白與之交叉反應的抗原的非人哺乳動物(如靈長類、豬或小鼠)，或是人疾病的動物模型。關於後者，這些動物模型可用於評估本發明抗體的治療功效(如測試施藥的劑量和療程)。在治療上有用的本發明阻斷性抗體包括但不限於例如抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗幹擾素和抗組織因子抗體。本發明的抗體可用於治療、抑制、延遲其發展、預防/延遲其復發、改善、或預防與一種或多種抗原分子的異常表達和/或活性有關的疾病、紊亂或狀況，包括但不限於惡性和良性腫瘤；非白血病淋巴惡性腫瘤；神經元、神經膠質、星形細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質和囊胚的疾病；及炎性、血管發生性和免疫紊亂。
一方面，本發明的阻斷性抗體對配體抗原特異，而且通過阻斷或幹擾牽涉配體抗原的配體-受體相互作用來抑制抗原活性，由此抑制相應的信號途經和其它分子或細胞事件。本發明的特色還有受體特異抗體，它們不必阻止配體結合但幹擾受體活化，由此抑制通常由配體結合啟動的任何應答。本發明還涵蓋優選或專門結合配體-受體複合物的抗體。本發明的抗體還可擔當特定抗原受體的激動劑，由此加強、增強或激活配體介導的受體活化的全部或部分活性。
在某些實施方案中，將包含與細胞毒劑綴合的抗體的免疫偶聯物施用於患者。在有些實施方案中，免疫偶聯物和/或它所結合的抗原由細胞內化，導致免疫偶聯物殺傷它所結合的靶細胞的治療功效提高。在一個實施方案中，細胞毒劑靶向或幹擾靶細胞中的核酸。這些細胞毒劑的實例包括本文所述任何化療劑(諸如美登木素生物鹼或加利車黴素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA內切核酸酶。
在治療中，本發明的抗體可以單獨使用，或是聯合其它組合物使用。例如，本發明的抗體可以與另一種抗體、化療劑(包括化療劑的雞尾酒樣混合物)、其它細胞毒劑、抗血管發生劑、細胞因子、和/或生長抑制劑聯合施用。當本發明的抗體抑制腫瘤生長時，可能特別希望將其聯合一種或多種同樣抑制腫瘤生長的其它治療劑。例如，在轉移性乳腺癌治療中可以將阻斷VEGF活性的抗VEGF抗體聯合抗ErbB抗體(HERCEPTIN抗HER2抗體)。或者/另外，患者可以接受聯合放射療法(如外部射束照射或使用放射性標記試劑諸如抗體的療法)。上文所述這些聯合療法包括聯合施藥(當相同或不同劑型中包含兩種或多種試劑時)和分開施藥，在後一種情況中，本發明抗體的施用可以發生在附屬療法的施用之前和/或之後。
可以通過任何合適手段來施用本發明的抗體(和附屬治療劑)，包括腸胃外、皮下、腹膜內、肺內和鼻內，以及損傷內(如果希望局部治療的話)。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施藥。另外，脈衝輸注抗體也是合適的，特別是抗體劑量衰減時。可以通過任何合適路徑服藥，例如通過注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施藥是短期的還是長期的。
可以以與優良醫學實踐一致的方式配製、服用和施用本發明的抗體組合物。在此內容中考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病症的起因、投遞試劑的部位、施藥的方法、施藥的日程安排、和醫學從業人員知道的其它因素。不是必需而是任選將抗體與目前用於預防或治療所討論病症的一種或多種試劑一起配製。這些其它試劑的有效量取決於配製劑中存在的本發明抗體的數量、病症或治療的類型、和上文討論的其它因素。這些通常是以與上文所述相同劑量和施用路徑使用，或是所述採用劑量的大約1至99％。
對於疾病的預防或治療，本發明抗體的合適劑量(在單獨使用或聯合其它試劑諸如化療劑時)將取決於所治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和發展階段、施用抗體是出於預防或治療目的、先前的療法、患者的臨床病史和對抗體的應答、及主治醫師的判斷。合適的是，一次性或通過一系列治療將抗體施用於患者。根據疾病的類型和嚴重程度，施用於患者的初始候選劑量是約1μg/kg至15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體，例如或是通過一次或多次分開施藥或是通過連續輸注。根據上文所述因素，典型日劑量的範圍可以是約1μg/kg至100mg/kg或更多。對於持續數天或更長的重複施藥，根據狀況，持續治療直至疾病症狀發生期望的抑制。抗體的例示劑量的範圍可以是約0.05mg/kg至約10mg/kg。由此，可以對患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一個或多個劑量。這些劑量可以間歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受由約2個至約20個例如約6個劑量的抗體)。可以施用初始較高加載劑量，後續一個或多個較低劑量。例示性服藥方案包括施用約4mg/kg抗體的初始加載劑量，後續每周約2mg/kg的維持劑量。但是，其它劑量方案也可能是有用的。這種療法的進程易於通過常規技術和測定法來監測。
產品在本發明的另一個方面，提供了含有可用於上文所述病症的治療、預防和/或診斷的物質的產品。該產品包含容器和與容器有關的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料構成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯合另外的組合物時有效治療、預防和/或診斷病症的組合物，而且可以具有無菌進入埠(例如容器可以是具有能夠被皮下注射針頭刺穿的阻塞物的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性試劑是本發明的抗體。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療選擇的病症，諸如癌症。此外，該產品可以包含(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發明的抗體；和其中裝有組合物的第二容器，其中所述組合物包含其它細胞毒製劑。本發明這個實施方案中的產品還可以包含指示第一和第二抗體組合物可用於治療特定病症如癌症的包裝插頁。或者/另外，該產品還可以包含裝有製藥學可接受緩衝液的第二(或第三)容器，諸如無菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer氏液和右旋糖溶液。它還可以包含商業和用戶立場希望的其它物質，包括其它緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
下面是本發明方法和組合物的實施例。應當理解，根據上文提供的一般描述，可以實行多種其它實施方案。
實施例實施例1本發明抗體的生成和鑑定(下文也稱為「單臂抗體」或「Fab/c抗體」)表達載體的構建用於表達全長或Fab/c抗-c-met抗體的所有質粒都是基於分開的順反子系統(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)，它們依賴分開的phoA啟動子(AP)(Kikuchi等人，1981，Nucleic Acids Res.，95671-5678)來轉錄重鏈和輕鏈和Fc片段，後繼trp Shine-Dalgarno序列來啟動翻譯(Yanofsky等人，1981，Nucleic Acids Res.，96647-6668；及Chang等人，1987，Gene，55189-196)。另外，將熱穩定腸毒素II信號序列(STII)(Picken等人，1983，Infect.Immun.，42269-275；及Lee等人，1983，Infect.Immun.，42264-268)用於重鏈和輕鏈和Fc片段的周質分泌。對兩條鏈和Fc片段的精細翻譯控制是用先前所述具有實測的相對翻譯力度的STII信號序列變體而達到的，它們在翻譯起始區(TIR)中含有沉默密碼子改變(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634；及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)。最後，將λt0轉錄終止子(Schlosstissek和Grosse，1987，Nucleic Acids Res.，153185)置於兩條鏈和Fc片段編碼序列的下遊。所有質粒都採用基於pBR322的載體系統的讀碼框(Sutcliffe，1978，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90)。抗c-met抗體源是美國專利號5,686,292、5,646,036、6,207,152、6,214,344和6,468,529中描述的5D5抗體。SDS源抗體的雜交瘤細胞系先前保藏於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，12301 ParklawnDrive，Rockville，Md.，USA)，ATCC編號HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)(保藏日期1995年5月23日)。
質粒pxcM11C生成編碼嵌合5D5抗c-met抗體的期望質粒pxcM11C需要兩種中間質粒。首先，為了表達每條鏈，將5D5重鏈和輕鏈的可變結構域分開轉移到基於pBR322的質粒上。下文描述了這些中間質粒pxcMLC和pxcMHC的製備，接著是pxcM11C的構建。
pxcMLC為了將5D5抗體的鼠源輕鏈可變結構域轉移到與生成全長抗體相容的人源輕鏈框架中而構建該質粒。該質粒的構建牽涉三種DNA片段的連接。第一個是消除了MluI-BamHI小片段的pPho51載體(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634，變體1)。連接的第二個部分是來自pST7LC的約516個鹼基對的AlwNI-BamHI片段，編碼輕鏈最後15個胺基酸、λt0終止子和tet基因開端。質粒pST7LC是變體6(見上文參考文獻)的衍生物，在STII信號序列下遊具有人κ輕鏈。連接的第三個部分是使用如下引物由含有5D5 Fab序列(下文實施例2中「5D5 Fab的克隆和重組表達」中所述)的質粒生成的約623個鹼基對的MluI-AlwNIPCR片段5』-TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC(SEQ ID NO9)5』-GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC(SEQ ID NO10)pxcMHC為了將5D5抗體的鼠源重鏈可變結構域導入與生成全長抗體相容的人源重鏈框架而構建該質粒。PxcMHC的構建牽涉兩種DNA片段的連接。第一個是消除了MluI-BstEII小片段的pST2HC載體。質粒pST2HC是變體3(見上文參考文獻)的衍生物，其中人源IgG1重鏈融合在STII信號序列的下遊。連接的第二個部分是使用如下引物由含有5D5Fab序列(下文實施例2中「5D5 Fab的克隆和重組表達」中所述)的質粒生成的約346個鹼基對的MluI-BstEII PCR片段5』-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG(SEQ ID NO11)5』-AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC(SEQ ID NO12)pxcM11C為了表達全長5D5嵌合抗體而構建質粒pxcM11C。該質粒的構建牽涉四種DNA片段的連接。第一個是消除了MluI-BstEII小片段的paTF20載體(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147，paTF20是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的多順反子載體)。連接的第二個部分是來自pxcMLC的約623個鹼基對的MluI-AlwNI片段。第三個部分是來自paTF50(見上文參考文獻；paTF50是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的分開順反子載體)的約547個鹼基對的AlwNI-BsiWI片段。連接的最後一個部分是來自pxcMHC的約349個鹼基對的BsiWI-BstEII片段。
質粒pxcM11C-Fc為了構建pxcM11C-Fc，將編碼Fc片段表達的盒以及所有上文所述控制元件(包括AP啟動子、STII信號序列和λt0轉錄終止子)加入質粒pxcM11C。首先需要描述通向pxcM11c-Fc構建的兩種質粒，pBR322.VNERK.HC和pBR322.Fc。
pBR322.VNERK.HC質粒pBR322.VNERK.HC是變體1(Simmons和Yansura，1996，NatureBiotechnol.，14629-634)的衍生物，在STII信號序列下遊具有人源重鏈。該質粒是通過將兩種DNA片段連接起來而構建的。第一個是清除了EcoRI-ClaI小片段的載體pBR322。連接的第二個部分是使用如下引物由pVG11.VNERK生成的約1885個鹼基對的EcoRI-ClaI PCR片段，編碼AP啟動子、STII信號序列、重鏈、λt0終止子和tet基因的開端5』-TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC(SEQ ID NO13)5』-TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCC(SEQ ID NO14)質粒pVG11.VNERK是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的分開順反子載體的衍生物(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods 263133-147)，其中輕鏈和重鏈可變結構域變成抗VEGF抗體(VNERK)。
pBR322.Fc質粒pBR322.Fc是質粒pBR322.VNERK.HC的衍生物，它編碼Fc片段的表達以及上文所述所有控制元件。
質粒pBR322.Fc是通過將兩種DNA片段連接起來而構建的。第一個是清除了MluI-NsiI小片段的載體pBR322.VNERK.HC。連接的第二個部分是來自pJAL226的約1319個鹼基對的MluI-NsiI片段，編碼胺基酸SGTT，繼以人IgG1的胺基酸221至429。pJAL226是變體3(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634)的衍生物，在STII信號序列下遊具有人Fc片段。
pxcM11C-FcpxcM11C-Fc是通過將兩種DNA片段連接起來而構建的。第一個是清除了HpaI-ClaI小片段的載體pxcM11C。連接的第二個部分是來自pBR322.Fc的約1198個鹼基對的HpaI-ClaI片段。該連接導致命名為pxcM11C-Fc的期望質粒。
質粒pxcM11C.H-Fc.K質粒pxcM11C.H-Fc.K是pxcM11C-Fc的衍生物，其中pxcM11C重鏈的CH3結構域用具有「穴(hole)」(本文也稱為「腔」)突變(T366S、L368A、Y407V)的CH3結構域置換(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)。另外，Fc片段的CH3結構域用具有「隆起(knob)」(本文也稱為「突起」)突變(T366W)的CH3結構域置換(見上文參考文獻)。
pxcM11C.H該質粒以兩個步驟構建。第一步，通過將兩種DNA片段連接起來而導入「穴」突變。第一個是清除了SacII-NsiI小片段的載體pxcM11C。連接的第二個部分是來自pBR322.VNERK.HC.H的約411個鹼基對的SacII-NsiI片段。pBR322.VNERK.HC.H是質粒pBR322.VNERK.HC(見上文)的衍生物其中導入了「穴」突變(T366S、L368A、Y407V)(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)。將該中間質粒命名為pxcM11C.H。
pxcM11C.H-Fc.K第二步，將「隆起」突變導入Fc片段，且牽涉兩種DNA片段的連接。第一個是清除了ClaI-HpaI小片段的載體pxcM11C.H。連接的第二個部分是來自pBR322.Fc.K的約1198個鹼基對的ClaI-HpaI片段，編碼具有「隆起」突變的Fc片段的表達盒。pBR322.Fc.K是質粒pBR322.Fc(見上文)的衍生物，它編碼具有「隆起」突變(T366W)的Fc片段的表達(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)以及上文所述所有控制元件。該連接導致命名為pxcM11C.H-Fc.K的期望質粒。
抗c-Met單臂Fab/c抗體的表達和鑑定使用親本構建物(5D5抗c-Met的pxcM11C)和單臂Fab/c抗體構建物(pxcM11C-Fc)進行抗體的小規模誘導。對於每種構建物的小規模表達，使用大腸桿菌菌株33D3(W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR)作為宿主細胞。轉化後，用所選轉化子挑取物接種5ml補充羧苄青黴素(50μg/ml)的Luria-Bertani培養基，並於30℃在培養輪上培養過夜。然後在C.R.A.P.磷酸鹽限制培養基(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)中稀釋(1∶100)每份培養物。然後以50μg/ml濃度向誘導培養物中添加羧苄青黴素，並將培養物於30℃在培養輪上培養約24小時。除非另有注釋，所有搖瓶誘導以5ml體積進行。
如下所述由誘導培養物製備非還原的全細胞裂解物(1)將1ml OD600誘導樣品在微量離心管中離心；(2)將每份沉澱重懸於90μl TE(10mM TrispH 7.6，1mM EDTA)；(3)向每份樣品中添加10μl 100mM碘乙酸(SigmaI-2512)以封閉任何游離半胱氨酸和預防二硫鍵改組；(4)向每份樣品中添加20μl 10％ SDS。將樣品旋渦震蕩，加熱至約90℃達3分鐘，然後再次旋渦震蕩。在樣品冷卻至室溫後，加入750μl丙酮來沉澱蛋白質。將樣品旋渦震蕩，並於室溫放置約15分鐘。在微量離心機中離心5分鐘後，吸走每份樣品的上清液，並將每份蛋白質沉澱重懸於50μl dH2O+50μl 2X NOVEXSDS樣品緩衝液。然後將樣品加熱至約90℃達4分鐘，充分旋渦震蕩，並使之冷卻至室溫。然後進行最後的5分鐘離心，並將上清液轉移到乾淨的管中。
如下所述由誘導培養物製備還原的全細胞裂解物(1)將1ml OD600誘導樣品在微量離心管中離心；(2)將每份沉澱重懸於90μl TE(10mM Tris pH7.6，1mM EDTA)；(3)向每份樣品中添加10μl 1M二硫蘇糖醇(SigmaD-5545)以還原二硫鍵；(4)向每份樣品中添加20μl 10％ SDS。將樣品旋渦震蕩，加熱至約90℃達3分鐘，然後再次旋渦震蕩。在樣品冷卻至室溫後，加入750μl丙酮來沉澱蛋白質。將樣品旋渦震蕩，並於室溫放置約15分鐘。在微量離心機中離心5分鐘後，吸走每份樣品的上清液，並將每份蛋白質沉澱重懸於10μl 1M二硫蘇糖醇+40μl dH2O+50μl 2X NOVEX SDS樣品緩衝液。然後將樣品加熱至約90℃達4分鐘，充分旋渦震蕩，並使之冷卻至室溫。然後進行最後的5分鐘離心，並將上清液轉移到乾淨的管中。
製備後，將5-8μl每份樣品加載到NOVEX製造的10孔1.0mm 12％ Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，並以～120伏特電泳1.5-2小時。然後將由此得到的凝膠用考馬斯藍染色或用於Western印跡分析。
對於Western印跡分析，在10mM CAPS緩衝液pH 11+3％甲醇中將SDS-PAGE凝膠電轉印到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然後將膜用溶液1XNET(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH 7.4，0.05％ Triton X-100)+0.5％明膠封閉約30分鐘至1小時，於室溫搖動。封閉步驟後，為了抗FabWestern印跡分析，將膜置於溶液1X NET+0.5％明膠+抗Fab抗體(過氧化物酶綴合的針對人IgG Fab的山羊IgG餾分；CAPPEL #55223)中。根據抗體的批次，抗Fab抗體的稀釋範圍由1∶50,000至1∶1,000,000。或者，為了抗FcWestern印跡分析，將膜置於溶液1X NET+0.5％明膠+抗Fc抗體(過氧化物酶綴合的針對人Fc片段的山羊IgG餾分；BETHYL#A80-104P-41)中。根據抗體的批次，抗Fc抗體的稀釋範圍由1∶50,000至1∶250,000。在每種情況中，將膜置於抗體溶液中過夜，於室溫搖動。第二天上午，將膜用1X NET+0.5％明膠清洗3×10分鐘，接著用TBS(20mM TrispH 7.5，500mM NaCl)清洗1×15分鐘。使用Amersham Pharmacia Biotech ECL檢測並將膜暴露於X射線膠片來顯現抗Fab抗體和抗Fc抗體所結合的蛋白質條帶。
圖1顯示了抗c-Met Fab/c抗體表達的抗Fab Western印跡結果。它們揭示了完全摺疊和裝配的全長抗體(泳道1)和單臂Fab/c抗體(泳道2)的表達。注意，抗Fab抗體不能結合Fc片段，因此沒有檢出。對於非還原樣品，Fc片段與全長抗c-Met抗體的共表達導致完全摺疊和裝配的全長抗體實質性轉變為完全摺疊和裝配的單臂Fab/c抗體。對於還原樣品，對全長抗c-Met抗體和單臂抗c-Met Fab/c抗體檢出的重鏈和輕鏈數量是相似的。單臂抗c-Met Fab/c構建物的輕鏈前體的數量略有增加，可能是由於分泌途經的輕微倒退(back up)。
類似的，圖2顯示了抗Fc Western印跡結果，它們也揭示了完全摺疊和裝配的單臂Fab/c抗體的表達(泳道2)。抗Fc抗體不能結合輕鏈，因此沒有檢出。對於非還原樣品，Fc區與全長抗c-Met抗體的共表達顯示完全摺疊和裝配的全長抗體轉變為完全摺疊和裝配的單臂Fab/c抗體。另外，在抗FcWestern印跡上還檢出Fc多肽的單體和二聚體。對於還原樣品，對全長抗c-Met抗體和單臂抗c-Met Fab/c抗體表達檢出的重鏈數量是相似的。單臂Fab/c抗體構建物也有少量的Fc片段前體，可能是由於分泌途經的一些倒退。
根據上述資料顯而易見的是，有可能生成其中主要抗體種類是期望的單臂Fab/c抗體的免疫球蛋白群體。然而，通過抗Fab和抗Fc兩種Western印跡分析仍能檢出完整形式的抗體(即完全摺疊和裝配的抗c-Met全長抗體)。由於完整形式的抗c-met 5D5抗體是c-met受體的激動劑，它在需要拮抗作用的治療方案中是不合需要的，因此通常希望將生成的完整形式抗體的數量降至最低。
包含突起和腔(下文也稱為「隆起嵌入穴」)的單臂Fab/c抗c-Me抗體的表達和鑑定為了進一步將抗c-Met Fab/c抗體製備中全長抗c-Met抗體的形成降至最低，基本上如Merchant等人(1998，Nature Biotechnology，16677-681)所述，在Fc的CH3結構域中進行「隆起嵌入穴」突變。製備單臂Fab/c抗c-Met抗體的構建物(pxcM11C.H-Fc.K)，即將「穴」突變(T366S、L368A、Y407V)導入全長重鏈，並將「隆起」突變(T366W)導入Fc片段。
然後如上所述以相同方式表達全長抗c-Met抗體(pxcM11C)、單臂Fab/c抗c-Met抗體(pxcM11C-Fc)、和單臂Fab/c「隆起嵌入穴」抗c-Met抗體(pxcM11C.H.Fc.K)構建物。製備全細胞裂解物，通過SDS-PAGE分離，轉移到硝酸纖維素上，並用先前所述山羊抗人Fab綴合抗體和山羊抗人Fc綴合抗體檢測。
圖3顯示了抗Fab Western印跡結果，它們顯示了單臂Fab/c「隆起嵌入穴」抗c-Met抗體的摺疊和裝配有顯著改善。另外，抗Fab Western印跡結果顯示了全長抗c-Met抗體降至不能檢出的水平。再次，重要的是要注意，抗Fab抗體不能結合Fc片段。對於非還原樣品，單臂「隆起嵌入穴」抗c-Met抗體的表達導致完全摺疊和裝配的全長抗體實質性轉變為完全摺疊和裝配的單臂Fab/c抗體。由野生型Fc移至「隆起嵌入穴」Fc，單臂Fab/c抗體的摺疊和裝配也有顯著改善。對於還原樣品，對全長、單臂Fab/c、和單臂Fab/c「隆起嵌入穴」抗c-Met抗體檢出的重鏈的數量是相似的。單臂Fab/c「隆起嵌入穴」抗c-Met構建物似乎也是加工後的輕鏈數量增加和輕鏈前體數量減少。
類似的，圖4中的抗Fc Western印跡結果顯示了單臂Fab/c「隆起嵌入穴」比野生型單臂Fab/c抗c-Met抗體的摺疊和裝配有顯著改善。再次，抗Fc Western印跡結果顯示了全長抗c-Met抗體降至不能檢出的水平。抗Fc抗體不能結合輕鏈，因此沒有檢出。對於還原樣品，對全長、野生型單臂Fab/c、和單臂Fab/c「隆起嵌入穴」抗c-Met抗體檢出的重鏈數量是相似的。
實施例2本發明抗體的藥物動力學特徵和治療功效材料和方法材料HGF和c-Met-IgG在Genentech生產，正如先前所述。Maxisorb微量滴定板購自NUNC(Rosklide，丹麥)。抗hFc購自Jackson Immunochemical(WestGrove，PA)。HRP-鏈黴親和素購自Zymed(South San Francisco，CA)。3H-胸苷購自Amersham Inc.(Arlington Heights，IL)。MDA-MB-435細胞由ATCC(Rockville，MD)獲得。焦穀氨酸氨肽酶購自Takara Biochemicals(Berkeley，CA)。NHS-X-生物素購自Research Organics(Cleveland，OH)。Immobilon-PSQPVDF購自Millipore(Marlborough，MA)。Superscript II RNA酶H-逆轉錄酶購自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)。Taq聚合物購自Perkin Elmer-Cetus(Foster City，CA)，Bakerbond ABX(40μ粒度)來自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)，而SP-Sepharose高效樹脂來自Pharmacia Biotech Inc.(Piscataway，NJ)。生物素-抗P-tyr來自Upstate Biotech(Lake Placid，NY)，TMB過氧化物酶底物購自KPL(Gaithersburg，MD)。
抗體和Fab片段的生成抗c-Met單克隆抗體的生成抗c-met單克隆抗體，包括5D5抗體的生成，已有描述。參閱如美國專利5,686,292；5,646,036；6,207,152；6,214,344；和6,468,529。第0、7、14、21、28、266、273、和279天將BALB/c小鼠每隻後足墊免疫2.5μg懸浮在MPL/TDM佐劑中的可溶性c-Met-IgG(Mark等人，1982，J.Biol.Chem.，26726166-26171)。最後一次免疫後4天，收穫淋巴結細胞，並如(Laskov等人，1980，Cell.Immunol.，55251)所述使用35％聚乙二醇與P3/X63-Ag8U1骨髓瘤細胞融合(Yelton等人，1978，Curr.Top.Microbio.Immunol.，811)。首先通過捕捉ELISA選擇分泌對c-Met特異的抗體的雜交瘤細胞系，然後使用表達c-Met的BAF3轉染細胞通過流式細胞術進行後續篩選。如下文所述，對選擇的雜交瘤進一步測試它們抑制生物素-HGF結合c-Met-IgG的能力。通過有限稀釋將雜交瘤克隆兩次，然後進一步鑑定它們的拮抗和激動能力。在balb/c小鼠中生成腹水，並使用蛋白G親和柱純化單克隆抗體。採用消光係數1.4，通過280nm吸光度測定蛋白質濃度。
天然Fab的生成和純化將抗體5D5在20mM磷酸鹽，10mM EDTA緩衝液中透析過夜，然後在Centricon 30中濃縮至7mg/ml。將0.5ml固定化木瓜蛋白酶(Pierce，Rockford，Il)用消化緩衝液清洗，然後加入10mg 5D5並於37℃溫育過夜，以200rpm搖動。向混合液中加入1.5ml結合緩衝液，然後將上清液與珠子分開並流過事先用結合緩衝液平衡的蛋白A柱。使額外的結合緩衝液流過柱子，並以1ml餾分收集洗脫液。讀取每個餾分的280nm吸光度，合併含有Fab片段的洗脫液。將蛋白質在PBS中透析過夜，並通過280nm吸光度測定蛋白質濃度，採用消光係數1.53。通過凝膠過濾進一步純化Fab片段以清除殘餘的F(ab』)2。
5D5 Fab的N端測序將一小份5D5 Fab在4-20％梯度SDS凝膠上解析，並在BioRadTrans-Blot轉移槽(Matsudaira，1987，J.Biol.Chem.，26210035-10038)中以250mA恆流1小時電轉印到PVDF(Immobilon-PSQ)膜上。將膜用溶於50％甲醇的0.1％考馬斯藍R-250染色0.5分鐘，並用溶於50％甲醇的10％乙酸脫色2-3分鐘。將膜用水徹底清洗，並使之乾燥，然後使用Blott柱體(Applied Biosystem)在473A型自動化蛋白質測序儀上測序。用JusticeInnovation軟體使用Nelson Analytical 760界面整合峰。在DECα(Henzel等人，1996，J.Chromatog.，40441-52)上進行序列解讀。
獲得5D5重鏈的序列需要如下進行去封閉。將Fab片段用7mM DTT於45℃還原1小時，並用180mM異丙基乙醯胺於25℃烷化20分鐘(Krutzsch和Inman，1993，Anal.Biochem.，209109-116)。然後將烷化Fab片段在Microcon-10中與含10mM DTT的0.1M磷酸鈉(消化緩衝液)交換3次，並在20μl消化緩衝液中用1mU焦穀氨酸氨肽酶於45℃消化3小時。然後如上所述將去封閉Fab轉移至PVDF並測序。
5D5 Fab的克隆和重組表達根據N端序列資料設計對輕鏈和重鏈可變區5』端特異的PCR引物，而3』引物設計成與每條鏈的共有框架4退火(Kabat等人，1991，《Sequences ofproteins of immunological interest》，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)。引物的設計中還添加用於克隆的限制性位點。將用Stratagene RNA分離試劑盒由108個雜交瘤5D5細胞提取的總RNA用作RT-PCR的底物。在標準條件下使用框架4特異引物和Superscript II RNA酶H-逆轉錄酶進行逆轉錄(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications》中，第21-27頁，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White編，Academic Press Inc.，San Diego，1990)。如(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications》中，第21-27頁，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White編，Academic Press Inc.，San Diego，1990)所述，PCR擴增採用Taq聚合酶，只是反應混合液中含有2％ DMSO。用限制酶SfiI和RsrII(輕鏈)或Mlu I和Apa I(重鏈)消化擴增得到的DNA片段，凝膠純化，並克隆到表達質粒pAK19(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10163-167)的衍生物中。此載體pXCA730經過定點誘變的修飾(Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488)後在ST II信號序列與可變結構域之間和在每條鏈的可變與恆定結構域接合處含有獨特限制性位點。將輕鏈和重鏈可變結構域cDNA插入人Cκ和CH1結構域的上遊且同一讀碼框中。消除pAK19中重鏈C末端半胱氨酸，它能夠形成二硫鍵而生成F(ab』)2分子，從而能夠只表達抗體的Fab形式。
如(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10163-167)所述，在大腸桿菌K12菌株33B6(W3110 tonA phoA E15 deoC KanR ilvGR degPD)argF-lac)169)(Rodriques等人，1995，Cancer Res.，5563-70)中表達重組5D5 Fab。通過連續補料離心由10升發酵液收穫細胞沉澱，冷凍並保存於-70℃。將一部分沉澱懸浮於提取緩衝液(120mM MES pH 6，5mM EDTA)中(5ml/g細胞沉澱)。於4℃使用ultraturrax(Janke and Kunkel)約15分鐘，將懸浮液徹底混勻。然後兩次通過安裝了冷卻旋管的細胞勻漿器(Microfluidizer，Microfluidics Corporation，Newton，MA)，破壞完整細胞。然後用調至pH 6的5％(v/v)儲存液將懸浮液調至0.1％(v/v)聚乙烯亞胺。通過25,400xg離心30分鐘，將完整細胞和PEI絮凝碎片與可溶餾分分開。通過添加純化的水將上清液的電導率調至低於4mS，並加載到Bakerbond ABX柱(1×10cm，40μ粒度)上。柱子已經用50mM MES，5mM EDTA pH 6平衡。所有步驟都以線性流速100cm/h進行。加載條件上清液後，用平衡緩衝液清洗柱子，直至流出液的吸光度等於基線。使用16個柱體積、由0至100mM線性梯度的溶於平衡緩衝液的硫酸銨進行洗脫。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析餾分，並合併含有Fab的餾分。將來自ABX柱的合併液的電導率降至低於4mS，並加載到經過25mM MOPS緩衝液pH 6.9平衡的SP-Sepharose高效樹脂柱(1×10cm)上。所有步驟都以線性流速100cm/h進行。加樣後，用一個柱體積的平衡緩衝液清洗柱子。然後使用16個柱體積、0至200mM線性梯度的溶於平衡緩衝液的乙酸鈉由柱上洗脫5D5 Fab。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析餾分，並合併含有Fab的餾分。
單臂5D5小規模蛋白質生產將表達質粒pxcM11C.H-Fc.K(如上所述)用於轉化大腸桿菌菌株33D3(W3110 kanR ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lacIq lacL8 ompTΔ(nmpc-fepE)degP)，然後將轉化子於30℃在添加羧苄青黴素(50μg/ml)的LB培養基中培養過夜。將LB培養液在含有羧苄青黴素(50μg/ml)的C.R.A.P.培養基中稀釋100倍，並於30℃搖動培養24小時。取出等量小份樣品通過SDS-PAGE和Western分析使用抗Fab抗體(過氧化物酶綴合的針對人IgG Fab的山羊IgG餾分；CAPPEL #55223)或抗Fc抗體(過氧化物酶綴合的針對人Fc片段的山羊IgG餾分；Bethyl #A08-104P-41)檢驗抗體表達。然後將剩餘培養物離心，並將細胞團冷凍於-70℃，直至開始抗體純化步驟。
單臂5D5的純化將冷凍細胞團融化，並懸浮於10倍體積(w/v)的裂解緩衝液(25mMtris-HCl，5mM EDTA pH7.5)中，然後離心。使用Polytron勻漿器(KinematicaA.G，瑞士)將不溶沉澱重懸於裂解緩衝液中，並通過兩次流過Microfluidizer(Microfluidics，Newton，Mass)來破壞細胞。向裂解物中添加聚乙烯亞胺(Sigma)0.1％(v/v)，隨後於4℃攪動1小時，然後以15,000xg離心。將由此得到的上清液與蛋白A親和樹脂混合併於4℃攪動過夜。讓樹脂沉降，倒出上清液，並將樹脂倒入連接液相層析系統(Varian Inc，Palo Alto，CA)的柱子。先用10mM tris-HCl，1mM EDTA緩衝液pH 7.5後用溶於相同緩衝液的0.5M NaCl清洗柱子，然後用50mM檸檬酸鈉，0.1M NaCl緩衝液的pH6至pH2梯度洗脫。將洗脫餾分立即調至終濃度2M尿素和pH 5.4，並通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。合併含有單臂抗cMet的餾分，並在用25mM MES，2M尿素pH 5.4平衡的SP Sepharose柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上進行陽離子交換層析。用溶於25mM MES pH5.4的0至1M NaCl梯度洗脫柱子。SDS-PAGE分析後，將合併的洗脫液調至0.4M硫酸鈉pH6，並加載到用0.4M硫酸鈉，25mM MES pH6平衡的Hi-Propyl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)柱上。用溶於25mM MES pH6的0.4M至0M硫酸鈉梯度洗脫柱子。SDS-PAGE分析後，使用CentriPrep 10(Millipore Corp，Bedford，MA)濃縮由此得到的洗脫液，然後再用10mM琥珀酸鈉，0.15M NaCl pH 5.0平衡的Superdex 200柱(Amersham Biosciences)上進行大小排阻層析。
通過定量胺基酸分析測定蛋白質濃度。通過LAL測定法測定內毒素水平。這些抗體製備物可用於後續分析。
測定法細胞培養在補充了10％ FBS的MEM中培養A549肺癌細胞。在補充了10％ FCS、5％ WEHI-231的細胞培養條件培養基(含有IL-3)、2mM穀氨酸鹽、4μl/Lβ-巰基乙醇、0.5mg/ml G418的RPMI 1640中培養如先前所述(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133709-718)經人cMet轉染的BaF3-cMet細胞和經載體轉染的BaF3-neo細胞。在含有10％ FCS的RPMI 1640中培養U87和U118成膠質細胞瘤細胞、786-0腎癌細胞。
HGF-cMet結合在固相系統中使用生物素-HGF進行HGF結合研究，其中經由IgG結構域將c-Met-IgG捕捉到微量滴定板上。通過與20倍摩爾過量的NHS-X-生物素在0.1M NaHCO3pH 8.5中一起保溫將HGF生物素化。將NHS-X-生物素分成4個增量，間隔15分鐘添加，並於室溫攪動。通過透析清除未綴合的生物素，並將經標記物質保存於4℃。將微量滴定板用2μg/ml AffiniPure兔抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch)在包被緩衝液(0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽pH 9.6)中於4℃包被過夜。將板用含有0.5％ BSA的PBS pH 7.4於室溫(RT)封閉1小時，然後與2μg/ml cMet-IgG一起保溫2小時。然後加入53ng/ml生物素標記的HGF，加入或不加0.01-1,000nM競爭物即冷的HGF、抗c-Met 5D5 mAb、Fab或單臂抗體，於室溫放置1小時。向板中加入辣根過氧化物酶(HRP)-鏈黴親和素(1∶10,000稀釋，Amersham)，於室溫放置1小時，然後是磷酸酶底物CP-磷酸硝基苯酯(Kirkegaard PerryLaboratories)，並測量405nm吸光度。
結果顯示於圖5。在競爭性結合測定法中，單臂抗c-met 5D5抗體的表現與抗c-met Fab相似。
KIRA對c-Met的酪氨酸磷酸化根據Sadick等人的方法，其中將溶解的受體捕捉到用抗受體抗體包被的板上並用抗P-Tyr檢測(Sadick等人，1996，Anal.Biochem.，235207-214)，通過三明治ELISA測量c-Met的酪氨酸磷酸化。將U87細胞以106/ml分配到96孔板中並於37℃培養過夜。然後將培養基換成含有HGF和/或抗體的MEM、0.1％ FBS，放置10分鐘。然後將細胞用100μl細胞裂解緩衝液(20mMTris pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1nM EGTA，1％ Triton，1x蛋白酶抑制劑雞尾酒樣混合物(Sigma)，1x磷酸酶抑制劑雞尾酒樣混合物II(Sigma))在搖板機上於室溫抽提30分鐘，並保存在冰上或-70℃。將裂解物加到經抗c-Met mAb 1949(Genentech)包被過夜的板上。用1∶4000稀釋的生物素化抗磷酸酪氨酸(4G10，Upstate)及後續HRP-鏈黴親和素和TMB顯色來檢測磷酸-酪氨酸c-Met。使用1∶10,000抗c-Met抗體類似地測量總c-Met。
結果顯示於圖6。
細胞增殖、遷移測定法BaF3是正常情況下不表達c-Met且不應答HGF的鼠IL-3依賴性淋巴樣細胞。然而，在通過用人c-Met的正常全長cDNA轉染衍生的BaF3-hMet(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133709-718)中，HGF在缺乏IL-3時刺激增殖和存活。將BaF3-hMet和BaF3-neo細胞在RPMI 1640，5％胎牛血清，4μl/L β-ME，100U/ml青黴素，100μg/ml硫酸鏈黴素，2mM L-穀氨酸鹽，和作為IL-3來源的5％ WEHI條件培養基中常規傳代。為了測量HGF依賴性增殖，通過添加25μl Alarma藍(Trek Diagnostic Systems)並測量4小時後的螢光強度來量化處理3天後的細胞數目。作為特異性的對照，單臂5D5也在用IL-3刺激的BaF3-hMet細胞中進行測試。
結果顯示於圖7。
使用經過改良的Boyden室測定法評估MDAMB-435-PGL細胞和U87細胞的遷移。將細胞分配到安有用10μg/ml纖連蛋白包被的5μm孔聚碳酸酯濾器的上層室(2×104/孔)中。向下層室的培養基中加入100ng/ml HGF，加入或不加指定數量的5D5 Fab或單臂抗體。將細胞培養過夜。使用專用海綿刷刮下濾膜頂面的細胞，並用YO-PRO-3碘化物(Molecular Probes)固定和染色遷移到濾器底表面的細胞，然後通過螢光顯微鏡計數。
結果顯示於圖8。
藥物動力學將OA-5D5或5D5 Fab(5mg/kg)靜脈內注射到裸鼠中。在指定時間點，由4隻小鼠採集血清樣品並通過三明治ELISA進行測定，其中將它捕捉到用cMet-IgG包被的板上，然後用輕鏈特異性二抗檢測。
結果顯示於圖9A。單臂5D5抗體的半衰期與其Fab對應物相比顯著延長。
為了測定OA-5D5在體內是否降解，將根據ELISA相當於40ng OA-5D5的來自第7天樣品的一定體積血清在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠轉移到硝酸纖維素上並通過HRP綴合的抗人Fc(1∶5,000，對人特異的，Jackson Labs)顯示印跡。平行運行等體積的來自未處理小鼠的血清作為對照。
結果顯示於圖9B。血清單臂5D5抗體在施用後第7天是完整的。
體內腫瘤功效研究使用皮下接種2.5×106個A549(人肺癌)或U87MG細胞(分泌自分泌HGF且表達c-Met的人成膠質細胞瘤)的4-6周齡雌性無胸腺裸鼠進行功效研究。在接種腫瘤細胞時(即輔助治療)或容許腫瘤生長至～150mm3時開始使用單臂5D5抗體、5D5 Fab抗體或對照抗體(抗gp120)的治療。所有抗體腹膜內施用，每周一次，持續4周。注意，只對單臂5D5抗體測試輔助治療方案(抗gp120作為對照)。
圖10顯示了通過接種U87 MG細胞生成的腫瘤的結果。如圖10A(輔助治療)和圖10B(腫瘤建立後治療)所示，單臂5D5抗體能夠抑制或引起腫瘤衰退。如圖10B所示，與其Fab對應物相比，單臂5D5抗體具有上佳的治療功效。(有趣的是，單臂5D5抗體在100nM時在體外展示對U87細胞數目的最低功效。)對於由接種A549細胞生成的腫瘤的治療結果是陰性的，這提供了特異性對照，證實單臂5D5抗-c-met抗體針對U87腫瘤的效果不是由於非特異細胞毒性作用。
使用其它本領域已建立的體內腫瘤模型，例如美國專利6,271,342中描述的Oncotest模型，還對單臂5D5抗c-met抗體測試了調控腫瘤發展的能力。與MRC-5成纖維細胞(ATCC CCL-171)共接種的BxPC-3(胰腺)(ATCCCRL-1687)細胞的腫瘤生長在每周兩次以30mg/kg施用單臂5D5抗體後顯示抑制50％。其它例示性數據列於下文●在Oncotest RXF1220(腎)，以10mg/kg q7d(即每7天一次)施用單臂5D5抗體中，抑制腫瘤生長～30％；●在(i)Oncotest PAXF736(胰腺)、10mg/kg、q7d；(ii)Oncotest GXF97(胃)、10mg/kg、q7d；(iii)Oncotest LXFA526(肺)、30mg/kg、q7d；(iv)Oncotest LSFA297(肺)、30mg/kg、q7d中，抑制腫瘤生長＜20％；●在A549異種移植物中，用10mg/kg、q7d單臂5D5抗體沒有觀察到活性；●在Oncotest LXFA650(肺)中，30mg/kg、q7d沒有觀察到活性。
權利要求
1.包含單個抗原結合臂和Fc區的抗體片段，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，所述Fc區提高所述抗體片段的穩定性，其中Fc區包含第一和第二Fc多肽的複合體，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重鏈。
2.權利要求1的抗體片段，其中所述抗體片段未糖基化。
3.權利要求1或2的抗體片段，其中所述抗體片段沒有或具有少許免疫抑制特性。
4.權利要求3的抗體片段，其中所述免疫抑制特性包括招致T細胞耗損的能力。
5.權利要求1-4任一項的抗體片段，它不具有FcRn結合以外的實質性效應物功能。
6.權利要求5的抗體片段，其中所述效應物功能指補體裂解。
7.權利要求1-6任一項的抗體片段，其中所述抗體片段結合FcRn。
8.權利要求1-7任一項的抗體片段，它不特異結合T細胞表面抗原。
9.權利要求8的抗體片段，其中所述T細胞表面抗原指CD3或CD4。
10.權利要求9的抗體片段，其中所述T細胞表面抗原指CD3。
11.權利要求1-10任一項的抗體片段，它特異結合腫瘤抗原。
12.權利要求1-11任一項的抗體片段，它特異結合在受體二聚化後活化的細胞表面受體。
13.權利要求1-12任一項的抗體片段，其中所述抗體片段包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含輕鏈可變結構域，第二多肽包含重鏈可變結構域和所述第一Fc多肽，而第三多肽包含所述第二Fc多肽。
14.權利要求13的抗體片段，其中所述第一多肽包含與人輕鏈恆定結構域融合的非人輕鏈可變結構域。
15.權利要求13的抗體片段，其中所述第一多肽包含與人源化或人框架序列融合的來自非人物種的CDR。
16.權利要求13的抗體片段，其中所述第二多肽包含與人重鏈恆定結構域融合的非人重鏈可變結構域。
17.權利要求13的抗體片段，其中所述第二多肽包含與人源化或人框架序列融合的來自非人物種的CDR。
18.權利要求13的抗體片段，其中所述第三多肽包含N端截短的重鏈，該重鏈在N端包含至少部分鉸鏈序列。
19.權利要求1-18任一項的抗體片段，其中所述兩種Fc多肽共價連接。
20.權利要求1-19任一項的抗體片段，其中所述兩種Fc多肽在鉸鏈區經由分子間二硫鍵連接。
21.權利要求1-20任一項的抗體片段，其中所述抗體片段在與靶分子結合後抑制靶分子多聚化。
22.權利要求1-21任一項的抗體片段，其中所述抗體片段在與靶分子結合後抑制相關結合配偶體結合靶分子。
23.權利要求1-22任一項的抗體片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，且第二Fc多肽的界面包含突起，該突起可位於第一Fc多肽的界面的腔中。
24.權利要求1-23任一項的抗體片段，其中所述第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼所述突起或所述第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼所述腔，或者二者兼之。
25.權利要求1-24任一項的抗體片段，其中所述第二Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼所述突起且所述第一Fc多肽已經由模板/原始多肽改變以編碼所述腔，或者二者兼之。
26.權利要求1-25任一項的抗體片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，其中第二Fc多肽的界面包含突起，該突起可位於第一Fc多肽的界面的腔中，且其中所述腔或突起或者二者已經分別導入第一和第二Fc多肽的界面。
27.權利要求24-26任一項的抗體片段，其中所述突起和腔已經導入各自Fc多肽的界面。
28.權利要求24-27任一項的抗體片段，其中所述突起和腔各自包含天然存在的胺基酸殘基。
29.權利要求24-28任一項的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽是通過用具有比原始殘基更大側鏈體積的輸入殘基替代來自模板/原始多肽界面的原始殘基而生成的。
30.權利要求24-29任一項的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始殘基更大側鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始殘基的核酸。
31.權利要求29或30的抗體片段，其中所述原始殘基是蘇氨酸。
32.權利要求29-31任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是精氨酸(R)。
33.權利要求29-31任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是苯丙氨酸(F)。
34.權利要求29-31任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是酪氨酸(Y)。
35.權利要求29-31任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是色氨酸(W)。
36.權利要求23-28任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽是通過用具有比原始殘基更小側鏈體積的輸入殘基替代模板/原始多肽界面中的原始殘基而生成的。
37.權利要求23-28和36任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始殘基更小側鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始殘基的核酸。
38.權利要求36或37的抗體片段，其中所述原始殘基是蘇氨酸。
39.權利要求36或37的抗體片段，其中所述原始殘基是亮氨酸。
40.權利要求36或37的抗體片段，其中所述原始殘基是酪氨酸。
41.權利要求36-40任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基不是半胱氨酸(C)。
42.權利要求36-40任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是丙氨酸(A)。
43.權利要求36-40任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是絲氨酸(S)。
44.權利要求36-40任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是蘇氨酸(T)。
45.權利要求36-40任一項的抗體片段，其中所述輸入殘基是纈氨酸(V)。
46.權利要求36-45任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的原始胺基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸。
47.權利要求36-46任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的輸入殘基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。
48.權利要求36-47任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的原始胺基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始胺基酸用選自下組的輸入殘基替代丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。
49.權利要求23-48任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽在第366位包含用絲氨酸替代蘇氨酸，胺基酸編號依照Katat的EU編號方案。
50.權利要求23-48任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸處包含丙氨酸替代，胺基酸編號依照Katat的EU編號方案。
51.權利要求23-50任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含纈氨酸替代酪氨酸。
52.權利要求23-51任一項的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個或多個選自下組的胺基酸替代T366S、L368A和Y407V。
53.權利要求23-52任一項的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，胺基酸編號依照Katat的EU編號方案。
54.權利要求1-53任一項的抗體片段，其中所述第一和第二Fc多肽各自包含抗體恆定結構域。
55.權利要求54的抗體片段，其中所述抗體恆定結構域指CH2和/或CH3結構域。
56.權利要求54或55的抗體片段，其中所述抗體恆定結構域來自IgG。
57.權利要求56的抗體片段，其中所述IgG指人IgG1。
58.權利要求1-57任一項的抗體片段，它具有單特異性。
59.權利要求1-58任一項的抗體片段，它是單特異性免疫粘附素。
60.權利要求1-59任一項的抗體片段，它是抗體-免疫粘附素嵌合體。
61.包含免疫球蛋白群的組合物，其中至少75％的免疫球蛋白是權利要求1-60任一項的抗體片段。
62.製備權利要求1-60任一項的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)培養包含編碼抗體片段的核酸的宿主細胞；並(b)由宿主細胞培養物回收抗體片段。
63.權利要求62的方法，其中包含抗體片段的多肽以這樣的比率表達，該比例導致由此產生的免疫球蛋白群中至少50％的免疫球蛋白是權利要求1-60任一項的抗體片段。
64.權利要求63的方法，其中所述多肽以近似等摩爾量表達。
65.權利要求64的方法，其中編碼多肽的核酸與近似相等長度的翻譯起始區(TIR)可操作連接。
66.權利要求62-65任一項的方法，其中所述宿主細胞是原核的。
67.權利要求66的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
68.權利要求67的方法，其中所述大腸桿菌是內源蛋白酶活性缺陷的菌株。
69.權利要求62-65任一項的方法，其中所述宿主細胞是真核的。
70.權利要求69的方法，其中所述宿主細胞是CHO。
71.權利要求62-70任一項的方法，其中由培養物的培養液回收抗體片段。
72.權利要求62-70任一項的方法，其中由細胞裂解物回收抗體片段。
73.製備權利要求23-60任一項的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)培養包含編碼抗體片段的核酸的宿主細胞，其中編碼第二Fc多肽的界面的核酸已經由編碼第二Fc多肽的原始界面的核酸改變以編碼突起或編碼第一Fc多肽的界面的核酸已經由編碼第一Fc多肽的原始界面的核酸改變以編碼腔，或者二者兼之；並(b)由宿主細胞培養物回收抗體片段。
74.權利要求73的方法，其中編碼第二Fc多肽的核酸已經由原始核酸改變以編碼突起且編碼第一Fc多肽的核酸已經由原始核酸改變以編碼腔。
75.權利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中編碼來自第二Fc多肽界面的原始胺基酸殘基的核酸用編碼具有比原始胺基酸殘基更大側鏈體積的輸入胺基酸殘基的核酸替代，其中具有更大側鏈體積的輸入殘基包含突起。
76.權利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中編碼第一Fc多肽界面中的原始胺基酸殘基的核酸用編碼具有比原始胺基酸殘基更小側鏈體積的輸入胺基酸殘基的核酸替代以形成腔。
77.權利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中將編碼第一和第二Fc多肽的核酸導入宿主細胞。
78.製備權利要求1-60任一項的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)製備形成抗體片段的多肽；並(b)容許發生異多聚化，由此形成抗體片段。
79.權利要求62-78任一項的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽複合體是權利要求1-60任一項的抗體片段。
80.權利要求62-78任一項的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽複合體是異三聚體。
81.權利要求62-78任一項的方法，其中步驟(b)包括將第一Fc多肽和第二Fc多肽在體外偶聯。
82.權利要求62-78任一項的方法，其中原始界面的胺基酸序列已經改變，從而在改造後界面中生成突起和腔。
83.編碼權利要求1-60任一項的抗體片段的分離核酸。
84.包含兩種或多種集體編碼權利要求1-60任一項的抗體片段的重組核酸的組合物。
85.包含權利要求83或84的核酸的宿主細胞。
86.權利要求85的宿主細胞，其中編碼抗原結合臂的核酸存在單個載體中。
87.權利要求85的宿主細胞，其中編碼抗原結合臂的核酸存在於不同載體中。
88.權利要求85的宿主細胞，其中編碼抗原結合臂和N端截短的重鏈的核酸存在於單個載體中。
89.製備權利要求1-60任一項的抗體片段的方法，包括培養包含權利要求83或84的核酸的宿主細胞使得多肽表達，並由細胞培養物回收抗體片段。
90.權利要求89的方法，其中由細胞裂解物回收抗體片段。
91.權利要求89的方法，其中由細胞培養物的培養液回收抗體片段。
92.權利要求89的方法，其中所述宿主細胞是原核細胞。
93.權利要求89的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
94.權利要求89的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物的。
95.包含權利要求1-60任一項的抗體片段和載體的組合物。
96.生成包含單個抗原結合臂和Fc區的抗體片段的方法，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，所述Fc區提高所述抗體片段的穩定性，所述方法包括在容許抗原結合臂形成和第一和第二Fc多肽二聚化而形成所述Fc區的條件下在合適宿主細胞中表達編碼抗原結合臂和第一和第二Fc多肽的核酸，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重鏈。
97.權利要求96的方法，其中所述方法生成異質免疫球蛋白群，且其中至少50％的免疫球蛋白包含單個抗原結合臂和Fc區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，所述Fc區提高所述抗體片段的穩定性。
全文摘要
本發明提供了包含穩定化單價抗體片段的方法和組合物，所述片段由單個抗原結合臂和Fc區組成，所述Fc區提高穩定性但不誘導二聚化，且包含第一和第二Fc多肽的複合體，其中只有Fc多肽之一是N端截短的重鏈。
文檔編號C12N15/13GK1922210SQ200480041905
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月17日 優先權日2003年12月19日
發明者阿瑟·J－Y·黃, 拉爾夫·H·施瓦爾, 丹尼爾·G·揚薩拉 申請人:健泰科生物技術公司