一種山苦瓜的組培快繁方法與流程
2023-11-10 10:30:02 1
技術領域：
本發明涉及種苗繁育技術領域，具體涉及一種山苦瓜的組培快繁方法。
背景技術：
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山苦瓜(momordicacharantiavar)又名土瓜、苦瓜蓮，葫蘆科山苦瓜屬多年生宿根草質藤本，喜溫怕寒。山苦瓜的根、莖、葉、花、果實和種子均可供藥用，性寒味苦，入心脾胃三經，清暑解熱，明目解毒。研究證實其果實中富含豐富的苦瓜甙、苦瓜素，能夠明顯降低血糖濃度，對健康非常有益，極具開發價值。
山苦瓜的繁殖方式常採用種子繁殖，繁育速度較慢，另外，其單果含種量僅有10餘粒，難以在短期內獲得大量種苗，嚴重製約了優良品種的推廣速度。因此研究山苦瓜的離體快繁方法，進一步提高山苦瓜的開發、利用價值，對其大規模生產和新優品種的快速推廣，具有重要的理論和現實意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種山苦瓜組培快繁的技術，它包括以下幾個步驟：
1)外植體處理
山苦瓜的外植體選取主要以帶腋芽的莖段為主，帶腋芽莖段可以由無菌幼苗途徑或大田實生苗途徑獲得。
①無菌幼苗途徑：選取成熟飽滿的種子，用50-55℃的溫水攪拌20min後浸種6-8h對種子進行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒10-15min,無菌水衝洗3-5次後，剝去種皮，胚根端朝下接種於ms培養基中培養，培養溫度28-30℃；光照強度2000-3000lux；連續光照培養10-12小時/天，7-10d後長出兩片真葉且展葉後備用。
其中，0.1％的hgcl2需提前4小時配製，保證充分溶解，配製時取1ghgcl2粉劑溶於1l無菌水中，避光保存；hgcl2粉劑採購於天津市致遠化學試劑有限公司。
②大田實生苗途徑：當年採收的種子播種後獲得大田實生苗，選取生長25-45天的帶腋芽的莖段作為外植體，剪成5-8cm小段，每段含有1-2個芽點，流水下衝洗10min-20min，再用0.1％hgcl2處理7-8min，無菌水振蕩衝洗3-5次,每次2-3min,消毒完成後備用；
2)腋芽誘導
將步驟1)所得的外植體切取3-5cm大小的莖段，確保每段含有1-2個腋芽，接入誘導培養基上,每30-50ml誘導培養基接種1-2個外植體，5-7天後即可誘導出腋芽。培養溫度28-30℃；光照強度2000-3000lux，連續光照時長10-12小時/天。
其中，改良基本培養基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.5-1.0g/l，蔗糖20-30g/l，瓊脂6.0-6.3g/l，用蒸餾水按常規方法配製培養基，用1mol/l的naoh或hcl調節ph到5.8-6.2。
誘導培養基為每升改良基本培養基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成
「寶力健」為一種新型有機微量元素添加劑，可以代替ms配方中的微量、有機、鐵鹽等，使效果更加突出，採購於北京康倍斯科技有限公司。
3)增殖培養
將步驟2)所誘導出的腋芽轉到增殖培養基上，每50ml培養基轉接5個腋芽進行增殖培養，培養溫度28-30℃，光照強度2000-3000lux，連續光照時長10-12小時/天。培養12-17天，待增殖係數達到4.0-5.0獲得分化苗叢生芽。
其中，增殖培養基為每升改良基本培養基添加0.2-0.5mg的6-ba和0.02-0.05mg的iba組成；
增殖係數為增殖後芽數與增殖前芽數的比值。
4)生根培養
將步驟3)所得的分化苗叢生芽分單株，每株切取大小3-5cm，轉接到生根培養基上進行生根培養，每50ml培養基上轉接5株進行培養，培養溫度28-30℃，光照強度2000-3000lux，連續光照時長10-12小時/天，7-10天後待生根苗株高至5-7cm，主根5條以上，健壯有活力，即可進行馴化移栽；
其中，生根培養基為每升改良基本培養基添加0.1-0.2mg的naa組成。
本發明採用組織培養的方法，通過不同外植體選取與處理、誘導、增殖、生根培養，獲得優質的山苦瓜快繁苗。使用本發明方法快繁山苦瓜的有益效果為：第一，可以明顯促進植株茁壯生長、提高繼代次數，緩解普通組織培養過程中組培苗玻璃化、黃化等問題；第二，避免普通山苦瓜繁殖過程中病毒侵害問題，提高山苦瓜繁殖品質；第三，本發明方法可以選擇性的快速大量繁殖優質山苦瓜品種，解決優質品種少，繁殖困難和繁殖周期長的問題，促進山苦瓜的開發、利用研究的進展，以滿足其大規模生產和新優品種快速推廣的需求。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍，除特殊說明外，下述實施例中均採用常規現有技術完成。
實施例1
所述的山苦瓜組培快繁技術，具體步驟如下：
首先，選取成熟飽滿的種子，用50℃的溫水攪拌20min後浸種6h後對種子進行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒10min,無菌水衝洗5次後，剝去種皮，胚根端朝下接種於ms培養基中培養，培養溫度28-30℃；光照強度2000lux；連續光照時長10小時/天，7天後長出兩片真葉且展葉後備用。
第二：將已經展葉的無菌播種獲得的外植體切取3cm大小的莖段，每段含有1個腋芽，接入誘導培養基上,每30ml培養基接種1個外植體，7天後誘導出腋芽。
其中，改良基本培養基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.5g/l，蔗糖20g/l，瓊脂6.0g/l，用蒸餾水按常規方法配製培養基，用1mol/l的naoh或hcl調節ph到5.8。
誘導培養基為每升改良基本培養基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導出的腋芽轉入增殖培養基上，每50ml培養基轉接5個腋芽進行增殖培養，培養溫度28-30℃，光照強度2000lux，連續光照時長10小時/天，17天增殖係數即可達到4.1，獲得分化苗叢生芽。
其中，增殖培養基為每升改良基本培養基添加0.2mg的6-ba和0.02mg的iba組成；
增殖係數為增殖後芽數與增殖前芽數的比值。
第四：將分化苗叢生芽分單株，每株切取3cm大小轉接到生根培養基，每50ml培養基上轉接5株進行生根培養，培養溫度28-30℃，光照強度2000lux，連續光照時長10小時/天，10天後平均株高5.4cm，生根8條並且健壯有活力，此時可進行馴化移栽；
其中，生根培養基為每升改良基本培養基添加0.1mg的naa組成；
實施例1中，在對山苦瓜組培過程中，無菌播種出芽率100％，腋芽誘導率達97％，增殖係數為3.7，生根率100％，馴化成活率90％。
實施例1中的改良基本培養基，與ms作為基本培養基組培快繁過程中生長指標差異如表1。
表1、以ms、改良基本培養基培養差異情況表
註：生長勢分三個等級，a：葉色濃綠，葉片厚實，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細弱
實施例2
所述的山苦瓜組培快繁技術，具體步驟如下：
首先，選取成熟飽滿的種子，用55℃的溫水攪拌20min後浸種8h後對種子進行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒15,無菌水衝洗5次後，剝去種皮，胚根端朝下接種於ms培養基中培養，培養溫度28-30℃；光照強度2500lux，連續光照培養11小時/天，8天後展出兩片真葉。
第二：將已經展葉的無菌播種獲得的外植體切取4cm大小的莖段，每段含有2個腋芽，接入改良基本培養基，每40ml培養基接種2個外植體，6天後誘導出腋芽。
其中，改良基本培養基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.8g/l，蔗糖25g/l，瓊脂6.2g/l，用蒸餾水按常規方法配製培養基，用1mol/l的naoh或hcl調節ph到6.0。
誘導培養基為每升改良基本培養基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導出的腋芽轉入增殖培養基上，每50ml培養基轉接5個腋芽進行增殖培養，培養溫度28-30℃，光照強度2500lux，連續光照時長11小時/天，15天增殖係數即可達到4.4；
其中，增殖培養基為每升改良基本培養基添加0.4mg的6-ba和0.04mg的iba組成；
增殖係數為增殖後芽數與增殖前芽數的比值。
第四：將將分化苗叢生芽分單株，每株切取4cm大小轉接到生根培養基，每50ml培養基上轉接5株進行培養，培養溫度28-30℃，光照強度2500lux，連續光照時長11小時/天，8天後生根苗平均株高至6.5cm，主根7條，並且健壯有活力，可進行馴化移栽；
其中，生根培養基為每升改良基本培養基添加0.15mg的naa組成；
實施例2中，在對山苦瓜組培過程中，無菌播種出芽率99％，腋芽誘導率達95％，增殖係數為4.4，生根率100％，馴化成活率90％。
實施例2中採用改良基本培養基，與ms作為基本培養基組培快繁過程中生長指標差異如表2。
表2、以ms、改良基本培養基培養差異情況表
註：生長勢分三個等級，a：葉色濃綠，葉片厚實，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細弱
實施例3
所述的山苦瓜組培快繁技術，具體步驟如下：
首先，選取溫室生長35天的帶腋芽的莖段為外植體，剪成5-8cm小段，每段含有2個芽點，流水下衝洗20min，用0.1％hgcl2處理8min，無菌水振蕩衝洗5次，每次3min，空水後備用；
第二：將消毒好的莖段外植體切取5cm大小，每段含有2個腋芽，接入改良基本培養基，每50ml培養基接種2個外植體，培養溫度28-30℃，光照強度3000lux，連續光照時長12小時/天，5天後誘導出腋芽。
其中，改良基本培養基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健1.0g/l，蔗糖30g/l，瓊脂6.3g/l，用蒸餾水按常規方法配製培養基，用1mol/l的naoh或hcl調節ph到6.2。
誘導培養基為每升改良基本培養基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導出的腋芽切下轉入增殖培養基上，每50ml培養基轉接5個腋芽進行增殖培養，培養溫度28-30℃，光照強度3000lux，連續光照時長11小時/天，14天增值係數達到4.7；
其中，增殖培養基為每升改良基本培養基添加0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成；
增殖係數為增殖後芽數與增殖前芽數的比值。
第四：將將分化苗叢生芽分單株，每株切取5cm大小，轉接到生根培養基，每50ml培養基上轉接5株進行培養，培養溫度28-30℃，光照強度3000lux，連續光照時長12小時/天，7天後生根苗平均株高至7cm，主根10條並且健壯有活力，可進行馴化移栽；
其中，生根培養基為每升改良基本培養基添加0.2mg的naa組成；
實施例3中，在對山苦瓜組培過程中，莖段外植體消毒萌芽率40％，腋芽誘導率達99％，增殖係數為4.7，生根率100％，馴化成活率90％。
實施例3中採用改良基本培養基與ms作為基本培養基組培快繁過程中生長指標差異如表3。
表3、以ms、改良基本培養基培養差異情況表
註：生長勢分三個等級，a：葉色濃綠，葉片厚實，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細弱
通過實施例的具體數據對比得到結論為:本發明通過對基礎培養基的優化，使得山苦瓜組培苗的黃化率、玻璃化比例顯著下降，生長周期明顯縮短，生長勢顯著提高，這對於山苦瓜優良品種的開發、利用與推廣提供了良好的技術基礎。