一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白ifit的表達載體及其製備和應用的製作方法
2023-10-05 01:40:44 2
一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白ifit的表達載體及其製備和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體及其製備和應用。幹擾素調控蛋白表達載體，以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物與載體pEASY-E2連接，獲得質粒pEASY-IIP；用限制性內切酶EcoRV酶切pEASY-IIP後回收1.3kb片段，與質粒pCN3連接，得質粒pCNIIP。本發明的幹擾素調控蛋白能顯著增強魚類抗細胞腫大病毒的能力。
【專利說明】一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體及其製備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體及其製備和應用。
【背景技術】
[0002]IFIT (Interferon-1nduced protein with tetratricopeptide repeat)蛋白家方矣是受幹擾素誘導表達的一類蛋白，也稱ISG56家族。所有IFIT蛋白都包含有多個TPR結構域(Tetratricopeptide Repeat Motif),其功能與蛋白質相互作用有關。IFIT蛋白家族的主要功能為抵抗病毒對宿主的侵染。機體在被病毒感染後，大量表達幹擾素，隨後IFIT蛋白在幹擾素的誘導下表達，抑制病毒複製。IFIT蛋白抗病毒的機制主要有兩方面，一是區分來自宿主和病毒的mRNA，識別缺少甲基化的病毒mRNA並與之結合阻止病毒蛋白的翻譯；二是與真核轉錄起始因子eIF3相互作用，抑制病毒基因的轉錄和蛋白的表達。因此IFIT家族蛋白是免疫系統中的一種重要的組成部分，在宿主抵抗病毒侵染中起到重要的作用。
【發明內容】
[0003] 本發明目的在於提供一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體及其製備和應用。
[0004]為實現上述目的，本發明採用的技術方案為:
[0005]一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體，
[0006]以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增IFIT基因；PCR擴增產物用T4DNA連接酶與載體PEASY-E2連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選獲得的質粒；將獲得質粒與質粒PCN3用限制性內切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接並轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選獲得的質粒pCNIIP，即為半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒；
[0007]所述Fl 為 5』 -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3』 ；R1 為 5』 -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3』。
[0008]一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體的製備方法，以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增IFIT基因；PCR擴增產物用T4DNA連接酶與載體PEASY-E2連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5a，篩選獲得的質粒；將獲得質粒與質粒pCN3用限制性內切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接並轉化入大腸桿菌DH5 a，篩選獲得的質粒pCNIIP，即為半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒；
[0009]所述Fl 為 5』 -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3』 ；R1 為 5』 -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3』。
[0010]一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體的應用，其特徵在於:所述半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒用於防控細胞腫大病毒感染。
[0011]所述半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒用於製備抗細胞腫大病毒的藥物。
[0012]本發明具有如下優點:本發明的幹擾素調控蛋白表達載體注射魚類後能夠顯著提高魚類抗病毒感染能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明的幹擾素調控蛋白表達質粒pCNIIP在抗病毒侵染中的應用。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。
[0015]在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均採用如下方法:
[0016]1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用「天根生化科技(北京)有限公司」的相應試劑盒。
[0017]2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。
[0018]3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自於「紐英倫生物技術有限公司」，北京。
[0019]實施例1
[0020]幹擾素調控蛋白表達質粒pCNIIP的構建:
[0021]以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增IFIT基因；PCR條件為:940C 60s預變性模板DNA，然後94°C 40s, 58C 60s，30個循環後再在72°C延伸反應7 —1min0 PCR產物用天根的相應試劑盒純化。PCR產物用T4DNA連接酶與載體pEASY_E2 (購於TransGen B1tech,北京)在室溫連接2 — 4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含氨苄青黴素(100ug/ml)的LB培養基上培養18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pEASY-1IP。用限制性內切酶EcoRV酶切pEASY-1IP後回收1.3kb片段；將質粒pCN3(構建過程參見 Jiao XD, Zhang M, Hu YH, Sun L.Construct1n and evaluat1n of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009 ；27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收5.4kb片段。將上述兩片段用T4DNA在室溫連接2 — 4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那黴素(50ug/ml)的LB培養基上培養18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，命名為pCNIIP。通過DNA測序分析pCNIIP含有SEQ ID N0.1中瑣事的幹擾素調控蛋白序列。
[0022]所述LB組成成分按重量百分比計:1.0%蛋白腖，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水。
[0023]所述Fl 為 5』 -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3』 ；R1 為 5』 -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3』。
[0024]序列表SEQ ID N0.1中的胺基酸序列為:
[0025]MSAAETKTLKAKLEDLQCHFTWNLDATASKLLRISEHLIDIGSDEGNTWLGQIYNLLGYIHFKLGNNDEAGEFFTKSEEALLKTKQGDQGPWMAVNYANQAWLRHHQGEEEEAQVYLSKIDALMKEYPTPSQDELHPEIYGEKAWTLLKFGKTQKVLALDLFKKAIEIKPDVVEWQSSYFIGFTNTHKHSREGLPAAKMEEIREAMEQDPENLYLAAVYLKARAERGEHVEEEARELATKILGNPVSCYSGLKVILRVYRTYDLIDEAIALAEEALENHAEERYLKRCAALCYQWKLKFSRNGRPTQRMIERAMALHKDVIVLYPHSSFVKKMDLATVYAKTCDVRRAEEIYKDLLRGDLEPEDRQVLYNSYAKFLNFERNDRDRSVDYHMMAAEIHHESFFRQNSISALEKIRDRGRNRRGREIAEFLENLEQEG
[0026](a)序列特徵:
[0027]?長度:436
[0028]?類型:胺基酸序列
[0029]籲鏈型:單鏈
[0030]?拓撲結構:線性
[0031](b)分子類型:蛋白質
[0032](C)假設:否
[0033](d)反義:否
[0034](e)最初來源:半滑舌鰨
[0035]結構特點:該蛋白預期含有兩個pentatricopeptide repeats (PPR)功能域(胺基酸 53 — 79 和 335-360)。
[0036]實施例2
[0037]幹擾素調控蛋白表達質粒pCNIIP的應用
[0038]步驟I)質粒注射
[0039]將上述實施例1的pCNIIP在PBS中稀釋至200ug/ml，即為pCNIIP稀釋液。將20條半滑舌鰨(重約14.3g)隨機分為2組，每組10條。將這2組分別命名為A和B。將A組的每條魚肌肉注射0.1ml pCNIIP稀釋液，將B組(對照組)的每條魚肌肉注射0.1ml PBS。
[0040]所述PBS組成成分按重量百分比計:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024% NaH2PO4,餘量為水。
[0041]步驟2)病毒懸液製備
[0042]將細胞腫大病毒RBIV-Cl (具體製備方法見Zhang M, Xiao Z, Hu Y, SunL.Characterizat1n of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck & Schlege), in China.Aquae Res.2012 ;43:556 - 64)於 PBS 中稀釋至lxl06copies/ml,即為病毒懸液。
[0043]步驟3)攻毒感染
[0044]在上述步驟I)注射後第3天，將A和B組的每條魚腹腔注射10ul上述步驟2)的病毒懸液。在感染後第7天，取魚腎臟和脾臟組織，提取DNA，用絕對定量PCR法檢測組織中病毒含量(具體方法見上述參考文獻)。結果表明A組魚腎臟的病毒數(3.52xl04)顯著(P<0.01)低於B組魚腎臟的病毒數(1.05x10s) ;A組魚脾臟的病毒數(3.55xl04)顯著(Ρ〈0.01)低於B組魚脾臟的病毒數(1.02χ106);(圖1)。
[0045]這些結果表明，pCNIIP能夠顯著增強魚類抵抗細胞腫大病毒的侵染。
【權利要求】
1.一種半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體，其特徵在於: 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增IFIT基因；PCR擴增產物用T4DNA連接酶與載體pEASY-E2連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選獲得的質粒；將獲得質粒與質粒PCN3用限制性內切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接並轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選獲得的質粒pCNIIP，即為半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒；
所述 Fl 為 5』 -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3』 ；R1 為 5』 -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3』。
2.—種權利要求1所述的半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體的製備方法，其特徵在於: 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增IFIT基因；PCR擴增產物用T4DNA連接酶與載體pEASY-E2連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，篩選獲得的質粒；將獲得質粒與質粒PCN3用限制性內切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接並轉化入大腸桿菌DH5a，篩選獲得的質粒pCNIIP，即為半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒；
所述 Fl 為 5』 -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3』 ；R1 為 5』 -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3』。
3.—種權利要求1所述的半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體的應用，其特徵在於:所述半滑舌鰨幹 擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒用於防控細胞腫大病毒感染。
4.根據權利要求3所述的半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體的應用，其特徵在於:所述半滑舌鰨幹擾素調控蛋白IFIT的表達載體質粒用於製備抗細胞腫大病毒的藥物。
【文檔編號】C12N15/70GK104178508SQ201410401856
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】孫黎, 龍昊 申請人:中國科學院海洋研究所