鮮黃芪來源的納米顆粒極化腫瘤相關巨噬細胞
2024-04-14 09:03:05 1
具有抗癌作用。黃芪來源納米囊泡能夠有效保護羅非魚免受氣單胞菌的感染[42]。但是鮮黃芪來源的納米囊泡(astragalus derived nanoparticles，adnps)是否能夠基於歸經理論對特定臟腑組織進行靶向作用，並被巨噬細胞等固有免疫細胞攝取，進一步調節抗腫瘤免疫應答的研究及其作用機制不明，有待進一步挖掘。
技術實現要素：
[0006]
本發明要解決的技術問題是，克服以上技術缺陷，提供一種對黃芪來源納米顆粒極化腫瘤相關巨噬細胞的研究方法。
[0007]
為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：鮮黃芪來源的納米顆粒極化腫瘤相關巨噬細胞，包括鮮黃芪來源納米顆粒(adnps)的提取，其中將adnps提取後進行初步性質鑑定，將adnps對m2-bmdm處理分析，對adnps的生物學分布進行檢測。
[0008]
作為改進，所述鮮黃芪來源納米顆粒(adnps)提取包括以下步驟：
[0009]
步驟1：用清水清洗新鮮黃芪的根，並用乾淨的吸水紙吸取表面多餘的水分；
[0010]
步驟2：將鮮黃芪根切成2-5cm的小段，去除壞死部分；
[0011]
步驟3：用韓國惠仁低速榨汁機(型號h300)進行低速榨汁；
[0012]
步驟4：將所得鮮黃芪汁進行2000rpm，20min離心，並分離其上清液，並重複此步驟；
[0013]
步驟5：將上清液進行100000rpm，20min離心。並分離器上清液；
[0014]
步驟6：將上清液進行100000rpm，1h超速離心，並獲取其沉澱；
[0015]
步驟7：將無菌無外泌體的pbs加入沉澱，並進行反覆吹打，並用均質儀處理20min，最後用0.45μm的膜過濾除菌，獲得adnps可以保存在-80℃環境。
[0016]
作為改進，所述adnps對m2型巨噬細胞處理具體為運用流式細胞分析術，觀察 adnps對於類m2型bmdms的活化情況，分析其cd206、cd86、cd80等蛋白分子的表達情況，同時檢測細胞上清中的tnfα，il-6蛋白含量。
[0017]
作為改進，所述adnps的生物學分布檢測包括將adnps靜脈注入小鼠後通過活體成像儀觀察尾靜脈給藥後dio-adnps在4t1原位移植瘤小鼠體內的分布情況，所述adnps 注射量為10mg/kg dio-adnps通過尾靜脈注射兩次(隔日一次)。
[0018]
作為改進，將重製備的m2-bmdms使用adnps處理24h，對樣本進行了轉錄組學檢測分析其數據。
[0019]
作為改進，所述adnps進行尾靜脈給藥後，對小鼠原位移植瘤的生長情況進行分析記錄。
[0020]
本發明與現有技術相比的優點在於：本技術通過將adnps提取後對其進行性質檢測，同時將其對m2-bmdm進行處理分析，分析得到其實用價值，證明了其可以極化小鼠巨噬細胞，同時可以抑制小鼠三陰性乳腺癌的生長，為adnps的臨床應用提供了基礎。
附圖說明
[0021]
圖1是adnps的透射電鏡圖。
[0022]
圖2是adnps粒徑檢測結果。
[0023]
圖3是高分辨液質聯用對adnps化學成分的鑑定(mzcloud best match》85)。
science,2019,110(7):2080-9.)。
[0040]
cd206，又名巨噬細胞甘露糖受體，缺失於淋巴細胞及單核細胞表面，但在單核細胞分化為巨噬細胞後開始表達。且cd206是m2型巨噬細胞的標誌物，具有高度的特異性 (xie m,huang x,ye x,et al.prognostic and clinicopathological significance of pd-1/pd-l1 expression in the tumor microenvironment and neoplastic cells for lymphoma[j].international immunopharmacology,2019,77(105999.)。
[0041]
運用流式細胞分析術，觀察adnps對於類m2型bmdms的活化情況，通過分析 cd206、cd86、cd80等一些蛋白分子的表達情況可知adnps的處理能夠增加巨噬細胞表面cd86和cd80的表達水平，降低cd206蛋白表達水平，同時檢測細胞上清中的tnfα，il-6蛋白含量，實驗結果表明adnps+m2組較m2組能分泌更多的tnfα，il-6炎症因子(圖4b)。而這兩種炎症因子已經被證實能有效活化下遊適應性免疫應答，並進一步殺傷腫瘤。這些結果表明，adnps可以有效極化類m2型巨噬細胞為類m1型巨噬細胞。請著重參考圖6，adnps對bmdms抗腫瘤免疫功能的影響，(a)運用流式細胞分析術，分析bmdms表面cd80、cd86、cd206功能蛋白表達情況。(n＝3，one-wayanova)，(b)運用elisa分析adnps處理bmdms細胞上清中，tnfα，il-6炎症因子濃度變化。(n＝3，one-way anova)。
[0042]
adnps小鼠體內生物學分布的探索，通過運用小動物活體成像儀觀察尾靜脈給藥後 dio-adnps在4t1原位移植瘤小鼠體內的分布情況，通過觀察發現adnps能夠在肺臟、脾臟、肝臟、腫瘤有很好的富集，因為肝臟及腫瘤組織中均有大量的巨噬細胞及dc細胞更易吞噬納米顆粒，因此促進了adnps對這些組織的浸潤。
[0043]
adnps重編程m2-bmdms的機制,為明確adnps極化tams的機制通路,通過提取並製備m2-bmdms，並用adnps處理24h。對樣本進行了轉錄組學檢測，通過數據分析可以發現，有大量的基因轉錄水平發生巨大變化，通過kegg信號通路富集分析，可以發現toll樣受體通路相關基因組間變化更為顯著，對比m2-bmdm細胞中toll相關基因轉錄水平發現，表達差異排名前25的基因多集中於促進巨噬細胞類m1活化通路，通過進一步分析可以發現，adnps處理後類m2型巨噬細胞內的tlr2-myd88-tbk1-nfκb相關轉錄水平有顯著提升。
[0044]
如圖8中control組及adnps處理組(a)kegg信號通路富集圖。(b)toll樣受體信號通路蛋白變化情況。(c)toll樣受體信號通路蛋白變化top25基因轉錄組表達差異分析熱圖。(d)火山圖呈現tlr2-myd88-tbk1-nfκb轉錄組表達差異分析，(n＝3)。
[0045]
為明確adnps重編程的巨噬細胞對於cd8
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t淋巴細胞增殖的影響，從小鼠脾臟中分選出cd8
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t淋巴細胞進行cfse染色，並在體外同adnps處理的bmdms共孵育60h，觀察cd8
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t淋巴細胞的增殖情況，實驗結果表明，m2-bmdms同cd8
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t淋巴細胞共孵育後，抑制了cd8
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t淋巴細胞的增殖能力，而adnps處理後m2-bmdms對cd8
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t淋巴細胞的增殖抑制情況得以改變，得出adnps能間接促進cd8
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t淋巴細胞的增殖。
[0046]
請著重參考附圖9，adnps重編程的m2-bmdms對於cd8
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t淋巴細胞的增殖影響。從左至右：cfse-cd8
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t淋巴細胞；加入anti-cd3,anti-cd28的cfse-cd8
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t淋巴細胞；加入anti-cd3,anti-cd28的cfse-cd8
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t淋巴細胞同等數量m2-bmdm進行共孵育；加入anti-cd3,anti-cd28的cfse-cd8
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t淋巴細胞同等數量adnps處理後的m2
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bmdm進行共孵育。
[0047]
adnps進行尾靜脈給藥後，通過分析小鼠原位移植瘤的生長情況，可以發現adnps 可以有效抑制小鼠三陰性乳腺癌原位移植瘤的生長情況，並且具有劑量依賴性。
[0048]
以上對本發明及其實施方式進行了描述，這種描述沒有限制性，附圖中所示的也只是本發明的實施方式之一，實際的結構並不局限於此。總而言之如果本領域的普通技術人員受其啟示，在不脫離本發明創造宗旨的情況下，不經創造性的設計出與該技術方案相似的結構方式及實施例，均應屬於本發明的保護範圍。