一種蕙蘭SSR引物組及應用該引物組構建蕙蘭品種指紋圖譜的方法與流程

2024-04-15 07:34:05

15.r:5
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34.本發明的第二個目的是提供上述的蕙蘭ssr引物組在構建蕙蘭品種指紋圖譜中的應用。
35.本發明的第三個目的是提供上述的蕙蘭ssr引物組在鑑定蕙蘭品種中的應用。
36.本發明的第四個目的是提供一種蕙蘭品種指紋圖譜的構建方法，其包括以下步驟：
37.(1)提取蕙蘭樣品的dna；
38.(2)以提取的dna為模板，以權利要求1所述ssr引物組為擴增引物，建立pcr反應體系並進行pcr擴增；
39.(3)將擴增產物進行毛細管電泳，根據毛細管電泳結果對蕙蘭每個品種的樣品dna的擴增結果形成擴增片段長度數據化編碼，構建得到蕙蘭品種指紋圖譜。
40.進一步的，步驟(2)中的pcr反應體系包括：10
×
pcr buffer 3μl、2.5mm dntp 2μl、mgcl
2 2μl、primer a2μl、primer b 2μl、template 1μl、ddh2o 18μl、taq酶0.2μl。
41.所述pcr擴增的反應程序為：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10個循環；60℃30min；4℃保存。
42.進一步的，步驟(3)中將擴增產物進行毛細管電泳，根據毛細管電泳結果對蕙蘭每個品種的樣品dna的擴增結果形成擴增片段長度數據化編碼，具體為：按照ssr_21319_c0_g2i1、ssr_71852_c0_g2i1、ssr_92040_c0_g1i7、ssr_12201_c0_g1i10、ssr_42275_c0_g1i1、ssr_52366_c0_g1i1、ssr_32581_c0_g1i1、ssr_22677_c0_g2i1、ssr_12742_c0_g7i1、ssr_62892_c1_g1i6、ssr_33144_c2_g1i2、ssr_33179_c0_g1i2、ssr_73252_c3_g1i1、ssr_53283_c0_g5i3的分子標記順序排列，通過毛細管電泳結果，依次記錄每個蕙蘭品種經每對
ssr引物擴增出現的片段長度，依據各個擴增片段長度進行數據化編碼，即為該蕙蘭品種的dna指紋圖譜。
43.進一步的，所述依據各個擴增片段長度進行數據化編碼，具體為：將各位點擴增片段的等位基因按分子量大小排列，等位基因從小到大以阿拉伯數字1-9標註，9個以上的等位基因，以大寫英文字母a-z標註，若該位點在某個品種中無擴增則記為0，每個位點佔兩位。
44.本發明的第五個目的是提供一種蕙蘭品種指紋圖譜，是由上述蕙蘭品種指紋圖譜構建方法構建得到。
45.本發明的第六個目的是提供上述的蕙蘭品種指紋圖譜在鑑定蕙蘭品種中的應用。
46.本發明的第七個目的是提供一種鑑定蕙蘭品種的試劑盒，該試劑盒含有上述的蕙蘭ssr引物組。
47.本發明的有益效果為：
48.(1)本發明利用毛細管電泳技術，實現了ssr分子標記與高效、自動化毛細管電泳技術的有益結合，檢測結果由分析軟體自動保存，檢測速度快，分離效率高，靈敏度較高，精確度達到1bp以內，有利於大批量樣品的檢測分析，為ssr分子標記技術在蕙蘭品種鑑定中的推廣和應用打下了堅實的基礎。
49.(2)本發明鑑定方法成本低，試劑耗材市場成熟，不計人工與儀器損耗，一個樣品的檢測成本低於10元。
附圖說明
50.圖1為ssr標記篩選的部分代表圖，樣品順序從左到右依次為老染字，大一品，南陽梅，金奧素和鄭孝荷。
51.圖2為以引物對ssr_62892_c1_g1i6對不同蕙蘭品種進行擴增結果峰圖，從上到下依次為老染字，大一品，南陽梅和鄭孝荷四個不同蕙蘭品種的擴增峰圖。
具體實施方式
52.以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
53.實施例1
54.1、蕙蘭品種採集
55.樣品來源於蕙蘭主產區我國廣東、廣西和臺灣，囊括不同花型、花色、葉色的79個品種，如下表1所示。
56.表1 79份蕙蘭品種
57.58.59.[0060][0061]
2、蕙蘭基因組dna提取
[0062]
對所收集的79份蕙蘭種質資源，用植物基因組dna試劑盒(天根公司)提取。首先，分批採集幼葉，每份樣品分2-3份(每份2g左右)存於2ml離心管中，液氮速凍後，-80℃冰箱凍存備用。用預冷的研缽和研棒，將凍存的植物組織充分研磨，提取其基因組dna。用1％瓊脂糖膠上電泳，gv(gold view)染色，用凝膠成像系統檢測條帶，判斷dna提取的質量，並用紫外分光光度計測定其dna濃度。
[0063]
3、全基因組ssr標記開發及篩選
[0064]
3.1ssr引物設計
[0065]
根據蕙蘭全基因組參考序列，用ssr hunter等軟體，共開發出50個ssr分子標記，並用primer 5軟體設計50對擴增各ssr的上下遊引物(表2)。對開發的50個ssr分子標記，以各種蘭花基因組dna為模板，進行pcr擴增。pcr擴增用的mix(由es taq dna polymerase、mg
2+
、dntps以及pcr穩定劑和增強劑組成的預混體系，並加入藍色染料)購自天根公司；50對ssr引物購自加拿大生工公司上海分公司。
[0066]
表2 50對引物列表
[0067]
[0068]
[0069]
[0070][0071]
3.2pcr反應體系包括10
×
pcr buffer 3μl，2.5mm dntp 2μl，mgcl
2 2μl，primer a2μl，primer b 2μl，template 1μl，h2o 18μl，taq酶0.2μl。
[0072]
pcr反應程序為：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10個循環；60℃30min；4℃保存。
[0073]
3.3 2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0074]
每孔上樣10μl pcr產物，100bp ladder指示，120v跑電泳60min初步篩選多態性引物(以同一引物不同樣品擴增的片段大小為指標)(圖1)。根據電泳檢測結果，篩選出14對條帶特異性強、在各樣品中多態性明顯的ssr分子標記，進行螢光引物設計，用於蕙蘭種質資源的分子鑑定。14對ssr引物序列具體見表3。
[0075]
表3 14對ssr引物序列
[0076][0077][0078]
4、ssr-pcr及毛細管電泳檢測
[0079]
4.1ssr-pcr反應
[0080]
pcr反應體系總體積為10μl，包括1.2μl dna模板(50ng/μl)，1.0μl 10
×
bufferι緩衝液，0.1μl takara hs taq酶(5u/μl)，0.6μl正向引物(5μm)，0.6μl反向引物(5μm)，0.8
μl 2.5mm dntp，0.5μl tp-m13(5μm)，去離子水補足至10μl。
[0081]
pcr反應程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30個循環；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10個循環；60℃30min；4℃保存。
[0082]
4.2毛細管電泳檢測
[0083]
96孔板中每孔加入擴增產物1.0μl，rox-500分子量內標和甲醯胺混合液(體積比0.5:8.5)9μl，95℃變性3min後，上abi 3730xl檢測儀進行檢測，1kv電壓進樣10s，電泳15kv，30min。
[0084]
5、引物擴增結果分析
[0085]
用篩選出的14對多態性ssr引物，對檢測合格的79份蕙蘭樣本進行基於毛細管電泳螢光檢測的str分型。結果顯示，引物對ssr_62892_c1_g1i6能在96.87％樣本中檢出條帶，檢出率最高；平均檢出率為88.60％(表4)，說明這14對多態性ssr引物可有效用於蕙蘭品種的分子鑑定。以引物對ssr_62892_c1_g1i6擴增結果峰圖為例進行展示(圖2)，本發明所述的ssr分子標記引物擴增效果好，檢出率高，且可擴增出穩定的dna條帶。
[0086]
表4篩選出的14對多態性ssr引物在79份蕙蘭樣本中的檢出情況
[0087][0088]
6、數據分析
[0089]
將data colletion軟體收集的原始數據文件導入到genemapper 6.0軟體中進行分析，將各峰值的位置與其泳道中的分子量內標予以比較，計算目標dna片段的準確大小。
各螢光標記座位上獨立進行3次重複的毛細管電泳檢測，取3次重複的平均值並四捨五入取整，作為實驗材料在該座位上的數據。
[0090]
採用popgene1.31和powermarker軟體進行以下遺傳多樣性參數的分析，運用past3等軟體進行遺傳多樣性指標、聚類及多態信息含量(pic)計算分析：
[0091]
觀測等位基因數(na)，基因觀測雜合度(ho)，基因期望雜合度(he)，多態性信息含量(pic)，有效等位基因數(ne)，遺傳偏離指數(d)，shannon
–
weaver diversity index(i)，聚類圖譜，dna指紋條帶信息及分子身份證信息等。利用生物信息學軟體(popgene、mega、joinmap、structure、r等)對str分型數據進行遺傳多樣性和聚類分析。運用ntsys等軟體進行遺傳多樣性指標、聚類及多態信息含量(pic)計算分析。結果見表5。
[0092]
表5遺傳多樣性分析結果
[0093][0094]
7、分子身份證構建
[0095]
按照二倍體標準構建，依據ssr檢測結果，對指紋數據進行數據化編碼(各位點擴增片段按分子量大小排列，擴增片段(等位基因)從小到大以阿拉伯數字1-9標註，9個以上的等位基因，以大寫英文字母a-z標註)，若該位點在某個品種中無擴增則記為0，每個位點佔兩位。其中，分子身份證ssr分子標記順序為：ssr_21319_c0_g2i1、ssr_71852_c0_g2i1、ssr_92040_c0_g1i7、ssr_12201_c0_g1i10、ssr_42275_c0_g1i1、ssr_52366_c0_g1i1、ssr_32581_c0_g1i1、ssr_22677_c0_g2i1、ssr_12742_c0_g7i1、ssr_62892_c1_g1i6、ssr_
33144_c2_g1i2、ssr_33179_c0_g1i2、ssr_73252_c3_g1i1、ssr_53283_c0_g5i3。
[0096]
79份蕙蘭品種的指紋圖譜見表6。
[0097]
表6 79份蕙蘭品種的指紋圖譜
[0098]
[0099]
[0100]
[0101][0102]
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護範圍應當以權利要求所限定的範圍為準。對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和範圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。