新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因及其重組蛋白和應用的製作方法

2024-04-07 14:02:05

專利名稱：新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因及其重組蛋白和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗原基因技術領域，是一種新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因 (XHFNP235)及其重組蛋白和應用。
背景技術：
克裡米亞-剛果出血熱(Crimean-CongoHemorrhagic Fever, CCHF)是一種廣泛 流行於非洲、亞洲、東歐和中東等地區經蜱傳播的病毒性自然疫源性疾病，其病原體為克裡 米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus, CCHFV)，平均病死率 在 10% -50%。克裡米亞-剛果出血熱在我國又稱新疆出血熱(Xinjiang Hemorrhagic Fever, XHF)，該病原體新疆出血熱病毒(Xinjiang Hemorrhagic Fever Virus，，XHFV)是目前我 國存在的唯一被證實有自然暴發流行的生物安全四級(Laboratory Biosafety Level 4， BSL-4)病原體。由於該病毒可在人_人間傳播，平時發病較少，臨床醫生沒有診斷該病的經驗，誤 診極易導致醫院內暴發流行，類似SARS，危害極大；同時，戰爭、未知疫源地內的大規模經 濟開發和生物恐怖襲擊(該病毒被列為重要生物恐怖戰劑之一)都會造成該病的嚴重流行 和危害。新疆出血熱已在新疆發生數次局部暴發流行。目前，還沒有有效地針對CCHF的預 防和治療手段。CCHFV屬於布尼亞病毒科(Bunyaviridae)內羅病毒屬(Nairovirus)，病毒基因 組由大(L gene)、中(M gene)、小(S gene)三股負鏈RNA片段組成，分別編碼RNA聚合酶 (RNA-d印endent-polymerase)、糖蛋白(GP)及核蛋白(NP)。新疆出血熱病毒核蛋白抗原 位點呈線性分布且性質穩定，是病毒誘導機體產生早期體液免疫和細胞免疫的主要抗原。S 基因編碼的核蛋白已表達於不同的系統，並證明可做為克裡米亞_剛果出血熱病的診斷性 抗原。通過基因重組的方法獲得具有相同或相似抗原特異性，而不再具有完整蛋白毒性的 抗原片段，已成為預防和診斷新疆出血熱病理想的候選診斷性抗原試劑。

發明內容
本發明提供了一種從新疆出血熱病毒中得到的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因 (XHFNP235)及其重組蛋白和應用，特別是在製備預防或診斷新疆出血熱病的診斷性抗原試 劑中的應用。本發明的技術方案之一是通過以下措施來實現的一種從新疆出血熱病毒中得到 的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其具有序列1的核苷酸序列。下面是對上述發明技術方案之一的進一步優化或改進通過設計一對引物，從新 疆出血熱病毒中得到的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因XHFNP235，該引物分別為Ji 遊弓丨· (Primer)5 『 —ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagt g-3'，
3
下遊引物(Primer) 5' -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtt tttgt-3'。本發明的技術方案之二是通過以下措施來實現的上述的新疆出血熱病毒核蛋白 抗原基因即XHFNP235抗原基因的重組蛋白。本發明的技術方案之三是通過以下措施來實現的上述的新疆出血熱病毒核蛋白 抗原基因即XHFNP235抗原基因在製備預防或診斷新疆出血熱病的診斷性抗原試劑中的應用。本發明的技術方案之四是通過以下措施來實現的上述的重組蛋白在製備預防或 診斷新疆出血熱病的診斷性抗原試劑中的應用。本發明從新疆出血熱病毒中得到新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因XHFNP235及其 重組蛋白。通過PCR擴增，克隆，轉化，表達質粒構建，誘導表達，免疫學檢測，新疆出血熱抗 原表位定位在NP蛋白的第235-305位胺基酸區域，這個區域也是NP蛋白的一個高度保守 的胺基酸區域，進一步表明XHFNP235重組蛋白可以成為新疆出血熱病的候選診斷抗原，為 新疆出血熱病的診斷和應用提供一條新的途徑。
四

附圖1為本發明新疆出血熱病毒核蛋白抗原XHFNP235重組質粒瓊脂糖凝膠電泳 結果，其中，M為DL2000 ；1為本發明XHFNP235的重組質粒雙酶切EcoR I和BamH I產物。附圖2為本發明XHFNP235重組蛋白SDS-PAGE電泳分析結果，其中，1為pGEX_KG 載體表達蛋白，2為pGEX-KG NP核蛋白全長表達蛋白，3為本發明pGEX-KG_XHFNP235表達 蛋白，4為pGEX-KG-XHFNP235純化蛋白，M為蛋白分子量marker。附圖3為用抗新疆出血熱病毒的多克隆兔血清對本發明XHFNP235重組蛋白 Western-blot免疫學檢測分析結果，其中，1為pGEX-KG表達蛋白，pGEX-KGNP表達蛋白， pGEX-KG XHFNP235 重組蛋白。
五具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可依據本發明的技術方案和實際情況來確定具體 的實施方式實施例1 利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術和基因重組技術大量獲得本發明新疆 出血熱病毒核蛋白N235抗原基因。根據新疆出血熱病毒S基因序列分別設計引物，以cDNA為模板，PCR擴增目的 片段。PCR 反應體系為cDNA2yL，10XEx Taq Buffer2 μ L, Sterilized dH2012. 9μ L, Ex Taq (5U/ μ L)0. 5μ L, Plprimer (20 μ M)0. 3 μ L, P2primer (20 μ M)0. 3 μ L, dNTP Mixture (each 10mM)2yLo根據新疆出血熱病毒核蛋白基因序列，設計引物。上遊引物Pl (Primer)5 『 -ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagtg-3『，下遊引物P2 (Primer)5' -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtttttgt—3『。
PCR擴增本發明XHFNP235基因的反應條件為94°C，10分鐘；32循環包括94°C 30 秒，61°C 30秒，720C 1分鐘；最後72°C持續10分鐘。利用PCR擴增儀擴增，擴增產物經1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，並測序正確後，將PCR擴增獲得片段XHFNP235基因片段克隆到 pGEX-KG的多克隆位點(EcoR I和BamH I)。重組質粒pGEX-KG_XHFNP235經酶切鑑定，大 小為5110bp，酶切條帶與預期大小相符。如附圖1所示。實施例2 獲取本發明XHFNP235重組蛋白。將本發明XHFNP235基因片段克隆到pGEX_KG原核表達載體上，轉化至大腸桿菌 BL21(具有表達功能)中，接種於含氨卞青黴素(50yg/mL)的3mL LB培養基中，37°C， 220rpm/min振蕩培養過夜後，按1 100接種於含相同濃度氨卞青黴素的LB培養基中， 370C，220rpm/min,培養3h後，至OD600 ^0.4時，加入IPTG至終濃度為0. 4mmol/L,繼續振 蕩培養3h，於4°C，4000rpm/min,離心12min，收集細菌。用適量PBS懸浮菌體，加入上樣緩 衝液 W. 08M Tris/HCl(pH 6. 8)，2% SDS，10%甘油，5% β -巰基乙醇，0. 005%溴酚藍]， 煮沸lOmin，12000Xg離心10分鐘，取5μ L上清液進行12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍 R-250染色。在電泳圖的32KDa處可見本發明XHFNP235重組蛋白表達，其附圖2所示，表明 本發明XHFNP235重組蛋白成功表達。實施例3 採用本發明XHFNP235重組蛋白為抗原，採用ELISA方法檢測採自新疆 出血熱流行區的動物血清樣本的應用。3. 1以XHFNP235重組蛋白為抗原建立XHFV抗體的ELISA檢測方法(1)製備抗原板用包被液(0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩衝液)稀釋XHFNP235重組 蛋白至1 μ g/ml，酶標板每孔0. 2ml，置37°C溫箱2h後轉至4°C冰箱過夜，翌日PBST洗液衝 洗5遍後拍幹備用。(2)抗原板每孔加1/100稀釋的羊血清100 μ 1，將酶標板置溼盒內37°C溫箱反 應lh，同時需做陽性、陰性、空白對照；PBST洗液洗4-5遍後拍幹，加1/500稀釋的兔抗 羊IgG-HRP酶標記物100 μ 1，置溼盒內37°C溫箱反應Ih ；PBST洗液洗4_5遍後拍幹，加 TMB (四甲基聯苯胺)顯色液，A液B液各100μ1，37 孵育lOmin，加2Μ H2SO4終止液，每孔 200 μ 1，置酶標儀0D45(1、OD630雙波長讀取結果。3. 2對來自新疆出血熱流行區動物血清中XHFV抗體的檢測共對來自新疆出血熱流行區尉犁縣實驗組羔羊(採用藥物驅蜱組)血液份85，對 照組(未採用藥物驅蜱組)37份，以及XHFV抗體陽性對照組羊血清10份，共計132份進行 檢測。陽性對照組陽性率為100%，實驗組CCHFV抗體陽性數19份，陽性率22.3%，對照組 陽性17份，陽性率45. 9%。經卡方檢驗具有極顯著性差異，表明藥物驅蜱抑制帶有XHFV侵 襲羔羊可以有效控制羔羊感染新疆出血熱。通過以上實驗表明，本發明XHFNP235重組蛋白能夠檢測人和動物血清是否感染 有出血熱病毒，可以成為檢測新疆出血熱病的候選診斷抗原。綜上所述，通過XHFNP235基因的克隆，轉化，誘導表達和血清檢測實驗，進一步表 明XHFNP235重組蛋白可以成為檢測新疆出血熱病的候選診斷抗原，為新疆出血熱病的診 斷和應用提供一條新的途徑。本發明新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因的核苷酸的序列1 見序列表。
權利要求
一種從新疆出血熱病毒中得到的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其特徵在於具有序列1的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其 特徵在於通過設計一對引物，從新疆出血熱病毒中得到的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因 XHFNP235，該引物分別為J^iit弓L (Primer)5『 -ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagtg-3『，下遊弓 I物(Primer) 5 『 -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtttttg t-3'。
3.一種含有權利要求1或2所述的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原 基因的重組蛋白。
4.一種根據權利要求1或2所述的新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原 基因在製備預防或診斷新疆出血熱病的診斷性抗原試劑中的應用。
5.一種根據權利要求3所述的重組蛋白在製備預防或診斷新疆出血熱病的診斷性抗 原試劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及抗原基因技術領域，是一種新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因(XHFNP235)及其重組蛋白和應用，該基因具有序列1的核苷酸序列。本發明從新疆出血熱病毒中得到新疆出血熱病毒核蛋白抗原基因XHFNP235及其重組蛋白。通過PCR擴增，克隆，轉化，表達質粒構建，誘導表達，免疫學檢測，新疆出血熱抗原表位定位在NP蛋白的第235-305位胺基酸區域，這個區域也是NP蛋白的一個高度保守的胺基酸區域，進一步表明XHFNP235重組蛋白可以成為新疆出血熱病的候選診斷抗原，為新疆出血熱病的診斷和應用提供一條新的途徑。
文檔編號C12N15/40GK101921781SQ20101010949
公開日2010年12月22日 申請日期2010年2月12日 優先權日2010年2月12日
發明者孫素榮, 張渝疆, 魏鵬飛 申請人:新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心