一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法
2024-04-07 15:29:05
專利名稱：一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法
技術領域：
本發明屬於發酵技術領域，具體涉及一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法。
背景技術：
異帕米星(Isepamicin)作為新一代半合成的氨基糖苷類抗生素,其抗菌譜類似慶大黴素，對大腸埃希菌、枸櫞酸桿菌、克雷白桿菌、腸桿菌、沙雷桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌等有很強的抗菌作用。其除耳、腎毒性低之外，還對細菌產生的多數氨基糖苷鈍化酶穩定，有良好的抗生素後效應，因此許多耐慶大黴素及部分耐阿米卡星的菌株對其仍呈敏感，特別是對硫酸慶大黴素耐藥菌株引起的敗血症、外傷、燙傷、手術創傷、二次感染、慢性支氣管炎、支氣管擴張感染、肺炎、腎盂腎炎、膀胱炎和腹膜炎等感染症都有效，因此其具有良好的發展前景。作為半合成抗生素的異帕米星，其是在慶大黴素B的I位氨基上連接上異絲氨酸衍生而成的。而慶大黴素B作為合成異帕米星的重要的前體物質，是由棘孢小單孢菌(Micromonospora ecAifliospora)發酵產生的。慶大黴素B的生產方式是將棘孢小單孢菌經孢子製備、搖瓶菌絲培養後接入種子罐，種子經過一級、二級、三級擴級培養後接入發酵罐。孢子製備是發酵工業生產中不可缺少的一個環節，孢子質量的好壞將直接影響到發酵生產的成功與否。孢子製備一般採用瓊脂斜面培養基或一般固體培養基經接種後進行培養而得。由於小單孢菌的孢子屬於低級類型的側生孢子，其存在著厚內層細胞壁，這些因素造成了小單孢菌的孢子有80 90%是組成型休眠孢子，只有10 20%的孢子可以萌發。小單孢菌的低萌發率的特點，促使我們在發酵工藝上必須加大接種量和增加發酵級數，使工藝複雜、設備利用率降低、成本升高。
發明內容
本發明的目的在於提供一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法。為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案
(1)孢子萌發培養基的製備取黃豆餅粉2-4%和玉米粉I.5-3%，加水定容，用6NHCl調pH2. 0-3. 0，煮沸並維持O. 5-1. 5小時，過程中補加蒸發掉的水分，冷卻後回調PH6. 0-7.0，過濾出浸汁備用；
(2)在上述浸汁中加入可溶性澱粉1-2%，葡萄糖O.05-0. 1%，硝酸鉀O. 05-0. 1%，蛋白腖
O.05-0. 1%，胰蛋白腖 O. 05-0. 1%，氯化鈷 O. 0001-0. 0003%,磷酸二氫鉀 O. 005-0. 01%,磷酸氫二鉀O. 01-0. 03%,調pH7. 2 7. 5，製成孢子萌發培養基；
(I)棘孢小單孢菌經斜面活化後，加孢子萌發培養基至斜面刮取孢子，得到孢子懸液，經過50-65°C水浴5-20分鐘，然後迅速冷卻，置於35-37°C搖床上1_4小時，搖床轉速200-240rpmo其中步驟(I)所述冷卻後回調pH6. 0-7. O採用質量比為30%Na0H溶液調節pH。步驟(2)所述調ρΗ7· 2 7. 5採用質量比為30%Na0H溶液調節pH。
本發明操作簡單易行，關鍵技術在於孢子萌發培養基的製備、水浴熱激活、孢子萌發，使棘孢小單孢菌的孢子萌發率由10-20%提高到30-50%，同時提高了孢子萌發和菌絲生長的同步性；本發明降低了成本，簡化了工藝，使原來的四級發酵改進為三級發酵，提高了設備的利用率，使生產效率得到了很大的提高，增加了發酵過程的可預測性。
具體實施例方式實施例I : 1.孢子萌發培養基的製備黃豆餅粉2g，玉米粉3g，定容至100ml，用6NHCl調pH3.0，煮沸維持I小時，過程中補加蒸發掉的水分，冷卻後用30%Na0H溶液回調pH6. O,過濾出浸汁備用;
2.在上述浸出汁中加入可溶性澱粉lg，葡萄糖O.lg，硝酸鉀O. 05g，蛋白腖O. 05g，胰蛋白腖O. Ig,氯化鈷200ug，磷酸二氫鉀O. 005g,磷酸氫二鉀O. 03g, 30%Na0H溶液調節pH7. 5，製成孢子萌發培養基；
3.棘孢小單孢菌經斜面活化後，加15ml孢子萌發培養基至斜面刮取孢子製備孢子懸液，置於55°C水浴中熱激活10分鐘，然後迅速冷卻，置於搖床上，溫度35°C，搖床轉速220rpm，培養2小時。本方法使孢子萌發率由10%提高到30%，同時提高了孢子萌發和菌絲生長的同步性；本發明降低了成本，簡化了工藝，使原來的四級發酵改進為三級發酵(現工藝流程孢子預萌發一搖瓶菌絲培養一一級種子罐一二級繁殖罐一發酵罐)，提高了設備的利用率，使生產效率得到了很大的提高，增加了發酵過程的可預測性。實施例2:
(1)孢子萌發培養基的製備黃豆餅粉4g，玉米粉I.5g，定容至100ml，用6N HCl調PH2. 0，煮沸維持I. 5小時，過程中補加蒸發掉的水分，冷卻後用30%Na0H溶液回調pH7. 0，過濾出浸汁備用；
(2)在上述浸出汁中加入可溶性澱粉2g，葡萄糖O.lg，硝酸鉀O. lg，蛋白腖O. lg，胰蛋白腖O. 05g,氯化鈷250ug，磷酸二氫鉀O. 007g,磷酸氫二鉀O. 02g,調pH7. 4，製成孢子萌發
培養基；
(3)棘孢小單孢菌經斜面活化後，加20ml孢子萌發培養基至斜面刮取孢子製備孢子懸液，置於60°C水浴中熱激活5分鐘，然後迅速冷卻，置於搖床上，溫度36°C，搖床轉速240rpm,預萌發I小時,最後接入種子培養基中。本方法使孢子萌發率由20%提高到50%，同時提高了孢子萌發和菌絲生長的同步性；本發明降低了成本，簡化了工藝，使原來的四級發酵改進為三級發酵，提高了設備的利用率，使生產效率得到了很大的提高，增加了發酵過程的可預測性。實施例3:
(1)孢子萌發培養基的製備黃豆餅粉3g，玉米粉2.5g，定容至100ml，用6N HCl調PH3. 0，煮沸維持O. 5小時，過程中補加蒸發掉的水分，冷卻後用30%Na0H溶液回調pH6. 5，過濾出浸汁備用；
(2)在上述浸出汁中加入可溶性澱粉I.5g，葡萄糖O. 05g,硝酸鉀O. 07g,蛋白腖O. 075g，胰蛋白腖O. 075g,氯化鈷IOOug,磷酸二氫鉀O. Olg,磷酸氫二鉀O. 03g,調ρΗ7· 2，製成孢子萌發培養基；
(3)棘孢小單孢菌經斜面活化後，加30ml孢子萌發培養基至斜面刮取孢子製備孢子懸液(孢子終溶度為5-6X108/ml)，置於65°C水浴中熱激活5分鐘，然後迅速冷卻，置於搖床上，溫度37°C，搖床轉速200rpm，預萌發4小時，最後接入種子培養基中。本方法使孢子萌發率由20%提高到30%，同時提高了孢子萌發和菌絲生長的同步性；本發明降低了成本，簡化了工藝，使原來的四級發酵改進為三級發酵，提高了設備的利用率，使生產效率得到了很大的提高，增加了發 酵過程的可預測性。
權利要求
1.一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法，其特徵在於 (1)孢子萌發培養基的製備取黃豆餅粉2-4%和玉米粉I.5-3%，加水定容，用6NHCl調pH2. 0-3. 0，煮沸並維持O. 5-1. 5小時，過程中補加蒸發掉的水分，冷卻後回調PH6. 0-7.0，過濾出浸汁備用； (2)在上述浸汁中加入可溶性澱粉1_2%，葡萄糖O.05-0. 1%，硝酸鉀O. 05-0. 1%，蛋白腖 O. 05-0. 1%，胰蛋白腖 O. 05-0. 1%，氯化鈷 O. 0001-0. 0003%，磷酸二氫鉀 O. 005-0. 01%，磷酸氫二鉀O. 01-0. 03%，調pH7. 2 7. 5，製成孢子萌發培養基； (3)棘孢小單孢菌經斜面活化後，加孢子萌發培養基至斜面刮取孢子，得到孢子懸液，經過50-65°C水浴5-20分鐘，然後迅速冷卻，置於35-37°C搖床上1_4小時，搖床轉速200_240rpm。
2.根據權利要求I所述的提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法，其特徵在於步驟(I)所述冷卻後回調PH6. 0-7. O採用質量比為30%Na0H溶液調節pH。
3.根據權利要求I所述的提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法，其特徵在於步驟(2)所述調PH7. 2 7. 5採用質量比為30%Na0H溶液調節pH。
4.根據權利要求I所述的提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法，其特徵在於步驟(3)中所述孢子懸液中孢子的終溶度為5 6X 108/ml。
全文摘要
本發明屬於發酵技術領域，具體涉及一種提高棘孢小單孢菌孢子萌發率的方法。具體是首先製取孢子萌發培養基，將新鮮棘孢小單孢菌孢子懸浮於孢子萌發培養基中，於50-65℃水浴中熱激活5-20分鐘，然後迅速冷卻，置於搖床上，溫度35-37℃，搖床轉速200-240rpm，預萌發1-4小時，使其孢子萌發率由10-20%提高到30-50%，同時提高了孢子萌發和菌絲生長的同步性。本發明降低成本，簡化了工藝，使原來的四級發酵改進為三級發酵，提高了設備的利用率，使生產效率得到了很大的提高，增加了發酵過程的可預測性。
文檔編號C12N1/20GK102899273SQ201210424789
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者洪劍輝, 郭麗娟, 楊梅, 林燈, 林毅, 羅義發 申請人:福建博美生物技術有限公司