用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及試劑盒的製作方法

2024-04-05 08:14:05

專利名稱：用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及農作物病害診斷、病原鑑定等領域，更具體涉及一種美澳型核果褐腐 病菌鑑定的引物及其應用。
背景技術：
褐腐病(Brown Rot)是核果類李屬植物桃、李、杏、櫻桃等果樹及仁果類蘋果、梨 屬植物的重要病害。褐腐病從核果仁果植物開花期便開始發生，造成花腐、枝腐；最嚴重的 是造成產中產後的果實腐爛。2001年，美國南部的喬治亞州褐腐病大面積發生，給桃產業 帶來直接經濟損失達430萬美元，購買殺菌劑帶來間接經濟損失為150萬美元(Phillips， 2002)。褐腐病主要是由子囊菌門(Ascomycete)，盤菌綱(Discomycete)，柔膜菌目 (Helotiales)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)，鏈核盤菌屬(Monilinia)(阿歷索保羅等， 1996)的三種病原菌一Monilinia fructicola、M. fructigena、M. laxa 及 2002 年新命名 的Monilia polystroma引起的。褐腐病菌在世界各地分布不同(Byrde& ffilletts, 1977 ； Batra, 1991)。美澳型核果褐腐病菌，即M. fructicola主要分布在美洲、澳大利亞、紐西蘭、 日本(Batra，1991) ；M. fructigena主要分布在歐洲、日本及亞洲其它地區；M. laxa分布最 為廣泛，幾乎存在於所有核果和仁果的種植區，Molinia polystroma則主要發生在日本。根 據文獻報導，我國1998年以前的褐腐菌有M. laxa和M. fructigena兩種(戴芳瀾，1979 ；莊 文穎，1998 ；王英祥等，1998)。2005年(Zhu, et al)首次報導在中國北京地區的桃和油桃 上發現了 M. fructicola。在檢疫中，M. fructicola是歐盟的A2類檢疫對象(0EPP/EPP0， 2005)，也是我國對外檢疫對象。四種褐腐病菌的的形態特徵非常相似，缺少經驗時很難準確判斷。近年發展起 來的分子生物學技術也在褐腐病菌的種類鑑定中得到了廣泛應用(loos et al. ,2000； Hughes, et al. 2000 ；Ma et al. ,2003 ；Cote et al. ,2004 ；Gell et al. ,2007) 但是由 於褐腐病菌不同種間的序列差異很小，利用ITS序列差異、微衛星引物等擴增片段差異設 計種類特異性引物時沒有充分考慮相近種的差異(如圖2所示)；同時，用於測試的菌株有 限，缺乏來自世界多個地區的褐腐病菌株，所設計的種類特異性引物的特異性往往較差。因 此，針對來自世界多個國家和地區的褐腐病菌株，開發具有穩定特異性的鑑定美澳型核果 褐腐病菌的引物是非常必要的。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物、試劑盒，以及一 種利用該引物和試劑盒快速鑑定美澳型核果褐腐病菌的方法。實現本發明的目的包括下列步驟1.根據美澳型核果褐腐病菌laCCaSe2(lCC2)基因序列的特異性，設計了對美澳 型核果褐腐病菌具有特異性的一對PCR引物，PCR引物的序列為
ClaF 5' -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5，-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，。2.美澳型核果褐腐病菌鑑定的方法(1)提取待測菌的基因組DNA。(2)以待測菌的DNA作為模版，以所述引物作為擴增引物，進行PCR擴增。(3)將5iU PCR產物用重量體積比為1.4%的瓊脂糖凝膠電泳分離後用EB染色， 若凝膠上顯現386bp的DNA條帶，則待測菌為美澳型核果褐腐病菌。上述方法第⑵步中PCR反應體系組成如下PCR反應體系25 iil，包括2. 5 ill 10 XPCR Buffer, 200 umol/L dNTPs，引物 ClaF 和 ClaR 各 0. 2 ii mol/L，1U Taq DNA 聚合 酶，10ng模板DNA，ddH20補足25 u 1 ；PCR反應條件為94_95°C預變性3分鐘，94_95°C變性 30秒，60-64°C退火30秒，72°C延伸1-1. 5分鐘，共30個循環；72°C延伸10分鐘。3.鑑定美澳型核果褐腐病菌的試劑盒試劑盒包含10XPCR BufferU0mmol/L dNTPs、5U/iil Taq DNA 聚合酶、ddH20、引 物ClaF和ClaR，引物濃度為10 P mol/L，所述引物序列為ClaF 5，-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5，-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，。本發明有益效果本發明提供的引物和方法能快速、準確鑑定美澳型核果褐腐病菌。本發明與現有 技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果①引物特異性強本發明的鑑定方法是利用核果及仁果上褐腐病菌的漆酶基因 lcc2具有種內保守、種間變異的特點，根據序列差異較大的區段設計引物進行鑑定。已經對 來自中國、美國、法國、紐西蘭、英國、義大利、日本等多個國家已知的4種仁果及核果褐腐 病菌艮口 Monilinia fructicola、M. fructigena、M. laxa、Monilia polystroma 及其近似禾中 進行了驗證，結果顯示該引物具有很強的特異性。②操作簡便快速應用本發明，提取褐腐病菌的DNA作為模板進行PCR擴增，用常 規的瓊脂糖凝膠電泳，整個過程可在6小時內完成。因此，本發明的引物和鑑定方法可用於 快速、準確鑑定美澳型核果褐腐病菌。


圖1A、B為用本發明的引物、試劑盒及鑑定方法鑑定美澳型核果褐腐病菌及近似 種各菌株的PCR擴增產物凝膠電泳圖譜。Monilinia fructicola為美澳型核果褐腐病菌， 分別來自美國、法國、紐西蘭、中國；Monilinia laxa為來自英國、義大利和中國的核果褐腐 病菌；Monilinia fructigena為來自法國、英國、義大利和中國的仁果褐腐病菌；其餘為果 實褐腐病菌近似種及其它植物病原真菌。所有M. fructicola菌株都產生一條大小為386bp 的片段，而陰性對照及其它菌株均無擴增產物，說明是特異性擴增。圖2為用文獻報導(loos等，2000)的引物鑑定我國褐腐病菌種類的PCR擴增 產物的凝膠電泳圖譜。CK為空白對照，Monilinia fructicola為美澳型核果褐腐病菌， Monilinia laxa為核果褐腐病菌；Moniliniafructigena為仁果褐腐病菌；其中，Ft、 P3、P1為來自法國的標準菌株，其它菌株均來自中國。所有M. fructicola菌株及1株
4M. fructigena菌株都產生了 1條擴增條帶，說明該引物不能準確鑑定美澳型核果褐腐病 菌。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述實施例一1.選用菌株美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐病菌(M. laxa)、仁 果褐腐病菌(M. fructigena)、串珠黴(Monilia polystroma, Monilia mumecola)、灰 葡萄孢(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、蘋果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、鏈格孢菌(Alternaria spp.)、蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、蘋果疫黴(Phytophthora cactorum)、番爺葉黴(Cladosporium fulvum)。上述菌株保存於中國農業大學植物病理學系，也可通過常規的植物病原分離純化 得到。2. DNA 提取從培養基表面刮菌絲，約50-100mg，放到2ml凍存管中，加入500 u 1抽提緩衝 液，置於DNA提取儀FastPr印-24中，設置速度為5，時間為40秒；取出混合液，加入50 yl 10% SDS，37°C水浴lh ；加入75 u 15M NaCl，將混合液輕輕混勻；加入65 u 1 CTAB/NaCl溶 液，充分混勻後於65°C水浴10-20min ；加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)， 充分混勻後，10, OOOrpm離心12min ；將上清轉移至另一印pendorf管中，加0. 6倍體積的 冷異丙醇，顛倒混勻，然後10，OOOrpm離心12min，去上清；加入500 u 1 70%乙醇，顛倒數 次；10，OOOrpm離心12min，去上清；用冷凍濃縮儀將沉澱抽乾，沉澱溶於100 yl TE中(含 100 u g/mlRNase)，_20°C保存備用。3.引物合成根據美澳型核果褐腐病菌laCCaSe2(lCC2)基因序列的特異性，設計了對美澳型 核果褐腐病菌具有特異性的一對PCR引物，PCR引物的序列為ClaF 5' -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5' -GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，上述序列由賽百盛合成，也可經常規的引物合成方法合成。4.菌株鑑定以上述所有菌株的DNA為模板，用ClaF/ClaR引物進行PCR反應，每次反應均包括 一個陰性對照(用ddH20代替DNA模板)。PCR反應體系組成總體積25iU，包括2. 5iU 10 X PCR Buffer (北京盛旭百川公 司生產)，200iimol/L dNTPs，引物 ClaF 和 ClaR 各 0. 2iimol/L，lU Taq DNA 聚合酶，10ng 模板 DNA，ddH20 補足 25 yl。PCR反應條件為95°C預變性3分鐘，95°C變性30秒，64°C退火30秒，72°C延伸1 分鐘，共30個循環；72°C延伸10分鐘。將5iU PCR產物用重量體積比為1.4%的瓊脂糖凝膠電泳分離後用溴化乙錠 (EB)染色後拍照。
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從電泳圖片上看(如圖1所示)，美澳型核果褐腐病菌的PCR產物經瓊脂糖凝膠電 泳顯色後，凝膠上顯現大小為386bp的DNA條帶，其它菌的PCR擴增產物經電泳顯色後凝膠 上不顯現DNA條帶，即說明本發明的引物可以特異性的擴增美澳型核果褐腐病菌的DNA。實施例二僅PCR反應條件不同，其餘鑑定過程同實施例1。具體的PCR反應條件為94°C預 變性3分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸1. 5分鐘，共30個循環；72°C延伸10 分鐘。SEQUENCE LISTING中國農業大學用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及試劑盒2PatentIn version 3. 5123DNAMonilinia fructicola1ggtaagcgac atcgcattct cac23224DNAMonilinia fructicola2gaggtaaatg tggtaaatat gcag2權利要求
用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物，其特徵在於，所述引物序列為ClaF5』-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3』ClaR5』-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3』。
2.一種鑑定美澳型核果褐腐病菌的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟(1)提取待測菌的基因組DNA;(2)以待測菌的DNA作為模版，以ClaF和ClaR引物作為擴增引物，進行PCR擴增；(3)PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後用EB染色，若電泳結果出現大小為386bp的DNA條 帶，則待測菌為美澳型核果褐腐病菌。
3.如權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於所述PCR反應體系組成如下PCR反 應體系 25ii 1，包括 2. 5ii 1 10XPCR Buffer, 200 umol/L dNTPs，引物 ClaF 禾口 ClaR 各 0. 2umol/L, 1U Taq DNA 聚合酶，lOng 模板 DNA，ddH20 補足 25 ii 1 ；PCR 反應條件為 94-95°C 預變性3分鐘，94-95°C變性30秒，60_64°C退火30秒，72°C延伸1-1. 5分鐘，共30-40個循 環；72°C延伸10分鐘。
4.一種採用如權利要求1、2、3所述的引物鑑定美澳型核果褐腐病菌的試劑盒，其特徵 在於，所述試劑盒包含 10 XPCR BufferU0mmol/L dNTPs,5U/u 1 Taq DNA 聚合酶、ddH20、 引物ClaF和ClaR，引物濃度為10 u mol/L。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述引物ClaF和ClaR序列為ClaF :5』 -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR :5』 -GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3』。
全文摘要
本發明提供了一種用於鑑定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及試劑盒。本發明涉及農作物病害診斷、病原鑑定等領域。本發明所述引物序列為上遊引物ClaF5』-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3』；下遊引物ClaR5』-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3』。經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可以特異性地從美澳型核果褐腐病菌的DNA中擴增出大小為386bp的片段。本發明引物序列特異性強，應用本發明的引物、方法及試劑盒能夠準確、快速的鑑定美澳型核果褐腐病菌。
文檔編號C12N15/11GK101831492SQ20091024228
公開日2010年9月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者國立耘, 朱小瓊 申請人:中國農業大學