一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用的製作方法
2024-04-05 14:25:05 2
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用。
背景技術：
抗生素類藥物作為預防、治療細菌類疾病的首選藥物在畜牧業生產中被廣泛使用，但由於使用不當和用藥壓力，出現了耐藥現象。沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌，對動物和人都有很大的危害。沙門氏菌在長期進化過程中不斷變化，也出現了多重耐藥現象。禽類是沙門氏菌的主要宿主之一，各種日齡的禽類都能被感染。作為重要的食源性病原菌，沙門氏菌可以通過汙染的畜禽肉產品、蛋類、奶類、甚至海洋產品等多種渠道感染人類，而感染情況主要取決於細菌血清型和使用者的身體狀況。體質低弱的人群極易感染，感染後有多種臨床表現，主要以急性腸胃炎為主。
技術實現要素：
本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種能夠快速檢測沙門氏菌的攜帶情況，為研究肉雞屠宰生產鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的關係提供參考，本發明提供了一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用。
技術方案：一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優選的，所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5，端進行氨基化修飾並附加10個鹼基t。
表1分子標記序列
所述分子標記在製備檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。
優選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
優選的，所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化後的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落於甘油中洗滌數次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200～500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
優選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
優選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
優選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
優選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
有益效果：(1)本發明所述分子標記能夠快速檢測沙門氏菌的攜帶情況，為研究肉雞屠宰生產鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的關係提供參考，也為控制肉雞屠宰生產鏈沙門氏菌的耐藥性提供基礎數據；(2)本發明所述分子標記的檢測結果具有穩定性高的優點。
附圖說明
圖1是實施例1～3檢測結果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產物電泳結果；2為實施例2pcr產物電泳結果；3為實施例3pcr產物電泳結果。
具體實施方式
實施例1
一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5，端進行氨基化修飾並附加10個鹼基t。
所述分子標記在製備檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化後的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落於甘油中洗滌數次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例2
一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5，端進行氨基化修飾並附加10個鹼基t。
所述分子標記在製備檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化後的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入40μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落於甘油中洗滌數次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋400倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋60倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例3
一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5，端進行氨基化修飾並附加10個鹼基t。
所述分子標記在製備檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化後的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落於甘油中洗滌數次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
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一種用於檢測肉雞沙門氏菌環丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用
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