一種防治植物病害的生防菌及其製備方法
2024-03-05 08:23:15
專利名稱：一種防治植物病害的生防菌及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物農藥技術領域，具體涉及一種防治植物病害的生防菌及其製備方法。
背景技術：
21世紀人類面臨著許多挑戰，而主要問題之一是人口與糧食問題。我國人口佔世界總人口的四分之一，但耕地只有世界耕地的6.8%，這個問題在我國尤其突出。因此，提高糧食產量是我國關係民生的戰略任務。但據調查，世界主要糧食作物和經濟作物每年因病害損失 20%(0erke et al, 1994. Crop Protection and Crop Production. Elsevier, Amsterdam, 808pp)。我國糧食作物因病害而損失至少10_15%，如果完全不使用殺菌劑，正常年份的黃瓜損失約為 75%、蘿蔔為40%、甘籃為25%、蘋果為30%，甜菜為(陳萬義，1998.植物保護對(5) :33-36)。由此可見殺菌劑在糧食作物和經濟作物中的重要地位。事實上，如果沒有殺菌劑的使用，世界上的作物將有一半在現有條件下不能栽種。目前農業生產上應用的殺菌劑多為化學合成物。化學合成殺菌劑雖具有防效較高和應用方便的優勢，但存在如下缺點X抗性問題嚴重特別是植物病原真菌對內吸性殺菌劑的抗性產生的速度快、抗性水平高。一般應用3年左右，植物病原真菌就可對其產生抗性。據報導已有46種病原真菌對苯菌靈產生了較高的抗性(Gullino et al, 2000. Crop Protection 19:1-11)。I；研製新品種殺菌劑的費用昂貴由於對殺菌劑的要求越
來越嚴格，新品種殺菌劑的研製費用也越來越大。在美國每研究開發成功一個新品種的殺菌劑需要研究20000多個化合物，花費約0. 8 1億美元(Leroux, 1996，Pestic. Sci.
47:191-197)。i環境汙染雖然化學合成殺菌劑較化學合成殺蟲劑對人蓄的危害要小一些，但化學合成殺菌劑也有致癌作用，對野生和非靶標生物有毒等缺點，環境相容性差。因此，在推行的無公害農藥和可持續農業生產的今天，開發和研製不易產生抗性的、較少引起汙染的環境友好型生物殺菌劑已成為農藥發展的必然趨勢。相對於化學合成殺菌劑，生物防治劑和天然產物的使用具有更加誘人的前景， 特別是微生物殺菌劑。一方面微生物是地球上最龐大的生物類群，具有廣泛的生物多樣性，還可通過生物工程技術大幅度提高目標物質的產量，易於實現工業化生產；另一方面， 微生物殺菌劑(活的微生物及其培養物)較化學農藥更加安全，易降解，合成成本較低。 目前報導的能夠產生抗真菌化合物的微生物很多(Liu et al. , 2007, Appl Microbiol Biotechnol 76459-466； Romero et al. , 2007, Journal of Applied Microbiology 103:969-976)，其中芽孢桿菌是研究最多的生防菌獲選菌，已證明芽胞桿菌屬中的許多種都具有合成抗菌活性物質一抗菌多肽的能力，例如，枯草芽孢桿菌產生的能抑制酵母和細菌生長的二肽一bacilysin，以及抑制植物病原菌真菌生長的脂肽(Loeffler et al.,1986, Phytopathology 115:204—213; Romero et al. , 2007, Journal of AppliedMicrobiology 103:969-976)；蠟狀芽胞桿菌合成的抗菌肽一mycocerein (ffakayama er al. , 1984, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 26:939—940) ·。胃i，包木幹胃胃以形成芽孢，細胞壁不含內毒素，除個別種外絕大多數對人畜無害，具有極強的抗逆性和良好的環境適應性及環境友好性，是最理想的生物殺菌劑資源。目前用於植物病害控制的芽孢桿菌生防菌株以枯草芽孢桿菌為主，如中國生產的百抗、麥豐寧、紋曲寧、依天得、根腐消等，用於水稻紋枯病、三七根腐病、菸草黑脛病等根部病害的防治；國外生產的 Serenade 、Souata AS、Kodiak、Subtilex、BioYielcU Taegro 和 Alifine-B等，用於防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的白粉病、霜黴病、疫病、灰黴病等葉部病害和由鐮刀菌、Fusarium spp.)、麴黴屬(Aspergillus spp.)、鏈格孢屬(Alterrmria spp.)、絲核菌屬imzoctonia spp.)等引起的豆類、麥類、棉花和花生根部病害，但針對白粉病防治的芽孢桿菌製劑國內外均非常有限。此外，由於芽孢桿菌種群及菌株的多樣性差異，不同芽孢桿菌乃至同一芽孢桿菌的不同菌株均具有不同的抗菌譜、抗菌活性和抗菌特點，篩選具有不同作用對象的高效芽孢桿菌生防菌劑仍是現在乃至今後相對長一段時期內各國科研工作關注的課題，開發擁有自主智慧財產權的新芽孢桿菌製劑仍具有較強的國際競爭能力。
發明內容
本發明需要解決的問題是利用植物內生細菌資源開發一種可用於植物病害防治的廣譜、高效、可產業化生產的生防菌劑，提供內生細菌ifeciBm sp. CC09菌株以及該菌株的分離、培養和鑑定方法；提供由該菌株製備的生防菌劑及其防治小麥白粉病和小麥赤黴病等植物病害的使用方法。本發明的具體技術方案如下
本發明採用的細菌是分離自植物樟樹莖幹的內生細菌ifeciBm sp. CC09菌株(以下簡稱為CC09)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年3月15日，保藏號為CGMCC No. 4669。本發明的生產菌株CC09經菌落和形態的顯微觀察、染色反應、常規生理生化特性實驗以及16S rDNA、rpoB序列分析，鑑定為feciBm sp.的一個新菌株CC09，具有以下特徵①菌落呈規則圓形，白色，乾燥，不透明；②菌體為杆狀，大小2. 57mmX 1. 2mm,有芽孢， 芽孢中生，橢柱或橢圓狀，革蘭氏染色陽性；③生理生化反應表現為阿拉伯醇、阿拉伯糖、 木糖、木糖醇、葡萄糖、山梨糖、甘露醇、澱粉酶、血清菊糖，均為陽性；硝酸鹽(產氣)、亞硝酸鹽(產氣)、葡萄糖(產氣)、尿素酶、乙醯胺、ONPG試驗結果為陰性。本發明按照常規方法製備，從樟樹莖杆中分離篩選出具有對植物病原真菌生長有抑制活性的菌株CC09，通過液體發酵和在發酵液中添加表面活性劑、防腐劑以及抗凍劑，製備CC09菌株的生防菌劑；利用皿內實驗，評價其對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用；以及盆栽實驗，評價其對小麥白粉病和赤黴病的防效。本產品發明的優點及效果本發明具有穩定的分離自樟樹莖杆的內生細菌一 Bacillus sp. CC09 (芽孢桿菌CC09菌株)，該菌株培養方法簡單；CC09菌株發酵過程所用原料主要為馬鈴薯和蔗糖，成本較低；由CC09菌株發酵製備的生防菌劑製備簡單，且對溫度、酸性和弱鹼性條件有較好的穩定性。本產品低毒，對人畜無害、對農作物無藥害，綠色環
4保，且對小麥白粉病和赤黴病等植物病害有顯著防效。
具體實施例方式下面用實施例來進一步詳述本發明，但本發明的內容並不局限於此。實施例一 CC09菌株的分離與鑑定
新鮮樟樹莖杆採自江蘇南京紫金山，自來水洗淨晾乾後切成Icm左右的小段。依次浸入75%乙醇和40%甲醛溶液表面消毒各3min，然後用無菌水清洗3次，以除去表面汙染雜菌，再用無菌剪刀將莖幹縱向切開，切面朝下放於馬鈴薯蔗糖瓊脂平板上，每平板5個莖段，共5個平板。30°C培養，逐天觀察新菌落的出現，共7天，挑取單菌落，劃線純化。另外， 在相同的馬鈴薯蔗糖瓊脂平板中放入2 3塊未剪碎的莖作對照，檢測表面滅菌是否徹底。 所得菌株採用甘油保藏法於-80°C冰箱保藏備用。將分離到的14株樟樹莖杆內生細菌分別接種於含馬鈴薯蔗糖培養基的15ml 試管中，37°C、100rmp搖床發酵48h ；發酵液離心除菌後取Iml與15ml溶化的馬鈴薯蔗糖培養基混勻，倒入直徑為9cm的培養皿中，製成含培養物1/15的馬鈴薯蔗糖培養基平板，冷卻後放入新鮮植物病原真菌菌餅，菌面向下，於30°C培養箱中培養40h後測量菌落直徑，並以同樣體積的培養基代替培養物作空白對照，計算培養物對測試真菌生長的抑制率，重複三次。抑制率(％)=[(對照組菌落平均直徑一樣品組菌落平均直徑)/ (對照組菌落平均直徑一原始菌片直徑)]χ 100%,菌落直徑單位釐米(cm)。根據對植物病原真菌立枯絲核菌、辣椒疫黴菌、禾穀鐮刀菌以及鏈格孢菌等菌絲生長的抑制活性，獲得一株產生廣譜、高效抗真菌活性物質的內生細菌菌株，經形態、染色、 生理生化反應(表1)，初步確定該菌為芽孢桿菌(Bacillus sp. CC09)。表1.內生細菌CC09菌株鑑定的形態、染色、生理生化特徵
權利要求
1.一種防治多種植物真菌病害的生防菌，其特徵在於該菌為一株植物內生細菌一 Bacillus sp. CC09 (芽孢桿菌CC09菌株)，該菌株分離自植物樟樹莖幹，已於2011年3月 15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4669。
2.一種防治植物病害的生防菌劑的製備方法，其特徵是利用權利要求1所述的生防菌進行液體發酵，發酵工藝包括種子液的製備和IL搖瓶培養，種子液製備為在15ml試管中加入4ml馬鈴薯蔗糖培養基，接種後於37°C、IOOrmp搖床發酵12h，得到種子液，將種子液按 0.5% (ν/ν)的比例接種於含400ml馬鈴薯蔗糖培養基的IL三角瓶中，37°C、IOOrmp發酵 48h，得到發酵液，再在發酵液中添加3% (w/v)表面活性劑0P-10、3% (w/v)防腐劑水楊酸鈉和m (w/v)抗凍劑尿素，得到芽孢桿菌CC09菌株的生防菌劑。
3.根據權利要求2所述的生防菌劑在防治小麥白粉病或小麥赤黴病中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物農藥技術領域，具體涉及一種防治植物病害的生防菌及其製備方法。主要內容包括(1)Bacillussp.CC09(芽孢桿菌CC09菌株)的分離與鑑定；(2)芽孢桿菌CC09菌株生防菌劑的製備及其防治植物病害的應用；(3)芽孢桿菌CC09生防菌劑的穩定性。芽孢桿菌CC09生防菌劑具有殺菌譜廣、效果持久、病害不易產生抗藥性、對人、畜、農作物安全和環境友好等特點，對禾穀鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、水稻立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和辣椒疫黴(Phytophthoracapsici)等的生長有顯著的抑制活性，特別對小麥白粉病和赤黴病有顯著的防治效果。
文檔編號A01P3/00GK102199563SQ20111007377
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月25日 優先權日2011年3月25日
發明者劉常宏, 雙驚雷, 李慧, 薛雅蓉 申請人:南京大學