神經幹細胞培養基的製作方法
2024-03-27 23:03:05
本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種神經幹細胞培養基。
背景技術：
神經系統損傷性疾病包括缺血性腦病、出血性腦病、運動神經元疾病等，是一種嚴重威脅人類健康的疾病，提高這類疾病的生存率，降低致殘率，最大限度地提高患者的生活質量，是防治此類疾病的首要任務。由於神經幹細胞的發現使得神經系統損傷性疾病的治療有了新的研究方向，神經幹細胞也成為了生物醫學工程以及體外模型研究中所必須的種子細胞。
神經幹細胞(neuralstemcells，nscs)是具有分化為神經神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，能自我更新，並足以提供大量腦組織細胞的細胞群，是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞，包括神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞。1992年神經幹細胞自成年動物腦紋狀體內第一次被發現，從而打破了認為神經細胞不能再生的傳統理論。根據分化潛能及產生子細胞種類神經幹細胞可分為如下幾類：
(1)神經管上皮細胞：分裂能力最強，只存茌胚胎時期，可以產生放射狀膠質神經元和神經母細胞。
(2)放射狀膠質神經元：可以分裂產生本身並同時產生神經元前體細胞或是膠質細胞，主要作用是幼年時期神經發育過程中產生投射神經元完成大腦中皮質及神經核等的基本神經組織細胞。
(3)神經母細胞：成年人體中主要存在的神經幹細胞，分裂能力可以產生神經前體細胞和神經元和各類神經膠質細胞。
(4)神經前體細胞：各類神經細胞的前體細胞，比如小膠質細胞是由神經膠質細胞前體產生的。
神經幹細胞作為生物醫學工程以及體外模型研究中的種子細胞，需要將其在體外進行擴大培養，而如何在體外大規模培養神經幹細胞便成為了醫學研究的重點。現有的培養神經幹細胞的常用培養基為gibco的含1~6827的neurobasal培養基，使用明膠預處理過的培養瓶進行貼壁培養。但經過該培養基培養的神經幹細胞增殖能力較弱。因此急需提供一種可增強神經幹細胞增殖能力的培養基。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了一種神經幹細胞培養基，該神經幹細胞培養基能夠大大增強神經幹細胞的增殖能力，同時能夠使得神經幹細胞在不用明膠預鋪板的惰況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產流程。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
一種神經幹細胞培養基，包括dmem/f12、非必需胺基酸、表皮生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、胰島素、氫化可的松、wnt3a、notchl和牛血清白蛋白。其中含有10～20umol/ml非必需胺基酸、10～20ng/ml表皮生長因子、5～15ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子、10～20ug/ml胰島素、40～60nmol/l氫化可的松、10～20nmol/lwnt3a、40～60nmol/lnotchl、40～60ug/ml牛血清白蛋白。
作為優選，神經幹細胞培養基還包括纖連蛋白和四型膠原蛋白。
更進一步的優選是：神經幹細胞培養基中含有10～20umol/ml非必需胺基酸、10～20ng/ml表皮生長因子、5～15ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子、10～20ug／ml胰島素、40～60nmol/l氫化可的松、10～20nmol/lwnt3a、40～60nmol/lnotchl、40～60ug/ml牛血
清白蛋白、15～35ng/ml纖連蛋白、50～70ng/ml四型膠原蛋白。
其中，非必需胺基酸為穀氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、笠氨酸或酪氨酸中的一種或兩者以上的混合物。
本發明至少具有如下優點：
本發明提供的神經幹細胞培養基能夠大大增強神經幹細胞的增殖能力。流式檢測結果顯示，本發明培養基能夠使p6代的神經幹細胞的表面標誌物nestin+cd133+的比例能夠達到33.3%，而傳統培養基在p6代的nestin+cd133+的比例僅為9.8%；本發明培養基培養的神經幹細胞在3～6天時具有明顯的對數生長期，細胞增殖較快，而採用傳統培養基培養的神經幹細胞的生長曲線顯示細胞生長緩慢，無明顯對數增殖；
具體實施方式
本發明公開了一種神經幹細胞培養基及培養基的製備，本發明提供的神經幹細胞培養基所用試劑、儀器、試驗動物等均可由市場購得。其中，wnt3a購自上海華騅思創，notchl購自武漢福來生物；非必需胺基酸購自gibco，貨號為11140，memnon-essentiaaminoacidssolutionlomm(100x)等等。下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例：
培養基的製備
培養液配方成分為：dmem/f12、10umol/ml非必需胺基酸、15ng/ml表皮生長因子、15ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子、10ug/ml胰島素、50nmol/l氫化可的松、20nmol/lwnt3a、40nmol/lnotchl、50ug／ml牛血清白蛋白、35ng／ml纖連蛋白、50ng/ml四型膠原蛋白。培養基製備方法為：使用時按照規定量將所有成分混合均勻。
培養基培養神經細胞實例
出生1～4天的新生小鼠，脫頸處死後取新生小鼠大腦，剝去腦膜後用4。cpbs清洗2次，加入2ml神經幹細胞培養液（試驗組1採用實施例1培養基，試驗組2採用實施例2培養基，試驗組3採用實施例3培養基），並用手術剪將大腦剪碎，接著用iml手動移液器
將碎片吹散成混懸液，然後調整細胞密度到5×l04/ml。將混懸液加入6孔板，每孔2ml在5%co，、37。c培養箱中放置2小時，2小時後吸取6孔板中的上清液，加入另一個6孔板中繼續培養，原6孔板棄去不要。培養24小時後棄去6孔板中的上清液，每孔加入2ml神經幹細胞培養液，之後每2～3天換液一次。直到細胞融合度達到80%時倒去培養基並用含0.04v／v%edta的濃度為0.25v/v%的胰蛋白酶消化細胞1分鐘，使其脫落，然後用各組所用培養基按照加入胰酶體積的5倍終止消化；離心後去除上清液，將沉澱細胞用各組所用培養基重懸，按照5×l04/ml的蜜度加入培養瓶中，標記為pl代細胞。重複傳代至p6代。
將上述各組培養的神經幹細胞進行流式檢測，神經幹細胞的表面標誌物nestin+、cd133+的比例能夠達到33.3%、29.5%、24.3%，而傳統培養基在p6代的nestin+、cd133+的比例僅為9.8%。
一般增殖能力強的細胞，生長曲線會呈「s」型，可分為3個生長時期：第一階段為適應期，細胞增殖較慢：第二階段為對數生長期，細胞增殖速度變快，呈對數生長；第三階段為平臺期，細胞增殖減緩。根據神經幹細胞p6代七天的細胞生長曲線圖，可看到0～2天為適應期，3～6天為對數生長期，細胞增殖較快，第7天細胞增殖變慢，進入了平臺期。細胞生長曲線圖可知，該細胞的增殖能力較強。而採用傳統培養基培養的神經幹細胞的生長曲線顯示細胞生長緩慢，無明顯對數增殖。可見，本發明提供的神經幹細胞培養基能夠大大增強神經幹細胞的增殖能力。
同時本發明的培養基能夠使得神經幹細胞在不用明膠預鋪板的情況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產流程。