殺蚊幼製劑—孑孓清培養基配方的製作方法
2024-03-27 22:11:05
本發明是經過分離、篩選、多次純化、生理、生化鑑定得到的一種病原微生物—細菌，該菌為蘇雲金芽胞桿菌以色列亞種（Bacillusthuingiensis subsp israelensis 簡稱Bti)。該菌在實驗室做了大量分離、篩選、純化、生理、生化鑑定、16SDNA序列分析和多種動物的慢性、亞急性、急性等安全性試驗外，還進行搖瓶、小罐、中灌、大罐和10噸灌生產發酵。除了能夠實現穩定產業化生產外，更重要的是，還要篩選出能夠適宜Bti發酵生長良好所需要的碳源、氮源、磷源培養基有效成分。本公司在長期生產發酵中，研製了出適宜Bti發酵生長旺盛、芽孢數量多、芽孢質量好、高質量形成晶體蛋白毒素（該Bti菌株在發酵生長過程中能產生5種以上晶體蛋白毒素）的培養基。蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種(Bti)是一種重要的兼型病原微生物—細菌，已知可分為40個血清種和54個血清亞種，對蚊幼蟲—孑孓有毒效的菌株有3種，血清型為H-14(以色列亞種)、PG-14(摩氏變種)和73-E10-2(達姆施塔特變種)，應用最廣的是蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種。BtHi-14由Goldbery(1972)和Margelit(1977)在以色列分離出。該菌對蚊幼蟲—孑孓有較高的專一性，在宿主腸道內，晶體蛋白原毒素在高pH值和適合的酶的作用下，很快轉變為較小的有毒亞單位，蚊幼蟲—孑孓吞食晶體蛋白後，引起中腸細胞破裂得敗血病症而死亡。我國20世紀70年代開始對以色列亞種進行中試生產，生產的殺蚊幼劑在野外汙水池、水稻田以濃度1~3mg/L應用，24小時殺滅庫蚊，對伊蚊幼蟲—孑孓防治效果達90%，對按蚊幼蟲—孑孓也有良好效果。至今該製劑年產數百萬噸，主要用來殺滅容器積水中的伊蚊幼蟲—孑孓，特別是飲水水缸中的埃及伊蚊幼蟲—孑孓。在我國南、北方有較大面積的應用，施藥1~2天後蚊幼蟲—孑孓密度明顯下降，有效率均在93%~95.3%。國內研製的蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種—187漂浮顆粒劑防治水稻田裡的中華按蚊，持效期為16天；巴州點綠農林科技有限公司研製的殺蚊幼製劑—孑孓清在野外蘆葦溼地、汙水處理廠、水稻田、養殖場汙水排放區域等地施藥1天後，查結果，殺死淡色庫蚊幼蟲—孑孓98%、殺死中華按蚊幼蟲—孑孓100%、殺死致倦庫蚊幼蟲—孑孓100%、殺死兇小庫蚊幼蟲—孑孓99%、殺死曼蚊幼蟲—孑孓100%、殺死和吶蚊幼蟲—孑孓98%，有的區域100%。持效期都在45天以上，效果穩定。
背景技術：
殺蚊幼製劑－孑孓清使用的細菌是分離到的一株蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種；屬革蘭氏陽性長桿菌，在適宜的pH值和營養充足條件下，桿菌在生長發育過程中，能形成橢圓形孢子。桿菌在生長發育形成孢子最後階段時，生長成為具有極強殺傷力的蛋白毒素－蛋白晶體。蚊幼蟲—孑孓取食蛋白晶體進入消化道後，被鹼性腸液破壞成較小單位的δ－內毒素，破壞蚊幼蟲—孑孓的胃蛋白酶，使中腸停止蠕動，中腸上皮細胞慢慢解離，蚊幼蟲—孑孓開始停止取食。芽孢在蚊幼蟲—孑孓的中腸開始萌發，經被破壞的腸壁進入血腔後開始大量繁殖，最後致使蚊幼蟲—孑孓全身癱瘓，使蚊幼蟲—孑孓得敗血病症而死。
殺蚊幼製劑—孑孓清產品功能：殺蚊幼蟲—孑孓廣譜、效果穩定、持效期長，對人、畜、禽和有益昆蟲無毒、無害，應用安全、使用方便、省工省時、不汙染環境、運輸方便、靶目標準確、性能穩定。是殺滅蚊幼蟲—孑孓、有效控制和減少成蚊密度、把成蚊傳播絲蟲病、登革熱、瘧疾、黃熱病、腦炎、盤尾絲蟲病，蟲媒病毒傳染病的傳播等降到最低限度。長期使用，不產生抗性，還能徹底淨化水質。
殺蚊幼製劑—孑孓清作用機理：主要活性成分是半包晶體－蛋白毒素。蚊幼蟲－孑孓取食後，很快能破壞孑孓的胃蛋白酶，被鹼性腸液破壞成較小單位的δ－內毒素。使中腸停止蠕動，中腸上皮細胞慢慢解離，蚊幼蟲—孑孓開始停止取食。芽孢在蚊幼蟲—孑孓中腸萌發，經被破壞的腸壁進入血腔後開始大量繁殖，致使蚊幼蟲—孑孓全身癱瘓，使蚊幼蟲—孑孓，無能力再取食而得敗血病症死亡。
殺蚊幼製劑—孑孓清用量：水域區為1－3ml /m2。家禽、家畜飼養場、養豬場、養牛場、汙水處理廠、城市水管網區、城市下水道、河流、堰塘等區域蚊幼蟲—孑孓發生量嚴重區域、或是有機質含量高的區域，為3－5 ml / m2。
技術實現要素：
：本發明主要用於殺蚊幼製劑——孑孓清產業化生產用的液體發酵培養基配方。
培養基配方(％) （LB斜面培養基全球通用在此處省略）
發酵液體培養基：
酵母粉 3.0
玉米漿 2.5
葡萄糖 2.0
氯化鈣 0.1 （CaCl）
碳酸鈣 0.1 （CaCO3）
磷酸二氫鉀 0.1 （KH2P04）
添加劑 0.3 複合維生素若干
pH值(滅菌前) 7.5
碳源、磷源培養基：
碳源 2.5
磷酸二氫鉀 0.3 （KH2PO4）
氯化鈣 0.2 （CaCl2）
氯化鋅 0.03 （ZnCl2 ）
三氯化鐵 0.05 （FeCl3 ）
氯化鎂 0.005 （MgC12）
氯化鈷 0.005 （CoC12）
氯化銅 0.005 （CuC12 ）
添加劑 0.3
複合維生素若干；
氮源、磷源培養基：
氮源 2.7
磷酸二氫鉀 0.3 （KH2 PO4）
磷酸氫二鉀 0.3 （K2 HPO4）
氯化鈣 0.2 （CaC12）
氯化鋅 0.05 （ZnC12）
三氯化鐵 0.05 （FeC13）
氯化鈷 0.005 （CoC12）
氯化銅 0.005 （CuC12）
添加劑 0.3
複合維生素若干：
單一碳源、氮源配方篩選原料：
山芋粉，馬鈴薯粉，木薯粉，玉米餅粉，玉米粉，糖蜜。
單一氮源配方篩選原料
蛋白腖，酵母粉，黃豆餅粉，蠶蛹粉，魚粉，花生餅粉，棉籽餅粉（不要抗蟲棉的棉籽餅）。
蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種幾丁質酶胺基酸序列
Ichi 151 DCDKYARCGNFGELKRLKAKYPHLKTIISVGGWTWSNRFSDMAADEKTRKVFAFSTVAFL
Ac 243 SAWDEPYKGNFGNLMALKQAHPDLKILPSVGGWTLSDPFYFLG-DKTKRDTFVASVREFL
Al 241 VDAKDPIRGVYSQLMALKQRYPDLKILPSVGGWTLSDPFHGFT-NKANPDTFVASVKQFL
BcAl 132 DTWDQPIAGNINQLNKLKQTNPNLKTIISVGGWTWSNRFSDVAATAATREVFANSAVDFL
Bl 128 DVWDEPIRGNFKQLLKLKKSHPHLKTFISVGGWTWSNRFSDVAADPVARGNFAASAVEFL
Bs 125 DTWDEPIRGNFKQLLKLKKNHPHLKTFISVGGWSWSNRFSDVAADPAARENFAASAVNFL
Ct 91 AILDTPIRGHFGQLIKYKEQYPHVRTLISVGGWTESKYFSDVALTEESRNTFADSCVEFL
Sm 243 TAWDDPYKGNFGQLMALKQAHPDLKILPSIGGWTLSDPFFFMG-DKVKRDRFVGSVKEFL
Ichi 211 RAYG-FDGVDLDWEYPGVETIPGGSYRP-EDKQNFTLLLQDVRNALN
Ac 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGQGANPSLGGP-NDGATYVVLMKELRAMLD
Al 300 KTWKFYDGVDIDWEFPGGDGPNPDLGDPINDGPAYVALMQELRAMLD
BcAl 192 RKYN-FDGVDLDWEYPVSGGLDGNSKRP-EDKQNYTLLLSKIREKLD
Bl 188 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQEVRKKLD
Bs 185 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQDVREKLD
Ct 151 RTYR-FDGVDIDWEYPVSGGMPENIRRP-EDKQNFTLLLKCLREKLD
Sm 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGKGANPNLGSP-QDGETYVLLMKELRAMLD